Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОСИНТЕЗ КАРОТИНОИДОВ MYCOBACTERIUM PHLEI В УСЛОВИЯХ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "БИОСИНТЕЗ КАРОТИНОИДОВ MYCOBACTERIUM PHLEI В УСЛОВИЯХ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ"

V -Ь'МЩ

всесоюзная ордена ленина академия сельскохозяйственных наук

пменн В. И. ЛЕНИНА

всесоюзный научно-исследовательски и институт сельскохозяйственной микробиологии

На правах рукописи

ПОЗДНЯКОВА Антонина Ивановна

БИОСИНТЕЗ КАРОТИНОИДОВ МУСОВАСТЕШиМ РПЬЕГ В УСЛОВИЯХ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Диссертация написана на русском языке (03.00.07 — Микробиология)

А ВТОР ЕФ ЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1973

ВСЕССШиЯ ОРДЕНЛ ЛИ1ША АК*ДЕМШ СЕЛЬСКОХОВЯЙСГОЕШЬК НАУК , , вмевя В,ИЛНШШ . •

; селшшхозяяствжной микробиологии

На правят рукотас*

ПОЭДШШВА Аитонсна tesBoma

БИОСШТБЭ КАРОТИШВДОП ЮСОамянтм НШПГ

в тсловййс глубивого культязнровшш

< Специальность 03 00 07 - юпфобводопм ) . Двгсерт_дтя нагтжсаяа иа руссвои языке 'v.

А в тор е ф ер a i джиргап— на соискание учета* степени ЩВвата аюшпчкш HSJK • :

Лйшсгрзд 1973

(i nfiüÄt;"« йпба^зтзна

К, -з ягяиЗ t:j3. «кьных.

ciyttr»: ,aWU K, Tc3S£raas

", - Вабота выполнена во Всесоюанои научно-исследователь - ■ : V,-.. ¿ком №сткт]гге сеяьскоховяйственной иикробиологии. '

Научный руководитель -

доктор вйологичееккгпарт Вовняковсная Ю,М.

Официальные оппоненты : ' .

доктор биологически* наук Лойцянская М.С., . . : -

- - доктор биологических наук Ларкин А.И. V . : ,

. Диссертация направлена для внеинего отаыва в Ленинградский , .' „\.

. хюшко-фармацевт(п«склй институт.

Автореферат радос тая " &&щ т\ ;: -.',• ., Завита диссертации состоится ..." ^ "' гК^+фнХ* 1973 г.

'; <':/ па васедании Ученого Совета Всесоюзного нэучио-исследователь - -

ского института сельскохозяйственной микробиологии. 1Ч ■ '' ." \

Отяыва в двух вквемплярах проси* направлять по адресу : ЦУ-',: Ленинград, Центр,ул.Герц<та,42,ШИЙСХМ,Ученому секретарю. ; .

0 диссертацией можно1 ознакомиться в библиотеке ШИИСХМ. :■:

ТчсннЯ секретарь ■•;• .у ■""■7""- •. :у:.'':• -У V?

. кандидат биологических наук .; ■ . /^О.С.Оследкин/ . ,

: . 4 • Ишьский Пленум ЦК КПСС 1970 года й ХХ1У съеад КПСС отметили,что в комплексе мероприятий по дальнейшему: раввитио сельского хозяйства" важное, место, занимает 'повышение продуктивности животноводства иптицеводстш.0сновшмпутямирешешя;; 1 этой эадапи' является улучшение кормовой СЬза, рациогальнов" пс-по льэ ованиее е ресурсов,а также разработка научно-обоснованных рационов и~ внедрение в практику белново-виташшых добавок, в том числе продуктов микробного синтеза.

В настоящее время в качестве добавокккормамиирояо испольвуют кормовые дрожжи (Валдман,1Э53; Котляр,1957; Дмят-роченко,1961; Тоьмэ.Кро хина, 1963) .Научнькэ исследования и хозяйственные опиты последних лет показали,что воотехнический щ экономические э£ф.кт вначительяо увеличивается от введения в рационы с дроххами различных биологически активных веществ,сре-ди которых по эффективности выделятся витамины ( Солук,1962; Букин, 1964,1535» 19бв; Кондцрев, 1964 .-(Ласлиева, 1966", 19б7;1урвв-лев,19<58{ Ваелина и др,,19?0).

.. Оонано'применение чистых витаминов ограничено ив-за их высокой стоимости и недостаточного объема производства.Микробиологический синтез витаминов является основным перспективным способом кх промни ленного производства длр использования в животноводстве и птицеводстве.Особое внимание уделяется отбору продуцентов и полученип концентратов с А-витамишой активностью поскольку его» витамин необходим всем видам хивояшх и птиц ( Пгааяк, 19711 Букин »Быковский ,197В). '

Теоретический и практический интерес как в биологическом,таяв в экономическом аспекте,представляют микробные . ; поливитаминные концентраты,которью окавывастся по своему фнакого гическому деаствнЬ ВДективнее оадельно ввятого витамина -(Красильников ,1966; Бекер,1971)♦

■ . С точки врения получения голивнтаминвогокшпентрета засчитают внимания сапрск|ятны0 микобактерия»которые сиктевн-руюградбвологичесхи активных веществ -кдротиноцпц,витамины \ группы В, в том числе витаминВ^., витамин К,аминокисготн,про-;теологические и фкбршолнтические ферменты и т.д.( соо11*1л, "

НоЫшаюпота е*-аЗ.»1968;Вовняновская К Др«,1М0, 1071; Квасников к др.Ч19е9;'Ков1всЬ,' , 1970 и ряд др.);

% * ' Целью настоящего исследования являлось изучение образования КарОТИНОВДОВ Мус.phlei шт.171 в условиях глубин -иого куль Tire про в a;t ия, вылсне иие возможности получения полив*! -тамяшого концентрат на основе доступных .дешевых и нетоксичных для животных источников сырья,испытание полученного нон-. центрата в качестве подкормки сельскохозяйственных животных , птиц И рыб. В основном изучали каротинообравукцую спосос/яость . этого,штамма,так как каротин-провитамин А является одним из дефицитных витаминов,К тому же кароишоиды в количественном -отношении являются основными биологически активными вещества -ни,сннтепируеиыии этим штаммом.

г'С'Гл- СКСПЕРК AFJI ТАЛЫ 1АЯ ЧАСТЬ.

- Объект и метода-исследования .

Объект исследования Mycobacterium phlel шт.171--продуцент комплекса витаминов,выделенный и ошсаяннй Воэня -. ковской Ю.М;(Во8Няковская,Хохянович,1965).При изучении морфологических,физиологических и биохимических свойств м^с.phlel использовали общепринятые методы исследования,применяемые в' микробиологии. / . ( ...

. Глубинное культивирование Mycphl»! - проводили.в .;;' ' колбах емкостью О мл,содержащих 50 ил среды,на качалке при 180-220 об/ui^j и в ферментерах емкостью 100 л при температуре

* В опытах определяли ¡количество биомассы - весовым методом; рН -потенциометркческк на ЛПУ-01; редуцирующие вещества -по Бертрану» азот биомассы после удаления жиров и вое становлении!? азот -по микроме тоду Ньельдаля; амшшЯ аэог - ■■■'.: -методом формольноге титрования ( Белозерский,Проскуряков,1Р51) с потенциометрическим титрованием на ЖЕГ—01 .Общий фосфор определяли по Berenblua , .Chain (1938) в модификации -: Weil- Malberbe , Green : (1951). "■.'

Штенсивность аэрации оценивали по скорости поглоще имя кислорода раствором сульфита (; Cooper" et al. ,1944 ). Количественное определение лшщцов в биомассе производили весовым методой Сокслета-в модификации гушковского. экстрагированием cuecen растворителей -днэгиловый вфир : ацетон 1:1 (Бурштейн ,

1963). ■

• ; ' Общее количество каротиноидов определяли во вляжяой

биомассе.Клетки микобактерий растирали со стеклянниц песком , _ Каротиновдн извлекали "шогократной зкстракцией отоноЫю-аце-; тоновой смесью СЗ_г 1) до полного обесцвечипэния осадка, Экст--ракг получали фильтрацией под вакуумом череа пористцй стеклянный фильтр № 4,доводили до определенного объема и колориметр«-■ ровали на ФЭК-56 со светофильтром ^Аил* -440 им.Количество каротшюцдов рассчитывали на объем культурлльной жидкости или на 1 г сухой биомассы по калибровочной кривой,построенной для синтетического & -каротина в этанольно-йчетоновой. смеси Э : 1. ,

Для отделения каротикоидое с . кисло-пиши свойстшш проивводили разделение пигментов способом Си|ляного распределения в системе несиешивгищихся растворителей.поело их предвари--тельного омыления спиртовки раствором КШ.В результате разделения нейтральные, каротиновдц переходили в петролойно-а^ный слой,а кислотные оставались в водном отпнояыю-ацетоновом слое, ■ Каротиноиды,перешедшие в петролейннД условно названы апи-,фазными, а б водно- &тано лыю -а иэ тоне ш^й • с ло й-гнгк^ и зшыи. ..-■

- { - Определение состаьа каротиноадыис гтгыентов производи- -ли методом тонкослойной хроматографии по Ии^вг, м^ог»---Вег1еьг;иь (19бй) в ыод;> ¡«жацш Корншенко и Сапойшкова -; (1969).Опыты проводили.в 5-6 повторноетях и подучетше данные обрабатцнали статистически (Асатиани,1365 ¡Вознесенский^ЭбЭ);

: ЗНАЧЕНИЕ КШШШПШ СШТЁТИЧЬККий ГВГИТЕШЮЯ СРЕДЫ . ДЛ1 ГЪСТА И КАПЛИШПЛЮА 1»Ыо1 шт. 171-.'

Использование микроорганизмов -продуцентов биологическж активных веществ для получения последних: в масштабах промышленного производства требует всестороннего и обстоятельного изучения фияиолого-биохимических свойств этих культур,Овдим из главных условий решения поставленной перед нами задачи являлось иву-чение роста и каротиногенеаа Уус. рк!е1 ' при гдубтнои культивировании.фи этом наши исследования били Направлены на подбор питательных сред и условий культивирования,отвечающих физиологическим потребностям -:_цус.рЫв1;' » позволяющих получать высокий выход биомассы и каротиноадов.

Сравнительные.испытания некоторых известных синтетических сред,используемых для ^выращивания микобактерий , йаи^оп '

(1912) Ingrabam , Steenbock (1935); Goodwin,johi-

korn . (1956) ; Aldri<lg# et. al,(1959) и Бобковой (1965) ' показали,что лучший рост Myc.pbloi (8,0 г/л) и образование каротиноидов (12,0 мг/л) наблодадос- на среде Бобковой.*,"* Так как »та среда является модификацией среды Goodwin, jami- r korn : : . (1956), последняя Сила выбрана нами. в качестве ос. — воввоЛ' среда для дальнейших исследований.Эту. среду шди{«ши-. ровали.увеличив концектрагию глккозы до заменив аспэрагин ."';: иючевино»,желеао-аымтчные квасцы"-хлорным мелевом.и исклшив ио состава среда лимоннокислый натрий.

С целью уточнения оптимального состава синтетической среди для культивирования Myciphiei шт.171 и выяснения вначения оедельных эдеменгов питания для роста и каротиноосра- :, вования культуры,н^ этой среде изучали влияние различных ис точников углерода,аао та и их соотношения,а .тарже вли(пгие вига-:, иинов,минеральных йонпонентови некоторых микроэлементов.,'

:'-■".' При. подборе ист о ч ник а у г л ер од а исходили ив литератугаых данных' о влиянии структуры источника углерода на количество синтезируемых микроорганизмом каротиноидов -( Gorton et al. ,1951).В одних сд/чаях более подходящими для: обравовашш каротиноцоов были пенховы ( Ыаве ,1959), в дру-. -гих - гсксоаы ( Cny » Lilly. ;1960), а в некоторых-орга- • нические виелоти( Гречушкинаи др. ,1965 )♦ .

ч Нами испытано 39 источников углерода по их влиянию на рост и образование каротиноидов ityc.phlet .Лучшие реауль-№Ш по накотижию биошсеы навлекались на средах с ра^иновой, -^ук*о8ой,лактоёой,сахароеой,глицерш(ои,ыа!шитом и сорбитом (14-12,4 г/л). На среде с глшоэой накопление биомассы было несколько ниже (11,2 г/л).На средах с арабиноэой,ксилозой и галактозой выход биомассы составлял 6,7 -7,8 г/л. : ; / ' ' . [ Максимальная продуктивность культуры (количество каро- ■ тиноццов на 1 г сухоЯ-Сиомассы ) была на среде с,арабиноэой (2,7 ш/г),На среда* ^ галактовой»мальтозой,ксилозой и сорба - , г тои устаыовлена Наиыенывая продуктивность культуры (0,9-1,3 мг/г), С остшишн источниками,углерода продуктивность культу- , ры была 1,9-2,3 мг/г.Слабый рост культуры на среде с мальтозой сопровождался невначительшк выходом каротиноидов ( табл.1 ).

:Влияние разлетадг источников'углерода на рост.и карогиногекев ■ . цуе.рЫв1 ■ вт,171 *. ' . ' : л ■ ■; (Длительность внращкванхя 144 часа ) , ; . " ..'■'. ■. ■■''-,''

■ Источни углерода ". рН ковеч- ' - Биошсса - - ' Углеводы . . Ойщее' х-во каттияовдов1

. ( 4,0%) ныЯ ' ( сух.з-во ) ■; ■ ■. ■■ ■■ -Г;.- '■■:

г/л * V мг/л •'. иг/г: "

Арайшээа ■ ■ 6,4 7,80+0,22 0,23 21,10*0,89 - 2,70

Кмиоэа = 5,6 6,74 ¿0,19 1,34 6,25 + 0,25 0,92^ , >Д

' Галактоза 6,4 7,72 ± 0,37 ' 1»2г 10,501 0,49 : 1»зб\

Глаюаа ' : ' 6,2 . 11,21 ±0,44' 0,45 »,30 + 0,99 2,16

„Яруиова 4 6,7 13,50 * 0,44 0,22 25,85 + 1,30 1,9г. . V/'

Лаиоаа 6,3 13,00 + 0,50 . ■ 0,54 26,07 £1,21 2,оо л'.',.:,

{ёльтова 7,4 2,20 + 0,13 3,30 : 2,66+0,30,: 1,20 V \ 2,10 , :

Сахароза ' 6,3 ; 12,70+0,49 . 1,52 . 27,67+ 1,29

йкйявова ■ у .. ■. ' 6,5 14^00 ± 0,55 0,3 30,83 + 1,63 " '2,20,

•Гяцври; ^. ■'■ в,4 13,06 + 0,43 0,56 26,50+ 1,11 2,о1 :;..ч 'у

Наннк 6,3 , 13,23 + 0,37 0г43 25,64 + 1,15 Л 1.04 - .V- •

Ссрсгг г в,4 : 12,40 + 0,55 0,82 15,85 + 0,97

Максимальная продуктивность культуры достигалась и при сов местном внесении в среду глосоэы с сахароеой.ймноэа,дулышт» инозит и крахмал культурой не испольвовались. _ >*■.-■'"■

Органические кислоты в качестве единственного источника углерода не обеспечивали удовлетворительного роста и образования каротнноидов иус.рыв! .Однако в специальных -опытах,проведенных с частично отштым от питательной среды и сконцентрированным посевндо материалом, все испытанные 1в органических кислот в той или шюй степеяистицулиронали обра -вование каротино идо в. Пропиоко ва я, масляная, валеряано вал и капроновая кислоты оказывали более сильное стиыулирущее дейст -виена каротино ген ев Муо.рМе! ,чем глккова и Сатарова в »тих условиях.Органические кислоты не использовалась культурой для построения вещества клетки,большинство ив них снижали выход биомассы на ТЯяиы образом, 1&а.ры«1 игт.171

в качестве первичных (цэодуктов для синтева каротиноидов макет ' использовать простые углеродные соединения ( С - С- )• Вов нежность кх использования определяется ,по-ввдАхюцу,в первую очередь. особеюгсстяьгд данного микроорганизма,наличием у него -определенных ферментных систем .

• ; Источник' а в о т а в среде оказывает эта - ; чптельное влияние на рост н кароткногепев отдельных продуцентов, хотя, как .известно, в молекулу каротянп авот не входит ( "Тт ОахЪов*«* а1. ,1950; ОооЛПа ? Ы. 31пяк1 г 195|: ;

.'." Кг1еа4 в* аЛ. ,1950 I Д$т,]"г»иэ ,1956 [ КггевШаек! , ^ ОиаскваЬисЬ »1960).Ипучали влияние на рост и образование каротиноидов Чус. ры«1 некоторых восстановленных (ашо-ниЛкые соли).окисленных ( нптратн и нитриты) фор« азота,ампно-киспт и сложных авотсодержащих веществ,Всего испытали Эб ис -точников ааота и 15 аминокислот.

'Как показали проведенные опыты, . Чтс.рЫе! ассими -лирует различные источник» азота.На средах с аыиениЯнымисолями минеральных кислот накапливалось 10,7-г/л биомассы , выход каротиноидов находился в пределах 23-Й5 »Уя, продуктов - ■ вость культуры была 2,18-й,05 мг/г.На средах с нитратамг накапливалось в среднем 13,б г/л биомасса, выход каротвншдов ссстав-ляд 20 мг/л, продуктивность культуры - иг/г. .

Выход биомассы на средах с ашоиийными, сояяш органи--ческкх кислот был 9,8-11г/л,выход каротиноидов-24-33(б мг/л,продуктивность культуры - 2,33-3,96 ыг/г, кроме среды со щавелевокислым аодонием ,на которой наблидался'слабый рост культуры ( 6,3 г/л) и низкий выход каротиновдов(15,2 мг/л). На средах со слакныш ааотсодеЕиащицр веществами (пептоном, аминопептидом,гидролизатом казеина, бульоном Хоттингера.рыб -шмгцпролиэп том, гороховым ас толиза то м,кук урувным экстрактом, комплексом "В4,соевой мукой и кормовыми дровами) выход био -массы (4,9-15,6 г/л) и каротинондов (о,ва-ЭЗ,4 мг/л) варьи -ровал в широких пределах.Ыакскмалыюе.количество биомассы (1С,б г/л) и каротине идое (33,4 мг/л) накапливалосьНа среде с гороховым автолизатом.Максимальная продуктивность культуры ( 3,23 иг/г) бит на среде с ашно пептидом , на которой выход биомассы составлял 8,1 г/л ( табл. 2)•

1 ' Выход зшЦаэных*кцротиночдов на большинстве сред достигал 30-4и^ от общего количества пигментов .На средах с нитра тми н^блкщалея наименьший выход эшцпэных каротипоидов и сое тавлял всего 15-17* от общей суммы пигментов. .

Аминокислоты,используемые в качестве источника азота, не стимулировали ооразованмекпротииоидов Цуа.рЫе! и в большинстве своем были неблагоприятными источниками аеота как для роста,так и каротинообразования.Ип 15 испытанных аминокислот только "¿-йлангаг и глютамнновэя кислота обеспечивали выход каротинокдов в пределах £5-27 мг/л.Многие аминокислоты, в том числе млин и лейцин -спещг)*иеские стимуляторы кароти-ногенеза ГЪусоаусвв Ъ1акея1в«апиз ( СМаивпЬер ,

1955,1959) ,ттгиб крова ли образование каротиноидоа; Мус.рЫ«! , Слабый рост культуры и «аротиногенев наблодзлея на средах с ■аспарагиновой кислотой и аспарагином.Следует отметить,что при использовании большинства сложных азотсодержащих веществ,вое ; становлениях и окислршгнх форм аэота не цаб лаялось существен ного различия в росте и образовании каротиноидоп Цуо.рМе!..

Равниц» не препш»ала <?1?.Одним из лучших источников азота ока залась мочевина .которая и испольпогалась тш с качестве азотного компонента основой синтетической средн.

■ .л ' - 8 -

-: Табдкца 2

Ьшвяе различные источников «sosa на pool и каротиногенеа «yc.pülei вт.171

'' _[ Длительность выраддвания 144 часа ) . . ■ . ' ■ -1 ■ ' .' ' ' - '',.'

йгточниС' авота ; ( 60 иг

pH Биошсса , конет-( сух .в-во ) щй ,

г/л

Азот ' 0Сщ»е г-во иаротшядов К-во ста^ааных '

- - - i ■ - ■■ i - ■ хароткнридов.в

VP% • «>>л "-Ï ^ % от оощего

ÍN^^HPQ. 7,5 10,75+0,37

NH4C£ t 7,2 It,б7 + 0,50

NH4N%\ . 8,0 . 12,80 + 0,-SÔ

К N 63 - - ■ 8,8 13,35 + 0,40 /

NH4 -уксуснокксдаЗ 7,6 10,22 ± 0,42

NH4 -яягарнокисшй . 8,0 11,00 ± 0,34

|S|H4-лшюшояжслей 7,7 9,00 + 0,37'

Азляопептад 0,5 8,12 + 0,31

Гялэолиаат кавеииа 7,0 11,20 + 0,33

ййньй пщролвват 0,6 9,35 + 0,48'

Гороховый автолиза* . 6,2 ' 15,60 + 0,47 ■■■

Кукурузный аястракт ж -8,0- -.12,33 ¿ 0,50

«очевина 1 V 9,1 Í1.5Í.+ 0,29

9,17 8,80

8,90 7,93 7,81 20,37 17,61 33,92 20,15 10,44 '7,40

23,80 ± l»t? »,00 + 0,82 25,35 ¿1,30 23,00 ± 0,75 25,20 ¿ 1,33 28,60 ±1,15 27,94 ± 0,99 26,27+1,30 35,47 t 1,27 21,13 + 1,10 33,40 + 1,52 24,60 + 1,06 28,00 ± t,U

2,18 2,Œ 2,СБ 1,72 2,47 2,60 ; 2,86 3,3 2,26 2|S8

2,00. : 2,42

32.2 ' 40,0

31.3 ■ »

16.7 37,2 38,2

40.6 33,0

34.8 ' 2В,7*

32.7

38.9

86.8

ЭнакЧ - ) озвачаег,что анаднаы не делалась'

V Г.* V-' " : V-' r - I; V, ■■ ГЧ V ¿i \ -//'.Jt ::

* ■ - Влияние с о о т и о те н и я у г л е р о д в ■ я а зо т а в среде ыа рост образование каротпноидовилипядов Uyc. phlel ; научали на синтетической средесдобавлением f , Z vr/л витамина В j.B этих опытах определяли количество липа-дов,исходя и8;таго»чго синтевкаротиноидав и жиров осуществ ляется иэ общей строительной единиц* и возмо1ен"конкурс" в отношении общего предшественника ,а отседа нежелательная на - -правленность процесса в сторонусингеза вместо каротиноидов . липодов ( ЦосЬшшшота et ai. ,1968),

■ величине соотношения углерода и а&ота в среде достигались путец изменения концентрации источника углерода в одних; опытах и азота в других. Оказалось, чтовустовияхнаших ? отлов слишком нивкие я высокие концентрации этих алеклятов среды снижал* продуктивность культуры. Штимальное соотношение C/N ' для образования каротиноццов находилось в пределах 29-35, при этих же соотношениях <УН набтэдался хороший рост культуры ( 13-14,5 г/л) .Содержание лищдов в клетках

повыналось с увеличением соотношения С/Ы ,содержание же аэота при втом умения лось.

В литературе имеются данные о влиянии вигами-н о в на рост п кароткногенев некоторых продуцентов.В частности, отмечалось значение витамина ВSchopfer ' ,1534, : 1937; 3taAr » Saperetein » 1953; îriend , cootoin ,1954} В рдце случаев установлено стицулирущва действие витаминов ■ групни В и витамина К ( Goodwin et; al* , 1953;;СгоЪ et al* 1954; u&se ,1963 ; Гуринович s др., 1966) .ГЬ некоторым сообщениям оздельгае представителя рода микобактерпй нуждаются в витаминах при культивировании на минеральных средах ( chang Кл1-и1ие » Jaw Chin -Jtrng ,1964 ; СкрябИН И Др,,1900).

В соответствии с этими данными,представлялось суцест -венным выяснить влияние виташшоа на рост в образование каро -тжновдов «yc.phlel шт. 171. В первую очередь изучали влшвп» витамина В ^ культивирование проводили на синтетической среде, приготовленной на водопроводной,воде. В качестве посевного материала использовали 3-х суточную культуру t выращенную на среде бее витамина В При налички в среде.следов витамин»7 В | набжкщался слабый , рост культуре, выгод биомассы составляя -всего !,5-2,0 t/nt выход каротиноцаов бия 0,3-0,4 мг/л,цродук-

тивность культуры также была низкой (0,15-0,2 мг/г) .Привведе ' нии в среду 1 ыкг/S витамина Bj увеличивалось накопление био массы к выход каротиноедов в 2,5-Э рава, при эхом продуктив ность культуры не изменялась«Повышение концентрации витамина В|До 5 мкг^ обеспечивало максимальное накопление биомассы, , в то время как оптимальная концентращм витамина Bj для максимального образования каротиноцдов находилась в пределах '

- so мкг^.Повцшение концентрации витамина.В j в среде* до tOOd

> шт% не окааывало сутцес тленно го влияния на рост и каротиноге-неэкультуры.Дадьпейшке исследования покавали,что аугсотроф -ность Myo.phlei »г.171 по витамину В| связана с неспо -. еобностью культуры синтезировать пиримвдииовую часть молекулы витамина -В . .Аналогичных сведений о данном шкроорганивме в литературе не встречается, ■ .. * '

t -: В условиях наших опытов наличие витаыинаВ ^в среде; обуславливает не только рост,но и образование жаротиноидов -.'. Иус.рЬ1*1^ «Воашхно,что в данном случае витамин В ^ не толь : ко косвенно ( череа недостаток ацетил-КЦА-исэдпного соедкне-^ нкя в биосинтеве каро тшоидов), но и непосредственно участвует j в сиосинтеве каротиноедов . uyc.phlei тт.171,подобно тому, как вто установлено для ГЬуоощусвв ЫакввХвеадив ( bowry, Chioh«eter ,1971)/ "

Добавление к питателыгой среде других витаминов группы В,а таксе витаминов С if К ,не окавивада значительного ".;-стимулирующего действия на.рост и обравование каротиноедов : Myo.pblei что,вероятно,объясняется способностью культура сштевировать ряд витаиинов группы В (Воэняковскаяи др., 1969,1971).

В литература шло сведений о значении мин ера ль н И х еле к е в х о в для роста к каре тшо генеза мико -' бактерий,В связи с етим изучали влияние минеральных компонентов (Входящих в состав среды Goodwin, jaaliorn (1956) на

- рост и образование каротиноидов Мус, рад.е1 ют.171.

Исследования покаеали.что в условиях наших опытов ин-,:: ' теяснвность биосинтеза каротиноцдов существенно вависит" от

содерканкя в среде ^фосфора и машия .Оптимальная концентрация, _np»F которой синтезировалось 2,3-3, 0 мг/г кзротиноидо в, со став -ляла. 0,1/Í фосфора и 0,1% сернокислого иапгия, при этом сера

¡ 10Г "'-'■ ■ ' \

в большей степени была необходима для роста культуры, в то время как магний оказывал большее влияние на образование ка-рсгиноцдов.Недостаток калия в среде сникал накопление биомассы и выход каротиновдов на бО^.Избытокв. среде фосфа-тов,сернокислого машин и солей калия окаоывал меньшее влияние ,чеи не до ста то к. Шш железа и цдака сталировали образование каротиновдов .увеличивая выход каротиновдов m 20-25J?. ' -Сернокислый Кобальт ингибировал сильнее каротиногенев,чем рост ку.1Ьтуры.Воаможно,это объясняется частичный разрушением витамина Ej .который в результате оказывался лимитирукщим «{актором среды ( Абакумов ¿1971). —

В результате изучения влияния отдельных элементов питания на рост и каротиногенеэ Uyc.pblel подобрана синтетическая среда следупцего состава ( в %) мочевина-0,125 глшоза-2,0; сахароза -£,0 ; Na .12 Н gO -0,4; K-LPO^-

-0,3 ; -0,1 j 3"еСйз-Ш мг/л; витамин Bj-0,5 мг/л*"

Эта" среда оказалась аффективнее среды . Goodwin,Jamikorn ; (1С6Й) по выходу биомассы в Г,5-2 раза, а по виходу карота -ноидов В 4-5 pes* ' V

Изучение динамики- роста и образования , к а р о т и н о и д о.в ' Uye.phiei,1 проводили при выращивании культуры на вышеукаванной среде в KojPiax на качалке в течение бОдней.Оказалось,что вавершение роста культуре н использование ею авота ие является обязатель-.ным условием для активного биосинтеза каротиноидов,как это наблщается у некоторых других продуцентов (Бобкова, ГЪботно -'ва ,1967)♦ : ' .. Л'--1 "

Процесс образования'каротиновдов происходит параллель* но pociy культуры.В течение 10-12суток наблвдается потребление. питательных веществ ( до 85JE углеводов казота, -до 5($. ~ . фосфора),снижается рН до 6,2,накапливается максимальное количество биошссы (12-14 г/л) и каротиноидов (Э5-40мг/я) (рис.1) В этот же период количество зггифззиых каротиновдов также достигает максимума и составляет 35—405?- от общеп количества пигментов". ГЬсле 15-18 суток культивирования Иуо.рЫв! начя -нается снижение количества биомассы,что,очевидаовязало с уменьшением весе Улетт,ввнпу израсходования ее затсных в е- : ществ. ,тяк как явного авто^шаа культуры по содер»ацию в среде

"5ч ч ч г

е А1 14

1 О л —2

Со лг

а

; 2

м 6 -Г--"

а

« « - Су/гг АК ^ .

Рис. 1.Биохимические изменения в процессе роста и каротино-. образования; Цус.рЫе1 шт. ¡71. на синтетической среде

1-бвоыасса( сухое в-во),г/л: 2-общее количество хароти-новдов,мр/л; З-углеводы ;4-рН; 5- азот,мг % .

«

< * г к

i * еР

1 1

11 1

а ■и

5

г е Ч?

*

Рис.2. Динамика роста и образования каротиноидов " ,; «ус.рМв! \\ ют.171 на синтетической среде. ■ - ■

1~биомасса( сухое в-во).г/л; 2-общее количество кароти- -:: но:шов,мг/л: 3- продуктивность кчльтуры по каротиноидам, , мг/г | 4-содержание лшчдовД ; 5- фосфор, мг ргл

азота и фосфора обнаружить'не удается. -

V Общее количество пигментов после достшения максимума сохраняетсяпримернонаодаоы уровне в течение 40-45 суток. _ Набладаемое увеличение продуктивности культуры до 3,5-4^0 иг/г в этот период, по-видимому, объясняется не, про до лк а щиыся образованием каротиноидов,как полагает некоторые авторы: Ьат,гЪе«аЬоск 1935; Цаао,Вио1шв11 , Ч'т '..'. ) , !

а происходит эа счет/снижения количества биомассы.Процесс синтева каротиновдов,вероятно ,прекращается после достижения максимума.После 50-55 суток выращивания культуры,в этих уело-' ..виях начинается разрушение каротинаядов.По мере старения культур, л снижается содержание в клетках лщаддов,уменьшаетсяколичество епяфаэних каротьшоидов и увеличивается, количество ги-полных. К 60 дням культивирования количество эпифаэных ка-ротаноццов уменьшается в 2-2,5 раза ( рис^. 2 )»

: ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЯ РиСХА И КАРОТШиГШКЭЛ Иуе,рН1«1."

,. :-.// -.. ; на компг.ккаюа срвде.

Для массового выращивания Кус.рЬ1о1 шт.171 с цель» под/чения по лив и гаишного конце]! трата подбирали ком пленсную' среду,пригодную для последукщего культивирования : продуцента в ферментерах.В качестве основных компонентов среды использовали доступные, дешевые и нетоксичные для животных* источники сырья. В процессе подбора-этой среды испытали более 100 вариантов различных штательнш сред,содержащ«х пуцадл, V молочную сыворотку, гидролиаатдревесины, или мелассу .Поскольку-Лучшие результаты по накоплшию биоиассы и обрааованию кароти-ноидов наблюдались' на средах с мелиссой, в дальнейших исследованиях в качестве одного'из основных компонентов среды использовали мелассу. ■[. ¡:.,;

Для повышения синтеэкрущей активности культуры при ее .культивировании на мелзссной среде внясняли влияние различных . источников , азота на рост и ооразовшиакаротиноидов .Большин' -/ ство испытанных источников азота' в сочетании"- * мелассой в ми-'; неральными"солями обеспечивали "'накопление биомассы .Му«.рЬ1в1„ в пределах 18-22,0; |/л(8Ы).од^каротиновдов варьиропал в более ; широких пределах' (18-41 мг/л) .111Г комплексных средах. нала пли- /

велось в 1,5-2 раза больше биомассы по сравнению с синтетическое средой,максимум каротинообрааования достишлся в.более Короткие сроки.Одним ив лучших источников азота на среде с ' мелассой был кукурузный екстракт.

Поскольку среда,приготовленная иэ мелассы и кукурузно-" го «стракта,содержит кроме углеводов и авотистых веществ ! равлячнне минеральные 8деыенты,а также ростовые вещества (Денщиков, 1963 ; Плевако,Белова,1968j Голышева и др.,1958 Куенецэва и др., 1968 и ряд др.),она окаеагась достаточно полно денной для роста и каротинообрааования «yc.phlet , что повволило исключить на состава комплексной среды минеральные , соли (фосфаты,сернокислый магний ) и витамин В,.

Для культивирования Ujo.phlel испытывали среды с ' содержанием кукурузного шстракта от 0,5 до;5,0/5 и мелассы от ; 2,0 до Zfffi.C увеличением в среде концентрации мелассы увеличивался выход бгомассы,кароткноидов к повшалась продуктивность культуры.С увеличением в среде кукурузного экстракта увеличивался выход биомассы,но выход кароткноидов и продуктивность вулыуры несколько снижались.В условиях оптимальной аэрации '" на среде с 5,0$ кукурузного екстракта и мелассы выход биомассы составлял 50-55 г/я,выход каротшоидов -130-140 мг/л при . продуктивности культуры 2,6-2,4 иг/г.Максимальный выход каротшоидов в данном случае. наб л сдался при соотношении кукуруено-го акстракта и иелзсеы,1;4.При исподьвовашлт. раэличных партий кукурузного экстракта и мелассы оптимальное соотношение этих компонентов варьировало в широких пределах 1:4 : 8 : 20. -

В дальнейшем работа велась в основном на среде,содержащей кукурузного шстракта н Щ, мелассы,Бкокимический состав донной среди был следуяцкй ¡углеводы (РВ) 3,8-4,5?Е;об-' щий ааот 1S8-163 ашиный ааот 41-53 мг^,* аммиачный asot-8-15,7 чг& общий фосфор -40-62 С /Н 20-25,За 5-6 суток культивирования» Myo.phiel наэтой - среде накаплива-.. лось 17-22 г/л сухой биомассы,выход кароткноидов,в зависимое- • am от партгЯ кукурузного экстракта и мелассы составлял 35-^5 мг/л,продуктивность культуры быга от 1,8 до 3,0 мг/г,содерта -Bdj в биошссе липидов составляло ;13-18Jf,условного белка(б,25х xN) £.Э^2?Е.Дучв1ие результаты по выходу биомассы и образование

каротиноццов Myc.phl»l шт. 171 яабледались'насредах с . медассой,имевдей нормальную или среднюю буферную емкость и рН не ниже в,б.

, 1Ьвесгно,что обмен веществ у микроорганивмовнаходит-ся в прямой яавксимости от у с л о в и в культивирования /т.е. от рада фивико-эгимических факторов,таких как jH среды, температуры выравнивания,аврации и.др.С целью получения максимального выхода биомассы и каротиновдов при -глубинном выращивании культуры,изучали влияние некоторш: из * указанных факторов на рост ибиосинтеа этихтгагментов ■ Mje.phlel ■ ■'.'./ '

По нашим данным, Mye.phlel ; наиболее активно растет » синтезирует каротиновды при температуре S8-30.Оптимальный 1Й комплексной среды для накопления биомассы и карлииои-дов находится в пределах в,8 ^8,5.При етсм вшсод биомассы :.". составлял 20-22 г/л.выхад общей суммы пигментов был 40-45 ш/л,вшсоД: эггафввяых каротиноедов от общего количества пиг-мштов составлял 38,изменении гй нкие и внтеоп-тимального наблюдалось стаеиие выхода каротпноидов.При гча-чениирН ниже 6,3 и выше 10,5 кулыура не росла .Щелочная среда способствовала накоплению большего количества эпи^аэнщ: каротиновдов, содержание которых повышалось до 505?. :

V Большинство ивучаемнх микробов-продуцгнтов каротинои-дов -агробы.№вестно,что степень насыщенности среда кислородом для авробных микроорганизмов является одним из важнейших факторов,определяющих их рост и образование биологически активных веществ .Для каждого, микроорганизш существует определенный режим аерации,при вотором сойдаются оптимальные условия для его роста к синтеза биологически активных веществ ' { Film ,1954; Chain «V al. ,19вб; Виестур ,1972).

- ; 6 условиях нашит опытов влияние а а р а ц и и на рост и образованиекаротиноедов ' Myo.phlei зависело от состава среды.ИаксииалышЙ аффект при культивировании на синтетической среде наблкдался при наснценности среды кислородом 0,68 - 1,44 г/л Од в час,на комплексной среде о одинаковым количеством редуцирующих веществ-1,44- 3,27 г/л Оg в nao; С увеличением кондан^рации питательных веществ в среде вов -растало требование культуры к аерации. -

Рис.3.Биохимические иэменения а процессе роста а карогино- Л образования мус.рЫв! шт.171 на комплексной среде. У г

1-биомасса! сухое в-во),г/л; 3-общее количество каротн-ноцдов,ыг/л; В-редуцирущие вещества,?; 4-аминныЯ ааот»" мг % ; 5-аыыонийней аэот, мг —

Рис.4. Динамика роста и образования каротиноидов

Нуо.рЫв! вт. 171 на комплексной среде., 1 . . .'' :

» 1-6 ко масса ( сухое в-во), г/л: а-общееколичество кароги- : Н01Ш08,мг/л]3-гН : 4 -общей авот,мг^ ; 5-общий фосфор, мг о- ллпидв, . ~

№учение- д и к а м и к и- р о с таи о б р а" -а о в а нин каротином до в мус.рЫв! шт,|71 ' при культивировании на комплексной среде в колбах на' качалке в течение 30 суток показало наличие двук(»вности роста куль туры.Первая фаза.заканчивалась л 72,часам.роста и характеризовалась интенсивном потреблением питательных неществ.( ДО .. 705? редуцируццих веществ-и азота; до 90Ж>1ос|орц) »повышением \ рН до 8,2-8,5 и накоплением биомассы ( рис. 3 )•

; Во второй 4«ае роста наблодался активный синтее каро-тиноцдов,которцй достигал шксимуш к 5-6 суткам роста.Основ-ное количество каротиноидов ( до 70?) синтезировалось культу-' рой-в период ватухания роста и достигало 2,3-2,5 мг/г.Посла „ достижения шксимуш количество каротиноидов существенно Не наменялось в течение однкх-двух суток,а энтем начинало снижаться »Черев я У суток.культивирования общее количество пмтт-тов составляло всего 5-от максимального. Резкое сиикение количества пигментов наблвдавось только при длительном культи-вироьании Мус.рМо! в условиях аирэнии { рис, 4 ),

/ ТЬким образом,при культивировании Мус.рЫ.е1 шт,171 па комплексной среде наблодались иная закономерность процесса образовании кчротиноидов но сравнении с синтетической средой, ' почти-полностью отсутствовал.период устойчивого сохранения" "' максимума каротиноидов и при этом не паблодалось изменения соотношения эпи^йвные /гипа{аэлие каротино иди. По-видимому, в. атих условиях происходило окисление карсттивдццов, которое при- , останавливалось введением пнгноксиданта, в 'частности' »витамина Е а период шксиизльиого каротонообрааоваиия/ При хранении культуральиой-жидкости;в.обычных условиях в комнате втечеяие нескольких месяцев заметного снихенип'количества-пигмагтов не ияблтоаяось. " 4 ; ■ ......

спшлнцт" гаетл н клпттигншм «ус.ры«! .

Для стимуляции образования каротиноидов микробами — • -процентами испо;ъэу»:тся различные вещества -спирта,гли-колн ,растительные моедщ,углеводороды,витамины и Т.Д.Особен-но широко используется ,/э ионон -циклический кетои,который в нас тощее время рассматривается как стимула то роощегоиэо-.

преыоидаого синтеза ( Reyee et al, ,1964).В литературе почти не встречается данных о влиянии ^-ионона на образование каротиыоидов микобактериями. « л .

В условиях наших опытов характер действия и о н о -ж а вначительно вависел от концентрации,времени его внесения в среду а в некоторой степени от состава среда.Оптимальная концентрация ^e-ионона для Myc.ptaei . составлял! 0,03-0,05'^. Наилучший результат наблкдался при введении ^s-ионона в синтетическую среду череа 3-ое суток, в комплексную среду черев 2-ое суток от начала культивирования,т.е.в то время,когда культура находилась в стационарной фаве или в фазе вату хания роста.При атом общее количество каротиноедов на синтетической среда увеличивалось на 5-10£,на комплексной среде на 2У-25?*, . выход апифавных каротиноедов достигал_65-ге^отсушн пигмея -тов,т.е. увеличивался на 100;£ по сравнении с контролем(табл.З)

Добавление "X комплексной среда растительных: масел или ката лотового хире приводило к увеличению выхода эли разных каротиноедов на 1Я-202,общее количество каротиноедов tie ивменя-лось.При внесении ^л-ионона в среды,содериащие растительные масла или каша лотовый жир, не набподалось увеличения положи те ль но го аффекта, получаемо го от .й-ионона .

По литературным данным (• Хп^гаъяш , Steenbock , 1935), этиленглкколь стимулирует биосинтез каротиноедов Uyc.piilei t увеличивая выход каротиноедов в 4U-60 раз .В условиях наших упытов этиленгликоль ингиоировал как рост,так и образование каротиноидов Myc.phlei тт,1?1.

КАЧЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ КАРОТИНОВДОВ .. Myc.pblei шт.171

Качественный состав пигментов ttyc.ptd.9i ^ , .синтезируемых в условиях глубинного культивирования,не вависел от с состава среды,что соответствует данным ,наблкщаемым другими исследователями ( Тоикаиига ,1965; Тагпок/Гвсгвок ,1970). Методом тонкослойной хромате графи и -в закрепленном слое я бно -массе обнаружено 10-12 каротиноидов,иа них 6 идент wf*uwpoваиы как близкие^ и у -каротинам, ле про тину, проняв одному /-каро -тине,веаксантину и крчптоксантину,Таким образом,среди выделенных нами каротиноидов, Myc.phlel шт.171 преобладают каро тиноцш,влияние , каротинам и их производным.

■"', V4"- '. Таблица. 3; ,. '¡, ' ашюю> -воиона на рос? в каротиногенвв Мус«.рЫе1 вг.171 на яошшксаой среде .. -( Дяиелыюсть выращивания 144 часа" ).;

, . РЙ - о«отсса в .Общее к-во карогияовдов К-во ша^аэ-

зреык янесенм -воновв - ■- коа»ч-( сух.в-во / наг хароти -

Контроль \ . , . 8,5 18,41 ± 0,37 41,25 + 1,89 - 100 35,9 " ; '/.

Тоже + > -ионон перед стерши- 8,7 18,33 + 0,50 38,70 + 2,03 94,0 48,8

■ ° ■■ * ■ г '■■■:.■■■■".'. ■■ л задней ■■ ■ ■ ■ ■

• 1 ■перед посевом , нет' рост & ■,. -л ■ -■■.

** .+ • " на 24 часа роста -8,9 14,00 + 0,43 14,35 10,80 34,8 . ; ^

' + ' на 48 часов " 8,8 ' 19,44 £ 0,67 50,50 + 2,37 122,0 • 73,5 • ■

■ Д аа 72 часа - * 9,0 19,« * О,® Г 46,15 ±2,19 • 112,0 55,5 ;.'■/''"■.' / \

, ^ • +'. ■• ка 96 часов • 9,2 18,87 + 0,60 ; 42,00 + 2,20 101,5 56,2 'V--.''

V ■ \ ^.''л,■.' ..; , .... -...у' ^^ .—,. '''., —, .. .. ...у

' V ; МАССОВОЕ • ГИРАЩИНМШЕ ' . Цуо»рЫе1 иг. 171. . '

-: • . В литературе не встречается данных о:культивирования• ^

; • • • сапрофитных мпкобактериД на комплексных средах в ферментерах. / - . . Лгеется сообщение о выращиваний некоторых ведов сапрофитных - .

микобактерип в - ферментерах^на углеводородах: без указания сос- ' * '

- тава среды н условий культи в и рованшК Слквкина,Котелев,1Рв8).' • На основе метода глубинного культивирования изучали воанож -

. ность выращивания Мус,р)ав± : шт.171 в ферментерах к полу-•> :\;„ . чеккя поливитаминного концентрата на относительно простой по составу среде -2/ кукуруаного экстракта мелассы, гV-."-.

Зарабатывали технологическую схему микробиологическое ■ -" '■■• - го проке водства по она ло гии • с проиэ ведством: антибиотиков, фер- " ' - : . ментов,аминокислот и т.д.При культивировании Муо»р1»1е1 .в

ферментерах отрабатывали режим ферментации - количество к во»- • рост посевного материала,температуру выращиваниясреды,аера-' - цкю,пеиогашеш<е и перемешивание.

Лучшие ревультаты по накоплению биомассы и образована» ':'■.-■■' каротиноидов шблцдались при использовании в качестве посевного . , г материала В-г суточной жидкоЯ культуры при внесении ее в коли- • . честве 7-10$ по объему.Титр после васева среды составлял 0,5 - -

■ '-..■'■- -О,в * Нелегок в 1 мл «Более низкий исходный тшр культуры

* ^ (0,3-0,В X 10 замедлял процесс накопления биомассы я снижал : ее выход на ' ■ ■< '' ^ - ■-■■ ^

Культуру в условиях ферментеров выращивали при ¡раалич- ' ; г ■ ных значениях температуры'г4-2б?29-30°и 32-34°,01шавльная тем-V т ратура роста Мус.рл1в1 в ферментерах ток же как в в колбах,

была 28-300.Пот1жение или повшшие температуры выращивания : : . ' приводило к вамедлеяию роста м снижению выхода каротиноцдов. -V'

- " Введу флотации культуры,т.е. всплывания бактериальной " /л

шсеы вместе с пеной и выбросок ее с отработанным воздухом в . : *.- ловушку, выращивание в ферькятерах проводили под избыточным'

давлением 1,0-1,8 ати,которое создавали над, поверхность» жид „' ,

■ ".'„кости.П^ж отработке режима апрации Myo.phl.9i. в фермяие - ;

1 ■ - ■ рвх устанавливали связь интенсивности аеращи с ростом культу- 4 : • ре к, образованней каротиноидов.06 эффективности аврации судили

- - по накоплению биомассы,выходу каротиноидов^иосинтеткческой — * ■

активности культуры С скорости обрайовакия каротгагоидов^) и ; потреблению редуиируицих веществ. ''}">/: ■ - -

'' Аэрация лимитировала не столько выход биомассы и каро-тиновдов^сколько скорость накопления биомассы и каротиноцдов, В результате многочисленных опытов установили оптимальный,режим ступенчатой аэрации культуры в ферментерах,который нахо дился в слидуицихпределах (объеи^объем/мин ); сО часов - роста до 12 часов роста -0,05 ; с 12 до .¿4 часов -0,35.¡ с 24 до 48-60 часов -0,5 и до кони» <|«рментации - 0,05, ' .*:.

• При указанном режиме аэрации в сочетании с избыточным' давлением над поверхность» жидкости и перемешиванием со ско- ■ росгыо ЭО1М00 оборотов в минуту накопление,биомдссы и каро- ^ / тиноидов.проходило более активно,« 72 часам ({«риентации выход > биомассы (16И8.г/л) и каротизювдов í 2&-Э0 мг/л) составлял -■ 85-90Í; от,максимума,достигаемого обычно К;120 часам,биосинте-' : тическая активность куДтуры била 20-25 мкг/г/час,потребление .редуцирущих веществ 0,45-0,5 ;г/л^час,что позволяло закончить. .процесс выращивания культуры в Ферментерах в 72-04 часа.

В качестве rte ко гасите ля , использовали смесь' подсолнечного .масла с кашалотовым жирсм 1:1,а также синтетический пенога-ситель А-154 в концентрации 0,06- 0,1 f. ' ••..':; <-■■

. В условиях ферментеров сглаживалась двух1|«зность роста' культуры,накопление биомассы и образование карстйноидовпрохо-%0Ш.о;параллельно,Всего проведено более 200 <)ерментаций._ '-.

•' Биомасса Myc.pnlei - шт.171.полученная на комплексной средекукурузного экстракта и 8* мелассы),содержала 1,5-2,0 мг/г каротиноцдов, 10-18^ липцдов и до 40 % условного белка_( в,25 х N ),богатого аминокислотами. В 1 г сухой био-■ массы содержалось'( мкг/г)¡ витамина:Bj" -3,36.; Bg'-100,0 ; -: в3 - 1163; вб -92,8 ; РР-1&91 ; биотина -1,97; иноаита -

6,1 (Воаняковская и др.»1969,1971) и витамин К* _ ' ,:На основании результатов,полученных при изучении про -•цесса ферментации • Mjo.phlei ; шт. 171 в, полу производствен - '' ных ycfloBHRXjсоставлен технологический регламент на получение поливитаминного концентрата с использованием о качестве продуцента витаминов„втого штамма.Р&зраПотанный технологический ре-

Ш может быть рекомендован микробиологической прсмышлшности для получения нового препарата кормового назначения из сапрофитных микобактерий, в частности, Myc.piaei. штЛ?1 ,содер жащего яаротиноццы,витамины группы В, в том.числе витамин В, витамин К и другие биологически активные вещества.

. -ИСШТАНИЕ ГШШОАМИШОГО КОНЦЕНТРАТА Ю :<ycphi.»l В КАЧЕСТВЕ ШДКОШКИ СЕЛЬСКОХОЗЯасТБ-ЛНЫХ ЖШиИШХ.ИТМЦ'И F1J">

В соответствии с технологическим регламентом в полуаа-' . водскюс условиях ( в ферментерах емк.МО и 500 л) получены партии поливитаыиннмч^концентрата и исштаны на животных. Концентрат с содержанием 5-7?! сухих веществ и 70-100 мг в 1 л каротшоидов получали.концентрированием культуральной жидкости сепарацией в 8-4 раза.Всего ва период с 1966 по 1972 гг. проведено 11 опытов на животных.

Основнс{ задачей этих оштов было noM»ujeimes биологи1 - " ческой полноценности и хозяйственной эффективности кормовых смесей путем добавки к ним полаьитамишого концентрата из Myc.phlat .Влияние концентрата изучали в с|>авнениц с витамином А,внташишзированнш ри1ьлц жиром,с масляным морков ным каротшом,хйойfоД пастой и витаминами группы В, в том . числе витамином В + витамин Â.

В ревультате испытания &{фективности использования поливитаминного концентрата из tiyc.plilei шт. 171 установлено,что введение его : в ращон телят увеличивает «ивой вес на 16,6;? а содержание каротина в крови на 42,9 % ; в рацион подсвинков увеличивает живой вес на 21$ ; в рацион Циплят увеличивает живой вес на 13-1 ^»содержание каротина в крови в пе -риод интенсивного роста на 40-7ï#, витамина А в крови на 20 --б^Е, и в печени на 78-00^, способствует улучшению физиологи -ческог" состояния цыплят, о чем свидетельствует повышение содержанья в крови црплят эритроцитов на £0^ ч гемоглобина на 40Çt ; увеличивается в 1,5-2 раза свертываемость крови; спи -жаезеся расход корма на 2~10/>J снижается себестоимость 1 кг прнвгеа по сравнении с контролем на 12-15,8JÎ.Скармливание" эквивалентного количества■поливитаминного концентрата иямино-бактерий снижает себестоимость 1 кг припеса по сравншио с вк-

тамиками на 5,в/?, витаминизированным рыЗьим жиром на И»^ и масляным морковным каротином'на 9,9%,'Зтот дополнительный -биологический аф}>ект,по~в1щию1СГ, объясняется действием Ком- " плекса*биологически активных'веществ,которые содержатся в поливитаминном концентрате ив ~ Цус»рЫе1* щт,171.

Скармливание концентрата |дграм-несушкам увеличивает кг жкэой вес на 7-14,6$,яйценоскость на 10-12,2^, крупность яйца на Ъ-7'г> »пигментацию желтка на 20,9%,содержание каротина в желтке на 9-16^, содержание витамина А в крови на 173/5, в печени на 255% к в желтке на 12-1б,'».В результате гистологичес- . ких исследований не установлено отрицательного влияния поли-! витаминного концентрата иа микобактерий на физиологическое состояние птицы при скармливании еш в течение 470дней,

В опытах,проведенных на радужной форели совместно с ' ':■ аспиранткой Государственного шучно-исс ледова те ль скс~^> инстн-тута оверного и речного рыбного хозяйства (йрис^ина, 1968), установлено, что' в условиях искусственного разведения радужной форели для сохранения окраски дашц метет бить использована биомасса Мус.рЫ»! : шт. 171. ' -

Скармливание животным лиофильно высушенной биомасс» или сухого концентрата, по лученного, методом распыления,дало . аналогичные ревуль та ты. Полученные данные свидетельствуй об еффевтизвости и воешжности использования поливитаминного ; концентрата иа Мус.рЫ«1 .шт.171 в Качестве витаминной добавки в рационы животных,птиц и рыб« ! "

'В Ы В О Д Ы' /л- .V

1. Цго, рЬ1в! ШТ.171 в услювиях глубинного вульти-вированкя синтезирует комплекс витаминов каретиноадн,пир* , донсш,пантотеновуо кислоту,биотин,парааминобензойяув кислоту, юювет.никотивовутб кислоту^итамин в^ци витамин К. - 7 ~ '

'2.Лучшим* источниками углерода для накопления биомассе ^ образования каретиновдов являются' угле водав некото £ыеспвр-ты.При втом более активный синтев каротиноидов наблтгзается на ■■ среде о арабиновой и при совместном внесении, глюновы к сахарозы. ; Цус.рЫ-в! ' . шт. 171 вссимялчрует азот амконнйт& солей

\ минеральных иорга1ичесяихкмсдат,мтратов»некоторыхаминокис-:.'

лот и равлнчНнх сложных азотсодержащих веществ И)дним Ma лучших

источников авота является мочевина» . " : />:, ^

v Максимальное накопление каротиноидов в клетках-' Муо. :

phlei шт. 171 обеспечивается при соотношении С/Ы в пре

делах 28 ^5,При tmtx же значениях.(УH иаблццается хороший?

рост культуры .С увеличением соотношения C/N повышается со -

дерсакие липидов в клетках микобактерий.

S .Для данного штамма Uye.phlet . . »ауксотрсфюго .по

витамину Bj, содер1ание укаванного витамина в среде обуслав -

ливает как интенсивность роста»так и каротинообраэсвания куль- -

■ туры, - - ' ' .

4»Содержание фосфора,магния,серы и калия в среде опре -

деляет как рост,тек и биосинтез каротиновдов,Ионы железа tf л цинка стимулируют только образование каротиноидов, в то время, как кобальт ингибирует в борщей степени кароткногенеэ,чем^ рост микобактерий, - - v'' ' ". . . , '

* б.При культивировании. Мус.' phlel- тт.171 ва синтетической среде следующего состава ( в JE) : ыочевгаа - 0,125; глюкоза -2,0; сахароза -2,0; Ma ¡^IRJ^.lâ H 20 ; КН^СЦ-0,3;:: 7 HgO-0,1} JêcCe-îo ш>'л » витамин В^ - 0,5 мг/л ва : - <мО суток накапливается 12-14 г/л биомассы: к 25-40 in/л.Ка- ; .-. роткновдовЛакопление каропэтовдов в клетках микобактерий про- .1; исходит параллельно росту культуры,достягает максимума к10-12 суткам,затем в течение 4СМ5 суток 'сохраняется на этом уровне, ■ после чегоначинаетстваться.прк втомколичество твфаэгух Л -каротияоедов уменьшается в 2 раза, ;

б» На комплексной среде,состоящей ив кукурузного эк- х Чтракта и Э^мелассц, выход биомассы составляет 17-20 г/л и ка-/; ротшюидов 95-55 мг/л.На этой питательной среде 'выявлена > 7' двухфазность роста культурАктивный биосинтев каротиноидов / набладается только во второй фазе'роста культуры; V

г. 7 »Добавление к средам .д -ионона повшает выход шифаэ - О ных каротиноидов в 2раэа.Этиленглшздльинп«5ирует как рост, ' ; так и каротинообрезование культуры, ' - v : ' -

ВЛетодам тонкослойной хроматографии в вакрепленном : сяоё в биомассе .* Чу о. phlei тт.171 обнаружено 10-)2карогя-; ""иовдов »кв них в цценп^яцированы как близкие ^ , f - каро »>..;/

тинам,лелротину,производному каротина,эеаксантииу и крипто- V„ ксантину. " - ■

-.-■/■'...у- 9.Вазр«ботая технологический режим выршципанил ЦУ®* " рЬ1«1 шт.171 в ферментерах и на основании результатов 1 ' ферментации культуры в полупроизводственних условиях составлен регламент на получение поливитаминного концентрата на . 1 ->учгрувно-мелзссной среде с выходом биомассы 16-18 г/л и каро-;■>.;■ тиноидов 25-80 мг/л.' " ••'*.'•

; -: ~ 10.В результате биологического испытания поливитамин - , .' ;.

- • ; но го концентрата из Мус.рЫв! . - -.: ют. 171; получены дшпше, 1," г. . Которые свидетельствуют об объективности й возможности исполь- '■" • .••... ; - зования концентрата в качестве витаминной добавки в рационы ; : животных,птиц и рыб. ■.■''., ' ..-■ .■,■■■ ;

; > ■ V;Список работ,опубликованных по материалам диссертации. - ; ' 7 -,' КВоанжовская О.М.,Элькин:С.Б.,Позднякова' А.И. 196В. • Способ получения микробного препарата для сельско - '

. : хозяйственных животных и птиц.Авторское свидетельство СССР V 1 "'■;■

»217935 .. ""''Л.:'У'УУ

' 2. Злькин С.Б;,ГЬэднякова А.И. 1968.Исследование уело- "" ■ вий каротинообразования МусоЬасСвгХют . р)11а1 V 7 1 : Д:

/ - В сб.: "Использование микроорганизмов в животноводстве и для .

..'' : ващитн растений Ленинград, 199. • - ^ ■'''■' :

Э. Элькин С.Б.,Смирнова М.Ф.,ГЬэд[Шкова А.И. 1960. Проверка э^ективности каротиноедов микробиологического синте- ; ва МусоЪас^пча рЫв! на рост и развитие телят, под евин - . ' ■■■: ков .и. цыплят.: - В сб.: "Использование микроорганизмов в живот- -V-'"- 'Г иоводстве и для защиты растений "Ленинград, Я9. / . :.' ч'

г " 4. Позднякова А.И.,8лькин С.Б. 1969. Биосинтез кароти- ■ - - 'V.:' ноиаов ■ МуооЬассогш» рЫ«1 171 на различных питательных . - средах-»Микробиологический синтез. Сборник реферативных материя- Си лов, 5-6,5. -' ' : ' .." ..

5. Титов П.М.,Смирнова М.Ф.,ГЬядпякова А.VI. 1971. . Использование микробного поливитаминного препарата ив - сапро - -^"Г'

фитных микобактерий в "рационах цыплят и кур.-№форшционный -V - / . листок СХ-49-71 (Птицеводство).Ленинградский межотраслевой V ^

территорипльннЯ центр иаучяо-технической ю?{©рмации и пропа - ! гаццы. ■■. 11 .""■-.■' -- ;■■''■'"'У ■ :■■■". -У,.' '- "'■■' ■'

6.Сшфнова МЖ ,Элькин С.Б.,Пэаднякова А.И. 1971.. Эффективность ввтаминно-каротиноэого препарата юскосзктернй при кормлении молодняка сельскохозяйственных животных и птиц Веб.: "Наука -седъскохоэяпстеетюцу производству ".Сборник

научно-технической информации.Северо-Западного НШ сельского хозяйства t!f 4Дивотноводство и коршпроиэводстэо, 19.

7,ГЬаднякова А.Н.,аиьк(я С.Б. 1971 .Стицуляцшя роста * биоевнтева кароткновдов Hjcotocteriua pta»i шт. 171.

( Сообцтше 1). - Бвдаэгепь ИШ1 сельскохозяйственной микробиология, вып.1 15,33.

е.ГЬадиякова А.И.,Элькю1 С.Б. 1971 .Сгацуякцпя роста к баоскятеъа каротнноадов Hycobacterium phiei irr.171. ( Оообкение П).- Бюллетень ЕИШ еельскаюаяйственной мюеро-б*олопо»,вып.115,34,

ОчПоэднякова А»Н.,Влъккн С.Б. 1971 .Влияние витамина В | на роет it биосинтез каротикоадов Hjcobeoteriun phiei от. 171. - Белле тень ШШ сельекохозяйстаенпов микробиологи», вотЛ.В 15.S9.

Ю.Смирповя ¡0.,Поаднякова А.И. 1971 ЛЧфектквиость -скаршэиолия пояпвптамэшого комплекса не сапрофитных мико-бактерий курам • несухкам .-бюллетень Hill! сельскохоеяйст — мкной микробиология,вып.I,® 15,45*

FTfi тип.ШР ткр.ДХ! 50.С.7;