Биосинтез, препаративное получение, физико-химические свойства изомальтулозосинтазы Erwinia rhapontici и её применение в биотехнологии

Божко, Ольга Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биосинтез, препаративное получение, физико-химические свойства изомальтулозосинтазы Erwinia rhapontici и её применение в биотехнологии
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез, препаративное получение, физико-химические свойства изомальтулозосинтазы Erwinia rhapontici и её применение в биотехнологии"

На правах рукописи

Божко Ольга Юрьевна

БИОСИНТЕЗ, ПРЕПАРАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЗОМАЛЬТУЛОЗОСИНТАЗЫ Е111УтА ШАРОЖ1Ст ЕЁ ПРИМЕНЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Специальность 03.00.04 - Биохимия

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о 2 О КГ 2008

Воронеж 2008

003447393

Работа выполнена в Воронежской государственной технологической академии

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Корнеева Ольга Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Епринцев Александр Трофимович

доктор технических наук, профессор Бирюков Валентин Васильевич

Ведущая организация: Открытое акционерное общество «Государст

венный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ» (ОАО «Гос-НИИсинтезбелок»), г. Москва

Защита состоится «17» октября 2008 года в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете (394006, г. Воронеж, Университетская площадь, 1, кон-ференц-зап).

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан «16» сентября 2008 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.б.н., проф

Грабович М. Ю.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Проблема получения безвредных натуральных сахарозаменителей с пребиотическими свойствами с целью создания функциональных продуктов питания является одной из важнейших медико-социальных проблем профилактики и лечения сахарного диабета, ожирения, метаболитного синдрома и дисбактериоза. Применение натуральных сахарозаменителей в рационе питания полезно также при занятиях фитнесом, спортсменам, для предотвращения кариеса зубов; они применяются в фармацевтической промышленности.

Среди известных технологий производства натуральных сахарозаменителей технологии на основе биокатализа являются наиболее перспективными и конкурентоспособными.

Одним из природных сахарозаменителей является изомальтулоза (б-О-а-О-глюкопиранозид-О-фруктоза) - редуцирующий дисахарид, молекулярная масса, вкус и внешний вид которой схожи с сахарозой. Сладость изомальтулозы составляет 40-60 % сладости сахарозы, калорийность около 2 ккал/г. Основными факторами, определяющими растущий интерес к изомальтулозе, являются: низкий гликемический индекс, низкая калорийность, безвредность для организма, отсутствие постороннего или горького привкуса, натуральное происхождение.

Изомальтулозу получают из сахарозы путем биокатализа под действием фермента изомальтулозосинтазы (ИС, КФ 5.4.99.11), также известного как сахарозоизомераза, а-гликозилтрансфераза, продуцируемого некоторыми микроорганизмами. Поиску активных продуцентов фермента, а также вопросам получения изомальтулозы посвящены работы австралийских ученых L.Wu, R.Birch (2004), немецких исследователей M.McAllister, C.T.Kelly (1990), A.Krastanov, D.BIazheva (2006), H.Kawaguti (2007), D.Zhang, X.Li (2002) и других зарубежных авторов. Однако в России исследования по ферментативной трансформации сахарозы не проводятся. Отечественное производство изомальтулозы отсутствует.

К недостаткам существующих зарубежных технологий производства изомальтулозы следует отнести сравнительно низкую каталитическую активность фермента и недостаточно высокий выход целевого продукта (60-70 %). Кроме того, основным субстратом в реакции, катализируемой ИС, является сахароза. Отсутствуют конкретные данные о способности бифидобактерий развиваться на среде с изомальтулозой, пребиотические свойства углевода изучены недостаточно.

В связи с этим поиск высокоактивных продуцентов ИС, оптимизация процесса биосинтеза фермента, исследование его физико-химических характеристик с целью интенсификации процесса трансформации сахарозы являются актуальной задачей и имеют важное теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось получение высокоактивной изомальтулозосинтазы микробного происхождения, исследование ее физико-химических характеристик с целью разработки биотехнологии натурального бифидогенного сахаро-заменителя изомальтулозы.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• выбор активного продуцента ИС;

• оптимизация условий биосинтеза целевого фермента;

• получение очищенного ферментного препарата ИС и изучение его физико-химических свойств и кинетических характеристик;

• определение рациональных условий биотрансформации сахарозы;

• исследование пребиотических свойств полученной изомальтулозы;

• разработка биотехнологии изомальтулозы из возобновляемых источников растительного сырья.

Научная новизна заключается в следующем: подобран высокоактивный продуцент изомальтулозосинтазы ЕгмМа гИароЫШ В-9292, способный трансформировать сахарозу в изомальтулозу. Полученные данные позволяют расширить представления о биохимических и каталитических характеристиках изомальтулозосинтазы. Исследованы физико-химические свойства очищенного ферментного препарата, установлена высокая специфичность, дана термодинамическая характеристика процессов его кислотной и термической инактивации. Изучен процесс биотрансформации сахарозы. Представлен гипотетический механизм метаболического пути изомальтулозы в организме человека и бифидогенно-сти полученного углевода.

сахара-сырца, что удешевит стоимость целевого продукта. По результатам оформлено две заявки на изобретение: № 2006139255/13(042801), получено решение о выдаче патента от 27.08.2008 г., № 2007128643/13 (031 195) приоритет от 25.07.2007 г. Установлены пребиотические свойства полученной изомальтулозы, что позволяет применять данный углевод в качестве компонента питательной среды в биотехнологиях пробио-тиков, а также для профилактики и лечения дисбактериозов.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на отчетных научных конференциях ВГТА (2004-2006 гг.), межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2006, 2007); 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пу-щино, 2006); V-й Международной научно-технической конференции «Техника и технология пищевых производств» (Могилев, 2006); Московском Международном форуме «Биотехнология и современность» (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской научной молодежной конференции «Основные направления функционального питания и безопасность пищевых продуктов» (Улан-Удэ, 2006); Общероссийской конференции молодых ученых «Пищевые технологии» (Казань, 2006-2007); четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), 2-ом международном форуме «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2006); V Всероссийской научно-практической конференции «Роль социальных, медико-биологических и гигиенических факторов в формировании здоровья населения» (Пенза, 2007), международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008).

Данная работа была представлена на конкурс инновационных проектов в рамках Воронежского Промышленного Форума (2008 г.), отмечена дипломом, а также на конкурс молодых ученых, проходивший в рамках международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (2008 г.), награждена дипломом и медалью

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 26 работ.

на 151 странице машинописного текста. Иллюстративный материал включает 36 рисунков и 24 таблицы. Библиография включает 182 наименований, в т. ч. 104 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, определены цели и задачи исследований.

ГЛАВА 1. Обзор литературы. Представлена классификация и общая характеристика подслащивающих веществ. Приведена сравнительная оценка различных микроорганизмов - продуцентов ИС. Рассмотрены современные представления о локализации фермента в бактериальной клетке, а также способы получения ферментных препаратов ИС. Проведен сравнительный анализ физико-химических и каталитических свойств фермента различного происхождения.

Представлены данные зарубежных ученых и отмечена перспективность применения изомальтулозы, полученной в результате трансформации сахарозы, в производстве диетических, диабетических продуктов, а также в продуктах питания функционального назначения.

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования.

Основным объектом исследования служила чистая культура бактерий Ештга гкароШт штамм В-9292, полученная из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ, г. Москва). Глубинное культивирование бактерий Е. гЬаропИсг В-9292 проводили в колбах емкостью 1 ООО мл в термостате, содержащих по 400 мл питательной среды исследуемого состава, в течение 48-54 ч при температуре 28-30°С.

Определение активности ИС осуществляли по количеству образующихся редуцирующих Сахаров в процессе трансформации сахарозы, согласно методу Сомоджи-Нельсона. За единицу ферментативной активности принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкМ изомальтулозы за 1 мин в стандартных условиях. Идентификацию продуктов ферментативной реакции проводили с помощью тонкослойной и газо-жидкостной хроматографии.

Математическое планирование эксперимента. Для построения математической модели в виде полинома второго порядка при подборе оптимальных условий трансформации сахарозы в изомальтулозу ферментом ИС выбрано центральное композиционное ротатабельное планирование.

Выделение и очистка фермента. Для получения высокоочищен-ного препарата ИС была использована схема очистки, включающая следующие стадии: получение экстракта фермента, гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-25, ионообменную хроматографию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, гель-хроматографию на колонке с сефадексом G-150. Контроль гомогенности ИС проводили путем электорофореза в по-лиакриламидном геле (ПААГ) по методу Дэвиса. Окрашивание белковых полос осуществляли, используя нитрат серебра.

Определение молекулярной массы нативного фермента проводили методом гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-150, а также электрофорезом в 10 %-ном ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН).

Определение константы Михаэлиса осуществляли по Диксону и Уэббу.

Пребиотические свойства изомальтулозы оценивали по росту и развитию пробиотической культуры бифидобактерий Bifidobacterium Ы-fidum in vitro. Культивирование бактерий проводили на среде Блаурокка в модификации Г.И. Гончаровой. Состав среды (г/л): пептон - 10; NaCl - 5; агар-агар - 0,75; лактоза - 10; L-цистеин или цистеин солянокислый - 0,1; печеночный отвар.

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили в 3-4 -кратной повторности. Для определения достоверности результатов применяли метод вариационной статистики. В таблицах и на рисунках приведены данные типичных опытов, где каждое значение есть среднее арифметическое. При математической обработке использовали статистический критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. Биосинтез ИС и исследование физико-химических свойств фермента

Выбор активного продуцента КС В результате поиска микроорганизмов был выбран продуцент ИС - бактерии Е. rhapontici В-9292 (табл. 1). Активность фермента в 20-30 раз превышала значение таковой среди известных микроорганизмов - продуцентов фермента.

Изучены некоторые культуральные и морфологические признаки бактерий Е. rhapontici В-9292. Исследована локализация фермента ИС в бактериальной клетке. Установлено отсутствие активности фермента в фильтрате культуральной жидкости. Ультразвуковое разрушение бактериальных клеток не приводило к увеличению количества растворенного

фермента. Показано, что максимальная активность ИС сконцентрирована в биомассе бактериальных клеток.

Таблица 1

Сравнительная характеристика микроорганизмов -продуцентов ИС

Продуцент Активность, E/r Выход изомальтулозы, % Патогенность для человека

Agrobacterium radiobacter 12±0,12 12±0,2 -

Klebsiella sp. IX 3 30±0,5 90±1,5 +

Erwinia rhapontici 1850±26,3 75±1,2 -

Leuconoslac mesenteroides 80±1,2 20±0,2 -

Pantoea dispersa 75±S,3 80±1,3 -

Protaminobacter rubrum 30±0.4 85л 1,4 -

Pseudomonas mesoacidophila 400±5,3 10±0,12 -

Serratia piymuthica 300±5,1 72±1,2 +

Влияние различных источников углерода и азота на биосинтез ИС.

Установлен индуцибельный характер биосинтеза фермента при культивировании Е. гИаропИс1 В-9292 на средах с различными углеводами (4 %). Так, уровень активности ИС на среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу, лактозу, изомальтулозу, мальтозу был наименьшим (рис. 1). Культивирование бактерий на средах с фруктозой приводило к увеличению активности фермента до 1490 Е/г.

Рис. I. Влияние источников углерода на активность ИС при культивировании Е. гИаропйа. 1 - без углевода. 2- глюкоза, 3-фруктоза, 4-сахароза., 5-мальтоза, 6-изомальтулоза. 7-лактоза

Рис. 2. Исследование процесса биосинтеза ИС на среде с содержанием тростникового сахара-сырца. 1- свекловичнаый сахар. 2-тростниковый сахар-сырец

Максимальная активность ИС 1850 Е/г была обнаружена при введении в состав питательной среды сахарозы.

Показано, что наиболее активный синтез фермента обеспечивало содержание сахарозы в среде в концентрации 10 %.

Известно, что источником сахарозы, кроме сахарной свеклы, может служить сахарный тростник. Кроме того, используемый с целью получения сахарозы тростниковый сахар-сырец в 1,7 раза дешевле сахарозы свекловичного происхождения. В связи с этим нами была предпринята попытка удешевления питательной среды для культивирования Е. гкаропНа В-9292 путем замены чистой сахарозы как источника углерода на тростниковый сахар-сырец. Как показали результаты исследований (рис. 2), активность ИС Е. гЬаропИи В-9292 при культивировании на среде, содержащей в качестве источника углерода сахарозу свекловичного происхождения, практически не отличалась от активности фермента, синтезированного на среде, содержащей тростниковый сахар-сырец.

При изучении влияния источников азота на биосинтез ИС использовали минеральные соли: (Ш4)2504, КШз, 1МН4С1 и источники органического азота: гидролизат казеина, пептон, кукурузный экстракт (рис. 3). Установлено, что наилучшая биосинтетическая способность бактерий наблюдалась

Источники азота

при внесении в питательную Рис. 3. Влияние источников азота на биосинтез СреДУ ИСТОЧНИКОВ органическо-ИС Е. гИаропЧси 1- (КН4)2Х04,2- К!ЧО<. 3- г ^ п

МВД, 4- гидролизат казеина. 5- пептон, 6- куку- го а30™' а Именно пептона. Вне-

рузный экстракт сение минеральных солей по-

давляло синтез фермента на 80-90 %. Концентрация пептона 3 % обеспечивала максимальный биосинтез ИС.

Факторы, влияющие на биосинтез ИС Е. rhapontici В-9292. Интенсивному образованию ферментов способствует ряд условий, среди которых величина pH, температура культивирования и аэрация процесса занимают важное место. Было установлено, что максимальный биосинтез фермента наблюдался при pH 7,5 и температуре 30 °С к 54 ч культивирования бактерий. Наибольшее значение изомальтулозосинтазной активности было получено при соотношении объема среды к объему кислорода 1:2,5.

Получение очищенного ферментного препарата ИС и исследование его свойств. Для изучения физико-химических свойств ИС бактерий Е. rhapontici В-9292, культивируемых органогетеротрофно, была проведена очистка фермента. Результаты очистки представлены в таблице 2.

Таблица 2

Очистка ИС Е. rhapontici В-9292

Стадия очистки Общий объем, мл Белок Активность Степень очистки j Выход, %

t s U S в" 1 ю О с: 1 ш § 1 Удельная, ФЕ/мг белка

Гомогенат 4,0 32,8± 0,8 131,2± 2,3 2563,0 ±62,3 10252,0± 170,2 78,14± 2,6 1 100

Гель-фильтрация на 0-25 3,5 14,9± 0,2 52,0± 1,3 1971,3 ±45,6 6899,6± 112,4 132,7± 2,2 1,7 67,3

Ионообменная хроматография наДЭАЭ-целлюлозе 3,2 0,8 5± 0,01 2,73± 0,11 1121,3 ±25,3 3588,2± 52,1 1314,4± 20,3 16,8 35,0

Гель-хроматография наG-150 1Д 0,3± 0,003 0,3б± 0,009 1068,0 ±17,8 1281,5± 18,4 3560,0± 80,3 45,6 12,5

В результате был получен ферментный препарат с удельной активностью 3560 Е/мг белка, степень очистки составила 45,6 раза.

Проведенный электрофоретический анализ очищенного препарата показал, что в полиакриламидном геле с помощью нитрата серебра проявлялась одна белковая полоса с Яг 0,45 (рис. 4), что свидетельствует о гомогенности ферментного препарата. Определенная гель-

хроматографией на сефадексе П-150 молекулярная масса нативного фермента ИС составила 73,0±1,2 кДа. С помощью ДДС-Ыа-ПААГ-электрофореза установлено, что фермент является мономером (рис.4).

Рис. 4. Электрофореграмма очншснной ИС Е. гИаропНа В-9292

1 - иеллюлаза (94.6 кДа);

2 - бычий сывороточный белок (66.2 кДа);

3 - яичный альбумин (45 кДа).

4 - карбоангидраза (31 кДа);

<—Р 5 - ингибитор трипсина (2!,5 кДа);

6 - лизоцим (14,4 кДа);

7 - ИС

Р-&лкшая паюса Р Р-фроет красителя

Исследование влияния рН и температуры на активность ферментного препарата ИС. Для определения рН-оптимума действия фермента проводили трансформацию сахарозы в интервале рН 4,0-8,0. Результаты исследования показали, что оптимум рН лежит в пределах 5,56,5. Максимальная активность ИС наблюдалась при температуре 30 °С.

Исследование кинетики кислотной и термической инактивации ИС. Нами была изучена кинетика кислотной и термической инактивации очищенной ИС. Инактивацию фермента Е. гЬаропИс/ В-9292 проводили в интервале рН 4,0-8,0 в 0,1 М ацетатном (в кислой зоне рН) и в фосфатном (в щелочной зоне рН) буфере.

Раствор фермента инкубировали при температуре 20-60 °С. В процессе инактивации контролировали изменение изомальтулозосинтазной активности. По истечении определенных промежутков времени отбирали пробы из инкубационной среды и определяли активность. Наибольшую стабильность фермент проявлял в зоне рН 6,0-7,0. Изменение рН как в кислую, так и в щелочную область приводило к увеличению константы скорости инактивации в 3-5 раз. При температуре 20-30 °С (табл. 3) скорость инактивации была незначительной. В интервале температуры 4050 °С константа инактивации увеличивалась в 10-12 раз. Следовательно, температура является наиболее значимым фактором инактивации ИС.

Таблица 3

Влияние температуры и рН на константу скорости инактивации ИС Е. гкаропйй В-9292

Температура, °С К(ч') прирН

4,0±0,1 5,0±0,1 6,0±0,1 7,0±0,1 8,0±0,1

20±0,3 0,0813± 0,002 0,0101± 0,0002 0,0049± 0,0001 0,0134± 0,0002 0,0283± 0,0004

30±0,3 0,704± 0,017 0,3567± 0,0041 0,1393± 0,0021 0,1054± 0,0017 0,6932± 0,0112

40±0,6 1,2711± 0,031 0,5706± 0,0081 0,3020± 0,0072 0,4468± 0,0065 1,5854± 0,0213

50±0,8 5,0799± 0,125 2,3019± 0,0031 1,7855± 0,0441 3,4469± 0,0541 5,8728± 0,0082

Специфичность действия ИС. Исследование субстратной специфичности ферментного препарата ИС Е. гЬаропйа В-9292 имеет важное значение для биотехнологии изомальтулозы, полученной в результате трансформации сахарозосодержащих источников растительного сырья. В связи с этим нами была исследована активность очищенного ферментного препарата по отношению к различным сахарам. В качестве субстратов были испытаны следующие: трегалоза, лактоза, раффиноза, стахиоза, инулин, леван. Активность фермента определяли по начальной скорости

трансформации субстрата при 30 °С и рН 6,0.

Определение кинетических характеристик ИС при трансформации различных субстратов показало, что фермент является высокоспецифичным по отношению к сахарозе, Кт = 62,5±1,02 8'м мМ (рис. 5). Такие сахара

как раффиноза, стахиоза, Рис. 5. Зависимость скорости ферментативной ИНуЛИН И леван оказались

реакции от концентрации сахарозы ,„

г полностью нереакцион-

носпособными при действии фермента (Утах= 0).

Влияние углеводов на активность ИС. Учитывая перспективу использования фермента ИС Е. гЬаропйсг В-9292 в проведении процесса трансформации сахарозосодержащих субстратов растительного происхождения, а также промежуточных продуктов в процессе промышленного получения сахара-песка, нами было изучено влияние возможных сопутствующих веществ на активность фермента. Наибольшее значение среди таковых имеют углеводы, такие как глюкоза, фруктоза, трегалоза, мальтоза, раффиноза, изомальтулоза, а также ионы некоторых металлов. Для этого процессу трансформации подвергался 4 %-ный раствор сахарозы, который служил контролем.

Таблица 4 ,,

Влияние углеводов на активность ИС Углев°Ды попеременно вносили в реакционную смесь. Как видно из таблицы 4, присутствие таких Сахаров, как фруктоза, изомальтулоза, трегалоза, мальтоза, раффиноза практически не оказывало влияния на активность фермента. Однако присутствие глюкозы в смеси снижало активность ИС на 9,5 % при концентрации глюкозы 1 % и на 93,8 % при концентрации 5 %. Установлено, что присутствие глюкозы в реакционной смеси оказывало ингибиторное воздействие на фермент ИС.

Влияние ионов металлов на активность ИС. Незначительное активирующее действие на фермент оказывали ионы Са2+, М§2+, Ва2+. Так, при введении в реакционную смесь сульфата магния или хлорида бария в концентрации 10 мМ активность фермента возрастала в 1,3 и 1,4 раза по сравнению с контролем. Ионы К+, Си2+, А§3+ снижали активность ИС в 1,2-1,8 раза, причем с повышением их концентрации ингибирующий эффект усиливался. Сильным ингибитором фермента являются ионы Мп2+ и Бе3*. Присутствие хлорида марганца или хлорида железа снижало активность ИС на 52,8-57,0 %. Введение в состав

Относительная активность ИС, %

Углеводы при концентрации Сахаров:

1 % 5%

контроль (сахароза 4 %) 100±1,6 100±1,6

глюкоза 90,5±1,2 6,25±0,1

фруктоза 9б,2±1,6 92,1±0,6

изомальтулоза 98,4±1,3 96,1±1,3

трегалоза 98,8±1,2 94,1±1,4,

мальтоза 100±1,6 100±1,6

раффиноза 99,3±1,1 98,3±1,3

реакционной смеси ЭДТА, как хелатора металлов, практически не влияло на активность ИС.

ГЛАВА 4. Биотехнология природного сахарозаменителя - изо-мальтулозы из возобновляемых источников растительного сырья

Влияние дозировки фермента на процесс трансформации сахарозы. Высокая активность ферментного препарата открывает большую перспективу его практического применения в биотехнологии. Нами исследовано влияние концентрации ИС Е. гИарошШ В-9292 на процесс трансформации 4 % раствора сахарозы при рН 6,0 и температуре 30 °С. Фермент вносили в количестве 1-15 Е/мг сахарозы с шагом 1 Е/мг (рис.

дозировках. Однако к 3 ч процесса степень трансформации была максимальной и составляла 90-95 %. Из этого следует, что увеличение дозировки фермента выше 5 Е/мг субстрата не целесообразно.

Важным фактором, от которого зависит действие фермента, является концентрация субстрата. Нами исследовано влияние концентрации са-

6).

Из рисунка видно, что при низкой дозировке фермента (1-3 Е/мг субстрата) степень трансформации сахарозы не превышала 80 % за весь исследованный период. При внесении фермента в большем количестве (5-15 Е/мг субстрата) отмечено увеличение скорости трансформации сахарозы в первые 2-2,5 ч при всех

Рис. 6 Динамика трансформации сахарозы при различной дозировке фермента (Е/мг сахарозы) 1-1, 2-3, 3-5, 4-7, 5-9, 6-11, 7-13, 8-15 СТ - степень трансформации

харозы на процесс трансформации при рН 6,0 и температуре 30 °С. Сахарозу вносили в концентрациях 5-50 % с шагом 2 Е/мг при оптимальной концентрации фермента (5 Е/мг субстрата). Кинетику процесса изучали в

Т ч

Рис. 7. Влияние концентрации сахарозы (%) на степень трансформации при дозировке ИС 5 Е/мг сахарозы 1-Ю, 2-5, 3-15, 4-20, 5-30, 640, 7-50 СТ -степень трансформации

течение 3 ч (рис. 7). Установлено, что при увеличении концентрации сахарозы от 5 до 10 % степень трансформации повышалась. Если при концентрации сахарозы 5 % она составляла 88,6 % за 3 ч, то при концентрации 10 % была максимальной и достигала 95 %. Дальнейшее увеличение концентрации сахарозы от 15 до 50 % приводило к снижению выхода изомальтулозы за указанный промежуток времени, что возможно объясняется образованием промежуточного неактивного комплекса, т. е. субстратным ингибированием.

Таким образом, максимальный выход конечного продукта изомальтулозы (92-95 %) достигается при концентрации субстрата 10 %, дозировке фермента 5 Е/мг субстрата, продолжительности процесса 3-3,5 ч.

Подбор оптимальных условий процесса трансформации сахарозы. Для исследования взаимодействия факторов, влияющих на процесс трансформации сахарозы ИС Е. гИаропйй В-9292, были применены математические методы планирования эксперимента.

Для построения математической модели в виде полинома второго порядка выбрано центральное композиционное ротатабельное планирование. В результате статистической обработки экспериментальных данных по известной методике получено уравнение регрессии, адекватно описывающее при 5-ти % уровне значимости зависимость степени трансформации от исследуемых факторов (в кодированном, безразмерном виде), у = 64,4 - 11,92 А', -10,86*2 + 6,0Х1 Х2 - 7,1Х,2 - 3,58Х\

Полученная математическая модель исследуемого процесса позволяет решить как прямую задачу, т. е. по известным значениям дозировки фермента и концентрации субстрата прогнозировать значение степени трансформации, так и обратную задачу - по заданному значению степени трансформации и одному из факторов определить другой неизвестный.

Ферментативная трансформация тростникового сахара-сырца. Известно, что основным источником получения изомальтулозы является сахароза, полученная из сахарной свеклы. Недостатком известного способа является высокая себестоимость продукта за счет использования дорогостоящего субстрата.

В связи с этим нами проводились исследования по изучению процесса трансформации сахарозосодержащего сырья растительного происхождения, а именно тростникового сахара-сырца (рис. 8).

Трансформацию 10 %-ного субстрата проводили с использованием биомассы бактериальных клеток Е. rhapontici В-9292 активностью 2800 Е/г. Установлены рациональные режимы процесса биотрансформации тростникового сахара-сырца: температура 30 °С; рН 6,0; дозировка фермента 5 Е/мг сахарозы и продолжительность процесса 3-3,5 ч.

ГЛАВА 5. Исследование пребиотических свойств изомальтулозы

Известно, что бифидобактерии являются наиболее значимыми представителями нормобиоценоза. Это анаэробные бактерии, морфологически представляющие собой крупные грамположительные неспоро-образующие палочки с раздвоенными концами, способные к полиморфизму.

С целью определения пребиотических свойств полученной изомальтулозы осуществляли культивирование пробиотической культуры Bifidobacterium bifidum in vitro на среде с ее содержанием. Данные по динамике роста В. bifidum на различных источниках углерода (рис. 9) показали, что микроорганизмы способны к росту на всех испытанных средах.

Ift

1Л

оя

-о- сахароза сахар-сырец

Рис. 8. Зависимость выхода изомальтулозы (%) от продолжительности процесса трансформации

1) 12 24 5Ь 4» Ю

т, ч

Рис. 9. Динамика накопления биомассы В. Ь'фЛит на средах с различными углеводами. 1-изомальтулоза, 2-лактоза, 3-трегалоза, 4-инулин, 5-фруктоза, 6-без углевода ОО - показатель оптической плотности

Максимальное накопление биомассы наблюдалось к 48 ч процесса культивирования бактерий. Однако внесение того или иного источника углерода оказывало различное

влияние на скорость и ин- ы-----т-

тенсивность роста бифидо- I

бактерий. Наилучшее влияние обеспечивали такие углеродные субстраты, как изомальтулоза и лактоза (рис. 10). Так, к 24 ч культивирования микроорганизмов количество биомассы на среде с изо-мальтулозой было в 1,4 раза больше по сравнению с инулин содержащей средой и в 3,5 раза больше по сравнению с биомассой в контроле, выращенной без источника углерода. Это согласуется с литературными данными о том. что бифидобактерии потребляют глюкозу, галактозу, большое число олигосахаридов, в том числе фруктоолигосахариды, а из полисахаридов -только инулин.

Интенсивность метаболических процессов у бифидобактерии контролировали по изменению рН среды, что служит показателем трансформации Сахаров в орга-

Рис. 10. Нефелометрическое определение биомассы В. Ь'ф(1ит на различных углеводных средах (24

ч). 1 - без углевода. 2 - инулин, 3 - изомальтулоза, 4 -лактоза, 5 - трегалоза, 6 - фруктоза.

нические кислоты как ко-

нечные продукты метаболизма. Из рис. 11 следует, что изменение величины рН коррелирует с ростом и развитием культуры бактерий на среде с изо-мальтулозой.

Также определяли биохимическую активность бифидобактерий по нарастанию титруемой кислотности через каждые 12 часов культивирования. Результа-

т, ч

Рис. 11. Динамика изменения рН среды культивирования В. Ы/Шит на средах с различными углеводами: 1-изомальтулоза, 2-лактоза, 3-трегалоза, 4-инулин, 5-фруктоза, 6-без углевода

ты исследований представлены в таблице 5.

Таблица 5

Кислотообразующая способность В. bifulum на средах с различными углеводами

Т, ч Титруемая кислотность, °Т

без углевода лактоза изомальтулоза

0 19±0,25 21 ±0,3 5 21 ±0,3 5

12 31±0,51 40±0,66 42±0,67

24 52±0,82 68±1,12 68± 1,13

36 65±1,04 76±1,27 79±1,32

48 87±1,43 108±1,8 112±1,6

Высокая активность роста, уровень накопления биомассы, продукции органических кислот при культивировании бифидобактерий на среде с содержанием изомальтулозы свидетельствуют о том, что данный заменитель сахара обладает пребиотическими свойствами. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что изомальтулоза может применяться как компонент среды в биотехнологиях пробиотиков, поскольку среда с содержанием изомальтулозы в качестве углеводного компонента пригодна для роста бифидобактерий.

Способность изомальтулозы увеличивать скорость и интенсивность роста бифидобактерий in vitro свидетельствует о возможности включения данного сахарозаменителя в рацион питания людей для профилактики диареи, колитов и других заболеваний желудочно-кишечного тракта человека, а также с целью поддержания нормобиоценоза кишечника.

Технология получения изомальтулозы. Установленные рациональные параметры процесса культивирования микроорганизмов Е. rhapontici В-9292 и трансформации сахарозы из различных источников растительного сырья послужили основой для разработки технологии получения изомальтулозы. Блок-схема получения изомальтулозы представлена на рис. 12.

Рис. 12. Блок-схема получения изомальтулозы

выводы

1. В результате скрининга микроорганизмов выбран высокоактивный продуцент изомальтулозосинтазы - бактерии Е. rhapontici В-9292, каталитическая активность фермента - 3000 Е/г, что в 20-30 раз превышает значение таковой среди известных продуцентов фермента.

2. Подобраны оптимальные условия для глубинного культивирования бактерий Е. rhapontici и биосинтеза ими изомальтулозосинтазы, что позволило увеличить исходный уровень активности фермента в 1,5-2 раза.

3. Разработана схема очистки изомальтулозосинтазы, при которой удельная активность фермента составляет 3560 Е/мг белка. Установлено, что фермент является мономером с молекулярной массой 73,0±1,2 кДа.

4. Установлены оптимальные значения рН и температуры изомальтулозосинтазы, при которых фермент проявляет наибольшую стабильность. Оптимум рН и температурный оптимум составляют соответственно 6 и 30 °С.

5. Установлено, что фермент изомальтулозосинтаза проявляет высокое сродство к сахарозе (Кт= 62,5±1,02 мМ). Раффиноза, стахиоза, инулин, леван оказались полностью нереакционноспособными при действии фермента.

6. Разработаны рациональные условия процесса биотрансформации сахарозы свекловичного происхождения, а также тростникового сахара-сырца с использованием изомальтулозосинтазы, позволяющие увеличить выход изомальтулозы до 92 - 95 %.

7. Выявлено, что культивирование бифидобактерий Bifidobacterium bifi-dum in vitro на среде с содержанием изомальтулозы отличается высокой активностью их роста, уровнем накопления биомассы, продукцией органически х кислот, что свидетельствует о пребиотических свойствах данного заменителя сахара.

8. Разработан гипотетический механизм бифидогенности изомальтулозы.

9. Получен натуральный заменитель сахара из источников растительного сырья, биотехнология которого может быть положена в основу его промышленного производства.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Корнеева О.С. Изомальтулоза - природный заменитель сахара /

О.С. Корнеева, О.Ю. Божко // Фундаментальные исследования. -М.: «Академия естествознания», 2005. - № 10.- С. 34-35.

2. Корнеева О.С. Изомальтулоза - природный заменитель сахара /

0.С. Корнеева, О.Ю. Божко // Материалы XLHI отчетной научной конференции за 2004 год. - Воронеж, 2005. - Ч. 1. - С. 91.

3. Корнеева О.С. Об активности изомальтулозосинтазы микробного

происхождения /О.С. Корнеева, О.Ю. Божко // Материалы XLIV отчетной научной конференции за 2005 год. - Воронеж, 2006. - Ч.

1.-С. 67-70.

4. Корнеева О.С. Использование бактерий рода Leuconostoc с целью

получения изомальтулозосинтазы / О.С. Корнеева, О.Ю. Божко // Материалы V-й Международной научно-технической конференции «Техника и технология пищевых производств». - Могилев, 2006.-С. 57.

5. Корнеева О.С. Изомальтулоза, изомапьт в свете современных исследований / О.С. Корнеева, О.Ю. Божко // Сборник тезисов 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2006. - С. 358.

6. Корнеева О.С. Биосинтез изомальтулозосинтазы Leuconostoc mes-enteroides subsp. mesenteroides / О.С. Корнеева, О.Ю. Божко, М.М. Корнеева // Успехи современного естествознания. - М. : «Академия естествознания», 2006. - № 10. - С. 75.

7. Корнеева О.С. Ферменты микробного происхождения и их при-

менение в пищевой промышленности / О.С. Корнеева, B.C. Кап-ранчиков, О.Ю. Божко // Материалы VII международного форума «Биотехнология и современность». - СПб., 2006. - С. 43-44.

8. Божко О.Ю. Изомальтулоза - перспективный заменитель сахара / О.Ю. Божко, О.С. Корнеева // Материалы Всероссийской научной молодежной конференции с международным участием «Основные направления функционального питания и безопасность пищевых продуктов». - Улан-Удэ, 2006. - С. 10.

9. Корнеева О.С. Биосинтез изомальтулозосинтазы Leuconostoc mes-

enteroides / О.С. Корнеева, О.Ю. Божко // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегиональный сборник научных работ. - Воронеж, 2006 - Вып. 8. - С. 111-114.

10. Божко О.Ю. Биотехнология изомальтулозы / О.Ю. Божко, О.С. Корнеева // Материалы общероссийской конференции молодых ученых «Пищевые технологии». - Казань, 2006. - С. 106-107.

11. Корнеева О.С. Динамика биосинтеза изомальтулозосинтазы в процессе культивирования Leuconostoc mesenteroides / О.С. Корнеева, О.Ю. Божко // Материалы 2-го международного форума «Актуальные проблемы современной науки». - Самара, 2006. - С. 54.

12. Применение продуктов микробного синтеза в пищевой промышленности и биотехнологии / О.С. Корнеева, О.Ю. Божко, И.В. Черемушкина, Т.В. Свиридова, B.C. Капранчиков, H.A. Чигорина, Е.А. Мотина, Т.Н. Фурсова // Материалы Четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва, 2007. - Ч. 2. - С. 176-177.

13. Применение ионообменной хроматографии как основного этапа в процессе очистки изомальтулозосинтазы Erwinia rhapontici и липазы Yarrowia lipolytica / А.Н. Ивентьев|, О.С. Корнеева, B.C. Капранчиков, Е.А. Мотина, О.Ю. Божко // VIII Всероссийская конференция молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии». - Казань, 2007. - С. 197.

14. Божко, О. Ю. Биосинтез изомальтулозосинтазы Erwinia rhapontici / О. Ю. Божко, О. С. Корнеева // VIII Всероссийская конференция молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии». - Казань, 2007. - С. 209.

15. Корнеева, О. С. Получение очищенного ферментного препарата

изомальтулозосинтазы Erwinia rhapontici / О. С. Корнеева, |А. Н.

Ивентьев[, О. Ю. Божко // Материалы ХЦУ отчетной научной конференции за 2006 год. - Воронеж, 2007. - Ч. 1. - С. 103-104.

16. Корнеева О.С. Получение и свойства изомальтулозосинтазы бактерий ЕпуШа гкаропйс'г / О.С. Корнеева, О.Ю. Божко, А.Н. Ивентьев| // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегиональный сборник научных работ. - Вып. 9. - Воронеж, 2007.- С. 87-91.

17. Божко О.Ю. Изомальтулоза - заменитель сахара для продуктов питания функционального назначения II О.Ю. Божко, О.С. Корнеева / Роль социальных, медико-биологических и гигиенических факторов в формировании здоровья населения : сборник

18. Божко О.Ю. Ионообменная хроматография как важнейший этап очистки изомальтулозосинтазы из бактерий Етта гИароШШ II О.Ю. Божко, ¡А.Н. Ивентьев, О.С. Корнеева / Сорбционные и хроматогра-

фические процессы. - 2007. - Т. 7. - Вып. 3. - С. 465-468.

19. Корнеева О.С. Биотехнология изомалътулозы - природного заменителя сахара // О.Ю. Божко, О.С. Корнеева / Вестник ВГТА. - 2007. № 12.-С. 34-39.

20. Корнеева О.С. Превращение сахарозы в изомальтулозу - природный заменитель сахара // О.С. Корнеева, О.Ю. Божко / Хранение и переработка сельхозсырья. - 2008. № 1. - С. 54-56.

21. Божко О.Ю. Разработка ферментативного способа получения изо-мальтулозы - натурального сахарозаменителя с функциональными свойствами // О.Ю. Божко, О.С. Корнеева / Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». - Москва, 2008. - С. 246.

22. Корнеева О.С. Биотехнология изомальтулозы - природного заменителя сахара с пребиотическими свойствами // О.С. Корнеева, О.Ю. Божко, Г.П. Шуваева / Биотехнология. - 2008. - № 2. - С. 46-50.

23. Корнеева О.С. Оптимизация процесса трансформации сахарозы в изомальтулозу - природный заменитель сахара И О.С. Корнеева, О.Ю. Божко, [А.Н. Ивентьев / Материалы ХЬУ! отчетной научной конфе-

ренции за 2007 год. - Воронеж, 2008. - Ч. 1. - С. 63-64.

24. Божко О.Ю. Исследование пребиотических свойств изомальтулозы -натурального сахарозаменителя / О.Ю.Божко, О.С.Корнеева, Г.П. Шуваева// Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегиональный сборник научных работ. - Воронеж, 2008,-Вып. 10.-С. 46-51.

25. Bozhko O.U. Working out of the biocatalytic technology the new natural sugar substitute with prebiotic properties / O.U. Bozhko, O.S. Korneyeva // Materials of the 2th International Conference "Biocatalysis in Non-Conventional Media". - Moscow, 2008. - P. 36.

26. Корнеева О.С. Физиолого-биохимические свойства бактерий Erwinia rhapontici - продуцентов изомальтулозосинтазы // О.С. Корнеева, О.Ю. Божко, З.М. Мангуева / Прикладная биохимия и микробиология. - 2008. - Т. 44, № 6.- С. 626-631.

Работы № 18, 20, 22, 26 опубликованы в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК.

Подписано в печать^Й^^Бумага для множительных аппаратов. Печать офсетная. Усл. п.л.1,0. Тираж 100 экз. Заказ,

Отпечатано в типографии ФГУ «Воронежский ЦНТИ» 394730, г.Воронеж, пр.Революции, 30

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Божко, Ольга Юрьевна

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Подслащивающие вещества, их классификация и характеристика.

1.1.1. Синтетические подсластители.

1.1.2. Природные подсластители.

1.1.2.1. Подсластители белкового типа.

1.1.2.2. Подсластители гликозидного типа.

1.1.3. Сахарные спирты.

1.1.4. Фруктоолигосахариды.

1.1.5. Сладкие вещества на основе сахарозы.

1.2. Характеристика изомальтулозосинтазы.

1.2.1. Микробный синтез изомальтулозосинтазы.

1.2.1.1. Продуценты изомальтулозосинтазы.

1.2.1.2. Факторы, влияющие на биосинтез изомальтулозосинтазы при культивировании продуцентов.

1.2.2. Локализация изомальтулозосинтазы в бактериальной клетке.

1.2.3. Методы выделения и очистки микробной изомальтулозосинтазы.

1.2.4. Физико-химические свойства изомальтулозосинтазы.

1.2.5. Специфичность действия зомальтулозосинтазы.

1.2.6. Практическое применение изомальтулозы.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Оживление чистой культуры бактерий.

2.1.2. Культивирование бактерий Е. rhapontici В-9292.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Определение активности изомальтулозосинтазы.

2.2.2. Количественное определение глюкозы.

2.2.3. Количественное определение сахарозы.

2.2.4. Качественный анализ Сахаров.

2.2.4.1. Тонкослойная хроматография.

2.2.4.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

2.2.5. Определение степени трансформации сахарозы.

2.2.6. Биохимические и микробиологические методы исследования.

2.2.7. Выделение и очистка фермента.

2.2.8. Определение молекулярной массы нативного фермента.

2.2.8.1. Определение молекулярной массы белка методом электрофореза.

2.2.8.2. Определение молекулярной массы белка методом гель-хроматографии.

2.2.9. Определение гомогенности ферментного препарата.

2.2.10. Статистическая обработка данных.

Глава 3. БИОСИНТЕЗ ИЗОМАЛЬТУЛОЗОСИНТАЗЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТА

3.1. Скрининг микроорганизмов, обладающих изомальтулозосинтазной активностью.

3.2. Характеристика некоторых культуральных признаков бактерий Erwinia rhapontici В-9292.

3.3. Изучение локализации изомальтулозосинтазы бактерий Erwinia rhapontici В-9292.

3.4. Влияние различных источников углерода и азота на биосинтез изомальтулозосинтазы.

3.5. Факторы, влияющие на биосинтез изомальтулозосинтазы Erwinia rhapontici В-9292.

3.6. Получение ферментного препарата изомальтулозосинтазы и исследование его свойств.

3.6.1. Очистка изомальтулозосинтазы Erwinia rhapontici В-9292.

3.6.2. Определение молекулярной массы фермента.

3.7. Исследование некоторых физико-химических свойств изомальтулозосинтазы.

3.8. Кислотная и термическая инактивация изомальтулозосинтазы.

3.9. Специфичность действия изомальтулозосинтазы.

3.10. Исследование влияния углеводов и ионов металлов на активность изомальтулозосинтазы.

3.10.1. Влияние углеводов на активность изомальтулозосинтазы.

3.10.2. Влияние ионов металлов на активность изомальтулозосинтазы.

Глава 4. БИОТЕХНОЛОГИЯ ПРИРОДНОГО

САХАРОЗАМЕНИТЕЛЯ - ИЗОМАЛЬТУЛОЗЫ ИЗ ВОЗОБНОВЛЯЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

4.1. Факторы, влияющие на процесс трансформации сахарозы.

4.2. Подбор оптимальных условий процесса трансформации сахарозы.

4.3. Ферментативная трансформация тростникового сахара сырца.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОМАЛЬТУЛОЗЫ

5.1. Исследование процессов роста и развития бифидокультуры на среде с изомальтулозой.

5.2. Гипотетический механизм метаболизма изомальтулозы в организме человека.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез, препаративное получение, физико-химические свойства изомальтулозосинтазы Erwinia rhapontici и её применение в биотехнологии"

Одним из природных сахарозаменителей является изомальтулоза (6-О-а-Б-глюкопиранозид-В-фруктоза) - редуцирующий дисахарид, молекулярная масса, вкус и внешний вид которой схожи с сахарозой. Сладость изомальтулозы составляет 40-60 % сладости сахарозы, калорийность около 2 ккал/г. Основными факторами, определяющими растущий интерес к изомальтулозе, являются: низкий гликемический индекс, низкая калорийность, безвредность для организма, отсутствие постороннего или горького привкуса, натуральное происхождение.

Изомальтулозу получают из сахарозы путем биокатализа под действием фермента изомальтулозосинтазы (ИС, КФ 5.4.99.11), также известного как сахарозоизомераза, а-гликозилтрансфераза, продуцируемого некоторыми микроорганизмами. Поиску активных продуцентов фермента, а также вопросам получения изомальтулозы посвящены работы австралийских ученых L.Wu, R.Birch (2004), немецких исследователей M.McAllister, C.T.Kelly (1990), A.Krastanov, D.Blazheva (2006), H.Kawaguti (2007), D.Zhang, X.Li (2002) и других зарубежных авторов. Однако в России исследования по ферментативной трансформации сахарозы не проводятся. Отечественное производство изомальтулозы отсутствует.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в получении высокоактивной изомальтулозосинтазы микробного происхождения, исследование ее физико-химических характеристик с целью разработки биотехнологии натурального бифидогенного сахарозаменителя - изомальтулозы.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Выбор активного продуцента ИС.

2. Оптимизация условий биосинтеза целевого фермента.

3. Получение очищенного ферментного препарата ИС и изучение его физико-химических и кинетических характеристик.

4. Определение рациональных условий биотрансформации сахарозы.

5. Исследование пребиотических свойств полученной изомальтулозы.

6. Разработка биотехнологии изомальтулозы из возобновляемых источников растительного сырья.

Научная новизна. Подобран высокоактивный продуцент изомальтулозосинтазы Erwinia rhapontici В-9292, способный трансформировать сахарозу в изомальтулозу. Полученные данные позволяют расширить представления о биохимических и каталитических характеристиках изомальтулозосинтазы. Исследованы физико-химические свойства очищенного ферментного препарата, установлена высокая специфичность, дана термодинамическая характеристика процессов его кислотной и термической инактивации. Изучен процесс биотрансформации сахарозы. Представлен гипотетический механизм метаболического пути изомальтулозы в организме человека и бифидогенности полученного углевода.

Практическая значимость работы. Разработана биотехнология натурального сахар озамените ля изомальтулозы с применением высокоактивной изомальтулозосинтазы бактериального происхождения. Установлены рациональные режимы биотрансформации сахарозы в изомальтулозу, позволяющие увеличить выход конечного продукта до 9295 %. Показана целесообразность получения изомальтулозы из тростникового сахара-сырца, что удешевит стоимость целевого продукта. По результатам оформлено две заявки на изобретение: № 2006139255/13(042801), получено решение о выдаче патента от 27.08.2008 г., № 2007128643/13 (031195) приоритет от 25.07.2007 г. Установлены пребиотические свойства полученной изомальтулозы, что позволяет применять данный углевод в качестве компонента питательной среды в биотехнологиях пробиотиков, а также для профилактики и лечения дисбактериозов.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на конференциях различного уровня. Они были представлены на отчетных научных конференциях ВГТА (2004-2006), межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2006, 2007); 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2006); V-й Международной научно-технической конференции «Техника и технология пищевых производств» (Могилев, 2006); Московском Международном форуме «Биотехнология и современность» (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской научной молодежной конференции «Основные направления функционального питания и безопасность пищевых продуктов» (Улан-Удэ, 2006); Общероссийской конференции молодых ученых «Пищевые технологии» (Казань, 2006-2007); четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007); 2-ом международном форуме «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2006); V Всероссийской научно-практической конференции «Роль социальных, медико-биологических и гигиенических факторов в формировании здоровья населения» (Пенза, 2007), международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008).

Биотехнология. Вода и пищевые продукты», отмечена дипломом и медалью.

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 26 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка использованной литературы и представлена на 151 странице машинописного текста. Иллюстративный материал включает 36 рисунков и 24 таблицы. Библиография включает 182 наименований, в т. ч. 104 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Божко, Ольга Юрьевна

выводы

7. Выявлено, что культивирование бифидобактерий Bifidobacterium bifidum in vitro на среде с содержанием изомальтулозы отличается высокой активностью их роста, уровнем накопления биомассы, продукцией органических кислот, что свидетельствует о пребиотических свойствах данного заменителя сахара.

8. Разработан гипотетический механизм бифидогенности изомальтулозы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследован процесс трансформации сахарозы в изомальтулозу ИС Е. rhapontici В-9292. Установлены оптимальные условия трансформации сахарных растворов: величина рН 6,0, концентрация сахарозы 10 %, дозировка фермента 5 Е/мг сахарозы, температура 30 °С, продолжительность 3- 3,5 ч.

В работе показана возможность получения изомальтулозы из тростникового сахара-сырца. Применение в качестве сырья не только сахарозы свекловичного происхождения, но и тростникового сахара-сырца позволит снизить стоимость целевого продукта по сравнению с зарубежными аналогами, а также открывает широкую перспективу использования различных сахарозосодержащих источников растительного сырья с целью получения изомальтулозы.

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ИЗОМАЛЬТУЛОЗЫ

5.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ РОСТА И РАЗВИТИЯ БИФИДОКУЛЬТУРЫ НА СРЕДЕ С ИЗОМАЛЬТУЛОЗОЙ

Стремительное развитие нового направления в науке о питании -функционального питания - требует создания заменителей сахара нового поколения - не только обладающих чистым сладким вкусом, безопасностью и высокими технологическими характеристиками, но и способных проявлять функциональные свойства, т. е. оказывать положительное регулирующее воздействие на организм в целом, либо на его отдельные органы и системы [4, 22, 27, 30, 36].

В последнее время, после открытия специфического биологического действия некоторых сахарозаменителей (неусваиваемых) и особой их ценности для здоровья человека они стали предметом специального изучения. Было установлено, что некоторые неусваиваемые углеводы являются пребиотиками - веществами, которые не гидролизуются и не всасываются в верхней части желудочно-кишечного тракта, но являются субстратом для полезных бактерий, обитающих в толстом кишечнике. Как все пребиотики, эти вещества регулируют кишечную микрофлору, индуцируют полезные эффекты не только на уровне желудочно-кишечного тракта, но и организма в целом, способствуя поддержанию иммунной системы человека [25, 76].

Известно, что бифидобактерии являются наиболее значимыми представителями нормобиоценоза [10, 26, 37, 43, 44, 72]. В качестве объекта исследования служил типовой вид рода - Bifidobacterium bifidum. Это анаэробные микроорганизмы, морфологически представляющие собой крупные грамположительные неспорообразующие палочки с раздвоенными концами, способные к полиморфизму [21].

Ранее было показано, что бактерии В. bifidum способны к росту на средах с фруктозой, глюкозой, галактозой, лактозой и других углеводах [59]. Данные представлены в таблице 5.1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Божко, Ольга Юрьевна, Воронеж

1. Азрилевич М.Р. Заменители сахара / М.Р. Азрилевич // Пищевые ингридиенты, сырье и добавки. 2002. - № 2. - С. 42-45.

2. Антипова Л.В. Прикладная биотехнология / Л.В. Антипова, И.А. Глотова, А.И. Жаринова. СПб.: ГИОРД, 2003. - 288 с.

3. Биология и микробиология : учебное пособие / Г.П. Шуваева и др.. Воронеж, гос. технолог, акад. Воронеж, 2003. - 300 с.

4. Богатырев А.Н. Качество пищи и культура питания / А.Н. Богатырев // Пищевая промышленность. 2006. - № 8. - С. 68-69.

5. Бугаенко И.Ф. Сахар и заменители // И.Ф. Бугаенко. М. : ООО «Телер», 2004. - 75 с.

6. Бугаенко И.Ф. Тростниковый сахар-сырец и его промышленная переработка на свеклосахарных заводах // И.Ф. Бугаенко, Г.И. Абрамова. -М. : ЦИНТИпищепром, 1964. 32 с.

7. Варфоломеев С.Д. Кинетические методы в биохимических исследованиях / С.Д. Варфоломеев, С.В. Зайцев. М. : Изд-во МГУ, 1982. -343 с.

8. Варфоломеев С.Д. Биокинетика : практический курс / С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич. М. : ФИР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.

9. Влияние гликозидов сахарола на энергетический обмен у животных с нарушенной толерантностью к углеводам / И. Смоляр и др. // Вопросы питания. 1993. - № 1. - С. 38 - 39.

10. Выделение, идентификация и некоторые биологические свойства бифидобактерий из кишечника человека / С.Г. Карпушина и др. // Биотехнология. 1998. - № 2. - С. 28 - 36.

11. Галь Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи. М. : Мир, 1982. - с. 149-258.

12. Ганина В.И. Пробиотики. Назначение, свойства и основы биотехнологии : монография / В.И. Ганина. М. : МГУПБ, 2001. - 169 с.

13. Гаппаров М.М. Новый подсластитель неогесперидин дигидрохалкон (цитроза) / М.М. Гаппаров // Пищевая промышленность. -1999.-№8.-С. 58.

14. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий / Г. Готтшалк. М. : Мир, 1982.-310с.

15. Грачев Ю.П. Математические методы планирования экспериментов / Ю.П. Грачев. М. : Пищ. пром-ть. - 1979. - 192 с.

16. Грачев Ю.П. Математические методы планирования эксперимента / Ю.П. Грачев, Ю.М. Плаксин. М.: ДеЛи принт, 2005. - 296 с.

17. Диксон М. Ферменты. В 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб. М. : Мир, 1982.- 1118 с.

18. Емцев В.Т. Микробиология / В.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. М. : Дрофа, 2006. - 444 с.

19. Жеребцов Н.А. Амилолитические ферменты в пищевой промышленности Текст. / Н.А. Жеребцов. М. : Легкая и пищевая пром-сть, 1984.- 160 с.

20. Жеребцов Н.А. Биохимия: учебник / Н.А. Жеребцов, Т.Н. Попова, В.Г. Артюхов. Воронеж : Изд. Воронежского гос. университета, 2002. -696 с.

21. Иммуностимулирующее влияние перорального введения бифидобактерий различных штаммов в эксперименте / Э.Н. Трушина и др. // Вопросы питания. 2006. - Т. 75. - № 5. - С. 70 - 74.

22. Казьмин В.Д. Диабет. Секреты его компенсации, профилактика, лечение осложнений / В.Д. Казьмин, З.В. Казьмин. М. : ИКЦ МарТ, 2004. -256 с.

23. Капрельянц Л.В. Неусваиваемые олигосахариды пищевые и функциональные добавки / Л.В. Капрельянц // Пищевые ингридиенты, сырье и добавки. - 2002. - № 1. - С. 36 - 38.

24. Капрельянц Л.В. Пребиотики и их роль в функциональном питании / Л.В. Капрельянц // Молочная промышленность. 2002. - № 1. -С. 44 - 46.

25. Капрельянц Л.В. Пребиотические пищевые ингредиенты. Современное состояние и перспективы / Л.В. Капрельянц // Продукты и ингредиенты. 2005. - № 6. - С. 60 - 62.

26. Квасников Е.И. Молочнокислые бактерии и пути их использования / Е.И. Квасников, О.А. Нестеренко. М. : Наука, 1975. - 384 с.

27. Киселева Т.Ф. Модификация ингредиентного состава пищевых продуктов для снижения гликемического индекса / Т.Ф. Киселева // Пищевая промышленность. 2006. - № 6. - С. 68 - 69.

28. Комаров В.И. К вопросу систематизации типовых пищевых добавок / В.И. Комаров, А.И. Гурьянов // Пищевая промышленность. 1998. -№ 7. - С. 64 - 65.

29. Корнеева О.С. Карбогидразы: препаративное получение, структура и механизма действия на олиго- и полисахариды / О.С. Корнеева. -Воронеж : Изд-во Воронежского гос. университета, 2001. 186 с.

30. Коррекция нарушения микробиоценоза человека с помощью пробиотиков / М.Ю. Волков и др. // Вопросы питания. 2006. - № 4. - С. 3234.

31. Крылова Э.Н. Сахарозаменители при производстве карамели / Э.Н. Крылова // Пищевая промышленность. 1999. - № 3. - С. 16.

32. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М. : Высшая школа, 1990.352 с.

33. Ленинджер А. Основы биохимии. В 3-х т. / А. Ленинджер. М. : Мир, 1985.-975 с.

34. Лисицин В.Н. Новые технологии производства диабетических и диетических продуктов на основе продукции переработки растения стевии / В.Н. Лисицин, Е.Л. Воловик // Пища, вкус, аромат. 1999. - № 4. - С. 8 - 9.

35. Лисицин В.Н. Стевия источник здоровья и долголетия нации /

36. B.Н. Лисицин, И.П. Ковалев // Пищевые ингридиенты, сырье и добавки. -2004. № 2. - С. 46.

37. Лобыкина Е.Н. Гликемический индекс продуктов и использование его в диетотерапии ожирения / Е.Н. Лобыкина, В.З. Колтун, О.И. Хвостова // Вопросы питания. 2007. - Т. 76. - № 1.- С. 14 - 21.

38. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков и др.. М. : Изд-во сельскохозяйственной литературы, 1952. - С. 149 - 177.

39. Мешкова Н.П. Практикум по биохимии / Н.П. Мешкова,

40. C.Е. Северин. М. : МГУ, 1979. - 430 с.

41. Моделирование и оптимизация технологических процессов отрасли : практикум по курсу: учеб. пособие / А.И. Бывальцев, Н.М. Дерканосова, А.А. Журавлев. Воронеж, гос. технол. акад. Воронеж, 2004. -140 с.

42. Нечаев А.П. Пищевые добавки / А.П. Нечаев, А.А. Кочеткова, А.Н. Зайцев. М.: Колос, 2001.-256 с.

43. Нечаев А.П. Подсластители и сахарозаменители / А.П. Нечаев // Пищевая промышленность. 2003. - № 2. - С. 50.

44. Новик Г.И. Архитектоника популяций бифидобактерий: субмикроскопический аспект когезии клеток Bifidobacterium adolescentis и Bifidobacterium bifidum / Г.И. Новик, В.В. Высоцкий // Микробиология. -1995. Т. 64. - № 2. С. 222 - 227.

45. Новик Г.И. Исследование физико-биохимических особенностей бифидобактерий на поздних стадиях развития популяций / Г. И. Новик,

46. Н.И. Астапович, А.А. Самарцев // Микробиология. 2001. - Т. 70. - № 4. -С. 495-502.

47. Об использовании нового сахарозаменителя эритрита в диетотерапии больных сахарным диабетом 2 типа / Х.Х. Шарафетдинов и др. // Вопросы питания. 2002. - № 3. - С. 19-23.

48. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. М. : Мир, 1997. - Т. 1. -С. 180-252.

49. Оптимальная переработка сахара-сырца / А.Р. Сапронов и др. // Сахар. 2006. - № 9. - С. 48 - 49.

50. Орещенко А.В. Сунетт перспективный подсластитель на рынке диетических напитков / А.В. Орещенко, О.Г. Лысюк // Пищевая промышленность. - 1998. - № 3. - С. 22 - 23.

51. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул / Л.А. Остерман. М. : Мир, 1983. - 233 с.

52. Очистка тростникового сахара-сырца с уменьшенным расходом извести / В.А. Лосева и др. // Сахар. 2007. - № 5. - С. 31-32.

53. Павлов М.Б. Еще раз об искусственных сахарозаменителях / М.Б. Павлов // Пищевая промышленность. 1999. - № 7. - С. 43 - 45.

54. Павлова Г.Н. Стевия источник натурального подсластителя продуктов питания Текст. / Г.Н. Павлова, Л.Д. Ершанова, Л.А. Алехина // Пищевая промышленность. - 1997. - № 5. - С. 9.

55. Пат. № 1011056. Способ получения изомальтулозы. К. Бак, П.С.Д. Читем. 1983, Бюл. № 13.

56. Пат. № 1022663. Способ энзиматического получения изомальтулозы. В. Крюгер, Л. Драт, М. Мунир. 1977, Бюл. № 21.

57. Пат. № 1512489. Способ получения изомальтулозы. М. Мунир. 1989, Бюл. № 36.

58. Пекич Б. Биосинтез декстранов штаммами Leuconostoc различного происхождения / Б. Пекич, JI. Вбрашки, М. Хаук // Прикладная биохимия и микробиология. 1991. - Т. 35. - № 6. - С. 866 - 870.

59. Пешкетова О.В. Подсластители / О.В. Пешкетова // Пищевая промышленность. 2001. - № 7. - С. 54-55.

60. Подбельцев Д.А. Влияние пребиотиков на морфологическую структуру слизистой оболочки толстой кишки крыс / Д.А. Подбельцев, Д.Б. Никитюк, A.J1. Поздняков // Вопросы питания. 2006. - № 2. - С. 26 - 29.

61. Практикум по микробиологии : учебное пособие / под ред. проф. Н.С. Егорова. М. : Изд-во Московск. ун-та, 1976. - С. 275 - 281.

62. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника : метод, рекомендации. М. : Минздрав СССР, 1986.-№ 10-11/31.-С. 14-23.

63. Путнам Ф. Денатурация белков / Ф.Путнам. М.: Мир,- 1984.24 с.

64. Роуз Э. Химическая микробиология / Э. Роуз. М. : Мир, 1971.294 с.

65. Рубин А.Б. Биофизика. В 2-х т. / А.Б. Рубин. М. : Книжный дом «Университет», 1999. - Т. 1. - 448 с.

66. Рухлядева А.П. Методы определения активности гидролитических ферментов / А.П. Рухлядева, Г.В. Полыгалина. М. : Легкая и пищевая промышленность, 1981. - 288 с.

67. Скоупс Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. М. : Мир, 1985.358 с.

68. Слюсаренко Т.П. Лабораторный практикум по микробиологии и пищевых производств / Т.П. Слюсаренко. М. : Легкая пром-ть, 1984. - 208 с.

69. Смолянский Б.Л. Лечение сахарного диабета / Б.Л. Смолянский,

70. B.Г. Лифляндский. СПб. : Издательский Дом Нева, 2004. - 384 с.

71. Стевиозид натуральный подсластитель / Г.О. Магомедов и др. // Кондитерское производство. - 2004. - № 1. - С. 14 - 15.

72. Сулимина О.Г. Сладкая альтернатива / О.Г. Сулимина // Пищевая промышленность. 1994. - № 11. - С. 20.

73. Сулимина О.Г. Функциональный углевод палатиноза / О.Г. Сулимина // Пищевая промышленность. 2007. - № 1. - С. 22.

74. Характеристика полисахаридов, секретируемых Bifidobacterium adolescentis 94 БИМ / Г. И. Новик и др. // Микробиология. 2002. - Т. 71. -№ 2. С. 205 - 210.

75. Хиль Г.Н. Подслащивающие вещества в пищевой промышленности за рубежом / Г.Н. Хиль // Пищевая промышленность. -1986.-№4.- С. 61 -62.

76. Чернышев Г.А. Вероятность и статистика в биологии и химии / Г.А. Чернышев, В.Н. Стариков. Воронеж: ВГУ, 1998 - 270 с.

77. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты / С.А. Шевелева // Вопросы питания. 1999. - № 2. - С. 32 - 39.

78. Шендеров Б.А. Пробиотики, пребиотики и синбиотики / Б.А. Шендеров // Пищевые ингридиенты, сырье и добавки. 2005. - № 2.1. C. 23 26.

79. Шлегель Г. Общая микробиология / под ред. Е.Н. Кондратьевой. М. : Мир, 1987. - 567 с.

80. Шубина О. Г. Пищевые ингридиенты как замена сахара / О.Г. Шубина, А.А. Кочеткова // Пищевые ингридиенты, сырье и добавки. -2006. № 2. - С. 24 - 27.

81. A revision of current data and views on membrane hydrolysis and transport in the mammalian small intestine based on a comparison of techniques of chronic and acute experiments: experimental reinvestigation and critical review /

82. А. М. Ugolev et al. // Сотр. Biochem. Physiol. 1986. - V. 85. - № 4. P. 593 -612.

83. Assessment of acid production by various human oral microorganisms when palatinose or leucrose is utilized / H.C. Peltroche-Llacsahuanga et al. // Journal of Dental Research. 2001. - V. 80. - P. 378 - 384.

84. Avigad G. Synthesis of glucosylfructoses by the action of a yeast alpha-glucosidase / G. Avigad // Biochemical Journal. 1959. - V. 73. - P. 587 -593.

85. Bhosale S.H. Molecular and industrial aspects of glucose isomerase / S.H. Bhosale, M.B. Rao, V.V. Deshpande // Microbiol. Rev. 1996. - V. 60. - № 2. -P. 280 -300.

86. Bornke F. Cloning and Charactirization of the Gene Cluster for Palatinose Metabolism from the Phytopathogenic Bacterium Erwinia rhapontici / F. Bornke, M. Hajirezaei, U. Sonnewald // Journal of Bacteriology. 2001. - V. 183.-№8.-P. 2425 -2430.

87. Bornke F. Potato tubers as bioreactors for palatinose production / F. Bornke, M. Hajirezaei, U. Sonnewald // Biotechnology. 2002. - V. 96. - № 1. - P. 119-124.

88. Bourne E.J. Oligosaccharides in dextran-producing cultures of Streptococcus bovis / E.J. Bourne, D.H. Hutson, H. Weigel // Biochem. J. 1961. -V. 79.-P. 549 - 553.

89. Cariogenicity of isomaltulose (palatinose), sucrose and mixture of these sugars in rats infected with Streptococcus mutans E-49 / N. Sasaki et al. // Swed. Dent. J. 1985. - V. 9. - P. 149 - 155.

90. Cheetham P.S.J. The formation of isomaltulose by immobilized Erwinia rhapontici / P.S.J. Cheetham, C.E. Imber, J. Isherwood // Nature. 1982. -V. 299. - P. 628 - 631.

91. Cheetham P.S.J. The extraction and mechanism of a noval isomaltulose-synthesizing enzyme from Erwinia rhapontici / P.S.J. Cheetham // Biochem. J. 1984. - V. 220. - P. 213 - 220.

92. Cheetham P.S.J. Isomaltulose production using immobilized cells / P.S.J. Cheetham, G. Clark, J. Clark//Biotechnol Bioeng. 1985. - V. 27. - P. 471 -481.

93. Cheetham P.S.J. Production of isomaltulose using immobilized microbial cells / P.S.J. Cheetham // Meth Enzymol. 1987. - V. 136. - P. 432 - 454.

94. Chen H.-L. Effects of Isomalto-Oligosaccharides on Bowel Functions and Indicators of Nutritional Status in Constipated Elderly Men / И.-L. Chen, Y.-H. Lu // Journal of the American College of Nutrition. 2001. - V. 20. - № 1. - P. 44 - 49.

95. Coudray C. Effects of Dietary Fibers on Magnesium Absorption in Animals and Humans / C. Coudray, C. Demigne, Y. Rayssiguier // J. Nutr. 2003. -V. 133.-P. 1 -4.

96. Draper N. R. «Ridge analysis» of Response Surfaces / N. R. Draper // Technometrics. 1963. - № 4, 5. - P. 3 - 18.

97. Elling L. Investigation of sucrose synthase from rice for the synthesis of various nucleotide sugars and saccharides / L. Elling, M Grothus // Glycobiology. 1993. - V. 3. - P. 349 - 355.

98. Enhanced conversion of sucrose to isomaltulose by a mutant of Erwinia rhapontici / S-J. Ahn et al. // Biot. Letter. 2003. - V. 25. - № 14. - P. 1179- 1183.

99. Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of the trehalulose synthase MutB from Pseudomonasmesoacidoghila MX-45 / S. Ravaud et al. // Acta Cryst. 2005. - V. 61. - P. 100 -103.

100. Extron J.H. Control of gluconeogenesis in liver. General features of gluconeogenesis in the perfused livers of rats / J.H. Extron, C.R. Park // J. Biol. Chem. 1967. - № 242. - P. 2622 - 2636.

101. Fujisawa T. Intestinal absorption of fructose in the rat / T. Fujisawa, J. Riby, N. Kretchmer // Gastroenterology. 1991. - V. 101. - P. 360 - 367.

102. Glinsmann W.H. Evaluation of health aspects of sugars contained in carbohydrate sweeteners. Report of Sugar Task Force / W.H. Glinsmann, H.Irausquin, Y.K. Park // J. Nutr. 1986. - V. 116. - P. 48 - 92.

103. Goda T. Hydrolysis of palatinose by rat intestinal sucrase-isomaltase complex / T. Goda, N. Hoyosa // Nihon Eiyo Shokuryo Gakkaishi. 1983. - V. 36. -P. 169- 173.

104. Goda T. Hydrolysis of palatinose condensates by rat intestinal disaccharidases / T. Goda, S. Takase, N. Hosoya // Nihon Eiyo Shokuryo Gakkaishi. 1991. - V. 44. - № 5. - P. 395 - 398.

105. Godshall M.A. How carbohydrates influence food flavors / M.A. Godshall // Food Technol. 1997. - V. 51. - P. 63 - 66.

106. Goulfi K. Disaccharides as a new class of nonaccumulated osmoprotectants for Sinorhizobium meliloti / K. Goulfi, N. Pica, V. Pichereau, C. Blanco // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - P. 1491 - 1500.

107. Hashimoto H. Glucosylation of methyl (3-D-arabinofuranoside with 6'-chloro-6'-deoxysucrose and immobilized Protaminobacter rubrum / H. Hashimoto, K. Yamada, О Yoshimura // Biotechnol. Lett. 1987. - № 9. - P. 849 - 854.

108. Hers H.G. Fructokinase of the liver/ H.G. Hers // Biochim. Biophys. Acta. 1952. - V. 8. - P. 416 - 423.

109. Hers H.G. Triokinase / H.G. Hers // Academic Press. New York. Methods in enzymology. 1962. - V. 5. - P. 362-364.

110. Heuvel E. Oligofructose stimulates calcium absorption in adolescents 1,2,3 / E. Heuvel, T. Muys, W. Dokkum, G. Schaafsma // American Journal of Clinical Nutrition. 1999. - V. 69. - № 3. - P. 544 - 548.

111. Huang J.H. Conversion of sucrose to isomaltulose by Klebsiella planticola CCRC 19112 / J.H. Huang, L.H. Hsu, Y.C. Su // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 1998. - V. 21. - P. 22 - 27.

112. Interaction of structural isomers of sucrose in the reaction between sucrose and glucosyltransferases from mutants streptococci / T. Minami et al. // Oral Microbiol. 1990. - V. 5. - P. 189 - 194.

113. Isolation and characterization of a trehalulose-producing strain of Agrobacterium / J. Nagai Miyata et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 1993. -Y. 57. - P. 2049-2053.

114. Isolation and characterization of isomaltulose- and trehalulose -producing bacteria from Thailand soil / K. Tsuyulci et al. // J. Gen. Appl. Microbiol. 1992. - V. 38. - P. 483 - 490.

115. Isolation and characterization of oligosaccharides produced from sucrose by transglucosylation action of Serratia plymuthica / S. Fujii et al. // Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi. 1983. - V. 30. - P. 339 - 344.

116. Isolation and characterization of Pseudomonas mesoacidoghila producing trehalulose / Y. Miyata et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. -V. 54.-P. 1680-1681.

117. Isomaltulose Synthase (Pall) of Klebsiella sp. LX3 / D. Zhang et al. // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - № 37. - P. 35428 - 35434.

118. Kawaguti H.Y. Production of glucosyltransferase by Erwinia sp. using experimental design and response surface methodology / H.Y. Kawaguti,

119. E.Manrich, L.F. Fleuri, H.H. Sato // Brazillian journal of Microbiology. 2005. -V. 36.-P. 227-234.

120. Kawai K. Changes in blood glucose and insulin after an oral palatinose administration in normal subjects / K. Kawai, Y. Okuda, K. Yamashita // Endocrinol. Jpn. 1985. - V. 32. - P. 933 - 936.

121. Klebsiella singaporensis sp. a novel isomaltulose-producing bacterium / X. Li et al. 11 Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. - V. 54. - P. 2131 -2136.

122. Krastanov A. Conversion of sucrose into palatinose in a batch and continuous processes by immobilized Serratia plymutica cells / A. Krastanov, D. Blazheva, I. Yanakieva, M. Kratchanova // Enzyme and Microbial Technology. -2006.-V. 39.-P. 1306- 1312.

123. Kuramitsu H.K. Molecular genetic analysis of the virulence of oral bacterial pathogens: an historical perspective / H.K. Kuramitsu // Crit. Rev. Oral Biol. Med. 2003. - V. 14. - № 5. - P. 331 - 344.

124. Laemli U.K. SDS-electrophoresis / U.K. Laemli // Nature. 1970. -V. 227. - P. 680 - 685.

125. Levi B. Long-term fructose consumption accelerates glycation and several age-related variables in male rats / B. Levi, M.J. Werman // J. Nutr. 1998. - V. 128. - № 9. - P. 1442 - 1449.

126. Li X. Substrate induction of isomaltulose synthase in a newly isolated Klebsiella sp. LX3 / X. Li, C. Zhao, Q. An, D. Zhang // Journal of Applied Microbiology. 2003. - V. 95. - P. 521 - 527.

127. Lichtenthaler F.W. a-D-Glucopyranosyl-D-fructoses: distribution of furanoid and pyranoid tautomers in water, dimethyl sulfoxide, and pyridine / F.W. Lichtenthaler, S. Ronninger // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1990. - V. 2. - P. 1489- 1497.

128. Lina B.A.R. Embryotoxicity / teratogenicity study with isomaltulose (palatinose) in rats / B.A.R. Lina, S. Prooije, W. Berendsen // Food Chem Toxicol. -1997. -V. 35. P. 309-314.

129. Lina B.A.R. Isomaltulose (Palatinose): a review of biological and toxicological studies / B.A.R. Lina, D. Jonker, G. Kozianowski // Food and Chemical Toxicology. 2002. - V. 40. - P. 1375 - 1381.

130. Lowry O.H. Protein estimation with folin phenol reagent /

131. H. Lowry, N.J. Resebrough, A.L. Farr, R.J. Randell // J. Biol. Chem. 1951. -V. 193.-№ l.-P. 265 -275.

132. Lund B.M. Nature of reducing compounds formed from sucrose by Erwinia carotovora var. atroseptica / B.M. Lund, G.M. Wyatt // Journal of General Microbiology. 1973. - V. 78. - P. 331 - 336.

133. MacDonald I. The bioavailability of isomaltulose in man and rat /

134. MacDonald, J.W. Daniel // Nutr. Rep. Int. 1983. - V. 28. - № 5. - P. 1083 -1090.

135. Mann M. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels / M. Mann // Anal. Chem. 1996. - V. 68. - № 5. - P. 850-858.

136. Matthysse A.G. Attachment of Rhizobiaceae to plant cells / A.G. Matthysse, J.W. Kijne // Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. 1998. -P. 235 - 249.

137. Mayes P.A. Effects of acute and long-term fructose administration on liver lipid metabolism / P.A. Mayes, M.E. Laker // Progress in Biochemical Pharmacology. 1986. - V. 21. - P. 33 - 58.

138. Mayes P.A. Intermediary metabolism of fructose / P.A. Mayes // Am. J. Clin. Nutr. 1993. - V. 58. - P. 754 - 765.

139. McAllister M. The isomaltulose-synthesizing enzyme of Serratia plymuthica / M. McAllister, C.T. Kelly, E. Doyle, W.M. Fogarty // Biotechnol. Lett. 1990. - V. 12. - P. 667 - 672.

140. Munir M. 1-0-alpha-d-glucopyranosyl-d-fructose: Preparation from saccharose and reduction to 1-Oalpha-d-glucopyranosyl-d-glucitol / M. Munir, B. Schneider, H. Schiweck // Carbohydrate Research. 1987. - V. 164. - P. 477 -485.

141. Nagai Y. Characterization of a-glucosyltransferase from Pseudomonas mesoacidophila MX-45 / Y. Nagai, T. Sugitani, K. Tsuyuki // Biosci.Biotech.Biochem. 1994. - V. 58. - № 10. - P. 1789 - 1793.

142. Nakajima Y. Manufacture and utilization of palatinose / Y. Nakajima //J. Jpn. Soc. Starch. Sci. 1988. - V. 35. - P. 131 - 139.

143. New developments in the use of sucrose as an industrial bulk chemical / H. Schiweek et al. // Carbohydrates as Organic Raw Materials ed. Lichtenthaler F.W. 1991. - P. 57 - 94.

144. Non cariogenicity of the disaccharide palatinose in experimental dental caries of rats / T. Ooshima et al. // Infect. Immun. - 1983. - V. 39. - P. 43 -49.

145. Palatinose a sucrose substitute / I. Takazoe et al. // Swed. Dent. J. -1985.-V. 9.-P. 81 -87.

146. Park Y.K. Conversion of sucrose to isomaltulose by microbial glucosyltransferase / Y.K. Park, R.T. Uekane, A.M. Pupin // Biot. Letter. 1992. -V. 14.-№7.-P. 547- 551.

147. Park Y.K. Biochemical characterization of a microbial glucosyltransferase that converts sucrose to palatinose / Y.K. Park, R.T. Uekane, H.H. Sato // Revista De Microbiologia. 1996. - V. 27. - P. 131 - 136.

148. Pat. № 082555 (U.S.) Process of the production of isomaltulose and other products. H. Heikkila, M. Sarkki, M. Lindroos, P. Ojala, V. Ravanko, M. Tylli. 2000.

149. Pat. № 201462 (U.S.) Production of isomaltulose. C. Burcke, P.S.J. Cheetham. 1982.

150. Pat. № 21252 (U.S.) Glucopyranosido-l,6~mannitol, a process for producing the same and its use as a sugar substitute. H. Schiweck, G. Steinle, L. Muller, W. Gau, M. Munir. 1980.

151. Pat. № 4670387 (U.S.) Fermentative production of isomaltulose. C. Bucke, P.S.J. Cheetham.

152. Pat. № 5786140 (U.S.) DNAs encoding sucrose isomerase and palatinase. R. Mattes, K. Klein, H. Schiwech, M. Kunz, M. Munir. 1998.

153. Pat. № 59002695. Production of isomaltulose by use of immobilized bacterial cell. M. Muniiru. 1984.

154. Pat. № 7618381. Enzyme and production of isomaltulose. K. Carl, S-K. Gunter, S. Hermann. 1982.

155. Pat. № 8124779. Method of producing am immobilized alpha-glucosyltransferase useful in the production of palatinose from sucrose. J. Shimizu, K. Suzuki, Y. Nakajima. 1982.

156. Pat. № 82109404.2 Immobilization of the sucrose mutase in whole cells of Protaminobacter rubrum. O.J. Lantero. 1983.

157. Pat. № 857808 (U.S.) Immobilization of microorganisms on weakly basic anion exchange substance for producing isomaltulose. M. Sarkki, H. Heikkila, T. Viljava. 1999.

158. Phosphorylation and metabolism of sucrose and its five linkage-isomeric alpha-D-glucosyl-D-fructoses by Klebsiella pneumoniae / J. Thompson et al. // Carbohydr. Res. 2001. - V. 331. - № 2. - P. 149 - 161.

159. Pikis A. Metabolism of sucrose and its five isomers by Fusobacterium mortiferum / A. Pikis, S. Immel, S.A. Robrish, J. Thompson // Microbiology. 2002. - V. 148. - P. 843 - 852.

160. Rumessen J.J. Absorption capacity of fructose in healthy adults. Comparison with sucrose and its constituent monosaccharides / J.J. Rumessen, E. Gudmand-Hoyer//Gut. 1986.-V. 27.-№ 10. P. 1161 - 1168.

161. Salvucci M.E. Distinct sucrose isomerases catalyze trehalulose synthesis in whiteflies, Bemisia argentifolii and Erwinia rhapontici / M.E. Salvucci // Comparative Biochem. and Physiology. 2003. - V. 135. - P. 385 -395.

162. Schlosser A. MsiK-dependent trehalose uptake in Streptomyces reticuli / A. Schlosser // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - V. 184. - P. 187 -192.

163. Schmidt-Berg-Lorenz S. Ein weiterer isomaltulose bildener bakterienstamm / S. Schmidt-Berg-Lorenz, W. Mauch // Zeilschrifi Zuckerindustrie. 1964. - B. 14. - S. 625 - 627.

164. Shevchenko A. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels / A. Shevchenko, M. Wim, O. Vorm, M. Mann // Anal. Chem. 1996. - V. 68. - № 5. - P. 850 - 858.

165. Smith M.M. Carbohydrate absorption from fruit juice in young children / M. M. Smith, M. Davis, F. I. Chasalow, F. Lifshitz // Pediatrics. 1995. -V. 95. - № 3. - P. 340-344.

166. Somogyi M.J. Determination of reducing sugar / M.J. Somogyi // J. Biol. Chem. 1952. - V. 195. - P. 19 - 23.

167. Stodola F.H. The preparation, properties and structure of the disaccharide leucrose / F.H. Stodola, E.S. Sharp, H.J. Koepsell // Journal of the American Chemical Society. 1956. - V. 78. - P. 2514 - 2518.

168. Takazoe I. New trends on sweeteners in Japan / I. Takazoe // Int. Dent. J. 1985. - V. 35. - P. 58 - 65.

169. Takazoe I. Palatinose an isomeric alternative to sucrose / I. Takazoe // Progress in Sweeteners ed. Grenby Т.Н. - 1989. - P. 143 - 167.

170. Thermostabilization praline substitution in an alkaline, liquefying alfa-amylase from Bacillus sp. strain KSM-1378 / K. Igarashi et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. - V. 63. - P. 1535 - 1540.

171. Topitsoglou V. Effect of frequent rinses with isomaltulose (palatinose) solution on acid production in human dental plaque / V. Topitsoglou, N. Sasaki, G. Frostell // Caries Res. 1984. - V. 18. - P. 47 - 51.

172. Trehalulose does not induce dental caries in rats infected with mutants streptococci / T. Ooshima et al. // Caries Res. 1991. - V. 25. - P. 277 -282.

173. Usefulness of palatinose as a caloric sweetener for diabetic patiens / K. Kawai et al. // Horm. Metab. Res. 1989. - V. 21. - P. 338 - 340.

174. Van den Berghe G. Fructose metabolism and short-term effects on carbohydrate and purine metabolism pathway / G. Van den Berghe // Progress in Biochemical Pharmacology. 1986. - V. 21. P. 1 - 32.

175. Veronese T. Mechanism of sucrose conversion by the sucrose isomerase of Serratia plymuthica ATCC 15928 / T. Veronese, P. Perlot // Enzyme Microb. Technol. 1999. - V. 24. - P. 263 - 269.

176. Veronese T. Proposition for the biochemical mechanism occurring in the sucrose isomerase active site / T. Veronese, P. Perlot // FEBS Letters. 1998. -V. 441.-P. 348-352.

177. Veronese Т. Rapid method for trehalulose production and its purification by preparative high-performance liquid chromatography / T. Veronese, A. Bouchu, P. Perlot // Biotechnol. Techniques. 1999. - V. 13. - P. 43 -48.

178. Vieille C. Thermozymes: identifying molecular determinants of protein structural and functional stability / C. Vieille, J.G. Zeikus // Trends Biotechnol. 1996. - V. 14. - P. 183 - 190.

179. Weidenhagen R. Palatinose 6-(-a-Glucopyranoside)-fractofuranose., ein neues bakterielles Umwadlungsprodukt der Saccharose / R. Weidenhagen, S. Lorenz// Z. Zuckerindust. 1957. - B. 7. - S. 533 - 534.

180. Wu L. Characterization of Pantoea dispersa UQ68J: producer of a highly efficient sucrose isomerase for isomaltulose biosynthesis / L. Wu, R. Birch // Journal of Applied Microbiology. 2004. - V. 97. - P. 93 - 103.

181. Wu L. Doubled sugar content in sugarcane plants modified to produce a sucrose isomer / L. Wu, R. Birch // J. Plant Biotechnology. 2007. -№5.-P. 109- 117.

182. Zhang D. Isomaltulose synthase from Klebsiella sp. strain LX3: gene cloning and characterization and engineering of termostability / D. Zhang, X. Li, L-H. Zhahg // Applied and Environmental Microbiology. 2002. - V. 68. - № 6. -P. 2676 - 2682.

183. Ziesenitz S.C. Cariological assessment of leucrose D-glucopyranosyl-a-(l-5)-D-fructopyranose. as a sugar substitute / S.C. Ziesenitz, G. Siebert, T. Imfeld// Caries Res. 1989. - V. 23. - P. 351 - 357.

Информация о работе

Божко, Ольга Юрьевна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Биосинтез, препаративное получение, физико-химические свойства изомальтулозосинтазы Erwinia rhapontici и её применение в биотехнологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы