Биотехнологические аспекты сохранения генетических ресурсов животных

Багиров, Вугар Алинияз оглы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биотехнологические аспекты сохранения генетических ресурсов животных
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические аспекты сохранения генетических ресурсов животных"

На правахрукописи

БЛГИРОВ Вугар Алинияз оглы

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОХРАНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ЖИВОТНЫХ

03.00.23 - Биотехнология 03.00.13 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Дубровицы - 2004

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства.

Научные консультанты: академик РАСХН

Эрнст Лев Константинович;

доктор биологических наук, профессор Зиновьева Наталия Анатольевна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Клинский Юрий Дмитриевич;

доктор биологических наук, профессор Рябых Владимир Павлович;

доктор биологических наук, профессор Ерохин Анатолий Сергеевич.

Ведущее учреждение: Московская государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

Защита диссертации состоится 01 февраля 2005 года, в 1000 часов, на заседании диссертационного совета Д.006.013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ВИЖ. Факс 8 (0967) 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЖа.

Автореферат разослан 28 декабря 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

В.П. Губанова

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Сохранение генетических ресурсов и рациональное использования животных является неотъемлемой частью биотехнологической и сельскохозяйственной науки. Из 6200 пород животных, относящихся к 40 видам, внесенных в банк данных ФАО/ЕАЖ, более 30% мировых генетических ресурсов домашних животных находятся на грани вымирания (Shend, 1997; Sheгf, 2000).

Впервые проблему сохранения генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных поднял А.С. Серебровский (1928) и ввел термин «генофонд». Автор подчеркивал, что «в лице генофонда мы имеем такое же национальное богатство, как в виде нефти, золота, угля, сокрытых в наших недрах». Рассматривая эту проблему, Ю.П. Алтухов с соавторами (1996) ввели термин «природоохранная генетика», который употребим и для популяций сельскохозяйственных животных, поскольку породы - это не что иное, как неотъемлемая часть животного мира.

Одним из выдающихся достижений отечественной науки XX столетия явилась разработка биотехнологического метода искусственного осеменения, позволяющего тиражировать ценные генотипы в сотни и даже тысячи раз, увеличивая их распространение в популяциях и вытесняя при этом малоценные генотипы.

Открытие Миловановым В.К., Соколовской И.И., Смирновым И.В. (1947) возможности длительного сохранения семени животных в глубокоохлажденном состоянии явилось основой для создания криобанка генетических ресурсов высокопродуктивных, редких, уникальных и исчезающих видов животных/

Криобанк семени перед традиционными методами сохранения видов имеет такие преимущества, как возможность транспортировки на большие расстояния; легкость обмена генетического материала между популяциями; высокая степень надежности; сведение до минимума эффекта генетического дрейфа и инбридинга; обеспечение сохранения видов в случае эпидемий, экологических и социальных катастроф; использование отдаленной гибридизации с целью совершенствования животноводства; создание коллекции биологических материалов для различных исследований.

Генетический материал, сохраняемый в криобанке, может быть использован не только для восстановления исчезающих видов, но и для обмена генетическим материалом между популяциями, разводимыми в неволе; для обогащения резерва наследственной изменчивости свободноживущих популяций, находящихся под угрозой исчезновения ввиду их малой численности; при разведении животных-носителей уникальных генов, полученных в процессе трансгенеза (Эрнст Л.К. и др., 1994; Эрнст Л.К., 2004).

Существование вида, его способность выжить в данной среде зависит от сохранности генома, которой вносит , сперматозоид в ооцит при оплодотворении. Совокупность механизмов обеспечивающих защиту генома в половых клетках самцов, подвергающихся сложным трансформациям в ходе сперматогенеза, является одним из условий, обеспечивающих существование вида.

Цель и задачи исследований.

Целью диссертационной работы являлась разработка и усовершенствование технологий и методик сохранения и рационального использования генетических ресурсов разных видов, животных с использованием биотехнологических методов.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

• Усовершенствовать технологию криоконсервации семени кроликов.

• Разработать технологию криоконсервации эпидидимального семени животных.

• Создать банк семени редких, исчезающих и уникальных видов животных.

• Изучить морфологические и гистологические особенности гонад и выполнить сравнительный анализ видовых характеристик сперматозоидов различных видов животных.

• Разработать методологию рационального использования генетических ресурсов.

• Изучить возможность получения трансгенных свиней после многолетнего хранения семени.

• Изучить возможность использования сперматозоидов в качестве вектора для переноса чужеродной ДНК в ооциты кролика.

• Усовершенствовать методику кариотипирования с использованием прикладных компьютерных программ и провести цитогенетический анализ животных разных видов.

Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы была усовершенствована технология криоконсервации семени кроликов, позволяющая улучшить биологическую сохранность сперматозоидов, получить более высокую оплодотворяющую способность сперматозоидов и повысить многоплодие в сравнении с прототипом.

Впервые была разработана технология криоконсервации эпидидимального семени овцебыка, сайгака, яка как метод сохранения редких и исчезающих видов животных. Предложен метод внутритрубного осеменения для размножения трансгенных свиней при наличии ограниченных количеств глубокозамороженного семени. Изучены видовые особенности сперматозоидов яков, сайгаков, овцебыков, кроликов, баранов, хряков и быков. Доказано, что в процессе криоконсервации семени, сперматозоиды способны связываться с чужеродной ДНК и переносить ее в ооциты при оплодотворении. Изучено влияние чужеродной ДНК на уровень хромосомной изменчивости у трансгенных свиней и кроликов.

Практическая значимость. Предложена усовершенствованная технология криоконсервации семени кроликов, на основе которой создан банк семени трансгенных кроликов. Разработана технология криоконсервации эпидидимального семени разных видов животных, с использованием которой создан банк семени редких, уникальных и исчезающих видов животных (овцебыков, сайгаков, яков). Создан банк семени трансгенных хряков 6-ти

поколений (Рг, Р3, р4, р5, Рб, р7). Доказано, что глубокозамороженное семя трансгенных хряков, хранящееся в жидком азоте более 10 лет, может быть использовано для получения потомства и возобновления трансгенной линии. Разработана методика кариотипирования на основе прикладных компьютерных программ, позволяющая повысить эффективность цитогенетического анализа животных.

Положения, выносимые на защиту.

• Усовершенствованная технология криоконсервации семени кроликов, позволяющая повысить сохранность, оплодотворяющую способность сперматозоидов и многоплодие.

• Технология криоконсервации эпидидимального семени как метод сохранения и рационального использования генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных.

• Биологическая полноценность семени трансгенных хряков, хранившегося более 10 лет в криобанке.

• Метод внутритрубного осеменения как способ тиражирования уникальных генотипов при ограниченном запасе семени.

• Морфологические и гистологические особенности семенников яков, сайгаков, овцебыков.

• Морфологические и гистохимические особенности сперматозоидов яков, сайгаков, овцебыков, кроликов, баранов, хряков и быков.

• Новая методика кариотипирования на основе использования прикладных программ как способ характеристики генетических ресурсов животных.

• Влияние чужеродной ДНК на уровень хромосомных нарушений и физиологические показатели у животных.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 12 научных конференциях (Москва, Дубровицы, Боровск, Санкт-Петербург, Гаага, Рим), на заседаниях ученого совета ВИЖа. По материалам диссертации опубликовано 33 научные работы, в том числе в центральных журналах - 8, книг - 6, методических рекомендаций - 3, в зарубежных изданиях - 2.

Объем работы. Диссертация изложена на 245 страницах машинописного текста, включает 33 таблицы, 79 рисунков, 1 график, 3 схемы. Библиографический список содержит 425 источников, в том числе 257 на иностранных языках.

2. Материал и методы исследований.

Работа выполнена в 1993-2004 гг. во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства, в экспериментальных хозяйствах ВИЖа «Кленово-Чегодаево», «Дубровицы», в экспериментальном хозяйстве ВИЭВ «Лисий остров» Тверской области, охранной зоне "Бикада" полуостров Таймыр, с. Бизинги Черекского района Кабардино-Балкарской

Республики, в вольере организации «Охрана дикой природы» Калмыцкой Республики.

Опыты проводили на следующих видах животных: 1) кролики (Qryctolagus cuniculus) пород шиншилла, шампань, калифорнийская, русская горностаевая - всего 50 самцов, 250 самок и 4 вазэктомированных самца в возрасте от 6 месяцев до 4 лет; 2) свиньи (Sus scrofa) породы крупная белая, ландрас и их помеси, дюрок - всего 30 самцов и 80 самок в возрасте до 5 лет; 3) овцы (Ovis aris) пород романовская, кавказская, куйбышевская, ромни-марш, тексиль, финский ландрас, линкольн и их помеси - всего 20 самцов в возрасте от 1 до 4 лет; 4) быки (Bos taurus) 20 пород - всего 50 голов в возрасте от 1 до 10 лет; 5) овцебыки (Ovibos moschatus) - 2 самца в возрасте больше 3 и 5 лет; 6) яки (Bos mutus) - 4 самца и 3 самки в возрасте от 1,5 до 7 лет; 7) сайгаки (Saiga tatarica) - 7 самцов в возрасте от 1,5 до 3,5 лет.

Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке 1.

Семя брали при помощи искусственной вагины от самцов кроликов, содержащихся в индивидуальных клетках. За основу взяты инструменты, приспособления и методика взятия семени, описанные Соколовской И.И. и Кононовым В.П. (1971), модифицированные нами. В свежевзятых эякулятах изучали качественные и количественные характеристики. Концентрацию сперматозоидов определяли при помощи камеры Горяева при увеличении 400х. Разработку среды для криоконсервации семени кроликов проводили с использованием метода треугольных графиков по В.К. Милованову (1962) для нахождения оптимального соотношения испытуемых компонентов. Оптимальный режим замораживания определяли путем изменения объема гранул семени, замораживаемых на фторопластовой пластине. В качестве прототипа использовали среду, предложенную Н.А. Комбаровой (1993).

Разбавленное семя охлаждали в течение 4-х часов в бытовом холодильнике до +4°С, предварительно поместив пробирки с семенем в поролоновый теплоизолирующий штатив. Затем семя охлаждали до 0 С, погружая пробирки в смесь воды со льдом. Замораживание семени проводили на охлажденной в жидком азоте фторопластовой пластине (Ющенко Н.П., 1968). Оттаивание семени осуществляли сухим методом с помощью оттаивателя (Кононов В.П., Нарижный А.Г., 1986).

Время выживания сперматозоидов оценивали по полупериоду подвижности (Милованов В.К. и др. 1981) и морфологической сохранности акросом акроскопическим методом (Соколовская И.И., 1980).

Спаривание самки с вазэктомированным самцом проводили за 5 часов до осеменения. Для индукции овуляции самкам непосредственно перед осеменением вводили внутривенно хорионический гонадотропин (Ovogest 1500, Intervet, Германия) из расчета 30 ME на 1 кг живой массы. Семя вводили в период охоты однократно в дозе 0,25 мл, содержащей около 20 млн. подвижных сперматозоидов. На 12-13 день крольчих пальпировали для предварительной диагностики сукрольности. Результативность осеменения оценивали по данным окрола, определяя процент окролившихся маток и размер гнезда.

Рис. 1.Схема исследований

Технология замораживания эпидидимального семени включала несколько этапов: получение содержимого эпидидимиса, извлечение из него сперматозоидов и их криоконсервация.

Выделение ДНК из ткани (выщипы ушной раковины) проводили перхлоратным методом по усовершенствованной методике (Зиновьева НА. и др., 2001). Для доказательства трансгенности использовали метод ПЦР-анализа (Saiki et al., 1985, 1988). Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в агарозном геле и визуализировали в УФ свете с помощью цифровой камеры и компьютерной программы Biotest.

Образцы тканей для гистологических исследований фиксировали в 10% растворе формалина и в фиксаторе Карнуа. Гистопрепараты готовили на парафиновом и замораживающем микротоме по методике Ромейс (1953). Анализ препаратов осуществляли с использованием камеры и компьютерной программы Image Scope (г. Москва, ООО «Системы для микроскопии и анализа»). Для этого проводили видеозахват 50 случайных полей зрения на 3-х препаратах, окрашенных по Фельгену, определяли длину, ширину, среднюю яркость и площадь 50 ядер сперматозоидов. Условную плотность находили по формуле а=(255-У), где а - плотность; b - яркость. Перемножая условную плотность на площадь ядра (axS), определяли условное количество ДНК. Препараты сперматозоидов для морфометрического анализа окрашивали гематоксилином-эозином. Измеряли длину, ширину, площадь, округлость головки сперматозоидов.

Криоконсервацию семени хряков проводили по методике ВИЖ с применением диализной криопротективной обработки.

Хирургические операции по внутритрубному осеменению свиноматок проводили под общим наркозом. Свиноматок фиксировали на операционном столе, производили разрез брюшной стенки по белой линии живота между предпоследней и последней парой молочных желез. Выводили на поверхность брюшной стенки сначала один рог матки в месте его соединения с яйцеводом, затем второй.

Для переноса чужеродной ДНК (чДНК) сперматозоидами в ооциты генную конструкцию pCMVlacZ добавляли к охлажденному до 0°С семени из расчета 1 мкг ДНК на 1 млн. сперматозоидов в виде 0,01% раствора в Трис-ЭДТА буфере. В контрольные образцы добавляли соответствующее количество трис-ЭДТА буфера. Семя инкубировали при 0°С в течение 10-15 минут, замораживали и сохраняли в жидком азоте до осеменения. Через 44-46 часов после осеменения проводили вымывание эмбрионов 0,9% раствором NaCl. Определяли количество оплодотворенных яйцеклеток, сопоставляя его с числом овуляций на яичниках. После морфологического тестирования эмбрионов их подвергали гистохимической реакции с субстратом X-gal с целью выявления активности ß-галактозидазы (Гоголевский ПА., 1991; Кузнецов А.В., 1993).

Для получения препаратов хромосом использовались лимфоциты периферической крови. Для этого, в зависимости от вида животных, брали кровь в количестве 2-5 мл из ушной или яремной вены в стерильный

одноразовый шприц с гепарином. Препараты готовили по методике (Кленовицкий и др. 2003).

Анализ препаратов хромосом проводился с использованием стандартных программ обработки видеоизображений (Image Scope 1 (OOO «Системы для микроскопии и анализа», г. Москва), Photoshop).

3. Результаты исследований.

3.1. Усовершенствование технологии криоконсервации семени кролика.

Разработку технологии криоконсервации кроличьего семени проводили в несколько этапов:

1) совершенствование криопротективной среды;

2) оптимизация режима замораживания семени;

3) выбор способа замораживания семени;

4) усовершенствование инструментария для искусственного осеменения крольчих.

3.1.1. Совершенствование криопротективной среды.

Оптимальное соотношение основных компонентов криопротекторной среды было найдено с использованием методов геометрических и арифметических рядов.

В качестве базовых были взяты компоненты, хорошо зарекомендовавшие себя как защитные факторы в работе с семенем других видов животных. В качестве неэлектролита была использована лактоза как дисахарид, обладающий высокими антиоксидантными свойствами и способный особо прочно связывать свободную воду. Электролитной частью среды являлся трис-цитратный буфер, зарекомендовавший себя как способный устойчиво удерживать концентрацию водородных ионов при охлаждении семени за счет сопряженного подавления констант диссоциации трис-катиона и основных анионов.

Таблица 1 Состав среды для криоконсервации семени кроликов

Название Химическая формула Молекулярный вес Кол-во вещества

Лактоза С,2Н220,1*Н20 360,32 2,17 г

Лимонная кислота с6н8о7 192,1 1,52 г

Трис C4HmNO, 121,1 2,74 г

Желток куриного яйца 15,0 мл

Глицерин с3н80, 92,09 2,0 мл

ДМСО (CH3)2so 78,11 2,5 мл

Вода бидистиллированная Н20 18 100 мл

pH среды 7,05

В связи с особым значением специфических криопротекторов для защиты семени при замораживании методом треугольных графиков в среду в оптимальных концентрациях были введены наиболее широко используемые глицерин и ДМСО. Результаты исследования по нахождению оптимальных

концентраций этих криопротекторов в связи с характеристиками биологической полноценности оттаянного семени показали, что оптимальные концентрации глицерина 2% и ДМСО 2,5%.

Состав разработанной среды приведен в таблице 1.

3.1.2. Оптимизация режима замораживания семени.

Следующим этапом исследований явилось нахождение оптимального режима глубокого охлаждения семени при замораживании его гранулами разного объема. Установлено, что объем замораживаемых гранул имеет решающее значение для выживаемости сперматозоидов. Чем больше объем гранулы в пределах до 0,3 мл, тем лучше сохраняется биологическая полноценность сперматозоидов.

Изменение характеристик семени на разных этапах криоконсервирования с использованием разрабатываемой нами технологии по сравнению с методикой-прототипом приведены в таблице 2.

Таблица 2

Изменение характеристик семени кроликов на разных

этапах криоконсервации_

Этапы криоконсервации Подвижность, % Сперматозоидов с интактными акросомами, % Подвижных сперматозоидов с интактными акросомами, %

Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль

Свежевзятое семя 82+1,8 74+1,3 85+2,1 82+2,8 100 100

После разбавления 78+1,4 74+1,3 83+2,9 78+4,0 98+0,6 95+1,0**

После эквилибрации 73+0,9 73+0,8 82+3,0 73+3,2** 96+0,9 89+1,4***

После оттаивания 25+2,3 15+1,1 73+2,2 55+3,0*** 86+1,6 67+2,1***

Примечание: опыт-замораживание семенипоразработаннойнамиметодике;

контроль-замораживание семенипометодикой-прототипом.

Из данных таблицы 2 видно, что замораживание семени по разработанной нами методике значительно лучше защищает сперматозоиды по сравнению с методикой-прототипом.

Результативность осеменений крольчих при использовании естественной случки, искусственного осеменения криоконсервированным семенем по нашей технологии и методике-прототипу приведена в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, криоконсервация семени с использованием разработанной технологии позволяет сохранить более высокую оплодотворяющую способность сперматозоидов (+18%) и повысить многоплодие на 0,9 крольчонка, чем при использовании технологии-прототипа (разница статистически достоверна).

Таблица 3

Результативность осеменения крольчих семенем, замороженным

разными методами, в сравнении с естественным спариванием

Показатели Осеменено крольчих Из них окролилось, голов Родилось крольчат, голов

п % п % п %

Естественная случка 104 100 94 90,4+2,9 686 7,3+0,52***

Новая технология 110 100 86 78,2+3,9 498 5,8+0,70

Прототип 111 100 67 60,4+4,6** 329 4,9+2,0

3.1.3. Выбор способа замораживания семени.

Предложена и апробирована методика криоконсервации семени кроликов в соломинках объемом 0,25 мл. Подвижность замороженно-оттаянных сперматозоидов в гранулах составила 25%, в то время как в соломинках - 20%. Сохранность акросом при этом была 73% и 62%, соответственно.

Хотя криоконсервация семени кроликов в гранулах дает' лучшие результаты по сравнению с соломинками, замораживание в соломинках имеет ряд преимуществ, таких как обеспечение лучшей стерильности, легкость и удобство оттаивания и маркировки.

3.1.4. Усовершенствование инструментария для искусственного осеменения крольчих.

Исходя из физиологических особенностей кроликов, при искусственном осеменении самок возникают проблемы, связанные с трудностями взятия семени и введения шприц-катетера. В этой связи были усовершенствованы вагина для взятия семени кроликов и шприц-катетер для искусственного осеменения крольчих.

Разработанная нами технология уже успешно используется для криоконсервации семени кроликов в рамках создания банка семени трансгенных животных (раздел 3.3.1).

3.2. Усовершенствование технологии криоконсервации

эпидидимального семени как метода сохранения и рационального использования генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных.

Возможность использования эпидидимального семени разных видов животных с целью получения потомства была доказана еще Ивановым И.И. (1910). Эрнст Л.К. с соавторами (1986), Шайдуллин И.Н. (1994), Абилов А.И. с соавторами (1994) подтвердили перспективность использования этого метода. Криоконсервация эпидидимального семени на сегодня осуществлена у снежного барана (Шайдуллин И.Н., 1988) и зубра (Абилов А.И. и др., 1994).

Задачей наших исследований явилось усовершенствование технологии получения и криоконсервации эпидидимального семени животных и его более

рациональное использование. Предложенное нами фракционное выделение спермы - это новый подход в получении эпидидимального семени.

Суть предложенной технологии заключается в следующем: хвост придатка отделяют от семенника и осторожно освобождают от оболочек и кровеносных сосудов, оставляя чистый клубок извитого канала эпидидимиса, заполненного сперматозоидами. Через надрезы канальцев эпидидимиса получают первую фракцию.

После выделения первой фракции чистого семени извитой канал измельчают ножницами, получившуюся массу смешивают со средой и фильтруют через стеклянный фильтр.

Технология получения и криоконсервации эпидидимального семени животных включает в себя несколько этапов:

1) отбор семенников;

2) препарирование эпидидимиса;

3) получение содержимого эпидидимиса;

4) выделение сперматозоидов по фракциям;

5) разбавление сперматозоидов средой;

6) эквилибрация семени;

7) криоконсервация эпидидимального семени.

Первоначально технология была отработана на кроликах. Выделенные из хвоста эпидидимиса по вышеописанной методике сперматозоиды подвергались глубокой заморозке. Сравнительный анализ выживания сперматозоидов в эякулированном и эпидидимальном семени приведен в таблице 4.

Таблица 4

Результаты замораживания эпидидимальных _сперматозоидов кролика_

Этапы криоконсервации Подвижность сперматозоидов, % Сохранность акросом, сперматозоидов, %

Эякулированное Эпидиди-мальное Эякулированное Эпидиди-мальное

Свежевзятое семя 82+1,8 50±2,4 85+2,1 87+1,5

После разбавления 78+1,4 90±2,1 83+2,9 78+3,1

После эквилибрации 73+0,9 75+1,5 82+3,0 75+2,6

После замораживания-оттаивания 25+2,3 30±1,9 73+2,2 68+3,2

Как показано в таблице 4, подвижность сперматозоидов эпидидимального семени после замораживания-оттаивания составляла 30%, что было на 5% выше по сравнению с подвижностью сперматозоидов в эякулированном семени. Сохранность акросом сперматозоидов в эпидидимальном семени лишь незначительно уступала этому показателю в эякулированном семени. Биологическая полноценность криоконсервированного эпидидимального семени кролика была доказана успешным получением потомства.

Разработанная методология сохранения генетических ресурсов редких, уникальных и исчезающих видов животных предусматривает проведение односторонней кастрации самцов, что не приводит к потере их воспроизводительной функции. Данная методология была апробирована на кроликах, баранах, сайгаках и яках.

Была изучена возможность криоконсервации эпидидимальных сперматозоидов из головки и тела эпидидимиса, а также тестикулярных сперматозоидов. Проведенные эксперименты показали, что после замораживания и оттаивания сперматозоиды сохраняют свою биологическую полноценность и пригодны для интрацитоплазматической инъекции (ICSI) ооцитов.

Предложенный подход открывает новые возможности в сохранении генетических ресурсов с использованием эпидидимальных сперматозоидов не только из хвоста эпидидимиса, а также из головки и тела эпидидимиса, и тестикулярных сперматозоидов.

3.3. Создание банка семени редких, исчезающих и уникальных видов животных.

Усовершенствованные в ходе выполнения диссертационной работы технологии криоконсервации семени (разделы З.1., 3.2.) были использованы для создания банка семени редких, исчезающих и уникальных видов животных.

3.3.1. Банк семени трансгенных кроликов.

Получение трансгенного животного является сложным и трудоемким процессом, поэтому ставится задача максимального тиражирования его в потомстве. Эту проблему помогает решать разработанная технология криоконсервации семени кроликов, дающая возможность круглогодично накапливать семя уникальных самцов и в последующем использовать его для осеменения самок. Характеристика созданного в ходе выполнения диссертации банка семени трансгенных кроликов дана в таблице 5.

Таблица 5

Характеристика банка семени трансгенных кроликов

Показатели Трансгенные по генам

МСР BLV

Заморожено доз 1150 780

Подвижность свежевзятого семени, % 75+2,24 80+2,69

Подвижность после замораживания-оттаивания семени, % 30±1,29 25+2,89

Сохранность акросом % 65±1,49 60±1,97

Из таблицы 5 видно, что подвижность сперматозоидов кроликов, трансгенных по генам МСР и BLV, после замораживания и оттаивания составила 25-30%, при этом сохранность акросом была на уровне 60-65%. Всего заморожено 1930 доз семени трансгенных кроликов.

Биологическая полноценность семени была доказана успешным получением трансгенного потомства. В ходе выполнения работы было исследовано пять поколений трансгенных животных. Для уменьшения эффекта инбридинга в размножении использовались интактные кролики.

С целью получения гомозиготного трансгенного потомства проводили спаривание по типу трансген х трансген. Гомозиготность самцов по интегрированному гену была доказана последующими анализирующими спариваниями с контрольными самками. Получено 2 гомозиготных трансгенных самца, семя от которых в количестве 200 доз содержится в криобанке.

3.3.2. Банк семени трансгенных баранов.

С молоком трансгенных животных уже получены целый ряд ценных веществ в том числе, биологически активные вещества технологического назначения, включая химозин (Эрнст и др., 1995).

Для сохранения генофонда трансгенных баранов по химозину с целью детального изучения этих животных и их дальнейшего использования создан банк семени. Всего заморожено 580 доз.

Характеристика семени трансгенных баранов приведена в таблице 6.

Таблица 6

Характеристика семени трансгенных баранов

Показатели Трансгенный по химозину

Всего заморожено доз 580

Подвижность свежевзятого семени, % 90+1,8

Подвижность после замораживания-оттаивания семени, % 45±1,5

Сохранность акросом % 68±2,3

Анализ таблицы 6 показал, что сперматозоиды баранов после криоконсервации сохраняли свою биологическую полноценность. Подвижность сперматозоидов трансгенных баранов после замораживания и оттаивания составила 45%, при этом сохранность акросом была на уровне 68%.

3.3.3. Банк семени трансгенных хряков.

Для сохранения генофонда свиней, трансгенных по генной конструкции релизинг-фактора гормона роста, нами был создан банк семени трансгенных хряков поколений р2, Рз, В§еТ®, было заморожено 2530 доз семени.

Характеристика отобранного и криоконсервированного семени хряков приведена в таблице 7.

Как показано в таблице 7, подвижность свежевзятого семени трансгенных хряков составляет 75-90%; при оценке спермы после процесса замораживания-оттаивания активность сперматозоидов в трансгенном семени составляла 35-

45%, сохранность акросом составила 52-65%. Полученные данные свидетельствует о биологической полноценности сперматозоидов трансгенных хряков.

Таблица 7

Характеристика банка семени трансгенных хряков

Показатели трансгенные хр фактору го яки, по релизинг рмона роста

г2 Р3

Заморожено доз 570 210 430 720 460 350

Подвижность свежевзятого семени, % 90+1,7 80+1,5 75+3,4 85+1,5 85+2,2 90+1,9

Подвижность после замораживания-оттаивания семени,% 45+2,7 35+2,2 35+2,3 35+2,0 40+1,2 35+2,5

Сохранность акросом % 65+1,5 55+1,3 52+2,4 58+2,6 60+2,0 60+2,1

3.3.4. Банк семени овцебыков.

Создание криобанка семени овцебыков является одним из актуальных вопросов в сохранении генетических ресурсов и в дальнейшем использовании в селекционно-племенной работе с овцебыками.

Впервые нам удалось получить и заморозить эпидидимальные сперматозоиды овцебыка и создать криобанк семени овцебыков, характеристика которого приведена в таблице 8.

Таблица 8

Криоконсервация эпидидимального семени овцебыков

Показатели Бык №1 (3-года) Бык №2 (5-лет)

Объем чистого эпидидимального семени из одного придатка, мл 4 5

Общее количество сперматозоидов, млрд. 34,1 53,5

Общий объем, мл 15,5 19,8

Концентрация сперматозоидов после разбавления,млрд 2,2 2,7

Подвижность свежеразбавленного семени 80+1,1 90+1,3

Объем одной дозы, мл 0,25 0,25

Общее количество доз 55 73

Подвижность семени после замораживание-оттаивания 35±1,7 45±0,9

Как показано в таблице 8, объем эпидидимального семени и концентрация сперматозоидов у 5-летного овцебыка были несколько больше по сравнению с 3-летним быком. Подвижность сперматозоидов 3-летного овцебыка после оттаивания составила 35%, а 5-летного - 45%.

Последние годы в целях восстановления исторического ареала овцебыков на севере России ведется огромная работа по расселению и одомашниванию овцебыка. На Восточном Таймыре отловлено 175 овцебыков, 148 из них выпущены в четырех запланированных районах, а 24 теленка отправлены на фермы, создаваемые в Оленекском, Сунтарском, Мирнинском и Горном районах Якутии (Царев, 2002).

Перспективы дальнейшей реакклиматизации овцебыков велики. Для расселения овцебыков пригодны приморские тундры от Кольского до Чукотского полуострова, все крупные острова Северного Ледовитого океан и горные тундры в пределах северо-таежной зоны, то есть территории общей площадью около 3,5 млн. км2. Необходимым условием для решения этой задачи является создание банка семени, позволяющего сохранить и рационально использовать генофонд этого уникального вида животных, хорошо приспособленного к экстремальным условиям обитания.

3.3.5. Банк семени яков.

Получением эпидидимального семени у яков во ВНИИ животноводства Киргизии занимался В.В. Ельчанинов (1962), однако полученные им эпидидимальные сперматозоиды не подвергались криоконсервации. Попытки по получению спермы от яков на искусственную вагину и ее криоконсервации с целью использования для осеменения коров, сделанные Е. Загдсуреном (1980), не увенчались успехом.

Нам удалось получить эпидидимальное семя от 4-х самцов и создать банк семени яков (таблица 9).

Таблица 9

Криоконсервация эпидидимального семени яков

Показатели Возраст животных, год

1,5 2,5 3,5 5,5

Объем чистого эпидидимального семени из одного придатка, мл 12 3,4 5 3,1

Общее количество сперматозоидов, млрд. 12,8 37,7 53,4 32,4

Общий объем, мл 6,4 14,5 18,4 13,5

Концентрация сперматозоидов после разбавления, млрд. 2,0 2,6 2,9 2,4

Подвижность свежеразбавленного семени 70±2,4 80±2,7 90±2,4 75±2,2

Объем одной дозы, мл 0,25 0,25 0,25 0,25

Общее количество доз 25 58 75 50

Подвижность семени после замораживание-оттаивания 25±2,9 30±1,5 35±1,3 25±2,1

Из таблицы 9 видно, что пик развития сперматогенеза наблюдался у животных в возрасте 2,5 и 3,5 года. Приведенные данные показывают, что

общее количество сперматозоидов, полученных после выделения их из эпидидимиса составляло у быков в 1,5 года - 12,8 млрд; в 2,5 года - 37,7 млрд., в 3,5 года - 53,4 млрд. и в 5,5 лет - 12,7 млрд. Подвижность сперматозоидов после замораживания-оттаивания составила, соответственно, 25%, 30%, 35% и 25%.

Результаты проведенных экспериментов показывают возможность успешного замораживания эпидидимального семени яка, что дает возможность использовать его для сохранения генетических ресурсов и отдаленной гибридизации.

3.3.6. Банк семени сайгаков.

В литературе отсутствуют данные о получении, оценке и криоконсервации спермы сайгака. В связи с этим, нами были выполнены работы по получению и сравнительной оценке электроэякулированного и эпидидимального семени сайгака (таблица 10).

Таблица 10

Криоконсервация эпидидимального и электроэякулированного семени сайгаков

Метод получение семени

Показатели Электроэякули- Эпидидималь -

рованное семя ное семя

п=5 п=1

Объем чистого эпидидимального 1,2

семени из одного придатка, мл

Общее количество сперматозоидов, млрд. 13,6(2,7)* 8,8

Общий объем, мл 8,0(1,6)* 4,2

Концентрация сперматозоидов после разбавления, млрд 1,7 2,1

Подвижность сперматозоидов в 80±2,5 70+1,6

свежеразбавленном семени, %

Объем одной дозы, мл 0,20 0,20

Общее количество доз 40 20

Подвижность семени после замораживания-оттаивания, % 35±1,3 30±2,3

* - от одного животного

Как показано в таблице 10, подвижность сперматозоидов в свежем семени, полученном с использованием электроэякулятора, была выше, а концентрация ниже по сравнению с данными показателями в эпидидимальном семени. Из приведенных данных видно, что после замораживания и оттаивания сперматозоиды сайгаков сохранили свою биологическую полноценность.

В исследованиях по получению семени с помощью электроэякулятора наблюдали случаи загрязнения мочой, что является недостатком данного метода.

Когда-то многочисленный сайгак находится на грани вымирания. Создание банка семени, позволяет сохранить и рационально использовать генофонд этого уникального вида животных, хорошо приспособленного к условиям обитания в аридной зоне.

3.4. Изучение морфологических и гистологических особенностей гонад и видовых характеристик сперматозоидов различных видов животных.

3.4.1. Биологические особенности гонад овцебыка.

В экспедиционных исследованиях на полуострове Таймыр проведена работа по изучению биологических особенностей овцебыков данной популяции. В первую очередь нас интересовала биология воспроизведения этих животных.

Анализ данных таблицы 11 показывает, что с возрастом вес и геометрические параметры семенников увеличиваются. Из таблицы видна асимметрия гонад у 3- и 5-летного овцебыков.

Таблица 11

Физиологические параметры семенников овцебыка_

№ п/п Возраст, (лет) Вес сем (г енника, р) Длина семенника, (см) Обхват семенника, (см)

левый правый левый правый левый правый

1 3 72 78 7,7 8,0 11,3 11,6

2 5 91 94 10,1 10,3 12,9 14,2

Изучены особенности гистологического строения семенников овцебыка. Результаты показали, что у старшего быка внутреннее содержимое канальцев было более наполнено клеточными структурами сперматогенного ряда.

3.4.2. Биологические особенности гонад яка.

В результате экспедиции в Кабардино-Балкарию удалось провести научно-исследовательскую работу по изучению биологических особенностей яков этой популяции. Изучены воспроизводительные функции самцов яков

Оказалось, что семенники у яка меньше, чем у крупного рогатого скота. Данные морфологической оценки семенников у яков разного возраста приведены в таблице 12.

Анализ таблицы 12 показывает, что до достижения полной половой зрелости вес и геометрические параметры семенников увеличиваются. Кроме того, видна асимметрия гонад у разновозрастных яков.

При изучении гистологических препаратов семенников разновозрастных яков установлено, что семенники, как у других видов животных, покрыты фиброзной капсулой, состоящей из плотной соединительной ткани, от них внутрь отходят соединительнотканные перегородки, разделяя их на отдельные дольки с канальцами.

Таблица 12

Физиологические параметры семенников яка

№ пп Масть яков Возраст, яка (лет) Вес сем (г енника, р) Длина семенника, (см) Обхват семенника, (см)

левый правый левый правый левый правый

1 Черно-пестрый 1,5 45 - 7,1 - 9,3 -

2 Светло-бурый 2,5 78 81 8,3 8,3 12,2 12,5

3 Черный комолый 3,5 103 97 10,4 10,1 14,8 14,3

4 Бурый 5,5 93 - 9,2 - 13,7 -

Самцы яка в возрасте 2,5 и 3,5 года характеризуются достаточно развитыми структурами канальцевой ткани, установлена полная картина сперматогенеза. Срез заполнен клеточными элементами сперматогенного эпителия.

У более старших животных плотность канальцевой ткани уменьшается, структура их постепенно претерпевает обратное развитие, "снижается активность сперматогенеза.

3.4.3. Биологические особенности гонад сайгака.

Эксперименты непосредственно проводились в вольере организации «Охрана дикой природы» Калмыцкой Республики.

Было изучена гистология семенника сайгака. На срезах выявлена довольно равномерная заполненность канальцев клетками сперматогенного ряда. Это говорит о нормальном функционировании органа.

3.4.4. Сравнительный анализ сперматозоидов различных видов животных.

Сравнение морфометрических и физиологических параметров сперматозоидов у разных видов животных позволяет получить наиболее полное представление об их биологических особенностях (Милованов, 1962).

Применение новых методов исследований по изучению и автоматизации анализа морфометрических параметров сперматозоидов позволяет более точно и достоверно определять их показатели.

С использованием прикладных компьютерных программ были изучены основные морфометрические параметры сперматозоидов разных видов животных (таблица 13), позволяющие охарактеризовать видовые особенности формы и строения их отдельных структур.

Впервые были изучены морфометрические характеристики сперматозоидов овцебыка, сайгака и яка. Проведенный сравнительный анализ морфометрических показателей сперматозоидов у разных видов животных выявил видовые особенности. Обнаружены достоверные различия по общей длине, ширине, длине и площади головки сперматозоидов.

Таблица 13

Морфометрическая характеристика сперматозоидов у разных видов животных

Вид животного Сайгак Баран Овцебык Бык Як Хряк Кролик

Морфология сперматозоидов ; ( 1 1 \ ( I 1 / /

Длина сперматозоидов 54,6+0,34 59,7+0,12 64,5+0,44 71,2+0,22 72,9+0,24 57,3+0,19 56,9+0,23

Длина головки сперматозоидов 8,2+0,08 8,34+0,05 6,95+0,05 8,75+0,06 8,71 ±0,06 8,42+0,14 7,51+0,05

Ширина головки сперматозоидов 4,54+0,06 4,52+0,04 4,11+0,04 4,84+0,05 4,67+0,04 4,51+0,15 4,25+0,04

Площадь головки сперматозоидов 29,4+0,39 30,7+1,33 23,7+0,96 35,8+1,23 33,7+1,68 31,6+1,17 28,7+0,83

Коэффициент округлости головки сперматозоидов 1,19+0,014 1.17+0,001 1,16+0,008 1,26±0,001 1,22+0,001 1,29+0,001 1,16+0,001

*- Параметры приведены в микронах

Одновременно была дана сравнительная характеристика ядер сперматозоидов этих видов животных. Результаты исследований приведены в таблице 14.

Таблица 14

Характеристика ядер сперматозоидов разных видов животных

Вид животных Площадь Средняя яркость Средняя плотность Кол-во ДНК

Кролик 91,5 70,9 184,1 16,9

Баран 116,3 65,9 189,1 22,0

Хряк 101,2 72,8 182,2 18,4

Бык 108,9 60,9 194,1 21,1

Овцебык 76,2 63,5 191,5 14,6

Сайгак 109,2 73,6 181,4 19,8

Як 107,2 67,2 187,8 20,1

Как видно из таблицы 14 наиболее интенсивная окраска ядер сперматозоидов наблюдалась у быка, овцебыка и барана, а самые крупные ядра были у барана, сайгака и быка. Ядра сперматозоидов этих животных содержали наибольшее количество ДНК. При этом отмечено, что наибольшая конденсация хроматина у всех изученных видов наблюдается в участке, прилегающем к шейке сперматозоида ядра.

График 1

Зависимость между гаплоидным числом хромосом и количеством ДНК в сперматозоидах

35 30 25 20 15 10 5 0

II Гаплоидное число хромосом^ „ ¡0 - - 30 30 -■ -

■"¿2

184 21,1 ^¡9,8 20,1

1Ь,Ь Количество ДНК -- __14,6 --- ---

Кролик Баран Хряк Бык Овцебык Сайгак Як

Сравнительный анализ ядер сперматозоидов разных видов животных показал, что количество ДНК положительно коррелирует с числом хромосом (график 1) Коэффициент корреляции между этими признаками равен 0,6.

3.5. Изучение возможности получения трансгенных свиней после многолетнего хранения семени.

Тиражирование уникальных генотипов позволяет осуществлять искусственное осеменение. Однако в свиноводстве в связи с видовой особенностью воспроизводительной функции - потребность относительно большого объема семени для осеменения одной матки - эти, несомненно, прогрессивные методы не достаточно эффективны (Эрнст и др., 1994).

Проблему получения за короткий срок максимально большего числа потомков, в том числе от высокоценных и уникальных хряков, можно решить, применяя метод хирургического внутритрубного осеменения маток. При этом обеспечивается существенное, в сотни раз, сокращение потребности в семени в сравнении с обычным естественным или искусственным осеменением. Метод внутритрубного осеменения маток безальтернативен при незначительном запасе семени.

Данная технология была использована для получения трансгенного потомства с использованием семени, хранящегося более 10 лет в жидком азоте.

Сравнительная оценка замороженно-оттаянного семени трансгенных и интактных хряков по подвижности, сохранности акросом и выживаемости не выявила существенных различий этих показателей (таблица 15).

Таблица 15

Биологические свойства семени трансгенных хряков после длительного хранения

Число Подвижность Сохранность

Группа животных животных, после акросом,

п оттаивания,% %

Контрольная, интактная 8 38 + 3,0 54,0 ± 3

Трансгенные 1991 г. 9 38 ±2,0 64,0 ± 5

Трансгенные 2002 г. 5 34 ± 3,6 56,2 ± 7

Как вскоре после замораживания, так и после 10-летнего хранения при температуре -196°С в жидком азоте, в оттаянной сперме имелось около 40% сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением и около 60% с морфологически нормальными акросомами. Следовательно, столь длительное хранение семени хряков в криоконсервированном состоянии не повлияло заметно на его качественные показатели.

Основным показателем биологической полноценности как свежевзятой, так и криоконсервированной спермы является ее оплодотворяющая способность.

Спустя десятилетие после криоконсервации семени возникла необходимость восстановления генотипов первого поколения трансгенных хряков (таблица. 16).

Таблица 16

Результаты внутритрубного осеменения свинок спермой трансгенных хряков, хранившейся более 10 лет

№ Число Опоросилось Родилось поросят

хряка маток число % всего из них

хрячков свинок в т.ч. трансгенных

5963 2 1 50+35 4 3 1 2

2975 9 3 33±16 10 6 4 3

6038 1 - - - - -

Итого 12 4 33+14 14 9 5 5

Из данных таблицы 16 видно, что, применяя метод внутритрубного осеменения свиноматок микродозами криоконсервированного семени уникальных трансгенных хряков, хранившегося в течение 10 лет, нам удалось получить потомство. Из 12 осемененных свиноматок 4 опоросились, что составило 33%. При этом 35,7% потомков оказались носителями трансгена.

Таким образом, эти результаты указывают на возможность получения неограниченного числа потомков от производителя с использованием внутритрубного осеменения свиноматок и, наоборот, получения потомства от минимальных запасов семени, когда традиционные приемы оказываются безуспешными.

Для рационального использования генетических ресурсов уникальных свиней метод внутритрубного осеменения открывает перспективы в этом направлении.

Таким образом, создавая банк семени трансгенных животных, в частности хряков, можно сохранить наследственный материал в качестве резерва генетических ресурсов с определенными заданными генами.

3.6. Новые подходы в генетической трансформации животных.

3.6.1.Использование сперматозоидов в качестве вектора для переноса чДНК.

Многообещающим методом получения трансгенных животных на сегодняшний день является осеменение самок сперматозоидами, обработанными чДНК.

Результаты опытов, приведенные в таблице 17, показывают, что добавление чДНК к семени перед замораживанием при заблокированной охлаждением активности нуклеаз, существенно не повлияло на оплодотворяемость. Это обстоятельство приводит к мысли, что чДНК, присутствующая в семени при замораживании, не связывается со сперматозоидами. Однако последующие опыты убедительно опровергли эту гипотезу.

Таблица 17

Влияние добавления чДНК к семени на оплодотворяемость

Осеменено Извлечено ооцитов и Оплодот-

Показатели маток эмбрионов воряемость,

всего эмбрионов число ооцит %

Без инкубации с чДНК (контроль) 8 108 99 9 92+3

Инкубация с чДНК (опыт) 16 230 205 25 89±2

Добавление чДНК к замораживаемому семени выявило существенное влияние этого фактора на развитие эмбрионов (график 2).

График 2

Дегенерация эмбрионов, вызванная введением чДНК

Как видно из графика 2, добавление чДНК к семени перед замораживанием и последующая инкубация при 0°С в течение 15-20 мин привели к появлению большого числа дегенерированных эмбрионов и высокой эмбриональной смертности. Поскольку такого явления не было в контрольной группе, эмбриональную смертность в данном случае однозначно можно объяснить действием экстрагенетической информации, заключенной в генной конструкции рСМУ1ае2.

При обработке сперматозоидов рекомбинантными ДНК в ряде случаев у доимплантационных эмбрионов кролика были выявлены характерные морфологические признаки апоптоза.

Причиной индукции апоптоза в ранних эмбрионах может быть деградация как экзогенной, так и собственной ДНК в сперматозоидах. Данное

предположение основано на представлении о роли белка р53 в остановке и переключении клеточного цикла для репарации или дальнейшего развития клетки по пути апоптоза при появлении разрывов в хромосомной ДНК (Nelson, 1994).

Включение механизмов апоптоза у ранних эмбрионов в ответ на проникновение со сперматозоидом фрагментированной ДНК представляется вполне вероятным. Возможно, это является одним из способов защиты развивающегося организма от чужеродной генетической информации.

В экспериментах по переносу pCMVlacZ в ооциты кролика с помощью сперматозоидов выявлены задержки развития, дегенерация и гибель доимплантационных эмбрионов (график 3).

График 3

Влияние чДНК на развитие эмбрионов

число бластомеров

Стадия развития эмбрионов, вымытых через 44-46 ч после осеменения, должна соответствовать 8-16 бластомерам. Было отмечено, что в контрольной группе 86,9% эмбрионов находились на 16-клеточной стадии и 13,1% - на стадии 8 бластомеров. Это свидетельствует о нормальном развитии эмбрионов. В экспериментальной группе на стадии 16 бластомеров находилось только 50,7% эмбрионов, в то время как на стадии 8 бластомеров - 24,9%, 4 бластомеров -15,1%, и 1-2 бластомеров - 9,3% эмбрионов.

Как видно из представленных данных, инкубация с семенем генной конструкции перед замораживанием влияет на развитие полученных зародышей, что сопровождается явной задержкой развития эмбрионов экспериментальной группы (с рСММас2) в сравнении с контролем.

Прямыми тестами была выяснена возможность переноса сперматозоидами чужеродной генетической информации в ооциты с последующей ее экспрессией. Для этого в эмбрионах, полученных от

оплодотворения как нативными сперматозоидами, так и обработанными генной конструкцией рСМУ1ас2, была определена активность р-галактозидазы -продукта экспрессии этого гена.

Таблица 18

Частота проявления экспрессии гена pCMVlacZ в эмбрионах

Показатели Всего исследовано эмбрионов Из них с положительной реакцией на галактозидазу

О % п %

Без инкубации с чДНК (контроль) 113 100 0 0

Инкубация с чДНК (опыт) 252 100 29 12+2"'

Данные таблицы 17 показывают, что 10-12% эмбрионов, полученных от семени, обработанного чДНК, имели положительную реакцию на р-галактозидазу.

Результаты проведенных экспериментов показали, что в процессе криоконсервации семени генетическая конструкция рСМУ1ас2 была связана со сперматозоидами и перенесена в яйцеклетки в процессе оплодотворения с последующей экспрессией.

Количество эмбрионов с положительной реакцией на р-галактозидазу было значительно меньше, чем число дегенерированных эмбрионов. Этот факт позволяет предположить, что для гибели эмбриона в ряде случаев достаточно проникновения чДНК без наличия экспрессии.

Вместе с тем, некоторые эмбрионы, положительно прореагировавшие на присутствие продукта экспрессии, не были дегенерированы, нормально развивались, что указывает на возможность использования сперматозоидов, трансформированных в процессе замораживания, в качестве естественного вектора при получении трансгенных животных.

С другой стороны, возникает необходимость защиты сперматозоидов от чужеродной генетической информации и, соответственно, снижения эмбриональных потерь. Современная технология искусственного осеменения не позволяет получать стерильное семя, а искусственная санация его не избавляет от чДНК. Кроме того, чужеродная генетическая информация заносится в семя при его технологической обработке.

3.6.2. Введение ретровирусных конструкций в семенники животных.

Последние годы наряду с введением чужеродных генов в эмбрионы и ооциты млекопитающих особый интерес представляет трансформация половых клеток самцов, т.к. сперматозоиды сами по себе являются природными векторами, доставляющими генетический материал в яйцеклетку.

Одним из эффективных методов переноса ДНК в сперматозоиды может служить использование ретровирусных векторов.

Ретровирусные конструкции были введены в семенники кроликов, хряков, баранов и быков (таблица 19).

Таблица 19

Результаты введения ретровирусов в семенники животных

Показатели Подвижность семени до введение, % Подвижность семени после введение, % ПЦР-анализ на наличие конструкции

Кролики 80 20 +

Хряки 80 30 -

Бараны 90 50 +

Быки 90 20 +

В результате ПЦР - анализа было доказано наличие ретровирусной генной конструкции в семени кроликов, баранов и быков. Возможно, что ретровирус интегрировался в клетки - предшественники сперматозоидов, обуславливая тем самым длительное наличие ДНК генной конструкции в сперме.

Гистологические срезы семенников быка, после введение ретровирусной конструкции

Окраска гематоксилин-эозином (ув. 10x40)

Рисунок 1

А) на гистосрезе видно нормальное состояние структур семенных канальцев. Сперматогенез не нарушен.

Б) На срезе видно начало разрушения паренхимы семенника

На рисунках В и Г видно разрушение слоев сперматогенных тканей семенника в результате инъекции ретровирусной конструкции.

Данные таблицы 19 показывают, что введение ретровируса отрицательно действует на подвижность сперматозоидов. В некоторых случаях в эякуляте сперматозоиды отсутствуют. Это, возможно, связано с тем, что при многократной инъекции нарушается гематотестикулярный барьер, что в конечном итоге приводит к нарушению сперматогенеза (рис.1)

3.6.3. Оптимизация технологии временного блокирования сперматогенеза у кроликов.

Трансплантация модифицированных первичных половых клеток в семенник стерильного самца является перспективным принципиально новым подходом в биотехнологии.

Стволовые клетки сперматогонии инициируют и поддерживают сперматогенез в семенниках. Изучена возможность стерилизации самцов кроликов с целью дальнейшей трансплантации в их семенники модифицированных первичных половых клеток.

Для стерилизации самцов использовали диметилфармамид + бусулфан (Д+Б), 40 мкг/мл. Анализ гистологических срезов семенников показал начало процесса блокирования сперматогенеза через неделю после введения Д+Б. В эякуляте присутствовали мертвые сперматозоиды. Отмечена деструкция осадка эякулята.

Через три недели на гистосрезах обнаружено отсутствие сперматозоидов и сперматид и отмечался эффект разрушающего действия введенного фактора. В эякуляте сперматозоиды отсутствуют. Также наблюдалась деструкция осадка эякулята.

Спустя 7 недель структуры канальцев восстанавливалась. Юные формы сперматогенного эпителия выглядели вполне нормально, хотя отмечалось отсутствие сперматозоидов и сперматид. В эякуляте сперматозоиды отсутствовали. Отмечена деструкция осадка эякулята.

С 14-й недели начинался процесс восстановления сперматогенеза, но появление сперматозоидов в эякуляте наблюдалось только на 15-м месяце после обработки. В дальнейшем идет полное восстановление воспроизводительной функции и отмечается появление сперматозоидов в эякуляте.

3.7. Цитогенетические исследования как метод характеристики генетических ресурсов.

3.7.1. Усовершенствование методики кариотипирования различных видов животных с использованием прикладных компьютерных программ.

Цитогенетические исследования играют большую роль в решении ряда теоретических и прикладных вопросов. В том числе комплекс мероприятий, связанных с сохранением генетических ресурсов, включает в себя цитогенетическую аттестацию самцов, используемых для криобанка семени.

Однако применение цитогенетики в практике животноводства в России еще не вышло за рамки лабораторий научных и учебных центров. Основная причина этого - низкая технологичность используемых в нашей стране методов изучения хромосом. Кроме того, отсутствует программное обеспечение для анализа кариотипов сельскохозяйственных животных.

Анализ препаратов хромосом является наиболее трудоемким процессом. В связи с этим был разработан ряд подходов, позволяющих упростить классический процесс кариотипирования. За основу были взяты система Image Scope 1 и Adobe Photoshop. Принципиальная схема кариотипирования показана на рисунке 2.

Рис. 2 Схема кариотипирования с применением пакетов прикладных программ Image Scope 1 и Photoshop

Система Image Scope 1 обеспечивает получение, передачу изображения на компьютер с последующей его записью и обработкой (подсчет и измерение хромосом).

Однако Image Scope 1 не позволяет напрямую проводить кариотипирование. Эта проблема решается с помощью Photoshop. Кариотипирование ведется в двухоконном режиме («Окна - Без перекрытия»). В одном из окон открыт исходный файл, во втором - рабочий, в котором создается кариотип.

При массовом исследовании подсчет хромосом проводится визуально. Используя Image Scope 1, подсчет можно проводить на дисплее или в автоматическом режиме. Процесс кариотипирования, в случае необходимости, корректируется по морфометрическим показателям через рабочий файл и Image Scope 1.

3.7.2. Изучение и сравнительный анализ кариотипов яка, крупного рогатого скота, овцебыка и овец.

Изучены хромосомные наборы яка, крупного рогатого скота, овцебыка и овец. Проведенные исследования четырех видов полорогих показали наличие существенных хромосомных различий.

Кариотип яка (Bos mutus) по числу и морфологии хромосом идентичен кариотипу крупного рогатого скота. Содержит 29 пар акроцентрических аутосом, образующих по своей величине плавно убывающий ряд, крупную субметацентрическую Х-хромосому и Y-хромосому - мелкая хромосома субметацентрической формы, диплоидное число равно 60 (рис. 3).

DIM ЛШМАД

у и он оо и н

7 12

flfi fifi 00 Об 00 Г. А

13 18

йь 00 Äf: ЪЛ ЛЛ

19 24

Oft Art ал л л ал Г»

25 29 XY

Рис. 3. Кариотип яка. Бык из кабардинской популяции. Окраска по Романовскому-Гимза. Предобработка 5-бром-дезоксиуридином и бромистым этидием.

Кариотип крупного рогатого скота содержит 29 пар акроцентрических аутосом. Полагают, что он наиболее близок к предковой форме. Мужская и женская половые хромосомы метацентрические (рис. 4).

И ?<(! •4 1'. л л У Й У //Ц

(18 7 р ¡1 йй № Йй 12

Гн] и А1' !• г/ jl.il Л А 18

й« Лй * я на н а в л Л

1» л

АП Л,'. «.« к 1 X. \

Рис. 4. Кариотип крупного рогатого скота. Бык. Предобработка 5-бром-дезоксиуридином и бромистым этидием. Окраска по Романовскому-Гимза.

Овцебык (Оу1Ъо8 шо8сИа1ш) является единственным представителем трибы Оу&оуШ. По хромосомному набору он существенно отличается от этих видов. Диплоидное число хромосом у овцебыка равно 48. Из них 6 пар аутосом метацентрические, а 17 - акроцентрики. Акроцентрики по величине образуют плавно убывающий ряд. Женская половая хромосома субтелоцентрическая, У-хромосома- метацентрик (рис. 5).

Ыш м

И /ш ло ос ад

Ой Л л ал см ли

12 16

АЛ АП Ой А Г) ЯЛ

17 Л 21

<1Ь л/> и»

Рис.5. Кариотип самца овцебыка из таймырской популяции. Предобработка 5-бром-дезоксиуридином и бромистым этидием. Окраска по Романовскому-Гимза.

Кариотип овцы содержит 27 пар хромосом. 3 пары аутосом метацентрические, 23 пары акроцентрики. Y-хромосома - метацентрик, X-хромосома - крупный акроцентрик. По характеру дифференциальной изчерченности кариотип овцы сходен с хромосомным набором крупного рогатого скота. Это связано с тем, что кариотипы полорогих произошли от общей предковой формы (рис. 6).

Рис. 6. Кариотип домашней овцы. Самец. Предобработка 5-бром-дезоксиуридином и бромистым этидием. Окраска по Романовскому-Гимза.

Анализ дифференциальной структуры хромосом овцы свидетельствует, что хромосома 1-й пары у О. aгies L. соответствует 1 и 3;2-2и8;3-5и11 парам хромосом В. tauгus L. и С. Ыгсге L. (Яковлев А.Ф., 1989).

Как отмечает Л.С. Билтуева (1995), овцебык имеет типичный для козьих рисунок 9-й, 14-й и X - хромосом. На основании анализа дифференциальной окраски хромосом полагают, что формирование метацентриков у овцебыка произошло в результате центрических слияний базовых хромосом, соответствующих 1 и 18; 2 и 22; 5 и 27; 11 и 23; 25 и 29; 24 и 28 хромосомам крупного рогатого скота.

Считают, что эволюция кариотипов в семействе полорогих шла путем центрических слияний. Проведенные нами сравнение генных карт этих видов по 484 общим генам выявило 54 группы сцепления, что соответствует 26 перестройкам. Разумеется, требуется дальнейшее уточнение этого вопроса. Однако ясно, что кариологические различия между В. tauгus L. и О. aгies L. не могут быть сведены лишь к наличию трех робертсоновских транслокаций.

Очевидно, это справедливо и для других видов, входящих в семейство полорогих. Из-за отсутствия генных карт у яка и овцебыка сравнительный анализ их хромосомных наборов проведен только по морфологии и числу хромосом.

3.7.3. Анализ хромосомных аберраций у трансгенных животных.

На современном этапе развитии биотехнология, позволяющая целенаправленно нарабатывать ДНК как носителя генетической информации, открывает новые перспективы в животноводстве.

В последние годы в нашей стране проводятся работы по получению трансгенных животных с целью направленного изменения их продуктивных качеств и создания животных-продуцентов биологически активных веществ. Известно, что микроинъекции чужеродной ДНК обуславливают дестабилизацию генома потомства (в ряде случаев трансгенез сопровождается хромосомными перестройками). Это свидетельствует о необходимости изучения цитогенетических нарушений у трансгенных животных.

3.7.3.1. Изучение влияния чДПК на стабильность кариотипа трансгенных кроликов.

Хромосомный набор у всех 55 опытных животных соответствовал видовой норме и содержал 44 хромосомы. Однако у значительной части из них был обнаружен повышенный уровень клеток с хромосомными аберрациями (рис. 7).

'•.И?

Й,

Рис. 7. Аберрации хромосом у кроликов, трансгенных по МСР а - хроматидные разрывы; б - изохроматидный разрыв; в - дицентрик.

Хромосомные аномалии у этих животных представлены, главным образом, хроматидными и изохроматидными пробелами и разрывами. Доля ди-центриков составила около 3% от числа аберраций. Около 37% пораженных клеток несли множественные аберрации, у 27,5% были выявлены изохромитидные аберрации. Примерно 11% клеток одновременно содержали и множественные перестройки и изохроматидные аберрации.

Отмечена определенная закономерность в распределении аберраций по хромосомам набора. В 45,3% случаев были поражены хромосомы 1 пары. Аномалии затрагивали как короткое,

БИБЛИОТЕКА С.Пеггрбург I

< О» ?00 акт ' ................ +

располагались преимущественно в зонах, соответствующих светлым бендам, выявляемым при инкубации с 5 бром 2 дезокиуридином (5'ВпШ) и бромистым этидием, в прителомерных и прицентромерных районах обоих плеч 1-й хромосомы. Это показывает наличие связи хромосомной нестабильности с особенностями нуклеотидного состава определенных участков ДНК.

3.7.3.2. Изучение влияния чДНК на стабильность кариотипа трансгенных свиней.

Исследовали свиней второго поколения, трансгенных по гену соматолиберина, полученных методом внутритрубного осеменения глубокозамороженным семенем, хранившимся 10 лет. Проведено двукратное взятие материала от 6 хрячков Р2 и 5 контрольных аналогов. Анализ показал наличие нестабильности хромосомного набора у трансгенных животных (рис. 8,9).

(с^Инн»'

1! »»!••.. Г

Рис. 8. Структурные хромосомные нарушения у трансгенного хряка №0438.

И»; ИНН

I I > 9

В К Й

и и ^ ** м

» 12

•Ни и »!„,„

" к

Рис. 9. Структурные количественные нарушения хромосом у трансгенного хряка.

На рисунке 8 показан кариотип трансгенного хряка с множественными хромосомными аберрациями: а - дицентрическая хромосома, возникшая при слиянии хромосом 2-й и 9-й пар; б - ацентрический фрагмент; в -изохроматидный разрыв в длинном плече хромосомы 7; г - аберрантная хромосома неясной природы.

На рисунке 9 приведен кариотип трансгенного хряка с моносомией по хромосоме 2-й пары - а и дополнительная хромосома неясной природы. - б.

При первом взятии доля клеток с аберрациями в среднем составила более 40%. Спустя три месяца частота аберрантных клеток уменьшилась, но оставалась выше, чем в контроле: 14,5 и 7,5%, соответственно. Известно, что для молодняка характерен более высокий уровень хромосомной изменчивости. У сибсов доля аберрантных клеток на момент второго взятия была близка к уровню этого показателя в контроле, хотя на начало исследования она почти в 3 раза превосходила контрольный уровень. Аналогично изменялось и число аберраций на клетку.

Результаты этих исследований свидетельствуют о дестабилизирующем действии экзогенов на ДНК хозяина. Таким образом, необходимым условием сохранения и рационального использования трансгенных животных является оценка полноценности генома, в том числе на хромосомном уровне.

выводы

1. Усовершенствованная технология криоконсервации семени кроликов позволяет повысить сохранность, оплодотворяющую способность сперматозоидов и многоплодие. Разработана криопротективная среда следующего состава: лактоза-2,17 г, лимонная кислота-1,52 г, Трис-2,74 г, глицерин-2,0 мл, ДМСО-2,5 мл, желток куриного яйца-15 мл, вода бидистиллированная-100 мл.

2. Создан банк семени гомозиготных и гемизиготных трансгенных кроликов по МСР и БЬУ. Дана оценка криоконсервированного семени после оттаивания: подвижность сперматозоидов составляла 25-30%, при этом сохранность акросом была 60-65%. Получено жизнеспособное потомство от замороженного семени трансгенных кроликов из криобанка.

3. Установлено, что сперматозоиды трансгенных хряков, хранившиеся 10 лет в жидком азоте, не потеряли своей биологической полноценности и сохранили оплодотворяющую способность. Из 12 внутритрубно осемененных свиноматок опоросилось 4, что составило 33%. При этом наследование трансгена было 35,7%.

4. Создан банк семени трансгенных баранов. Изучена биологическая полноценность сперматозоидов. Установлено, что после криоконсервации и оттаивания активность сперматозоидов у трансгенных баранов составляла 45%, а сохранность акросом - 68%.

5. Создан банк семени трансгенных хряков 6 поколений

Дана оценка биологической полноценности их сперматозоидов. После процесса замораживания-оттаивания активность составляла 35-45%, сохранность акросом была 52-65%.

6. Односторонняя кастрация самцов не приводит к снижению репродуктивной функции и может быть использована в качестве приема рационального использования и сохранения генетических ресурсов.

7. На основе разработанной технологии получения и криоконсервации эпидидимального семени с целью сохранения и рационального использования генетических ресурсов создан банк семени редких, уникальных и исчезающих видов животных.

8. Подвижность замороженно-оттаянных эпидидимальных сперматозоидов кролика составляла 30%, при этом сохранность акросом была 68%. Получено потомство от замороженно-оттаянной эпидидимальной семени кроликов.

9. Проведен сравнительный анализ морфометрических показателей сперматозоидов разных видов животных. Обнаружены достоверные различия по общей длине, ширине, длине и площади головки сперматозоидов. Впервые дана характеристика видовых особенности сперматозоидов сайгака, овцебыка и яка.

10. В результате изучения кариотипов и цитохимического анализа выявлены видовые особенности, а также установлена положительная связь между числом хромосом и содержанием ДНК в сперматозоидах у разных видов животных.

11. При криоконсервации семени кроликов добавленная чДНК способна связываться со сперматозоидами и проникать в ооциты при оплодотворении с последующей ее экспрессией.

12. Связанная со сперматозоидами чДНК не влияет отрицательно на их оплодотворяющую способность. Перенесенная со сперматозоидами в ооциты чДНК задерживает развитие зародышей, вызывает дефрагментацию эмбрионов и раннюю эмбриональную смертность.

13. В результате ПЦР-анализа установлено наличие ретровирусной генной конструкции в семени кроликов, баранов и быков. Введение ретровирусной конструкции отрицательно действует на подвижность сперматозоидов, которая снижается до 20% при исходной подвижности 80-90%.

14. Анализ гистологических срезов семенников кроликов показал, что процесс блокирования сперматогенеза начался через неделю после введения диметилфармамид+бусулфана. С 14 недели начинается процесс восстановления сперматогенеза. Появление сперматозоидов в эякуляте наблюдается на 15 месяце после обработки.

15. Разработанный метод использования прикладных компьютерных программ позволяет в значительной мере повысить эффективность цитогенетического анализа.

16. Установлено, что интеграция чужеродных генов у кролика и свиньи сопровождается значительным повышением уровня хромосомных нарушений.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. С целью повышения эффективности и расширения возможностей селекционно-племенной работы в кролиководстве предлагается технология криоконсервации семени кроликов, позволяющая получать высокую результативность осеменения.

2. Для сохранения и рационального использования свиней с уникальными генотипами предлагается метод внутритрубного осеменения свиноматок.

3. Рекомендуется технология получения и криоконсервации эпидидимального семени животных в целях сохранения генетических ресурсов редких, уникальных и исчезающих видов животных.

4. В целях сохранения и рационального использования редких, уникальных и исчезающих видов животных рекомендуется использовать метод односторонней кастрации животных.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Баш ров ВА. Новый метод криоконсервации семени кроликов // Зоотехния. 1996. №6. С. 28-29.

2. Кононов В.П., Багиров ВА О некоторых причинах эмбриональной смертности у животных // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук 1996. № 6. С.37-38.

3. Эрнст Л.К., Кононов В.П., Багиров ВА, Зыкунов Н.П., Некрасов А.А., Шатайло В.Н., Чабан И.М. Трансгенных поросята от спермы, хранившейся в течении десяти лет // Свиноводство. 2002. № 3. С.23-24.

4. Кленовицкий П.М., Багиров ВА, Иолчиев Б.С. Доцев А.В. Вопросы прикладной цитогенетики сельскохозяйственных животных // Достижения науки и техники АПК. 2003. № 10. С. 17-19.

5. Багиров В.А. Технология криоконсервации семени кролика // Достижения науки и техники АПК. 2004. № 9. С.35-37.

6. Кленовицкий П.М., Багиров ВА Сохранение биоразнообразия и характеристика спермиев разных видов животных // Аграрная наука. 2004. №10.С.26-28.

7. Кленовицкий П.М., Марзанов Н.С., Багиров ВА, Марзанов Ю.С., Абдул Ахад Бисвас А.К.М. Сравнение генных карт и анализ дивергенции кариотипов некоторых полорогих // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2004. №3. С.72-75.

8. Багиров ВА, Эрнст Л.К., Кленовицкий П.М., Зиновьева Н.А. Сохранение генетических ресурсов редких, исчезающих и уникальных видов животных // Цитология 2004. Том. 46. №9. С.767-768.

9. Кленовицкий П.М., Багиров ВА, Марзанов Н.С., Зиновьева НА Генные карты сельскохозяйственных животных. Дубровицы. 2003. 91с.

10.Кленовицкий П.М Никишов АА, Иолчиев Б.С, Багиров ВА, Марзанов Н.С. Введение в прикладную цитогенетику одомашненных животных. Дубровицы. 2003. 56с.

11.Кленовицкий П.М Абдул Ахад Бисвас А.К.М., Марзанов Ю.С., Марзанов Н.С, Багиров В.А. Сравнительный анализ генных порядков домашней овцы (Ovis aries L.) и крупного рогатого скота (Bos taurus L). Дубровицы. 2003. 48с.

12.Кленовицкий П.М., Багиров ВА, Марзанов Н.С, Насибов М.Г. Генетика и биотехнология в селекции животных. Москва. 2004.238с.

13.Кленовицкий П.М. Никишов АА, Иолчиев Б.С, Багиров В.А Хромосомы одомашненных животных и родственных им видов. Дубровицы. 2002.44с.

14.Кленовицкий П.М., Багиров ВА, Нгбодо Ж.В., Доцев А.В., Иолчиев Б.С. Использование прикладных программ обработки изображений, совместимых с Windows, в цитогенетических исследованиях. Дубровицы.. 2002.20с.

15.Зыкунов Н.П., Багиров ВА, Кононов В.П., Некрасов АА, Голышев НА Башкеев Е.Д., Шатайло В.Н., Чабан И.М., Клецко Н.Г., Эрнст Л.К. Метод внутритрубного осеменения свиней. Методические рекомендации. Быково-2003.24с.

16.Багиров ВА., Кленовицкий П.М., Эрнст Л.К. Мутационные изменения у трансгенных свиней. Материалы международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных». Дубровицы. 2003. С.80-83.

17.Bisvas A.A.A.K.M., Klenovitsky P.M., Bagirov V.A. Marzanov N.S. Syntenic maps construction of domestic sheep (Ovis aries L.). Материалы международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных». Дубровицы. 2003. С.153-155.

18.Багиров ВА, Зыкунов Н.П., Кононов В.П., Эрнст Л.К. Метод внутритрубного осеменения свиноматок. Материалы международной научно-практической конференции «Роль и значение искусственного осеменения с.х. животных XX и XXI веков». Дубровицы. 2004. С. 149-152.

19. Bagirov V.A. Exogenous DNA as the reason of embryonic mortality at animals. Материалы международной научно-практической конференции «Роль и значение искусственного осеменения сельскохозяйственных животных XX и XXI веков». Дубровицы. 2004. С.217-222.

20.Багиров ВА, Эрнст Л.К., Грезина Н.М., Кленовицкий П.М., Зиновьева Н.А. Сохранение генетических ресурсов разных видов животных и изучение особенностей ядер их сперматозоидов. Материалы международной научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки». Дубровицы. 2004. С. 129-134.

21.Багиров ВА Криоконсервация семени кролика. Школа-практикум: «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных». Дубровицы. 2002. С.7-12.

22.Кленовицкий П.М., Багиров В.А., Доцев А.В. Получение хромосомных препаратов и кариотипирование кроликов. Школа- практикум: «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных». Дубровицы. 2002. С.62-66.

23.Bagirov V.A., Kononov V.P.. The possibility of exogenous DNA penetration into spermatozoa at semen cryopreservation. Book of Abstracts of the 51th Annual Meeting ofthe EAAP. The Hagua. Netherland. 2000. P. 19.

24.Иолчиев B.C., Кленовицкий П.М., Багиров ВА., Гришин В.Н. Компьютерная обработка изображений в цитогенетике животных. Материалы международной научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства». Быково. 2002. Вып.8. С.228-229.

25.Багиров ВА. Возможность проникновения экстрагенетической информации в сперматозоиды при криоконсервации семени. И-международная конференция «Актуальные проблемы биологии в животноводстве». Боровск 1995.С.169-170.

26.Багиров В.А., Кононов В.П. Сперматозоиды как векторы для переноса чужеродного генетического материала. Современные проблемы воспроизводства стада сельскохозяйственных животных и задачи кадрового обеспечения. Быково. 1996. С.21-22.

27.Багиров В.А. Индукция суперовуляции у крольчих. Научно-практическая конференция «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». Быково. 1997. С. 111-113.

28.Багиров ВА, Новые приемы получения трансгенных животных. Научно-практическая конференция «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». Быково. 1998. Часть I. С.95-97.

29.Багиров ВА, Кононов В.П. О возможности проникновения экстрагенетической информации в сперматозоиды при криоконсервации семени. Международная научно-практическая конференция. «Актуальные проблемы биологии в животноводстве». Боровск. 1997. С.272-278.

ЗО.Эрнст Л.К., Зыкунов Н.П., Багиров В.А., Некрасов АА, Шатайло В.Н., Чабан И.М. Трансгенные поросята от семени, сохраненного в течение десяти лет. VIII-Международная научно-практическая конференция «Перспективы развития свиноводства в XXI веке». Быково. 2001. С. 151-153.

31 .Кононов В.П., Зыкунов Н.П., Багиров ВА, Ондар А.А. Экстрагенетическая информация, как возможная причина эмбриональной смертности у свиней. VnI-Международная научно-практическая конференция «Перспективы развития свиноводства в XXI веке». Быково. 2001. С.147-150.

32.3ыкунов Н.П., Некрасов АА, Багиров ВА Внутритрубное осеменение свиноматок микродозами семени хряка. Материалы юбилейной международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию РАМЖ по проблеме «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». Быково. 2004. С. 186-190.

33.Bagirov VA, Klenovitsky P.M., Zinoveva N.A. Analysis of chromosome aberrations in transgenic pigs and rabbits. Book of Abstracts of the 54b Annual Meeting of the EAAP. Rome, Italy. 2003. P. 14.

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-н, п. Дубровицы тел. 8 (27) 65-14-24, 8(27)65-14-07

Сдано в набор 22.12.2004 Заказ №37. Печ.л.2,1 Тираж 150 экз.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Багиров, Вугар Алинияз оглы

Общая характеристика работы

Глава 1 Сохранение и рациональное использование g генетических ресурсов 1.1. Обзор литературы

1.1.1. Сохранение генетических ресурсов

112 Общая характеристика овцебыков ^ (Ovibos moschatus)

1.1.3. Общая характеристика яков (Bos mutus)

1.1.4. Общая характеристика сайгаков (Saiga tatarica)

1.1.5. Сперматозоиды животных

1.1.6. Воспроизводительная функция у кроликов

1.1.7. Воспроизводительные особенности у кроликов

1.1.8. Биотехника воспроизведения кроликов 22 f0 1.1.9. Криоконсервация семени кроликов

1.2. Материалы и методы исследований

1.3. Результаты исследований и обсуждение

1 31 Усовершенствование технологии криоконсер- jg вации семени кролика

1.3.1.1. Совершенствование криопротективной среды 1.3.1.2. Оптимизация режима замораживания семени

1.3.1.3. Выбор способа замораживания семени

13 14 Усовершенствование инструментария для 44 искусственного осеменения крольчих. Усовершенствование технологии криоконсер-вации эпидидимального семени как метода

1.3.2. сохранения и рационального использования 45 генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных

Односторонняя кастрация самцов как метод

1.3.2.1. сохранения и рационального использования 47 генетических ресурсов

Создание банка семени редких, исчезающих и gQ уникальных видов животных

1.3.3.1. Банк семени трансгенных кроликов

1.3.3.2. Банк семени трансгенных баранов

1.3.3.3. Банк семени трансгенных хряков

1.3.3.4. Банк семени овцебыков

1.3.3.5. Банк семени яков

1.3.3.6. Банк семени сайгаков

Изучение морфологических и гистологических 1.3.4. особенностей гонад и видовых характеристик сперматозоидов различных видов животных

1.3.4.1. Биологические особенности гонад овцебыка 13 411 Изучение гистологических особенностей разных .органов овцебыка

1.3.4.2. Биологические особенности гонад яка

1.3.4.3. Биологические особенности гонад сайгака

13 5 Сравнительный анализ сперматозоидов различных видов животных 1.3.6. Внутритрубное осеменение свиней

13 61 Изучение возможности получения трансгенных ^ свиней после многолетнего хранения семени 1.4. Заключение

Глава 2 Новые подходы к генетической трансформации ^ животных

2.1. Обзор литературы

2.1.1. Трансгенные животные

2.1.2. Методы получения трансгенных животных

2.1.3. Ретровирусные векторы.

2.1.4. Использование половых клеток семенников

2.1.5. Связывание чужеродной ДНК сперматозоидами

2 16 Влияние отдельных факторов на процесс связывания чДНК сперматозоидами ч Возможность проникновения чДНК в ядра сперматозоидов

2.1.8. Строения ДНК сперматозоидов

2.1.9. Нуклеазы семени - как фактор защиты от чДНК

2.2. Материалы и методы исследований

2.3. Результаты исследований и обсуждение

231 Использование сперматозоидов в качестве ^

И ' естественного вектора для переноса чДНК

2 3 2 Введение ретровирусных конструкции в семенники животных

2 3 3 Оптимизация технологии временного блокирования сперматогенеза у кроликов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологические аспекты сохранения генетических ресурсов животных"

Впервые проблему сохранения генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных поднял A.C. Серебровский (1928) и ввел термин «генофонд». Автор подчеркивал, что «в лице генофонда мы имеем такое же национальное богатство, как в виде нефти, золота, угля, сокрытых в наших недрах». Рассматривая эту проблему, Ю.П. Алтухов с соавторами (1996) ввели термин «природоохранная генетика», который употребим и для популяций сельскохозяйственных животных, поскольку породы - это не что иное, как неотъемлемая часть животного мира.

Существование вида, его способность выжить в данной среде зависит от сохранности генома, которой вносит сперматозоид в ооцит при оплодотворении. Совокупность механизмов обеспечивающих защиту генома в половых клетках самцов, подвергающихся сложным трансформациям в ходе сперматогенеза, является одним из условий, обеспечивающих существование вида.

Цель и задачи исследований.

Целью диссертационной работы являлась разработка и усовершенствование технологий и методик сохранения и рационального использования генетических ресурсов различных видов животных с использованием биотехнологических методов.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

• Усовершенствовать технологию криоконсервации семени кроликов.

• Разработать технологию криоконсервации эпидидимального семени животных.

• Создать банк семени редких, исчезающих и уникальных видов животных.

• Разработать методологию рационального использования генетических ресурсов.

• Изучить возможность получения трансгенных свиней после многолетнего хранения семени.

• Усовершенствовать методику кариотипирования с использованием прикладных компьютерных программ и провести цитогенетическии анализ животных разных видов.

Научная новизна.

В ходе выполнения диссертационной работы была усовершенствована технология криоконсервации семени кроликов, позволяющая улучшить биологическую сохранность сперматозоидов, получить более высокую оплодотворяющую способность сперматозоидов и повысить многоплодие в сравнении с прототипом.

Изучены видовые особенности сперматозоидов яков, сайгаков, овцебыков, кроликов, баранов, хряков и быков. Доказано, что в процессе криоконсервации семени, сперматозоиды способны связываться с чужеродной ДНК и переносить ее в ооциты при оплодотворении. Изучено влияние чужеродной ДНК на уровень хромосомной изменчивости у трансгенных свиней и кроликов.

Практическая значимость.

Предложена усовершенствованная технология криоконсервации семени кроликов, на основе которой создан банк семени трансгенных кроликов. Разработана технология криоконсервации эпидидимального семени разных видов животных, с использованием которой создан банк семени редких, уникальных и исчезающих видов животных (овцебыков, сайгаков, яков). Создан банк семени трансгенных хряков 6-ти поколений (Р2, Р3| Р4> Р5, Р6> Р7). Доказано, что глубокозамороженное семя трансгенных хряков, хранящееся в жидком азоте более 10 лет, может быть использовано для получения потомства и возобновления трансгенной линии. Разработана методика кариотипирования на основе прикладных компьютерных программ, позволяющая повысить эффективность цитогенетического анализа животных.

Положения, выносимые на защиту.

• Биологическая полноценность семени трансгенных хряков, хранившегося более 10 лет в криобанке.

• Морфологические и гистологические особенности семенников яков, сайгаков, овцебыков.

• Влияние чужеродной ДНК на уровень хромосомных нарушений и физиологические показатели у животных.

Объем работы. Диссертация изложена на 235 страницах машинописного текста, включает 30 таблиц, 73 рисунка, 5 графиков, 3 схемы. Библиографический список содержит 375 источников, в том числе 177 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Багиров, Вугар Алинияз оглы

4. ВЫВОДЫ

2. Создан банк семени гомозиготных и гемизиготных трансгенных кроликов по МСР и В1\/. Дана оценка криоконсервированного семени после оттаивания: подвижность сперматозоидов составляла 25-30%, при этом сохранность акросом была 60-65%. Получено жизнеспособное потомство от замороженного семени трансгенных кроликов из криобанка.

5. Создан банк семени трансгенных хряков 6 поколений {Рг, Рз, Ра, Рб, Рб, Р7). Дана оценка биологической полноценности их сперматозоидов. После процесса замораживания-оттаивания активность составляла 35-45%, сохранность акросом была 5265%.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

3.4. Заключение

В ходе наших исследований решен ряд методических вопросов, связанных с проблемой получения и анализа хромосомных препаратов у различных видов животных. В настоящее время основным источником препаратов хромосом являются лимфоциты периферической крови. Данный метод основан на получении препаратов из стимулированных митогенами клеток белой крови. Он наиболее технологичен и приемлем для работы с любыми животными.

Выбор митогена зависит от вида животных: у крупного рогатого скота, других представителей семейства полорогих и кролика из известных лектинов лучшие результаты дает конканавалин А (СоА), у свиней фитогемагглютинин (ФГА).

Для изучения тонкой морфологии хромосом разработан метод, основанный на эффекте неравномерной конденсации хромосом под действием соединений, модифицирующих ДНК. С этой целью предложено за несколько часов до окончания культивирования воздействовать на хромосомы 5-бромдезоксиуридином и бромистым этидием.

Анализ препаратов хромосом является наиболее трудоемким процессом. Основная причина этого низкая технологичность используемых в практике методов изучения хромосом, и в первую очередь кариотипирования.

Решение этой проблемы было значительно облегчено с использованием стандартных программ обработки видеоизображений. Нами предложено использовать для анализа хромосом систему Image Scope 1, разработанную фирмой Системы для микроскопии и анализа и Adobe Photoshop. Сочетание этих двух программ позволяет осуществлять подсчет и измерение хромосом, анализировать их оптические плотности, а также проводить кариотипирование животных.

Необходимым условием сохранения и рационального использования биоразнообразия является оценка полноценности генома, в том числе на хромосомном уровне. Кариотипы диких животных, использованных нами с целью сохранения генетических ресурсов, соответствовали видовой норме, хромосомных нарушений не обнаружено.

Одним из путей повышения эффективности использования природных ресурсов является гибридизация. Для ее успешного осуществления необходим сравнительный анализ хромосомных наборов у исходных видов.

На основании морфологических особенностей хромосом и их рисунка в цитогенетике получило широкое распространение мнение, что эволюция кариотипов в семействе полорогих шла путем центрических слияний (Орлов и Булатова, 1983). Проведенный Марзановым и Кпеновицким (1998) анализ хромосомной локализации 147 общих для крупного рогатого скота и овец структурных генов и сателлитов на хромосомах показал, что у этих видов существует 36 общих групп сцепления. Это соответствует 10 межхромосомным перестройкам, приведшим к перегруппировке генетического материала в ходе эволюционного расхождения данных видов.

Проведенное нами изучение и анализ генных карт этих видов по 484 общим генам выявили 54 группы сцепления, что соответствует 26 перестройкам. Разумеется, требуется дальнейшее уточнение этого вопроса. Однако ясно, что кариологические различия между В. 1аигиБ 1. и О. анеэ 1. не могут быть объяснены наличием трех робертсоновских транслокаций.

Из-за отсутствия генных карт у яка и овцебыка сравнительный анализ их хромосомных наборов проведен только по морфологии и числу хромосом.

Исследования по цитогенетике трансгенных животных связано с анализом влияния различных экзогенных конструкций на состояние хромосомного аппарата.

При изучении свиней, трансгенных по гену соматолиберина, обнаружено наличие нестабильности хромосомного набора. В исследованиях, проводимых на трансгенных животных, был выявлен факт повышения хромосомной нестабильности и у кроликов, трансгенных по гену МСР. Очевидно, что хромосомные аберрации у трансгенных животных являются результатам присутствия в их геноме чужеродного генетического материала.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Багиров, Вугар Алинияз оглы, п. Дубровицы, Московской обл.

1. Абилов А.И. Разработка методов оценки и регуляции иммунного состояния организма в связи с совершенствованием технологии искусственного осеменения в скотоводстве. Автореф. дис. д.б.н /ВИЖ.- Дубровицы, Моск. обл., 1996. -41с.

2. Абилов А.И. Связь аутоиммунных явлений, состава протектора и способов осеменения эффективностью воспроизводства: Автореф.дис. к.б.н/ВИЖ.-Дубровицы, Моск. обл., 1984. -22 с.

3. Абилов А.И. Эрнст Л.К., Стрекозов Н.И. Получение гибридов путем осеменения домашних коров эпидидимальным семенем диких зубров. // Метод, рекомендации. -ВИЖ, Дубровицы, 1994.-26 с.

4. Алексеевич Л.А., Барабанова Л.В., Суллер И.Л. Генетика одомашненных животных. С.-П. - Ломоносов. - 2000.

5. Алтухов Ю.П., Корочкин Л.И., Рычков Ю.Г. Наследственное биохимическое разнообразие в процессах эволюции и индивидуального развития // Генетика. 1996. 1996, № 11, С.1450-1473.

6. Аниськин В.М., Исаев С.И., Щипанов H.A. Сравнительная цитогенетика трех видов южноамериканских полевых хомячков рода Akodon (Rodenita, Cricetidae) // Генетика.-1996.-T.32.-N 1. С.83-93.

7. Багиров В.А. Возможность проникновения экстрагенетической информации в сперматозоиды при криоконсервации семени // Вторая международная конференция "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" Боровск-1995, С. 169-170.

8. Багиров В.А., Кононов В.П. Сперматозоиды как векторы для переноса чужеродного генетического материала // "Современные проблемы воспроизводства стада с.-х. животных и задачи кадрового обеспечения". Быково. 17-21 июня 1996 г. С. 21-22.

9. Бакай A.B., Перчихин Ю.А., Семенов A.C. Кариотипические исследования сельскохозяйственных животных. Методические указания. М., МВА. - 1986.

10. Белоус A.M. Грищенко В.Н., Паращук Ю.С. Криоконсервация репродуктивных клеток. Киев :Наукова думка, 1986. 205 с.

11. Белоус A.M., Бондаренко В.А. Криоповреждения мембран, структурно-функциональные нарушения митохондрий и лизосом // Актуальные проблемы криобиологии. Киев: наук, думка, 1981. -С.41 -100.

12. Белоус A.M., Бондаренко В.А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении.- Киев: Наукова думка. -1982.-256с.

13. Билтуева Л.С. Консервативные районы хромосом парнокопытных. Автореферат диссертации кандидата наук. Новосибирск 1995. 15с.

14. Близнюк А.И., Букреева О.М. Плодовитость и отел сайгака, Saiga tatarica, калмыцкой популяции на современном этапе. Зоологический журнал., 2000; Т.79, N 9, С. 1124-1132.

15. Босток К, Самнер Э. Хромосома эукариотической клетки.-М.: Мир.-1981.

16. Брем Г., Зиновьева H.A., Эрнст Л.К. Генные фермы новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными //Сельскохозяйственная биотехнология. - 1993. - №6. - С. 3-27.

17. Брем Г., Крейслих X., Штанцзинглер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве. М. - 1995.

18. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве. Пер. с нем. М.: Россельхозакадемия, 1995. -326 с.

19. Буйная П.А., Мусиенко Ю.Н. Мясная продуктивность гибридного скота в Аскании-Нова. Гибридизация в скотоводстве. Научно-технический бюллетень. Херсон, 1981 вып. 1, с 11-14.

20. Варнавский А.Н., Варнавская В.А. Разработка протектора для глубокого замораживания семени барана// Животноводство. -1978. -N9. С.65-67.

21. Введение в прикладную цитогенетику одомашненных животных. / Кленовицкий П.М., Никишов A.A., Иолчиев Б.С., Багиров В.А., Марзанов Н.С. // Дубровицы 2003, 56 с.

22. Вердиев З.К., Ерин И.А. Яководство это мясо и молоко. // Молочное и мясное скотоводство, 1981, № 2, ч 16-17.

23. Верещагина Н.К., Забродин В.А. и др. Овцебык в тундре России. Эксперимент XX века по восстановлению исчезнувшего вида. Санкт-Петербург 2003г.

24. Гайдышева В.Д. Гибриды яков Горного Алтая. Животноводства. 1981, № 12, с.46-48.

25. Генетика и биотехнология в селекции животных./ Кленовицкий П.М., Багиров В.А., Марзанов Н.С., Насибов М.Г.// Москва. 2004. 238с.

26. Генетическая экспертиза племенной продукции (материала) в Российской Федерации, утвержденной в 1998г. МСХ и продовольствия РФ (приказ № 291).

27. Генетические ресурсы в России и сопредельных странах.- С.-Пб.: ФАО/ЮНЕП и РАСХН.-1994.

28. Генные карты сельскохозяйственных животных. / Кленовицкий П.М., Багиров В.А., Марзанов Н.С., Зиновьева H.A. //-Дубровицы, ВИЖ. -2003. 9с.

29. Гилберт С. Биология развития. М.: Мир. 1993. В 3-х томах. Т. 1.228 с.

30. Глебов O.K. Генетическая трансформация соматических клеток.-Л.: Наука.- 1989.

31. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология: принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 589 с.

32. Говалло В.И. Иммунология репродукции. М. Медицина 1987.

33. Гоголевский П.А. Использование сперматид в процедуре ЭКО/ИКСИ. //журнал Проблемы репродукции, 1998, №6.

34. Графодатский A.C., Битуева Л.С. 1987. Гомология G -окрашенных хромосом млекопитающих // Генетика. Т.23. № 1. С.95-104.

35. Графодатский A.C., Раджабли С.И. Особенности эволюции хромосомных наборов ряда видов сельскохозяйственных млекопитающих / Сельскохозяйственная биология. 1981.-Т.16.-С.435-445.

36. Графодатский A.C., Раджабли С.И. Хромосомы сельскохозяйственных и лабораторных млекопитающих. -Атлас. Новосибирск.: Наука. 1988.-127 с.

37. Давыдова А.И. Гематотестикулярный барьер в норме и при экспериментальных воздействиях. Автореферат дис. канд. медицинских наук. М., ММСИ 1973.

38. Данилкин А. Сайгак: стратегия сохранения популяций. Охота и охотничье хозяйство, 2003; N 9, С. 14-16

39. Данилов М.А., Бояхчян Г.А., Костацдян Г.М., Манвелян С.С. Микроэлементы и воспроизводительная функция у коров // Ветеринария. 1977. - №2. -С.66-68.

40. Данилова Л. В., Габер Е. С. Идентификация атипичных сперматозоидов у тутового шелкопряда.— Изв. АН СССР. Сер. биол., 1981, № 5, с, 751—765.

41. Данилова Л.В., Бурнашева С.А., Габаева Н.С., Князева Е.Ф., Костомарова A.A., Райцина С.С. Современные проблемы сперматогенеза М. 1982.

42. Дарий Г.Е. Действие неэлектролитов и электролитов на физиологическую полноценность семени быков при замораживании: Автореф.дис. к.б.н / ВИЖ,-Дубровицы,Моск.обл.,1977.- 23с.

43. Денисов В.Ф. Домашние яки и их гибриды. М. Сельхозгиз, 1958. 116с.

44. Джапаридзе С.Т., Кленовицкий П.М., Кобидзе И.Г. Анализ последствий радиационного воздействия на хромосомный аппарат свиней// Бюлл. научных работ ВИЖ. 1994. - В. 109. -С.84-88.

45. Дзуев Р.И. Хромосомные наборы млекопитающих Кавказа. Нальчик: Эльбрус.-1998. 256с.

46. Дыбан А.П., Баранов B.C. Цитогенетика развития млекопитающих. М.: Наука.-1981.

47. Евченко JIB. Санитарная оценка спермы быков и усовершенствование методов микробиологического контроля. Автореферат дис. к.б.н. Воронеж. 1987.

48. Ендолов В.В., Арцимович Н.Г. Специфические торможение прилипания макрофагов у морских свинок с посттравматическим асперматогенезом. Бюл. эксперим. Биологии и медицины, 1977, №3, с 324-326.

49. Енин В.П., Сеглиньш А.К. Влияние различной обработки разбавителя и Сахаров на живчиков при замораживании //Животноводство.-1972.- N9.- С.80-81.

50. Ерохин A.C. Регуляция овуляции и соотношение полов потомства у млекопитающих: Автореф.дис. к.б.н/ВИЖ. -Дубровицы, 1982. -22с.

51. Ерохин A.C. Физиологические аспекты криорезистентности спермы баранов и быков: Автореф.дис. д.б.н/ВИЖ. -Дубровицы, Моск.обл.,1984.-39с.

52. Забродин В.А., Якушкин Г.Д. Овцебыки Генетические ресурсы сельскохозяйственных животных в России и сопредельных странах. Санкт-Петербург 1994 г с.343-351

53. Завада А. Н. Хромосомный анализ и возможность его использования в селекционной работе. // Современные аспекты селекции, биотехнологии, информатизации в племенном животноводстве / Юб. сб. ВНИИплем. 1997. - С. 279-30.1

54. Закона «О племенном животноводстве».

55. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П., Барановская Л.И.

56. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П., Барановская Л.И. Хромосомы человека. Атлас. М.: Медицина. -1982.

57. Захаров И.А, Никифоров B.C., Степанюк Е.В. 1996. Гомология и эволюция генных порядков: простой метод проверки гипотез о характере этой эволюции // Генетика.Т.32 № 1.- С. 128-132.

58. Захаров И.А, Никифоров B.C., Степанюк Е.В. Гомология и эволюция генных порядков: комбинаторная мера сходства групп синтении и моделирование эволюционного процесса //Генетика.-1992-T.28.-N7-C.77-81

59. Захаров И.А, Никифоров B.C., Степанюк Е.В. Гомология и эволюция генных порядков: простой метод проверки гипотез о характере этой эволюции // Генетика.- 1996- Т.32.- N 1.- С. 128132.

60. Захаров И.А, Никифоров B.C., Степанюк Е.В. Измерение сходства порядков гомологичных генов // Генетика.- 1991.-Т.27.- N2.- С.367-369.

61. Захаров И.А. Генетические карты сельскохозяйственных животных. Информационно-справочные материалы .- М.-1993, 62 с.

62. Зиновьева H.A. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных. / Зиновьева H.A., Гладырь Е.А., Эрнст Л.К., Брем Г. //-Дубровицы: ВИЖ. -2002.

63. Зиновьева H.A., Безенфельдер У. Получение яйцеклеток и пересадка микроинъецированных зигот у кроликов. / Онтогенез. 1996. Т.27.№3. с 214-217.

64. Зиновьева H.A., Попов А.Н., Эрнст Л.К. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. Дубровицы: ВИЖ, 1998. -47 с.

65. Зиновьева H.A., Эрнст Л.К., Брем Г. Трансгенные животные и возможность их использования. Молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве. ВИЖ.- 2001

66. Зиновьева H.A., Эрнст Л.К., Проблемы биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных. Москва.- 2004. 315с.

67. Зыкунов Н.П., Багиров В.А., Кононов В.П. и др. Методические рекомендации по внутритрубному осеменению свиноматок. М. 2003

68. Иванов И.И. К вопросу о наиболее подходящем времени для искусственного оплодотворения. Избранные труды. М: Колос, 1970 с. 153-163.

69. Илюшина И.А., Коновалов М.А., Кленовицкий П.М. Распространение робертсоновской транслокации 1/29 в стадах крупного рогатого скота // Тез. докл. 4 Всес. конф. по эколог, генетике растений, животных и человека Кишинев, 1991, С.265.

70. Иолчиев Б.С. Структура белков молока овец, трансгенных по гену asi -казеин/химозин 2-ая Международная научная конференция «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 19-20 ноября 2002 г.

71. Использование прикладных программ обработки изображений, совместимых с Windows, в цитогенетических исследованиях. /Кленовицкий П.М., Багиров В.А., Нгбодо Ж.В., Доцев A.B., Иолчиев B.C. // Дубровицы, ВИЖ. - 2002. 35с.

72. Кленовицкий П. М., Моисейкина Л. Т., Марзанов Н. С. Цитогенетика сельскохозяйственных животных. Элиста. -1999.

73. Кленовицкий П.М. Ядрышкообразующие районы у трансгенных свиней (mT-1/hGRF) /Кленовицкий П.М., Завада А.Н., Живалев И.К., Некрасов A.A. // Генноинженерные с.-х. животные. Сб. науч. трудов. В.1. 1995.-М. -С.64-68.

74. Кленовицкий П.М., Информационная мера расстояния порядков гомологичных генов // Тезисы докладов научно-практической конференции "Повышение конкурентоспособности животноводства". Быково. 1997 С.54-55.

75. Кленовицкий П.М., Марзанов Н.С., Моисейкина Л.Г., Иолчиев Б.С. Гомеология генных порядков и картирование хромосом // Научные труды ученых и специалистов Республики Калмыкия. Сборник научных Трудов. Т.7. Элиста. 1999. С.200-202.

76. Кленовицкий П.М., Миталлипова М.М., Цветкова Т.Г. Анализ дифференциальной структуры хромосом у кролика, трансгенного по гену mMT1/bGHatt // Бюлл. научных работ ВИЖ. -1994. В. 109. -С.80-83.

77. Кленовицкий П.М., Моисейкина Л.Г., Живалев И.К. Лабораторный практикум по цитогенетике животных. -Элиста. 1997. -48 с.

78. Кленовицкий П.М., Моисейкина Л.Г., Марзанов Н.С. Цитогенетика сельскохозяйственных животных. Элиста: Джангар. 1999, 141 с.

79. Кленовицкий П.М., Нгбодо Ж.В., Гришин В.Н. Цитогенетика нутрии (Myocastor Coypus Molina). Дубровицы, РУЦ ЭБТЖ-2002.

80. Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Гловера Д.- М.:Мир. 1988. 538с.

81. Кононов В.П. Дезоксирибонуклеиновые кислоты и липиды живчиков в связи с хранением семени вне организма. Автореферат дис. к.б.н. Дубровицы 1969.

82. Кононов В.П. Криопротекгивное действие плазмы на сперматозоидов хряков // Доклады ВАСХНИЛ. 1984. - N6. -С.29-31.

83. Кононов В.П. Глубокое охлаждение семени хряков, новое в теории и практике // Теория и практика воспроизведения животных. М., 1984. С. 241-256.

84. Кононов В.П. Значение слабодиссоциирующих катионов при охлаждении семени // Доклады ВАСХНИЛ. 1977. - N5. -С. 25-26.

85. Кононов В.П. Тепловое расширение живчиков при замораживании //Доклады ВАСХНИЛ. 1982. - №5. - С.31-34.

86. Кононов В.П., Голышев H.A., Хачапуридзе Э.Л. Оборудование для глубокого охлаждения и оттаивания спермы // Свиноводство. 1975. No 6. С.23-25.

87. Кононов В.П., Хачапуридзе Э.Л. //- Оптимальные режимы охлаждения и оттаивания спермы хряка. Доклады ВАСХНИЛ.-1975. N 8. - С. 23-24.

88. Кононов В.П., Голышев H.A., Нарижный А.Г. Выход трансаминаз из живчиков как показатель оплодотворяющей способности // С.-х. биология //1978. Т. 13. №1.С. 104-108.

89. Кононов В.П., Мамбеталиев М.С. Оценка потенциала воспроизводительной способности быков // Зоотехния. 1994. N 7. С.27-29.

90. Корбан Н.В., Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш. Оценка замороженно-оттаянной спермы по морфофизиологическим и биохимическим показателям // Сборник научных трудов ВНИИРГЖ.1979. N 27. С.24-30.

91. Кузнецов A.B. Мозаичная экспрессия гена RSV-LTR-lacZ в предимплантационных эмбрионах кролика. / Кузнецов A.B., Собенникова Л.Л., Каурова С.А., Гусев В.В. // Материалы итоговой конференции ВНИИ ПМ, 1991, С. 29-31.

92. Кузнецов A.B., Кузнецова И.В. Попытки получения трансгенных животных с помощью подвижных векторов. -Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов. (Вып. 1). РАСХН. М. 1995. С. 173-180.

93. Кузнецов A.B., Кузнецова И.В. Связывание экзогенной ДНК ^ pRK3lacZ сперматозоидами кролика, ее перенос в ооциты иэкспрессия в доимплантационных эмбрионах. // Онтогенез. 1995. Т. 26(4). С. 300-309.

94. Кузнецов В. А., Лушекина А.Г. Калмыцкий сайгак на грани катастрофы. //Степной бюллетень 2002, №11.

95. Кузнецова И.В. Использование сперматозоидов кролика в качестве вектора для чужеродной ДНК. /Кузнецова И.В., Кузнецов A.B., Сигаева В.А., Щит И.Ю. // Биотехнология. 1993.1. Т. 11-12.С. 2-5.

96. Кузнецова И.В. Методика лабораторная обработки сперматозоидов кролика с целью передачи экзогенной генетической информации в ооцит (искусственной трансформации). МЛ 15,347-93. ГосНИИ ПМ. Оболенск. 1993щ

97. Кузнецова И.В., Лущиков С.Б, Кузнецов A.B. Изучение деконденсации хроматина в сперматозоидах кролика // Проблемы репродукции. 1995. Т. 4. С. 8-12.

98. Кузнецова И.В., Щит И.Ю., Кузнецов A.B. О ДНКазной активности спермы различных видов животных в связи с особенностями их оплодотворения. // Сельскохозяйственная биология, 1999, №2, с 77-79.

99. Лакин Б.Г. Биометрия.- М.Высшая Школа, изд.4-е,1990.-352с.

100. Лущекина А. Живая легенда калмыцкой степи. Охрана дикой природы, 2002; № 1, с. 4-11

101. Лущекина А. Международное сообщество призывает к спасению сайгака Международного совещания по охране сайгака. Степной бюллетень, 2002; № 12, С. 58-59.

102. Лянсберг Э.С. Синтетические среды для хранения семени барана: Автореф.дис. к.б.н / Виж. Дубровицы, 1970.- 18с.

103. Майр Э. Зоологический вид и эволюция.- М.: Мир.-1968.

104. МакГрегор Г., Варли Дж. Методы работы с хромосомами животных. М. "Мир". - 1986.

105. Максимов И.А. О вымерзании и холодостойкости растений // Эксперим. и теоретич. исследов. Спб.Б.и., 1913. -149с.

106. Малышенко A.M., Егоров И.К., Доминантные летали у инбредней мышей под действием этиленемина. Генетика 1967, №3, с 59-67.

107. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. 480с.

108. Марзанов Н.С., Кленовицкий П.М. 1996. Сравнительный анализ некоторых генных карт // II- международная конференция Молекулярно-генетические маркеры животных. Тезисы докладов. Киев. С. 16-17.

109. Мартыненко H.A. Вариабельность содержания РНК в зигох свиней как возможная причина эмбриональной смертности.// Vll-международный конгресс по размножению и искусственное осеменения животных. Мюнхен. 1972. Т.2 С.1131-1184.

110. Медведев С.Ю., Козикова Л.В., Босак Н.П. Получение трансгенных кроликов и свиней, несущих ген рилизнг-фактора гормона роста человека / Генноиженерные сельскохозяйственные животные. Сб. научных трудов. В.1. -М.- 1995.-С. 104-110.

111. Методы генетики соматических клеток. Под ред. Шея Дж. М. Мир: 1993. В 2-х томах. Т. 2. 629 с.

112. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение животных. М. 1962. 695с.

113. Милованов В.К. Пути интенсификации воспроизводства сельскохозяйственных животных // Животноводство. 1984. № 7. С. 19-21.

114. Милованов В.К. Связь биологии воспроизведения, селекции и искусственного осеменения сельскохозяйственных животных. /Милованов В.К., Соколовская И.И., Кононов В.П., Субботин А.Д., Бронская A.B. // Проблемы интенсификации животноводства. 1989, с. 73-81.

115. Милованов В.К., Селиванова А. Разбавители для семени сельскохозяйственных животных. // Проблемы животноводства.-1932.- N2.- С.74-86.

116. Мороз Л.Г., Корбан Н.В., Шапиев И.Ш. Оценка спермы хряков для замораживания и прогнозирования ее оплодотворяющей способности //Сельхоз.биол.-1982.-N3.394-397.

117. Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш., Шаробайко В.И. Изменения активности лактатдегидрогеназы в сперме хряков после замораживания-оттаивания // Бюллетень ВНИИРПЖ. 1974. N3.C.8-12.

118. Наук В.А. Структура и функция спермиев с.-х.животных.при криоконсервации.-Кишинев: Штиница, 1991.- 199с.

119. Новое в клонировании ДНК. Методы. Под ред. Гловера Д. М.: Мир. 1989. 368 с.

120. Орлов В.Н., Булатова Н.Ш. Сравнительная цитогенетика и кариосистематика млекопитающих.- М.: Наука.-1983. 405 с.

121. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей. Киев: Урожай, 1978.-256с.

122. Осташко Ф.И., Скоряков Б.А. Нарушение ультраструктуры спермиев при низкотемпературной консервации // Криобиология и криомедицина. 1975. -N1. - С. 110-114.

123. Паденко A.C. Адаптационная способность яков к условиям Восточного Памира. Сборник Научных трудов .Таджикский НИИЖ, 1976, с 116-174.

124. Падучева А.Л. Регулирование половой функции крольчихи // Тр. по динамике развития. 1939. - Вып. 2 -С. 186-197.

125. Падучева A.A., Симон A.C., Вундер П.А. Использование пролана для подготовки маток к искусственному осеменению // Кролиководство. -1934. N7. - С. 15-17.

126. Падучева A.A., Вундер Л.А., Завадовский М.М. Экспериментальная овуляция и ее применение для искусственного осеменения кроликов // Тр. по динамике развития. -1935. Вып.9. - С. 97-110.

127. Платов Е.М. О причинах низкой суягности от замороженного семени // Овцеводство. 1970.-N8. - С.25.

128. Платов Е.М. Теоретические и практические основы замораживания семени производителей с.-х. животных: Автореф.дис. д.б.н / ВИЖ.- Дубровицы, 1973.- 42с.

129. Помытко В.И.Андреева B.C., Владимиров A.B. Инструкция по искусственному осеменению кроликов. -М.: Колос, 1975. -32с.

130. Прокофьев М.И. Трансгенные сельскохозяйственные животные-продуценты рекомбинантных лекарственных белков. 2-ая международная научная конференция «современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 19-20 ноября 2002.

131. Проняев A.B. Фенотипическая и генотипическая характеристики и современное состояние популяций сайгака. Автореферат дис. Кандидата биологических наук. М, 1985, с23.

132. Райцина С.С. Восстановительные процессы и аутоиммунтет при травме семенника у млекопитающих. Автореферат дис. доктора медицинских наук. М., Ин-т. мед. Генетики АМН СССР, 1969.

133. Райцина С.С., Сперматогенез и структурные основы его регуляции. Москва 1985.

134. Растимешин С.П. Воспроизводительная способность самцов кроликов в зависимости от возраста и сезона года: Автореф. дис. к.с.-х.наук/ НИИПЗиК.- М.,1980. -17 с.

135. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. -М.: Мир, 2000. 592 с.

136. Рузен-Ранге Э, Сперматогенез у животных, Москва, Мир, 1980. 255 с.

137. Саморуков Ю.В., Марзанов Н.С. Сохранение и рациональное использование генофонда молочного скота Российской Федерации. Быков 2002, 50с.

138. Сарбагишева Б.С., Рабочее В.К., Теребаев А.И. Яки. Генетические ресурсы с/х животных в России и сопредельных странах. Санкт-Петербург 1994,335-345

139. Сарбагишева Б.С., Черткиев Ш.Н., Пути повышения продуктивности яков. Фрунзе 1983, с 1-12.

140. Сингер М., Берг П. Гены и геномы: В 2-х т. Т.1. Пер. с англ. -М.: Мир, 1998.-373 с.

141. Сингер М., Берг П. Гены и геномы: В 2-х т. Т.2. Пер. с англ. -М.: Мир, 1998.-391 с.

142. Соколовская И.И. Метод снижения эмбриональной смертности у свиней. / Соколовская И.И., Рымарь М.А., Бондаревская Л.Ф., Островский Ф.М. // Разведение и биология размножения животных. М. 1966. С.304-307.

143. Соколовская И.И. Может ли замороженная сперма оплодотворять и давать нормальное потомство // Доклады ВАСХНИЛ.1947. N 6. С.21-23.

144. Соколовская И.И. Некоторые причины и меры предотвращения эмбриональной смертности. //Доклады советских ученых к Пятому международному конгрессу по биологии воспроизведения и искусственному осеменению животных. М.1964. С. 122-126.

145. Соколовская И.И., Бондаревская Л.Ф., Бронская A.B. Метод вызывания овуляции у крольчих // Животноводства 1978.-N3. - С.61-63.

146. Соколовская И.И., Кононов В.П. Искусственное осеменение кроликов // Кролиководство и звероводство. 1971. №3. С.37-39,

147. Соколовская И.И., Кононов В.П. Искусственное осеменение кроликов // Кролиководство и звероводство. 1971. №4. С 3135.

148. Соломонов Н.Г., Киселев Ю.А., Слепцов М.К. Акклиматизация яков в Якутии. Новосибирск: Наука, 1980, с. 104.

149. Соунсон Е., Мерц Т., Янг У. 1969. Цитогенетика. М.: Мир.280с.

150. Сперматогенез и его регуляция. / Габер Е.С., Князева Е.Ф., Костомарова A.A., Наук В.А., Петросьян Ж.Л., Райцина С.С., Ротт H.H. //Москва 1983.

151. Столповский Ю.А. Консервация генетических ресурсов сельскохозяйственных животных: проблемы и принципы их решения.-М.-1997, 109с.

152. Стоянов В.К. Новое в осеменении мясошерстных овец// Овцеводство.- 1980.- №11.-С.36-37.

153. Стрелко Г.Н., Саль Б.А. Анализ результативности программ TESE и MESA в зависимости от типа азооспермии. Журнал Проблемы репродукции" №5 2001 г. стр. 24-26.

154. Турбин В.Ф. Методы быстрого замораживания семени быков-производителей// Животноводство.- 1966,- № 10.-С.70-75.

155. Туре У.Б. Совершенствование искусственного осеменения коров замороженным семенем: Автореф. дис. к.б.н /ВИЖ. Дубровицы, Московская обл., 1981.-24с.

156. Уханов C.B., Столповский Ю.А., Банникова Л.В. и др. Генетические ресурсы крупного рогатого скота.- М.: Наука.-1993.

157. Фарид А.Э.Э. Влияние различных Сахаров солей ЭДТУК и гипертонической среды на семя быка при глубоком охлаждении// Направления и новые результаты исследований по биологии воспроизведения.- Дубровицы, 1974.- С.66-69.

158. Фарид А.Э.Э. Действие состава среды, числа живчиков и своевременности осеменения на результаты использования глубокозамороженного семени быка: Автореф. дис. к.б.н. ВИЖ. Дубровицы, Моск. обл., 1975. - 23с.

159. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. М.: Агар, 1999. - 512 с.

160. Хромосомы одомашненных животных и родственных им видов. /Кленовицкий П.М., Никишов A.A., Иолчиев B.C., Багиров В.А. //Дубровицы, ВИЖ. -2001, 44с.

161. Хромосомы человека. Атлас. М.: Медицина. - 1982.

162. Царев С.А. Актуальные вопросы расселения и одомашнивания овцебыка на севере России. // Вопросы современного охотоведения. 2002, С. 357-362

163. Шайдуллин И.Н. Искусственное осеменение овец глубокозамороженным семенем. //Животноводство.- 1977.-№8. -С.54-61.

164. Шайдуллин И.Н. Усовершенствование метода замораживания семени барана путем применения антиоксидантов: Автореф.дис. к.б.н/ВИЖ-Дубровицы, Моск.обл.1987.-24с

165. Шевелуха B.C., Калашникова Е.А, Дегтярев C.B., Кочиева Е.З., Прокофьев М.И., Новиков H.H., Ковалев В.М., Калашников Д.В. Сельскохозяйственная биотехнология. М.: Высшая школа, 1998. -416 с.

166. Эрнст Л.К. Метод быстрого размножения уникальных генотипов в свиноводстве. / Эрнст Л.К., Брем Г., Некрасов A.A., Кононов В.П., Шихов И.Я., Голышев H.A. // Журнал Доклады РАСХН 1994, №1,31-33

167. Эрнст Л.К. Проблемы селекции и биотехнологии сельскохозяйственных животных. М.: Россельхозакадемия, 1995.-360 с.

168. Эрнст Л.К., Гольдман И.Л., Кадулин С.Г. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца // Биотехнология. -1993. №5. - С.2-14.

169. Эрнст Л.К., Жигачев А.И. Профилактика генетических аномалий крупного рогатого скота. Л.: Агропромиздат. — 1990.

170. Эрнст Л.К., Прокофьев М.И. Биотехнология сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1995. - 192 с.

171. Эрнст Л.К., Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных. М.: Агропромиздат, 1989.- 302 с.

172. Ющенко Н.П., Семаков В.Г., Левин К.Л. Замораживание спермы быков в гранулах без применения сухого льда //Молочное и мясное скотоводство. 1968. - N5. -С.36-37.

173. Яблонский В., Плахий П. иммуноэлектрофоретическая характеристика белков сыворотки крови крупного рогатого скота // воспроизводство и болезни крупного рогатого скота в промышленных комплексах. Кишинев, 1977. -С. 15-19.

174. Яковлев А.Ф. Цитогенетическая оценка племенных животных.- М.: Агропромиздат. -1985. 266 с.

175. Якушкин Г.Д. Овцебыки на Таймыре. Новосибирск, 1998, 235с.

176. Якушкин Г.Д. Репродуктивный цикл овцебыков на полуострове Таймыр. //Экология и рациональное использование наземных позвоночных севера Средней Сибири. Новосибирск 1983, с.23-29.

177. Abilov A.I. Creation of a European bison sperm cryobank as a method for preserving the genetic polymorphism of the species. / Abilov A.I., Sipko T.P., Shurkhal A.V., Rott N.N. // Genetika. 1993 Dec;29(12):2051-6.

178. Adams C.E. Early embryonic martality in the rabbit.- J.Reprod. Fertil., 1960. N 1, 315-316.

179. Adams C.E. Studies of prenatal mortality in the rabbit, oryctolagus cuniculus: The effect of transferring varying numbers of eggs.-J. Endocrin., 1962. N24,471-490.

180. Akesson A., Henricson B. Embryonic death in pig cause by unbanaced karyotype //Acta. Vet. Scand. 1972. - V. 13. - N 2. — P.151-160.

181. Al-Shawi R. Failure to produce transgenic mice by exposing to spermatozoa to DNA./ Al-Shawi R., Ansell J.D., Bishop J.O., Simons J.P.,West J.D. // Mouse Genome. 1990. V. 86. P. 224.

182. Anderson W., Persone P. The functional anatomy of the spermatozoon. Ed. Afzelius B. Oxford: Pergamon press. 1975. 423 p.

183. Anderson W.A., Weissman A., Ellis R.A. Cytodifferentiation during spermiogenesis in Lumbricus terrestris. J Cell Biol. 1967 Jan;32(1): 11-26.

184. Antinori S. Successful fertilization and pregnancy after injection of frozen-thawed round spermatids into human oocytes. Hum Reprod 1997; 12:3.

185. Arezzo F. Sea urchin sperm as a vector of foreign genetic information // Cell Biol. Int. Rep. 1989. V. 13 (4). P. 391-404.

186. Arezzo F., Giudice G. The lack of cell contact causes genomic activation in early sea urchin embryos. Cell Biol Int Rep. 1983 Jan;7(1):5-10.

187. Armero E., Garcia-Ximenez F., Vicenta J.S. Cycle synchronization of rabbit does naturally mated or artificially inseminated// World Rabbir Sci. -1994. V.2(3). - P. 107-113

188. Atkinson P.W. Association of exogenous DNA with cattle and insect spermatozoa in vitro. / Atkinson P.W., Hiñes E.R., Beaton S., Matthaei K.I., Reed K.C., Bradley M.P. // Mol. Reprod. Dev. 1991. V. 29. P. 1-5.

189. Atkinson P.W., James A.A. Germline transformants spreading out to many insect species. Adv Genet. 2002;47:49-86.

190. Atkinson PW, Michel K.What's buzzing? Mosquito genomics and transgenic mosquitoes. Genesis. 2002 Jan;32(1):42-8.

191. Baclhin D., Lenne G., Naletto G. Fecondazione artificíale futuro e gia iniziato//Riv. Coniglicoltura.- 1988.- V.12. P.69-76.

192. Bagirov V.A., V.P.Kononov. The possibility of exogenous DNA penetration into spermatozoa at semen cryopreservation. EAAP-51th Annual Meeting, Animal Genetics The Hagua 2000 p. 19.

193. Balhorn R. A model for the structure of chromatin in mammalian sperm. J Ceel Biol. 1982. V 93. P 298-305.

194. Bamba K., Cran D.G. Effect of rapid warming of bull and rabbit semen// Reprod. Fert.- 1988,- V.82(2). -P.501-507.

195. Bearer E.L., Friend D.S. Morphology of mammalian sperm membranesduring differentiation, maturation and capaci- tation // J. Electron Microscopy Technique. 1990. V. 16. P. 281-297.

196. Berta F., Cava P.L. La fecondarione artificíale nell allevamento cunicolo//Riv. Coniglicoltura. -1984. V.21(8). - P.12-14.

197. Bhargava P.M. Amino-acid composition of RNA-ase from seminal plasma: / Bhargava P.M., Reddy E.S.P., Sitaram N., Scheit K.H.//A correction.-J. Mol. Biol., 1981. 146(2): 261-263.

198. Bhargava P.M. Four new and unusual proteins from bovine seminal plasma.- Biol. Soc. Trans., 1981. 9(6): 540-543.

199. Black-Show A.W., Snlisbyry G.W. Factors influencing metabolic activity of bull spermatozoa cold shock and its preventions // Dairy Sci. 1957. -V.40. - P. 1099-1105.

200. Bowling A.T. Horse Genetics.-CAB INTERNATIONAL.-Cambridge.- 2000.

201. Brackett B.G. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization. / Brackett B.G., Baranska W., Sawicki W., Koprowski H.// Proc Natl Acad Sci USA. 1971 Feb;68(2):353-357.

202. Brambell F.W. The reproduction of the wild rabbit Oryctolagus cuniculus//Proc.Zool.Soc.Lond. 1944. -V.1. N 114. - P. 1-45.

203. Braun J., Leidl W. Der Einfluss der Superovulation auf Morphologie, Kultivierung und Tiefgefrierkonservierung von Embryonen beim Kaninchen.- 1980.

204. Brem G. Transgenic animals. In Biotechnology. V. 2.Ed. A. Puhler. N.-Y.: VCH Press, 1993. P. 745-832.

205. Brem G. Expression of synthetic cDNA sequences encoding human insulin-like grown factor-1 (IGF-1) in the mammary gland of transgenic rabbits. / Brem G., Hartl P, Besenfelder U, Wolf E, Zinovieva N, Pfaller R. // Gene 1994; 149:351-355.

206. Brem G., Besenfelder U. Production of foreign proteins in the mammary glands of transgenic animals.// Chemicalogy. 1993. №10. P. 21-25.

207. Brem G., Besenfelder U., Hartl P. Production of forign proteins in the mammary gland of transgenic rabbits. Chimia Oggi. 1993; 11: 21-25

208. Brem G., Kuhholzer B. The recent history of somatic cloning in mammals. Cloning Stem Cells. 2002;4(1):57-63.

209. Brem G., Nowshari M.A. Nuclear transfer in cattle. Methods Mol Biol. 2004;254:213-26.

210. Brinster C.J. Restoration of fertility by germ cell transplantation requires effective recipient preparation./ Brinster C.J., Ryu B.Y., Avarbock M.R., Karagenc L., Brinster R.L., Orwig K.E. // Biol Reprod. 2003 Aug;69(2):412-20. Epub 2003 Apr 02.

211. Brinster R.L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 2002 Jun 21;296(5576):2174-6.

212. Brinster R.L. Regulation of metallothionein-thimidinekinase fusion plasmids injection into mouse eggs. / Brinster R.L., Chen H.Y., Warren R., Sarthy A., Palmiter R.D. // Nature. 1982. V. 296. P. 3943.

213. Brinster R.L. Somatic expression of herpes thymidinekinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. / Brinster R.L., Chen H.Y., Trumbauer M.E., Senear A.W., Warren R., Palmiter R.D. //Cell. 1981. V. 27. P. 223-231.

214. Brinster R.L. The effect of cells transferred into the mouse blastocyst on subsequent development // J. Exp. Med. 1974. V. 140. P. 1049-1056.

215. Brinster R.L. Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum. / Brinster R.L., Chen H.Y., Trumbauer M.E., Avarbock M.R. // Nature. 1980. V. 283. P. 499-501.

216. Brinster R.L., Sandgren E.P., Behringer R.R., Palmiter R. D. No simple solution for making transgenic mice // Cell. 1989. V. 59. P. 239-241.

217. Brinster R.L., Zimmermann J.W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Nov 22;91(24):11298-302.

218. Brinster RL, Avarbock MR.Germline transmission of donor haplotype following spermatogonia! transplantation. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Nov 22;91(24):11303-7.

219. Camaioni A. Uptake of exogenous DNA by mammalian spermatozoa: specific localization of DNA on sperm heads. / Camaioni A., Russo M.A., Odorisio T., Gandolfi F., Fazio V.M., SiracusaG. //J. Reprod. Fertil. 1992. V. 96. P.203-212.

220. Carney E.W., Foote R.H. Effects of superovulation, embryo recovery, culture system and embryo transfer on development of rabbit embryos in vivo and in vitro.- J. Reprod. Fertil., 1990. N 89, 543-551.

221. Chang M.C. A detrimental effect of rabbit seminal plasma of the fertilizing capacity of sperm // Nature (London). 1957. - V. 179. -P.258-259.

222. Christians E., Rao V.H., Renard J.P. Sequential acquision of transcriptional control during early embryonic development in the rabbit// Developmental biology. 1994. V.164. Nol P. 160-172.

223. Clausen P.A. DNA uptake by mammalian spermatozoa. / Clausen P.A., Iyer A.P., Zaneveld L.J.D., Polakoski K.L. Waller D.P., Drisdell R. //J. of Andrology. 1991. V. 12(1). P. 69.

224. Costantini F., Lacy E. Introduction of a rabbit b-globin gene into the mouse germ line // Nature. 1981. V. 294. P. 92-94.

225. D'Alessio G. Bull seminal ribonucleases. 1. Purification and physicochemical properties of the major component. / D'Alessio G., Floridi A., DePrisco R., Pignero A.,Leone E. Eur.J.Biochem., 1972. 26(2), 162-167.

226. De Vos W.M., Venema G. Transformation of Bacillus subtilis competent cells: identification and regulation of the recE gene product// Mol. Gen. Genet. 1983. V. 190. P. 56-64.

227. Deng M, Yang XJ. Full term development of rabbit oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection. Mol Reprod Dev. 2001 May;59(1):38-43.

228. Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes. Biol. Reprod 1999 Nov;61(5):1331-9.

229. Dostal J, Matousek J. Purification of aspermatogenic substance in bull seminal vesicle fluid.-J. Reprod.Fertil., 1972. 31:273-275.

230. Dubiel A., Krolinski J., Weitze K.P. Sztucne uwasienianie krolik wasieniem konserwowanym w niskich temperaturach przy uzycin minitub // Med.wet. 1986. - V.42.- N.10. - P.618-620.

231. Ernst L.K., Zhigachev A.I. Role of genetic factors in the occurrence of umbilical hernias in cattle. I. The incidence of the anomaly and genealogical data. Genetika. 1981; 17(6): 1103-6.

232. Fainsold A. Chicken homeogenes expressed during gastrulation and the generation of transgenic chicken. / Fainsold A., Frumkin A., Rangini Z., Revel E., Yarns S., Ben-Yehuda A., Gruenbaum Y.

233. EMBO-EMBL Symposium "The Molecular biology os vertebrate development." 1990. 31.

234. Fawcett D.W. A comparative view of sperm ultrastructure. Biol Reprod Suppl. 1970;2:90-127.

235. Fawcett D.W., Anderson W.A., Phillips D.M. Morphogenetic factors influencing the shape of the sperm head. Dev Biol. 1971 0ct;26(2):220-51.

236. Fawcett D.W. The cell biology gametogenesis in the male. Perspectives in biology and medicine. 1979, pt. 2, p. 556-573.

237. Fee A.R., Parkers A.S. Studies on ovulation. 1. The relation of the anterior pituitaru body to ovulation in the rabbit // Physiology. -1929. V.67. - P.383-388.

238. Francolini M. Evidence for nuclear inter- nalization of exogenous DNA into mammalian sperm cells. 7 Francolini M., Lavitrano M., Lamia C.L., French D.,Frati L., Cotelli F., Spadafora C. // Mol. Reprod. Dev. 1993. V. 34. P. 133-139.

239. Gabler G. Untersuchungen ueber die Gewinnung, Konservierung und Transplantation von Eizellen bei Kaninchen unter Beruecksichtigung von in vitro-Befruchtungsversuchen.- Diss, med. vet., Hannover 1970.

240. Gagne M.B., Pothier F., Sirard M.-A. Electroporation of bovine spermatozoa to carry foreign DNA in oocytes // Mol. Reprod. Dev. 1991. V. 29. P. 6-15.

241. Gandolfi F. Failure to produce transgenic offspring by intra-tubal insemination of gilts with DNA-treated sperm. / Gandolfi F., Terqui

242. M., Modina S., Brevini TA., Ajmone-Marsan P.,Foulon-Gauze F., Courot M. Reprod Fertil Dev 1996;8(7): 1055-1060

243. Gandolfi F. Spermatozoa, DNA binding and transgenic animals. Transgenic Res. 1998 May;7(3): 147-55.

244. Gandolfi F. The use of sperm-mediated gene transfer for the generation of transgenic pigs. I Gandolfi F., Lavitrano M., Camaioni A., Spadafora C., Siracusa G., Lauria A. I I J. Rep- rod. Fert. Abstr. 1989. V. 4. P. 21.

245. Gandolfi F.Sperm-mediated transgenesis. Theriogenology. 2000 Jan 1;53(1): 127-37.

246. Getzenberd R.H. Nuclear structure and three-dimensional organization of DNA. I Getzenberd R.H., Pienta K.L., Ward W.S., Coffey D.S. J Cell Biochim. 1991. V 46 P 1-11.

247. Goetze G., Paufler S. Besamungsergebnisse und praenatale Mortalitaet nach Verwendung von Fluessig und Tiefgefriersperma beim Kaninchen bei normaler Ovulationsausloesung und Superovulation.- Zuchthyg., 1976 N 11, 169-174.

248. Goldberg R.B., Geremia R., Bruce W.R. Histone synthesis and. replacement during spermatogenesis in the mouse. Differentation 1977. V 7. P 167-180.

249. Gottsghewski G.H.M., Zimmermann W.Die Embryonalentwicklung des Hauskaninchens: Normogenese und Teratogenese. Hannover, 1973 11-75.

250. Gou K.M. Sheep transgenic embryos produced by intracytoplasmic sperm injection. I Gou K.M., An X.R., Tian J.H., Chen Y.F.// Article in Chinese. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 2002 Jun;35(2):103-8.

251. Graham E.F., Crabo B.C., Pace M.M. Current status of semen preservation in the ram, boar and stallion/ J. Anim.Sci. -1978.-V.47.- P.80-118.

252. Hahn J., Ady G., Schneider U. Ueber den Einfluss der Superovulation auf die Entwicklung in vitro-befruchteter Kanincheneizellen.- Dtsch.Tieraertztl. Wochensch., 1977. N 84, 2205-252.

253. Hammer R.E. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by ^ microinjection . / Hammer R.E., Pursei V.G., Rexroad C.E., Wall

254. R.J., Bolt D.J., Palmiter R.D., Brinster R.L. // Nature. 1985. V. 315. P. 680-683.

255. Hammond J. Factors producting sterility with special reference to genetic causes // Proc.Royal.Soc.Med. 1933. V.26.- P.1183-1186.

256. Hammond J.,Asdell S.A. The vitality of the spermatozoa in the male and female reproductive tracts // Brit. J. Exp.Biol.- 1926.-V.4.- N2.- P.155 -185.

257. Hanada A., Nagase H., Cryoprotective effects of come amides on rabbit spermatozoa // Reprod.Fert. 1980. - V.1. - P. 247-252.

258. Harris G.W. Electrical stimulation of the hypothalamus and the mechanism of neural control of the adenohypophysis

259. Physiol.(lond). 1948. - V.107.-N4.- P.418-429.

260. Heape W. Ovulation and degeneration of ova in the rabbit // Proc.Roy.Soc.B. 1905. - V.76. -P.260-268.

261. Hellemann C., Gigoux E. Tiefgefrierkonservierung von Kaninchensperma, Einfluss eines obenflachenaktiven Praparates auf die Befruchtungsfahigkeit // Zuchthyg. -1988. lg.23. - H.1. -S.33-37.

262. Hill R.T., Allen E., Kramer T.C. Cinemicrografic studies of rabbit ovulation.-Anat. Ree., 1935. N 63,239-242.

263. Hochereau-de Reviers M.T., Loir M, Pelletier J. Seasonal variations in the response of the testis and LH levels to hemi castration of adult rams. J Reprod Fertil. 1976 Jan;46(1):203-9.

264. Hochi S.I. Fate of exogenous DNA carried into mouse eggs by spermatozoa. / Hochi S.-l., Ninomiya T., Mizuno A., Honma M., Yuki A. //Animal Biotech. 1990. V. 1(1). P. 21-31.

265. Hogan B., Constantini F., Lacy E. Manipulation of the mouse embryo // In: Cold Spring Harbor Laboratory Press. N.-Y. 1986.

266. Horan R. Association of foreign DNA with porcine spermatozoa. / Horan R., Powell R., McQuaid S., Gannon F., Houghton J.A. // Archives of Andrology. 1991. V. 26. P.83-92.

267. Hosokawa S., Irie M. Purification and properties of seminal vesicle ribonuclease.-J. Biochem. (Tokyo), 1971. 69: 683-697.

268. Huguet E, Esponda P. Foreign DNA introduced into the vas deferens is gained by mammalian spermatozoa. Mol Reprod Dev. 1998 Sep;51(1):42-52.

269. Imai H., Characteristics of DNA binding to sheep spermatozoa. / Imai H., Walton C.E., Marshall J.T., Nancarrow C.D. // J. Reprod. Develop. 1992. V. 38 (4). P. 255-262.

270. Jackson D.A. Organization beyond the gene. TIBS 1986. V11. P 249-253.

271. Jackson J. Stable and unstable expression of genes in DNA transformed cells. / Jackson J., Lowy I., Ostrander M., Pellicer A., Roberts J., Robins D., Sim G.K., Sweet R., Wold B., Silverstein S., Axel R. //Miami Winter Symp. 1980. V. 17. P. 181-199.

272. Jager S., Wijchman J., Kremer J. Studies on the decondensation of human, mouse and bull sperm nuclei by heparin and other polyanions. JExpZool. 1990. V 250.P 315-322.

273. Johnson M.H., Thakur A.N., Sheth A.R. Distribution of inhibin in testes of neonatal, pubertal, and adult rats. Arch Androl. 1981 Sep;7(2):127-31.

274. Kemme M. Characterization of basic proteins of bull seminal plasma. /Kemme M., Theil R., Madiraju M.V.V.S., Scheit S., Scheit K.H. //- Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem., 1984. 365(10), 1173-1181.

275. Kennely J.J., Foote R.H. Superovulatory response of pre- and postpubertal rabbits to comercially available gonadotrophins.- J. Reprod. Fertil., 1965. N 9, 177-188.

276. Kim W.R., Dickson E.R. The role of prognostic models in the timing of liver transplantation. Application in cholestatic liver diseases. Clin Liver Dis. 1997 Aug; 1(2):263-79, vii.

277. Klaudy J., Dostal J., Veselsky L. Bull seminal ribonuclease AS in the bull reproductive tract.-AJRIM, 1985. 7(2): 50, abstr. 14.

278. Kononov V.P. Effect of triethylenethiophosphoramid on the spermatozoa of rabbits. Arkh Anat Gistol Embriol. 1975 Aug;69(8):96-101.

279. Kuznetsov A.V., Kuznetsova I.V., Schit I.Y. DNA interaction with rabbit sperm cells and its transfer into ova in vitro and in vivo. Mol Reprod Dev. 2000 Jun;56(2 Suppl):292-7.

280. Lauria A., Gandolfi F. Resent advances in sperm cell mediated gene transfer// Mol. Reprod. Dev. 1993. V. 36. P. 255-257.

281. Lavitrano M. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs genetic transformation of mice. / Lavitrano M., Camaioni A., Fazio V.M., Dolci S., Farace M.G., Spadafora C. // Cell. 1989. V. 57. P. 717-723.

282. Lavitrano M. Sperm mediated gene transfer in pig: Selection of donor boars and optimization of DNA uptake. / Lavitrano M., Forni M., Bacci M.L., Di Stefano C., Varzi V., Wang H., Seren E. // Mol Reprod Dev. 2003 Mar;64(3):284-91.

283. Lavitrano M. The interaction between exogenous DNA and sperm cells. /Lavitrano M.f French D., Camaioni A., Zani M., Frati L., SpadaforaC. //Mol. Reprod. Dev. 1992a. V. 31. P. 161-169.

284. Lavitrano M., Frati L. Xenotransplantation: state of the art. Forum (Genova). 1999 Jul-Dec;9(3 Suppl 3):74-83.

285. Mahi C.A., Yanagimachi R. Induction of nuclear decondensation of mammalian spermatozoa in vitro. J Reprod Fertil. 1975. V 44. P 293-296.

286. Mahi C.A., Yanagimachi R. Prevention of in vitro fertilization of canine oocytes by anti-ovary antisera: a potential approach to fertility control in the bitch. J Exp Zool. 1979 Oct;210(1): 129-35.

287. Marshall F.H. Verney E.B. The ocurence of ovulation and pseudopregnansy in the rabbit as a result of central nervous stimulation //Physiology. -1936. V.86.- N 3. - P.327-336.

288. Marushige Y., Marushige K. Enzumatic unpackind of bull sperm chomatin. Bichim Biophys Acta. 1975. V403. P 180-191.

289. Marushige Y., Marushige K. Transformation of sperm histone during formation and maturation of rat spermatozoa. J. Biol. Chem 1975. P 39-45.

290. Marx J.L. Making mutant mice by gene transfer // Science. 1985. -V. 228. - P.1516-1517.

291. Matousek J. The effect of bovine seminal ribonuclease (AS RNase) on cells of Crocker tumour in mice.-Experientia, 1973. 29: 858-859.

292. Matousek J, Grozdanovic J. Specific effect of bull seminal ribonuclease (AS RNase) on cell systems in mice.- Comp. Biochem. Physiol., 1973 A, 46: 241-248.

293. Matousek J, Picha J, Pichova D. Seminal ribonuclease synthesis in bull reproductive organs during ontogenesis.- Anim. Reprod. Sci., 1981.4(1): 9-17.

294. Matousek J. Bull seminal ribonuclease its biosynthesis in normal and orchitic bulls and correlation to blood plasma hormone levels. / Matousek J, Picha J, Pichova D, Petelikova J. //Animal Reprod. Sci., 1980. 3(1): 1-15.

295. Matousek J. Effects on spermatogenesis in guinea-pigs, rabbits and rams after their immunization with sexual organ fluids of bulls.-J. Reprod. Fertil., 1969. 19(1): 63-72.

296. Matousek J. Effect of native and modified bull seminal ribonuclease on tumours and testicular cells and phytohaemagglutinin-stimulated pig lymphocytes. / Matousek J., Stanek R., Dostal J., Macha J. // Folia Biol. (Praha), 1979. 25: 34.

297. Mattey R. Cytogenetic mechanisms and speciation of mammals / Chromosome (in vitro). 1967. -V.1. - P.1-11.

298. Mattey R. Cytogenetique et taxonomie des rat appurtenant au sous-genre Mastomys Tomas (Rodentia-Murdae) // Mammalia. -1966. V.30. - N 1. - P. 105-119.

299. Maurer R.R., Hunt W.L., Foote R.H. Developmental potential of superovulated rabbit ova.-J. Reprod. Fertil.,1965, N15.

300. Maurer R.R., Stranzinger G.F., Paufler S.K. Embryonic development in rabbit after insemination with spermatozoa stored at +37,5 00C or -196 0C for varios period. //Reprod Fertil. -1976.-V.48.-P.43-59.

301. Michelmann H.W., Paufler S.K. Untersuchungen ueber die normale hormonelle Ovulationsausloesung und die Superovulation beim Kaninchen.-Zuchthyg., 1974. N 9, 116-121.

302. Milner-Gulland E.J. Conservation: Reproductive collapse in saiga antelope harems. / Milner-Gulland E.J., Bukreeva O.M., Coulson T., Lushchekina A.A., Kholodova M.V., Bekenov A.B., Grachev I.A. // Nature. 2003 Mar 13;422(6928):135.

303. Milner-Gulland E.J. Dramatic declines in saiga antelope populations. Running head: Saiga antelope declines. / Milner-Gulland E.J., Kholodova M.V., Bekenov A., Bukreeva O.M., Grachev lu.A., Amgalan L., Lushchekina A.A. // Oryx. 2001. N

304. Milner-Gulland E.J., Mace R. Conserving biological resources. Trends Ecol Evol. 1999 Jun;14(6):236.

305. Mirkovitch J, Gasser S.M., Laemmli U.K. Relation of chromosome structure and gene expression. Philos R Soc Lond. 1987. V 317. P 563-574.

306. Nagano M. Lentiviral vector transduction of male germ line stem cells in mice. / Nagano M., Watson DJ., Ryu BY., Wolfe JH., Brinster RL. //FEBS Lett. 2002 Jul 31;524(1-3):111-5.

307. Nagano M. Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro. / Nagano M., Ryu B.Y., Brinster C.J., Avarbock M.R., Brinster R.L.// Biol Reprod. 2003 Jun;68(6):2207-14. Epub 2003 Jan 22.

308. Nagano M. Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells. / Nagano M., Shinohara T., Avarbock M.R., Brinster R.L., //FEBS Lett 2000 Jun 9;475(1):7-10

309. Nagano M. Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells. / Nagano M., Brinster C.J., Orwig K.E., Ryu B.Y., Avarbock M.R., Brinster R.L. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Nov 6;98(23):13090-5. Epub 2001 Oct 23.

310. Nagano M., Patrizio P., Brinster R.L. Long-term survival of human spermatogonia! stem cells in mouse testes. Fertil Steril. 2002 Dec;78(6): 1225-33.

311. Nagase H., Niva T. Deep freezing semen in concentrated pellet form: V-th Intern.Congr.Anim.Reprod. Trento, 1964. - V.4. -P.410-415.

312. Neaves W.B. Asynchronous testicular cycles among Equatorial colonies of Rock Hyrax. In; Testicular development, structure and function/Raven press, 1980, p. 411-419.

313. Nelson W.G., Kastan M.B. DNA strand breaks, the DNA template alteration that triggers p53-dependent DNA damage response pathways. Mol Cell Biol 1994; 14:1815—1823.

314. Neri Q.V. Intracytoplasmic sperm injection. Accomplishments and qualms. / Neri Q.V., Tanaka N., Wang A., Katagiri Y., Takeuchi T., Rosenwaks Z., Palermo GD. // Minerva Ginecol. 2004 Jun;56(3):189-96.

315. O'Brein D.A., Belive A.R. Protein constitunts of the mouse spermatozoon II. Temporal synthesis during spermatogenesis. Dev Biol. 1980. V 75. P 405-418.

316. Ogawa T., Dobrinski I., Brinster R.L. Recipient preparation is critical for spermatogonia! transplantation in the rat. Tissue Cell 1999 Oct;31(5):461-72.

317. Ogura A., Matsuda J., Yanagimachi R. Birth of normal young after electrofusion of mouse oocytes with round spermatid. Proc Natl Acad USA. 1994;91:7460 —7462.

318. Ogura A., Yanagimachi R., Usui N. Behavior of hamster and mouse round spermatid nuclei incorporated into mature oocytes by electrofusion. Zygote. 1993;1:1 —8.

319. Orwig K.E., Avarbock M.R., Brinster R.L. Retrovirus-mediated modification of male germline stem cells in rats. Biol Reprod. 2002 Sep;67(3):874-9.

320. Palermo G.D. Application of intracytoplasmic sperm injection in assisted reproductive technologies. / Palermo G.D., Takeuchi T., Neri Q.V., Katagiri Y., Veeck L.L., Rosenwaks Z. //Reprod Biomed Online. 2003 Jun;6(4):456-63.

321. Palermo G.D., Cohen J., Rosenwaks Z. Intracytoplasmic sperm injection: a powerful tool to overcome fertilization failure. Fertil. Steril. 1996 May;65(5):899-908.

322. Parkash O. Induction of Sex-linked recessive lethals and visible mutations by feeding X-irradiated DNA to Drosophila melanogaster // Nature. 1965. V. 205. P. 312-313.

323. Parrish J.J., Foote R.H. Fertility of cooled and frozen rabbit sperm measured by competive fertilization // Biol. Reprod. 1986. -V.35(2). - P.253-257.

324. Perez A. Sperm cells mediated gene transfer in cattle. / Perez A., Solano R., Castro F.O., Lleonart R., de Armas R., Martinez R., Aquilar A., Herrera L., de la Fuente J. // Biotechnological Aplicada. 1991. V. 8(1). P. 90-94.

325. Perry A.C. Efficient metaphase II transgenesis with different transgene archetypes. / Perry A.C., Rothman A., de las Heras J.I., Feinstein P., Mombaerts P., Cooke H.J., Wakayama T. // Nat. Biotechnol. 2001 Nov;19(11):1071-3.

326. Perry A.C. Metaphase II transgenesis. Reprod Biomed Online. 2002 May-Jun;4(3):279-84.

327. Perry A.C., Wakayama T., Kishikawa H., Kasai T., Okabe M., Toyoda Y., Yanagimachi R. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection. Science. 1999 May 14;284(5417): 1097-8.

328. Pienta K.J., Getzenberd R.H., Coffey D.S. Cell structure and DNA orqanization. Crit Reveuk Gene Exspress. 1991. V 1. P 355-385.

329. Pincus G. Superovulation in rabbits.-Anat. Ree., 1940 N 77, 1-8.

330. Polakovski K.L., Kopta M. Seminal plasma In: Biochemistry of Mammalian Reproduction. /Egs Zanefeld L.J.D., Chatterton R.T., N.-Y.: J.Wiley and Sons, P 89-117.

331. Polge C., Smith A., Parkes A. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures // Nature London.- 1949. -V. 164. N 4219. - P.666.

332. Popescu P.C. Cytogenetigue des mammiferes d'elevage.- INRA- Paris.-1989.

333. Powell D., Gran D.G., Jennings C., Jones R. Spatial organization of repetitive DNA seguens in the bovine sperm nucleus. // J Cell Sci. 1990. V 97. P 185-191.

334. Rapoport F.T., Sanpath A., Kano K. Immunologial effects of thermal injuri. Inhibition of spermatogenesis in guinea-pigs. J. Exp. Med. 1969, v 130, p 2416-2431.

335. Rebollar P.G., Alvarino J.M.R., Ubilla E. Grouping of rabbit reproduction management by means of artificial insemination// Word Rabbit Sci. -1994. V.2.- P.87-91.

336. Reiter R.J. Seasonal aspects of testicular function in male photoperiodic rodents. In; Testicular development, structure and function/Raven press, 1980, p. 395-401.

337. Robertson E.J. Pluripotential stem cell lines as a route into the mouse germ line //Trends Genet. 1986. V. 2. P. 9-13.

338. Rodriguez A. Exogenous cloned DNA can penetrate living sperm cells. /Rodriguez A., Castro F.O., Guillen I., Perez A., Hernandez O., Duenas M., Solano R., Baranosky M., Falcon V., Martinez R.,

339. Aguilar A., Lleonart R., de la Fuente J. // Advances in Gene Technology: Feeding the World in the 21st Century. 1991. P. 53.

340. Ross D.A., Dhadwall H.S. Laser measurement of the motility of bull spermatozoa in an egg-yolk diluent // Repr. and Fertil.- 1983.-V.67.- N2.- P.263-268.

341. Ross P. Protein synthesis and secretion in the human epididymis and immunoreactivity with sperm antibodies. / Ross P., Kan F.W.K., Antaki P., Vigneault N., Chapdelaine A., Roberts K.D. // Mol. Reprod. Dev. 1990. V. 26. P. 12-23.

342. Rottmann O.J., Antes R., Hofer P., Maierhofer G. Liposome mediated gene transfer via spermatozoa into avian egg cells // Zuchtungsbiologie. 1991. V. 109. P. 64-70.

343. Rottmann O., Hofer P. A method for transferring organic and/or inorganic substances to egg cells and/or somatic cells of animals and compositions for use therein // World patent WO 87/05325. 11.09.1987.

344. Rottmann O., Stranzinger G. Ergebtisse der Superovulation beim Kaninchen durch einmalige PMSG-Applikation bei zwei Zuchtlinien.- Zichthyg., 1977 N 12, 14-18.

345. Rottmann O.J., Stratowa Ch., Hornstein M., Hughes J. Tissue specific expression of hepatitis B surface antigen in mice following liposome-mediated gene transfer into blastocytes // Zbl. Vet. Med. A. 1985. -V.32. - P.676-682.

346. Russell L.D. Spermatogenesis in Bclw-deficient mice. / Russell L.D., Warren J., Debeljuk L., Richardson L.L., Mahar P.L., Waymire K.G., Amy S.P., Ross A.J., MacGregor G.R. // Biol Reprod. 2001 Jul;65(1):318-32.

347. Russell L.D., Griswold M.D. Spermatogonia! transplantation an update for the millennium. Mol Cell Endocrinology 2000 Mar 30;161(1-2):117-20

348. Saiki R.K. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. / Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J, Higuchi R, Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. //Science. 1988 Jan 29;239(4839):487-91.

349. Salisbury G. W, Hart R. G., Lodge J. R. The spermatozoon.— Perspect. Biol, and Med, 1977, vol. 20, p. 372—393.

350. Salisbury G. W, Hart R. G. Functional integrity of spermatozoa after storage. Bioscience, 1975, vol. 25, p. 159—165.

351. Salisbury G. W, Hart R. G, Lodge J. R. The fertile life of spermatozoa,— Pers-pect. Biol, and Med, 1976, vol. 19, p. 113— 130.

352. Salisbury G.W, Hart R.G, Lodge J.R. The spermatozoon. Perspect Biol Med. 1977 Spring;20(3):372-93.

353. Salisbury GW, Hart RG, Lodge JR. The spermatozoan genome and fertility. Am J Obstet Gynecol. 1977 Jun 1;128(3):342-50.

354. Salisbury GW, Hart RG.Functional integrity of spermatozoa after storage. Bioscience. 1975 Mar;25(3): 159-65.

355. Sato F. Evaluation of deoxyribonuclease activity in seminal plasma of ejaculated chicken semen. / Sato F, Soh T, Hattori M A, Fujihara N.//Asian J Androl. 2003 Sep;5(3):213-6.

356. Sato M, Furukawa F, Nishikawa A, Imazawa T, Yoshimura H, Suzuki J, Nakamura K, Takahashi M. Effects of cyclophosphamide on spontaneous testicular and pancreatic lesions in WBN/Kob rats. Eisei Shikenjo Hokoku. 1993;(111):34-8.

357. Sato M., Ishikawa A., Kimura M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Mol Reprod Dev. 2002 Jan;61(1):49-56.

358. Shannon P., Curson B. Effects of cisteine and DTA on in vitro survival at 37 50 0C and fertility of diluted bovine semen// N.Z.J.-Agr.Res.-1983.-V.26.- N1.- P.85-88.

359. Shaver E.L. The chromosome complement of blastocysts from rabbits injected with various doeses of HCG before ovulation.- J. Reprod. Fertil., 1970. N 23, 335-337.

360. Shend H. Human Nature agricultural biodiversity and farm -based food security. RAFI. 1997. -94s.

361. Sherf B.D. World Watch List for domestic animal diversity. 3rd edition/ FAO. Rome. Italy. 2000.

362. Shinohara T. Restoration of spermatogenesis in infertile mice by Sertoli cell transplantation. / Shinohara T., Orwig K.E., Avarbock M.R., Brinster R.UI Biol Reprod. 2003 Mar;68(3): 1064-71.

363. Shinohara T.E. Spermatogonia! stem cell enrichment by multiparameter selection of mouse testis cells. / Shinohara T.E., Orwig K.E., Avarbock M.R., Brinster R.L. // Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Jul 18;97(15):8346-51.

364. Smelser G.K., Walton A., The effect of light on ovarian activity in the rabbit//Exp. Biol. 1934. - V.11. - P.352-363.

365. Smith H.O., Danner D.B., Deich R.A. Genetic transformation // Annual Review of Biochemistry. Esmond E. Snell, Editor. 1981. V. 50. P. 41-68.

366. Sokolovskaya II.Genetic and other factors influencing the immune response in animal Am J Reprod Immunol Microbiol. 1986 Mar; 10(3):93-9. reproduction.

367. Tanaka A. et al. Clinical Evaluation of Round Spermatid Injection (ROSI) Into Human Oocytes. ASRM Abstracts. 1996.

368. Thorey I.S. Embryonic expression of human keratin 18 and K-18-yff-galactozidase fusion genes in transgenic mice. / Thorey I.S., Meneses J.J., Neznanov N.S., Kulesh D.A., Pedersen R.A., Oshima R.G. // Develop. Biol. 1993. V. 160. P. 519-534.

369. Tournaye H. et al. Correlation between testicular histology and outcome after intracytoplasmic sperm injection using testicular spermatozoa. Hum Reprod 1996; 11:1.

370. Veprintsev B.N., Rott N.N. Conserving genetic resources // Nature 1979. V. 280. P. 633-634.

371. Veprintsev B.N., Shnol S.E. Outline of the history of biophysics in the Soviet Union. Biofizika. 1977, Nov-Dec;22(6):968-76.

372. Walton A., Hammond M.A. Observation on ovulation in the rabbit.-Brit. J. Exp. Biol., 1929 N 6, 190-205.

373. Wang H.J., Lin A.X., Chen Y.F. Association of rabbit sperm cells with exogenous DNA. Animal Biotechnol. 2003 Nov; 14(2):155-65.

374. Ward M.A., Ward W.S. A model for the function of sperm DNA degradation. Reprod Fertil Dev. 2004;16(5):547-54.

375. Ward W.S. Deoxyribonucleic acid loop domain tertiary structure in mammalian spermatozoa // Biology of reproduction. 1993. V 48, P. 1193-1201.

376. Ward W.S., Nancarrow C.D. The genetic engineering of production traits in domestic animals // Experientia. 1991. V. 47. P.913-922.

377. Ward W.S., Coffey D.S. Specific organization of genes in relation to the sperm nuclear matrix. Biochem Res Commun. 1990. P 173. V 20-25.

378. Ward W.S., Kimura Y., Yanagimachi R. An intact sperm nuclear matrix may be necessary for the mouse paternal genome to participate in embryonic development.

379. Weitze K.F., Rath D., Krause D. Tiefgefrierkonservierung von Kaninchensperma. III Jahreszeiniche Schwankungen der Besamungsergebnisch //Zuchthyg. 1983. - Ig. 18. - H.2. - S.172-177.

380. Wiesel S., Schultz G.A. Factors which may affect removal of protamine from sperm DNA during fertilization in the rabbit. Gamete Res 1981. V4. P 25-34.

381. Willmitzer L., Bode J., Wagner K.G. Phosphorylated protamines. I. Binding stochiometry and thermal lability of complexes with DNA. Nucleic Acids Res. 1977. V4. P 1459-1462.

382. Wolf D.E. Expressionbedingte Veränderungen bei Wachstumshormong-transgenen Mausen // München, Diss. med. vet.- 1992.

383. Wolf D.E. Protein dynamics in sperm membranes: implica- tions for sperm function during gamete interaction. / Wolf D.E., McKinnon C.A., Leyton L., Lakoski Loveland K., Saling P.M. // Mol. Reprod. Dev. 1992. V. 33. P. 228-234.

384. Yamazaki Y, Fujimoto H, Ando H, Ohyama T, Hirota Y, Noce T. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biol Reprod. 1998 Dec;59(6):1439-44.

385. Yanagimachi R. Mammalian fertilization the physiology of reproduction. N.Y.: Ravon Press Ltd, 1994.-317c.

386. Yanagimachi R. Sperm penetration intro hamster egg in vitro: Proceeding of the 3rd Intern.Congr.Anim.Reprod. Trento, 1964. -P.623-624.

387. Yanagimachi R. Fertilization and development initiation in orthodox and unorthodox ways: from normal fertilization to cloning. Adv Biophys. 2003;37:49-89.

388. Yanagimachi R. Mechanism of fertilization in mammals //Fertilization and Embryonic Development in vitro/Eds. L.Mastroianni, J. Biggers. N.Y.,1981. P.81-182.

389. Yanagimachi R. Production of fertile offspring from genetically infertile male mice/Yanagimachi R., Wakayama T., Kishikawa H., Fimia G.M., Monaco L., Sassone-Corsi P. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Feb 10;101(6):1691-5. Epub 2004 Feb 02.

390. Yanagimachi R. Requirement of extracellular calcium ions for varioses stages of fertilization and fertilization related phenomena in the hamster // Gam.Res. 1982. - V.5 - P.323-344.

391. Yanagimachi R., Noya Y.D. Electron microscopic studies of sperm incorporation into the golden hamster eggs. Am J Anat 1970. V 128. P 249-262.

392. Young R.J., Sweeney K. Mammalian ova and one-cell embryos do not incorporate phosphate into its nucleic acids. Eur J Biochem. 1978. V91. P 111-117.

393. Zani M. The mechanism of binding of exogenous DNA to sperm cells: factors controlling the DNA uptake. / Zani M., Lavitrano M., French D., Lulli V., Maione B., Sperandio S., Spadafora C. // Exp Cell Res 1995, 217(1): 57-64

394. Zanirato M.G. Relationships between physiological state and results of artificial insemination in rabbit //Riv. Coniglicoltura. -1989. V.26(10). - P.35-37.

395. Zinovieva N, Muller M, Brem G. Short communication: Identification and characterization of multiple splicing forms of bovine prochymosin mRNA. J Dairy Sci. 2002 Dec;85(12):3476-9.

396. Zondek B., Aschheim S. Ovulation in der Graviditat ansgelost durch H.V.L.H. Hypophysan vonderlappenhormone //Endokrinol. 1928. J.1. -S.10-12.

Информация о работе

Багиров, Вугар Алинияз оглы
доктора биологических наук
п. Дубровицы, Московской обл., 2004
ВАК 03.00.23

Диссертация

Биотехнологические аспекты сохранения генетических ресурсов животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы