Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биопленки Staphylococcus aureus: структурно-функциональные характеристики и взаимоотношения с нейтрофилами

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биопленки Staphylococcus aureus: структурно-функциональные характеристики и взаимоотношения с нейтрофилами"

На правах рукописи

Чеботарь Игорь Викторович

Биопленки Staphylococcus aureus: структурно-функциональные характеристики и взаимоотношения с нейтрофилами

03.02.03. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

5 ДЕК 2013

Москва, 2013

005542339

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант:

Маянскнй Андрей Николаевич,

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: Бондаренко Виктор Михайлович,

доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории генетики вирулентности бактерий Федерального бюджетного государственного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Воронина Любовь Григорьевна,

доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры лабораторной диагностики и бактериологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Червинец Вячеслав Михайлович,

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « б» февраля 2014 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.208.046.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

Автореферат разослан« ноября 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Ольга Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Течение инфекционных болезней может протекать с осложнениями из-за формирования в организме микробных биопленок (Романова Ю.М. и соавт., 2011; Aparna M.S., Yadav S., 2008; Donlan R.M., 2002; Marrie T.J., Costerton J.W. 1983). Биопленки являются формой микробных сообществ, фиксированных на поверхностях и состоящих из микробных клеток и ассоциированного с ними внеклеточного матрикса (Costerton J.W. et al., 2003). С биопленочными инфекциями связаны многие хронические заболевания - муковисцидозная пневмония, средний отит, патология зубов и околозубных тканей, остеомиелит, инфекции мочевыводящих путей и пр. (Лямин A.B. и соавт., 2012; Donlan R.M., Costerton J.W., 2002). До 80 % всех бактериальных инфекций человека связаны с образованием биопленок (Römling U., Balsalobre С., 2012). Часто биопленки развиваются на поверхности медицинских устройств (протезов, катетеров, имплантов) и являются этиопатогенетической основой развития так называемых девайс-ассоциированных инфекций. В Германии, одной из немногих стран, где ведется статистический учет девайс-ассоциированных инфекций, количество подобных заболеваний превышает 100 000 случаев в год (Mack D. et al., 2004). В Западной Европе и США ежегодно регистрируется более 500 000 случаев катетер-ассоциированных инфекций (Бережанский Б.В., Жевнарев A.A., 2006). Каждое осложнение в виде катетер-ассоциированной инфекции удорожает лечение одного больного на сумму от 33000 до 65000 долларов США (PittetD. et al., 1994; Orsi G.B. et al., 2002).

Стафилококки - актуальные возбудители оппортунистических гнойно-воспалительных заболеваний - являются бактериями, способными к формированию биопленок. Прежде всего, это касается Staphylococcus aureus (Götz F., 2002; Mack D. et al., 2004; Otto M., 2008; Agarwal A. et al., 2010). Известно, что от 67 % до 78 % клинических изолятов S. aureus могут формировать биопленки (Jain A., Agarwal А., 2009; Taj Y. et al., 2012). Формирование биопленок с участием & aureus и Staphylococcus epidermidis может играть решающую роль в патогенезе остеомиелита, синуситов и риносинуситов, эндокардитов, отитов, муковисцидоза, септических артритов, хронической раневой инфекции (Costerton J.W. et al., 1999; Lynch A.S., Robertson G.T., 2008; Ryan M. et al., 1997; Howell W.R. et al., 2011; Larson D.A., Han J.K., 2011; Goerke С., Wolz С., 2010; Siddiqui A.R., Bernstein J.M., 2010). Особую роль стафилококковые биопленки играют в развитии инфекций, связанных с имплантами: они наблюдаются у 1,5-2,5 % больных с первично имплантированными коленным или тазобедренным суставами, причем в 22-23,6 % случаев от них выделяется S. aureus (Rohde H. et al., 2007). Вышеизложенные факты свидетельствуют о том, что проблема стафилококковых биопленок

является актуальной для современной медицинской науки и практики здравоохранения.

Степень разработанности темы исследования

Одни из первых работ, в которых была описана сложность межклеточных контактов внутри бактериальных колоний, принадлежат отечественному микробиологу Н.Д. Иерусалимскому (Иерусалимский Н. Д., 1952). Однако, доказательства патогенетической роли микробных сообществ - биопленок -появились лишь около 30 лет назад в работах Т. Мэриэ, Д. Костертона и Д. Неллигана (Marrie T.J. et al., 1982; Marrie T.J., Costerton J.W., 1983). Основоположниками учения о медицинских биопленках считаются Джон Костертон (автор более 400 работ о биопленках), Томас Мэриэ (автор более 100 работ) и Карла Арсиола (автор более 150 работ). В России несколько научных коллективов активно занимаются проблемами биопленок. Научно-исследовательская работа, посвященная проблеме биопленок, проводится на базах ФБГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (под руководством А.Л. Гинцбурга), Санкт-Петербургского государственного университета (под руководством д.б.н. О.В. Рыбальченко), Самарского государственного медицинского университета (под руководством Жесткова А.В.) и других научных коллективов. Существенный вклад в исследование биопленок внесли зарубежные ученые. Об этом говорит статистика электронного ресурса PubMed: в 2012 году по теме биопленок в мире было опубликовано более 3000 научных работ. Работы Дитриха Мака и Ганса-Курта Флемминга посвящены изучению биопленочного матрикса (Mack D. et al., 2004; Flemmmg H.C., Wingender J., 2010). Ким Льюис известен своими работами о биопленочной антибиотикорезистентности (Льюис К., 2005; Lewis К., 2005). Джефф Лейд изучает взаимоотношения биопленок с эффекторами иммунной системы (Leid J.G. et al., 2002). Анна Донгари работает в области исследований, посвященных взаимодействиям между иммунной системой и биопленками (Dongari-Bagtzoglou А., 2008). Ультраструктура бактериальных биопленок и роль биопленкообразования в симбиотических и антагонистических отношениях микробиоты кишечника человека, исследованные с помощью различных методов электронной микроскопии, отражены в новейшем обзоре Рыбальченко О.В. и Бондаренко В.М. (Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., 2013). Однако, в большинстве работ, посвященных медицинским биопленкам, в качестве объекта исследования были использованы микроорганизмы, не относящиеся к роду Staphylococcus. В знаниях о стафилококковых биопленках имеется существенный пробел, касающийся структурно-функциональных особенностей биопленок золотистого стафилококка, которые можно было бы использовать в качестве основы для разработки методов диагностики и управления стафилококковым биопленочным процессом. Вопросы взаимоотношения

биопленочных стафилококков с организмом человека, проблемы диагностики и фармакологического контроля стафилококковых биопленочных процессов являются малоизученными направлениями современной медицинской микробиологии.

Цель исследования

Охарактеризовать структурно-функциональные свойства биопленок Staphylococcus aureus для обоснования рациональных подходов к диагностике и управлению стафилококковыми биопленочными инфекциями.

Задачи исследования:

1. На основе изучения морфо-функциональных и физико-химических свойств биопленок S. aureus разработать и апробировать диагностический алгоритм для идентификации и количественной оценки стафилококковых биопленок.

2. Описать феноменологию и изучить механизмы структурных изменений в биопленке S. aureus, возникающих при взаимодействии с нейтрофилами в условиях in vitro.

3. Охарактеризовать нейтрофил-стимулирующие свойства биопленок S. aureus.

4. Проанализировать особенности экспрессии гена AgrA биопленочных и планктонных стафилококков до и после контакта биопленок S. aureus с нейтрофилами человека.

5. Исследовать структурно-функциональные особенности дериватов, образующихся в результате взаимодействия нейтрофилов с биопленкой S. aureus.

6. Разработать и апробировать способ, сочетающий в себе (1) определение чувствительности биопленочных микробов к антимикробным препаратам и (2) избирательную оценку фильтрующей способности биопленок в отношении противомикробных агентов.

7. Исследовать возможность образования биопленки S. aureus на поверхности синтетических макропористых сетчатых эндопротезов, применяемых в хирургии для пластики брюшной стенки.

Научная новизна

Впервые была показана возможность использования метода масс-спектрометрии для идентификации видовой принадлежности биопленочных стафилококков из моновидовой стафилококковой биопленки. Лимитированные микроколебания клеток в стафилококковой биопленке описаны в качестве нового критерия наличия межклеточного биопленочного матрикса. Оптимизирована методика выявления ультрамикроструктур межклеточного

биопленочного матрикса биопленок S. aureus при помощи сканирующей электронной микроскопии. Показано, что вновь разработанный способ количественного учета стафилококков был оптимальным методом для количественной оценки ранних биопленок (менее 24 часов). Подтверждено, что метод количественной оценки биопленок на основе спектрофотометрического исследования элюатов красителя, смытого с предварительно окрашенной биопленки, был неэффективен для ранних (менее 24 часов) и оптимален для более зрелых биопленок (24 часа и более).

Вскрыты механизмы нейтрофил-зависимой деструкции биопленок S. aureus, которые связаны с разрушением протеино-нуклеотидного биопленочного матрикса ферментами нейтрофилов. Было обнаружено, что нейтрофилы, разрушая биопленку, не обеспечивают полного киллинга биопленочных стафилококков, которые трансформируются в жизнеспособные планктонные (плавающие) бактерии.

Впервые проанализированы особенности стимуляции люминол-зависимой хемилюминесцении нейтрофилов человека в реакциях с биопленками S. aureus: биопленочные стафилококки обладали пониженной способностью индуцировать эту реакцию по сравнению с планктонными стафилококками. Было выявлено, что это снижение связано с наличием в биопленке внеклеточного протеино-нуклеотидного матрикса.

Впервые описаны особенности коррелирующей с вирулентностью стафилококка экспрессии гена AgrA при взаимодействии между биопленкой S. aureus и нейтрофилами человека. Доказано, что стафилококки, трансформируясь в планктонные формы, демонстрировали усиление экспрессии AgrA, что было новым свидетельством повышения вирулентности стафилококков, высвобождавшихся из биопленки.

Впервые обнаружены и охарактеризованы наноразмерные везикулы, которые появляются в инкубационной среде при взаимодействии биопленки S. aureus с нейтрофилами человека. Везикулы обладали способностью разрушать биопленки S. epidermidis, что, по-видимому, было связано с присутствием в их составе протеинов, дестабилизирующих биопленочный матрикс.

С помощью вновь предложенного метода оценки антибиотикорезистентности биопленочных бактерий был доказан факт снижения скорости фильтрации антибиотика (пефлоксацин) через биопленку по сравнению с фильтрацией через слой адгезированных между собой планктонных стафилококков. Это явление сопровождалось повышением выживаемости биопленочных стафилококков при обработке терапевтическими концентрациями пефлоксацина и рассматривалось в качестве механизма снижения чувствительности биопленочных стафилококков (S. aureus) к антибиотикам.

Была установлена способность S. aureus к формированию биопленок на поверхности синтетических эндопротезов, применяемых в отечественной

хирургии для пластики брюшной стенки (полипропилен, поливинилиденфторид, комплекс «полипропилен-поливинилиденфторид» и реперен). Это стало свидетельством универсальности биопленкообразования золотистым стафилококком, который способен закрепляться и размножаться на разнообразных полимерных поверхностях.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результата настоящего исследования вносят существенный вклад в изучение структурно-фунциональных характеристик биопленок, сформированных золотистыми стафилококками, дополняют научные представления о морфологии и физиологии биопленок, позволяют обосновать новые походы к диагностике и лечению биопленочных процессов. Научно обоснована и подтверждена концепция о том, что разрушение биопленок S. aureus нейтрофилами создает условия для диссеминации стафилококков в организме. Выявлены ранее неизвестные закономерности изменений экспрессии agr-системы, контролирующей вирулентность золотистого стафилококка, которые происходили в процессе нейтрофил-опосредованного разрушения биопленок S. aureus. Расширены представления о функциях внеклеточного матрикса, обеспечивающих защиту биопленочных стафилококков за счет подавления кислород-зависимой биоцидности нейтрофилов. Исследование фильтрации антибиотика через биопленку S. aureus позволило установить связь между замедлением проникновения антибиотика сквозь биопленку и устойчивостью биопленочных стафилококков к его действию. Получено представление о том, что золотистый стафилококк проявляет универсальность в использовании синтетических поверхностей для формирования на них биопленок, что продемонстрировано на моделях эндопротезов, изготовленных из различных материалов.

Предложен и апробирован новый алгоритм исследования стафилококковых биопленок, включающий набор методик, направленных на идентификацию биопленочного стафилококка, обнаружение специфичных для биопленки структур, а также на количественную оценку интенсивности биопленкообразования.

Установленное матрикс-зависимое подавление хемилюминесценции нейтрофилов демонстрирует возможность использования биопленочных компонентов (матрикс) для создания новых препаратов, ингибирующих фагоцитарные реакции.

Обнаружены и охарактеризованы везикулы с антибиопленочным эффектом в отношении биопленок S. epidermidis, которые могут стать прототипом нового класса антибиопленочных препаратов.

Предложен новый метод, который позволяет производить одновременную оценку (1) резистентности биопленочных бактерий к противомикробному

препарату и (2) избирательную оценку фильтрующей способности биопленки в отношении этого препарата.

Выявленная способность клеток S. aureus к формированию биопленок на поверхности эндопротезов (полипропилен, поливинилиденфторид, реперен, полипропилен-поливиншгаденфторид) должна учитываться при имплантации эндопротезов в контаминированные раны.

Методология и методы исследования

Методология настоящего исследования спланирована, исходя из современных принципов научного познания, и организована адекватно поставленной цели. Предметом исследования стали проблемы, связанные со стафилококковыми биопленочными процессами. Анализ научной литературы, посвященной проблеме стафилококковых биопленок, проведен на основе формально-логических методов исследования. Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов.

Основными объектами исследования являлись биопленки, образованные золотистыми стафилококками S. aureus, биопленочный матрикс, биопленочные золотистые стафилококки, планктонные стафилококки, нейтрофилы крови человека, везикулярные структуры из реакционной смеси биопленок S. aureus и нейтрофилов. В основу дизайна исследования были положены два типа экспериментов. Первый был основан на регистрации морфологических и функциональных параметров биопленок S. aureus и биопленок, подвергавшихся воздействию клеточных (нейтрофилы) и неклеточных (ферменты, антибиотики, окислители) агентов. Второй тип экспериментов был основан на регистрации морфо-функциональных параметров нейтрофилов человека в реакциях с биопленками S. aureus и отдельными компонентами биопленок (бактериальные клетки, внеклеточный биопленочный матрикс).

В работе применялись следующие методы исследования: бактериологические, гистологические, биохимические, иммунологические; центрифугирование, спектрофотометрия, методы сепарации клеток крови, цитологические методы, методы традиционной световой микроскопии, исследование хемилюминесценции, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, электронная трансмиссионная и электронная сканирующая микроскопия, масс-спектрометрия, измерение размера и заряда наночастиц методом лазерного углового динамического светорассеяния. Результаты анализировались при помощи статистических методов.

Материалы и методы. В соответствии с поставленными в работе задачами исследования проведены 156 серий лабораторных экспериментов (более 1800 анализов).

В большинстве экспериментов с биопленками был использован биопленкообразующий штамм золотистого стафилококка (S. aureus, штамм 5983/2), выделенный из клинического источника. Биопленки моделировали в жидких питательных средах (бульонах), содержащих 1 % глюкозы. В большинстве экспериментов использовали трипсинизированный соевый бульон Tryptic Soy Broth (TSB). Моделирование биопленок включало три этапа: подготовку стандартной взвеси биопленкообразующего микроба, инокуляцию стандартной взвеси на поверхность для роста биопленки (чашки Петри, лунки 96-луночных планшетов, инсерты с мембранным дном) и инкубацию при 37°С. Сроки инкубации определялись условиями конкретного эксперимента. Идентификацию видовой принадлежности бактерий проводили на основе рутинных бактериологических методов, используя диагностические тест-системы STAPHYtest-24 (ErbaLaChema) и API-Staph (BioMerieux), а также на основе технологии MALDI-TOF MS методом прямого профилирования на масс-спектрометре Mícroflex (Bruker Daltonics) с использованием программы Maldi Biotiper automatic (Маянский Н.А. и соавт., 2011). Для масс-спектрометрической идентификации видовой принадлежности стафилококка материал из чашек Петри смешивали с 1 мкл матрицы (насыщенный раствор а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в смеси 50 % ацетонитрила и 2,5 % трифторуксусной кислоты), наносили непосредственно на мишень специального планшета и подвергали масс-спектрометрии. Микроскопические исследования, нацеленные на визуализацию трехмерной структуры биопленок и на оценку жизнеспособности клеток (стафилококков, нейтрофилов), проводили с помощью лазерного сканирующего (конфокального) микроскопа LSM 510 Meta (Zeiss), придерживаясь рекомендаций по конфокально-микроскопическому исследованию микробиологических объектов (de Carvalho С.С. et al., 2007; Palmer R.J. et al., 1999).

Для ультраструктурных исследований биопленки использовали сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) (Рыбальченко О.В. и соавт., 2008; Чеботарь И.В. и соавт., 2013; Ganderton L. et al., 1992). Пробоподготовка для СЭМ включала фиксацию биопленок в 2,5 % растворе глутарового альдегида и постфиксацию 0,5%-ным раствором 0s04- После лиофилизации высушенный препарат монтировали на держатель электронного микроскопа и на его поверхность методом ионного распыления в аргоновой плазме наносили слой платины (10 нм), используя установку JFC-1600 (JEOL). СЭМ проводилась при увеличении от 1000 до 10000 раз в режимах, рекомендуемых рекомендациями фирмы-производителя сканирующего электронного микроскопа JSM 6390А.

Для оценки интенсивности биопленкообразования использовали два метода. Первый был основан на традиционной окраске фиксированных в чашках Петри биопленок анилиновыми красителями (Esteban J. et al., 2010; Christensen

G.D. et al., 1985). Этот метод количественно отражает объем исследуемой биопленки. Биопленки окрашивали 1%-ным раствором кристаллического фиолетового (4 мин при комнатной температуре), затем ополаскивали дистиллированной водой. Оценку результатов проводили визуально и/или спектрофотометрически. Спектрофотометрическая оценка была основана на исследовании светопоглощения/светопропускания (длина волны 590 нм) смывов, которые получали в результате элюирования красителя из биопленочной массы смесью этанол-изопропанол (1:1). Результаты выражали в процентах относительно контрольных проб. Второй способ оценки интенсивности биопленкообразования, который был разработан в ходе выполнения настоящей работы, основан на микроскопическом исследовании биопленок с последующим компьютерным документированием и статистическим анализом (Чеботарь И.В. и соавт., 2010). Полученные изображения подвергали обработке при помощи программы «Подсчет микробов в кластерах», определяя количество стафилококков, количество стафилококковых кластеров и распределения стафилококк/кластер в изучаемой биопленке.

Нейтрофилы выделяли из венозной гепаринизированной крови здоровых доноров на градиенте плотности фиколла-верографина (Подосинников И.С. и соавт., 1981; Brinkmann V. et al., 2010). Остаточные эритроциты лизировали изотоническим раствором. Нейтрофилы отмывали от гемолизата и ресуспендировали в растворе Хенкса. Жизнеспособность контролировали тестами с трипановым синим и пропидия йодидом; жизнеспособность полученных нейтрофилов составляла не менее 97 %. Лизат нейтрофилов получали путем обработки взвеси клеток (10б/мл) ультразвуком (22 кГц, 15 с) при 0°С с последующей фильтрацией через бактериальный фильтр с порами 0,2 мкм (Corning) (Roberts P.J., 1990). Эритроциты выделяли из венозной гепаринизированной крови здоровых доноров на градиенте плотности фиколла-верографина, отмывали фиколла и верографина изотоническим раствором натрия хлорида (pH 7,2) и ресуспендировали в растворе Хенкса, доводя до концентрации 106 в 1 мл. Жизнеспособность эритроцитов контролировали тестами с трипановым синим.

О реактивных изменениях нейтрофилов при контакте с биопленками и биопленочными компонентами судили по показателям люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов, которая отражает степень метаболической перестройки клеток (Маянский А.Н. и др., 1997). Для изучения люминол-зависимой ХЛ нейтрофилов биопленки моделировали в течение 48 ч при 37°С в 96-луночных планшетах Cellstar (Greiner Bio-one) в 0,35 мл бульона Tryptic Soy Broth (TSB) (Becton, Dickinson and Company), содержащего 1 % глюкозы. Перед экспериментом биопленки отмывали раствором Хенкса и добавляли в лунки по 0,2 мл раствора Хенкса. Взвесь нейтрофилов (2 х 10б в 1

мл), содержащую 10'5 M люминола, вносили (по 0,2 мл) в лунки с биопленками и измеряли люминол-зависимую хемилюминесценцию при 37°С, используя хемилюминометр Luminoskan Ascent (Thermo Scientific). Измерения проводили на 5, 10, 15, 30, 45, 60 минутах реакции. Контролями служили (1) нейтрофилы в лунках с 0,2 мл раствора Хенкса без биопленок, (2) биопленки, куда вносили 0, 2 мл раствора Хенкса с люминолом (без нейтрофилов). Объектами сравнения для биопленочных систем служили (1) планктонные (плавающие) стафилококки, вносимые в лунку планшета в количестве, эквивалентном количеству стафилококков в одной биопленке, (2) биопленочный матрикс, (3) планктонные стафилококки, прединкубированные (15 мин, 37°С) с биопленочным матриксом. Контролем жизнеспособности и реактоспособности нейтрофилов служили пробы с СЗЬ-опсонизированным зимозаном (0,2 мл взвеси нейтрофилов и 0,2 мл взвеси СЗЬ-зимозана концентрации 1 мг/мл).

Идентификация биохимической природы внеклеточного матрикса проводилась путем обработки биопленок субстанциями, обеспечивающими специфическую деструкцию разных типов матрикса (Frank K.L., Patel R., 2007; Izano E.A. et al., 2008; Wang X et al., 2004). Для того, чтобы подтвердить структурную роль белков в образовании матрикса использовали протеиназу К (Amresco) и трипсин (Thermo Scientific), для обнаружения в составе матрикса внеклеточной ДНК (еДНК) применяли ДНКазу (Fermentas). Для выявления полисахаридов проводили обработку биопленок периодатом натрия.

Везикулы изучали с помощью метода трансмиссивной электронной микроскопии. Образцы были фиксированы путем смешивания с эквивалентным объемом 5 % раствора глутарового альдегида в 0.1 M Na-какодилатном буфере (pH 7.4). Из фиксированного образца забирали 30 мкл и наносили на пленку из пиолоформа на электронно-микроскопической сетке, затем окрашивали фосфорно-молибденовой кислотой (предварительно нейтрализованной раствором NaOH до pH 7,2-7,4) (Bello V. et al., 2010). Высушенные образцы подвергали исследованию на электронном микроскопе Morgagni 268D (FEI) при увеличении в 1000-140000 раз. Размеры наноразмерных частиц в суспензиях измеряли при помощи анализа лазерного углового динамического светорассеяния на аппарате Beckman Coulter Submicron Particle Size Analyzer (Model N5 Analazer, Beckman Coulter). Для измерения использовали 1,0 мл центрифугированного и фильтрованного супернатанта, который смешивали с эквивалентным количеством забуференного физиологического раствора (pH 7,2), помещали в измерительную кювету и анализировали по методике, рекомендованной фирмой-изготовителем (Beckman Coulter). Для изучения биохимической природы везикулярных структур супернатант, содержащий везикулы, был подвергнут обработке ферментами. Использовали фосфолипазу С (Sigma), протеиназу К (Roche Applied Science) и ДНКазу (Amresco) (Higgins J.A. et al., 1982; Frank K.L., Patel R., 2007; Izano E.A. et al., 2008).

Определение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) осуществляли согласно общепринятым принципам (Breed R.S., Dotterrer W.D., 1916). Для этого производили посев исследуемого материала на мясо-пептонный агар (МПА) сплошным газоном и подсчетом КОЕ через 24 ч инкубации при 37°С.

Количественное определение белка осуществляли по общепринятой методике (Bradford М.М., 1976).

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью стандартных пакетов программ «Статистика+», «Apache OpenOffice.org Cale», а также с помощью компьютерных программ, обеспечивающих работу использованных в настоящем исследовании приборов. Использовали традиционные методы статистического анализа (Гланц С., 1999). Любая выборка данных предварительно оценивалась на принадлежность к нормальному распределению. В случае принадлежности данных в выборке к нормальному распределению вычисляли среднюю арифметическую (М), среднее квадратичное отклонение (о), среднюю ошибку средней арифметической (т). Корреляционный анализ проводился с использованием коэффициента корреляции Спирмена. Достоверность различий определялась по критерию t Стьюдента и rf Пирсона. Различия между независимыми группами данных считались достоверными при р < 0,05. В случае, если распределение данных в выборке не могло характеризоваться как нормальное распределение, использовали непараметрические методы статистического анализа, рассчитывая медиану (Me), персентили, критерий Манна-Уитни (различия между независимыми группами данных считались достоверными при р<0,05).

Использованные информационные средства. В работе были использованы программные пакеты Statistica, пакеты программ, входящие в комплект использованного оборудования (LAS AF Lite, Zeiss LSM Image Browser и другие), международные компьютерные базы данных и информационные научные ресурсы (PubMed, Scirus, ScienceDirect, Gene, Protein и другие).

Личное участие автора в получении результатов

Участие автора заключалось в выборе темы диссертации, формулировке цели и задач, а также обосновании дизайна исследования. Диссертация представляет собой обобщение и анализ результатов, полученных автором лично. Автором проводилась статистическая обработка полученных результатов, а также сопоставление результатов исследования с данными научной литературы. Отдельные эксперименты были выполнены совместно с сотрудниками Нижегородской государственной медицинской академии (экспрессия генов изучалась совместно с научным сотрудником группы постгеномных технологий НИИ ПФМ, к.б.н. E.JI. Гурьевым, трансмиссивная электронная микроскопия выполнялась совместно с заведующей отделом электронной микроскопии ЦНИЛ, к.б.н. M.JI. Бугровой, моделирование

биопленок осуществлялось совместно с ассистентами кафедры микробиологии и иммунологии, к.б.н. Н.И. Евтеевой, Е.И. Рудневой и Е.Д. Кончаковой), Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (сканирующая электронная микроскопия выполнялась совместно с д.б.н., профессором А.Г. Погореловым), Института биофизики клетки РАН (лазерная сканирующая микроскопия проводилась совместно с В.А. Яшиным), НИИ педиатрии Научного центра здоровья детей РАМН (масс-спектрометрия выполнялась совместно с д.м.н., профессором H.A. Маянским, клиническим ординатором Г.Г. Ломинадзе, врачами-бактериологами A.B. Лазаревой и В.П. Чистяковой), ГБУЗ ГО Городской больницы № 35 г. Нижнего Новгорода (исследование биопленкообразования на эндопротезах проводилось совместно с врачами-хирургами, д.м.н. В.В. Паршиковым, к.м.н. В.Г. Фирсовой, A.A. Самсоновым, В.А. Ходаком, И.Ю. Лазаревым) при непосредственном участии автора. Написание программы для ЭВМ «Подсчет микробов в кластерах» осуществлялось совместно с A.A. Таланиным.

Положения, выносимые на защиту:

1. Количественная оценка ранних этапов биопленкообразования возможна с использованием методов учета, позволяющих подсчитать количество бактерий на микроскопическом уровне.

2. Биопленки S. aureus разрушаются под воздействием нейтрофилов человека. Процесс разрушения сопровождается высвобождением биопленочных стафилококков и трансформацией их в жизнеспособные планктонные (плавающие) формы с одновременным повышением экспрессии AgrA, ассоциированного с проявлением их вирулентности.

3. Способность стимулировать респираторный взрыв нейтрофилов у биопленочных стафилококков выражена слабее, чем у планктонных (небиопленочных) стафилококков.

4. При взаимодействии нейтрофилов человека и биопленок S. aureus в реакционной среде появляются наноразмерные везикулы, структурообразующими компонентами которых служат фосфолипиды и протеины, обладающие биологической активностью, которая проявляется в способности разрушать биопленки S. epidermidis.

5. Скорость фильтрации антибиотиков через биопленки S. aureus достоверно ниже, чем через эквивалентный по количеству бактерий слой небиопленочных стафилококков.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

О достоверности результатов работы свидетельствует использование современных адекватных методов исследования, которые характеризуются высокой чувствительностью, объективностью, а также поддерживаются

программным обеспечением, позволяющим проводить статистический анализ больших массивов данных. Использование указанных методов, а также корректной статистической обработки позволило количественно оценить объем стафилококковых биопленок, восстановить трехмерную структуру стафилококковых биопленок, визуализировать наноразмерные структуры (матрикс), на основе которых идентифицируются биопленки, обнаружить и охарактеризовать везикулярные структуры, образующиеся при взаимодействии стафилококковых биопленок с нейтрофилами, исследовать биохимические характеристики матрикса биопленок, исследовать состояние кислород-зависимого метаболизма нейтрофилов при контакте со стафилококковыми биопленками, оценить экспрессию гена А§гА у стафилококков и исследовать антибиотикорезистентность биопленочных стафилококков. Основные феномены, обнаруженные и изученные в ходе исследования, были воспроизведены в опытах с разными штаммами золотистого стафилококка.

Диссертация апробировалась на заседании кафедры микробиологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России 21 января 2013 года (протокол № 27) и на расширенном заседании проблемной комиссии «Иммунология, инфекционная патология и эпидемиология» ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России 19 июня 2013 года (протокол № 11).

Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на 8-й Всероссийской конференции «Актуальные вопросы герниологии» (Москва, 2011), Приволжской региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы хирургии, травматологии, ортопедии и интенсивной терапии» (Саранск, 2011), ХП1 Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2012), V Общероссийском научно-практическом семинаре «Репродуктивный потенциал России: версии и контрверсии» (Сочи, 2012).

Разработанные методы исследования биопленок используются для изучения катетеров и эндопротезов в хирургической практике в ГБУЗ ГО Городская больница № 35 (Нижний Новгород), на кафедре госпитальной хирургии им. Б.А. Королева ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России. Результаты исследования используются в лекциях и на практических занятиях при обучении студентов и клинических ординаторов на кафедре микробиологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России.

Результаты проведенного диссертационного исследования в полном объеме изложены в 21 научной работе, опубликованной автором, из которых 15 работ опубликованы в изданиях, включенных в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК, и 6 работ опубликованы в сборниках материалов конференций и конгрессов. Получено Свидетельство

Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам (Роспатент) о государственной регистрации программы для ЭВМ «Подсчет микробов в кластерах» (№ 2010613048 от 07.05.2010 года).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Методический алгоритм для идентификации и количественной оценки стафилококковых биопленок. На первом этапе работы на основе изучения морфо-функциональных и физико-химических свойств биопленок S. aureus был разработан и апробирован надежный диагностический алгоритм для идентификации и количественной оценки стафилококковых биопленок. Актуальность создания такого алгоритма обусловлена необходимостью дифференцировать микробы, обладающие способностью формировать биопленки, и микробы, лишенные такой способности. Известно, что не все бактерии обладают способностью формировать биопленки. Это правило распространяется даже на внутривидовом уровне. Например, от 21 % до 45 % клинических изолятов S. aureus не являются биопленкообразующими (Jain А, Agarwal А., 2009; Taj Y., et al., 2012). Из этого следует, что для выбора оптимальной тактики лечения инфекций, которые могут быть ассоциированы с биопленочным процессом, следует проводить микробиологическую диагностику, направленную не только на видовую идентификацию возбудителя, но и отвечающую на вопрос о способности микроба-возбудителя формировать биопленку.

Объектом исследования был придонный слой бульонной 48-часовой культуры клинического изолята коагулазопозитивного стафилококка в пластиковых чашках Петри. Была проведена серия экспериментов, направленных на оценку интенсивности биопленкообразования на ранних этапах. В этих случаях сроки инкубации составляли 8, 12, 24 и 48 часов (при 37°С). Идентификация вида стафилококка производилась по рутинной методике с использованием тест-систем STAPHYtest-24 (ErbaLaChema) и API Staph (BioMerieux, Франция), а также с использованием способа масс-спектрометри на основе технологии MALDI-TOF MS методом прямого профилирования на масс-спектрометре Microflex (Bruker Daltonics). Доказательство того, что исследуемый объект является биопленкой, было основано на исследовании двух обязательных атрибутов биопленки - микробных клеток и матрикса, которые исследовали при помощи лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и сканирующей электронной микроскопии. В качестве известного способа оценки интенсивности биопленкообразования использовали метод, основанный на окраске фиксированных в чашках Петри биопленок 1%-ным раствором кристаллического фиолетового (Esteban J. et al., 2010). Оценку результатов проводили визуально и спектрофотометрически. Спектрофотометрическая

оценка была основана на исследовании светопоглощения/светопропускания смывов, которые получали в результате элюирования красителя из биопленочной массы. Об интенсивности биопленкообразования судили по степени окраски элюата, интенсивность которой (светопропускание, проценты) выражали относительно контроля. В качестве контроля использовали чашки Петри, проинкубированные со стерильным питательным бульоном. Второй способ оценки интенсивности биопленкообразования, который был разработан в ходе выполнения настоящей работы, основан на микроскопическом исследовании биопленок с последующим компьютерным документированием и статистическим анализом количества стафилококков (в поле зрения) и распределения стафилококк/кластер в изучаемой биопленке. Окрашенные кристаллическим фиолетовым биопленки микроскопировали и, используя компьютерную программу «Подсчет микробов в кластерах», определяли интенсивность биопленкообразования.

Результаты видовой идентификации биопленочных бактерий при помощи технологии MALDI-TOF MS подтвердили их достоверную принадлежность (score п = 2,420) к виду S. aureus (штамм был зарегистрирован под номером 5983/2), что совпало с результатами традиционного метода идентификации стафилококка на основе тестов STAPHYtest-24 и API Staph. Визуализация биопленки с помощью конфокальной микроскопии и программного обеспечения LSM Image Browser выявила характерную для биопленок трехмерную организацию бактериальных клеток. Толщина двухсуточной биопленки S. aureus колебалась от 20 до 47 мкм. Микроскопическое наблюдение за живой биопленкой в режиме реального времени позволило обнаружить особый вид хаотического (теплового) движения стафилококков, находящихся в составе биопленки. Некоторые стафилококки, являясь микроскопическими частицами, совершали хаотические колебания внутри ограниченного объема, соизмеримого с размерами стафилококков. При этом стафилококки могли не иметь прямых контактов с соседними клетками. В отличие от классического броуновского движения перемещения стафилококков были ограничены. Это свидетельствовало о том, что стафилококки механически связаны между собой, и являлось косвенным подтверждением существования необходимого атрибута любой биопленки — внеклеточного матрикса, связывающего биопленочные микробы между собой и с подлежащей поверхностью. Из-за своих малых размеров структурные элементы матрикса не могли быть визуализированы методом конфокальной микроскопии. Прямая визуализация элементов матрикса с помощью ультрамикроскопического исследования (сканирующая электронная микроскопия) подтвердила наличие элементов внеклеточного матрикса. В пространственном расположении стафилококков прослеживались два уровня организации. Первый уровень связан с тем, что стафилококки формировали кластеры, включающие от 9 до 55 клеток. На более высоком уровне организации

стафилококковые кластеры формировали единую надкластерную структуру, состоящую из многих слоев, - биопленку. Массив биопленки был пронизан многочисленными каналами, устья каналов открывались на внешнюю (исследуемую) поверхность биопленки. Через просветы каналов не было видно подложки, на которой сформировалась биоленки. На 100 мкм2 поверхности биопленки открывалось в среднем от 4 до 6 устьев каналов. В образовании стенок каналов в районе устьев принимало участие от 9 до 27 стафилококков. Между стафилококками наблюдалось 2 типа контактов: непосредственное взаимодействие, с помощью которого формируются кластеры, и матрикс-опосредованные связи. Последние обнаруживались при увеличении от хЗООО до х15000: между отдельными стафилококками существовали необычные «перемычки» - структуры биопленочного матрикса, связывающие бактерии друг с другом. Клеточная поверхность большинства стафилококков была ровной округлой формы; исключения составляют участки клеточной поверхности, связанные с внеклеточным матриксом. Их поверхность была неровной, матрикс представлял собой неструктурированную, неоформленную субстанцию. Следует отметить, что биопленочный матрикс в условиях in vitro может быть образован как активно секретируемыми бактериальными полимерами, так и дериватами клеток, полученными в результате аутолиза (Flemming Н.С., 2010). Ультрамикроскопические исследования показали наличие атрибутов, обязательных для биопленок, - бактерий (5. aureus) и внеклеточного матрикса. Это означает, что объект исследования являлся биопленкой.

Традиционный способ оценки интенсивности биопленкообразования на основе спектрофотометрии элюатов красителя, полученных с биопленок, показал, что традиционный способ не позволяет уловить количественные различия показателей биопленкообразования на ранних этапах (8 и 12 часов). Показатели 8- и 12-часовых биопленок не имели статистически значимых отличий от контроля (соответственно р = 0,060603 и р = 0,11021) и между собой (р = 0,563703). Показатели 24-часой биопленки и 48-часовой биопленки достоверно отличались как от контрольных результатов (соответственно р = 0,020922 и р = 0,020922), так и показателей 8-часовых (соответственно р = 0,020922 и р = 0,020922) и 12-часовых биопленок (соответственно р = 0,020922 и р = 0,020922). При этом показатели 48-часовой биопленки имели значимые отличия от показателей 24-часовой биопленки (р = 0,020922). Полученные результаты свидетельствуют о том, что данный метод неэффективен для оценки ранних этапов биопленкообразования, когда на поверхности фиксировано малое количество биопленочной массы (клеток и матрикса). Настоящий метод более информативен для оценки зрелых биопленок, то есть биопленок, накопивших достаточную массу, объем которой может быть пропорционален количеству элюированного красителя. Невозможность оценки ранних биопленок является недостатком метода, поэтому существует необходимость создания нового

метода, позволяющего количественно оценить биопленкообразование на ранних фазах, включающих закрепление стафилококковых кластеров на поверхности и их укрупнение. Применение вновь предлагаемого способа и компьютерной программы «Подсчет микробов в кластерах» позволило более детально охарактеризовать биопленкообразование на ранних (8 и 12 часов) этапах. Статистический анализ, проведенный на основе данных программы «Подсчет микробов в кластерах», подтверждает это предположение. Статистически значимые отличия в количествах закрепившихся на единице поверхности стафилококков (в поле зрения) обнаружены между контролем и 8-часовыми биопленками (р < 0,02), между контролем и 12-часовыми биопленками (р < 0,01), между 8-часовыми и 12-часовыми биопленками (р < 0,05), между контролем и биопленками на более поздних сроках (24 и 48 часов) культивирования, между ранними биопленками (8 и 12 часов) и биопленками на более поздних сроках (24 и 48 часов) культивирования (во всех случаях р < 0,05). Между образцами со сроками культивирования 24 часа и 48 часов не наблюдалось статистически значимых различий (р > 0,05).

Таким образом, проведенные исследования подтвердили, что вновь разработанный способ позволяет (1) учитывать абсолютное количество микробных клеток на цифровом изображении микроскопического препарата, (2) учитывать количество кластеров с определением количества микробных клеток, из которых они состоят, и (3) отображать распределение микроб/кластер в виде графика. Это свидетельствует о перспективности применения метода в количественном анализе бактериальных надклеточных структур, включая биопленки. Однако, способ является неэффективным для оценки зрелых биопленок. Следует отметить, что выявление и исследование биопленочного процесса в первые часы контаминации поверхности инвазированных в организм человека медицинских устройств может быть важным в борьбе с инфекционным процессом. Доказано, что адгезия на искусственных поверхностях бактерий развивается в течение первых двух часов после контаминации (O'Neill Е. et al., 2008). Первые часы развития биопленок являются критическими в патогенезе биопленочного процесса, потому что биопленка на этом этапе своей эволюции является более чувствительной к повреждающим факторам, чем в более зрелом состоянии. Это является причиной для создания методов, позволяющих количественно оценивать биопленкообразование на ранних этапах. В связи с этим, предлагаемый способ может быть полезным для исследования ранних (незрелых) биопленок и создания на его основе тест-систем для поиска препаратов, блокирующих биопленкообразование на ранних этапах. Традиционный способ на основе оценки элюируемого из биопленочной массы красителя, является более информативным для исследования зрелых биопленок.

Полученные результаты позволяют считать предлагаемый в работе комплекс методов перспективным для исследования стафилококковых

биопленок в научных исследованиях и практике клинико-микробиологических лабораторий. При исследовании биопленок рекомендуется руководствоваться диагностическим алгоритмом, который должен включать последовательно выполняемые мероприятия, направленные на: 1) видовую идентификацию биопленкообразующих бактерий, 2) доказательство характерной для биопленок трехмерной организации, 3) обнаружение элементов матрикса, 4) количественную оценку биопленкообразования. Подтверждена эффективность вновь разработанного способа оценки интенсивности ранних этапов биопленкообразования.

Структурные изменения биопленок Staphylococcus aureus в условиях контакта с нейтрофилами человека. Фагоциты, являясь важнейшими клетками иммунной системы, играют огромную роль в защите организма от пиогенных бактерий (Пинегин Б.В., Маянский А.Н., 2007; Пинегин Б.В., 2009). Поэтому проблема участия фагоцитов — нейтрофилов и макрофагов - в борьбе с биопленочными процессами является актуальной. Несмотря на важность этой проблемы до настоящего времени остается много неизученных вопросов, касающихся взаимодействия стафилококковых биопленок с важнейшими неспецифическими эффекторами иммунитета - нейтрофилами. Целью исследования было описание феноменологии и изучение механизмов структурных изменений, возникающих в биопленке S. aureus, при взаимодействии с нейтрофилами человека в условиях in vitro. В качестве объекта исследования использовали 48-часовые биопленки S. aureus (штамм 5983/2), которые подвергались обработке нейтрофилами человека и продуктами их лизиса. Наиболее важные феномены (кинетика нейтрофил-опосредованного разрушения биопленок, высвобождение жизнеспособных стафилококков в супернатант, частичная гибель стафилококков в составе биопленки), детально описанные для системы «нейтрофилы - биопленка S. aureus, штамм 5983/2», были воспроизведены в системах с биопленками других штаммов золотистого стафилококка (S. aureus, штамм 5663 и S. aureus, штамм 18 А). Биохимическая идентификация элементов межклеточного биопленочного матрикса проводилась путем обработки биопленок субстанциями (трипсин, протеиназа К, ДНКаза, периодат натрия), обеспечивающими специфическую деструкцию разных типов матрикса. В качестве контроля использовали слой адгезированных стафилококков (S. aureus, 5983/2), не являющихся биопленкой. В качестве основных критериев оценки результатов реакции использовали (1) оценку степени деструкции биопленок (метод элиирования красителей из окрашенной биопленки, результаты выражали в процентах от контроля), (2) количество высвободившихся из биопленки жизнеспособных стафилококков (культуральный способ на основе подсчета КОЕ), и (3) соотношение между живыми и мертвыми нейтрофилами в составе биопленок. Дополнительным критерием служило измерение толщины биопленки при помощи лазерной

сканирующей конфокальной микроскопии. Биопленку оценивали на 5, 15, 30, 45 и 60 минутах инкубации с нейтрофилами. Для проверки ферментативной гипотезы разрушения биопленок нейтрофилами использовали искусственно полученный лизат нейтрофилов, который содержал набор ферментов. На поверхность биопленки наслаивали 1,5 мл лизата нейтрофилов, инкубировали 30 мин при 37°С, дважды отмывали раствором Хенкса, результаты оценивали по приведенным выше методикам. В качестве контролей использовали (1) аналогичный объем (1,5 мл) раствора Хенкса, (2) 1,5 мл лизата, куда предварительно был добавлен комплекс ингибиторов протеаз Protease Inhibitor Cocktail Р8340 (Sigma), в соотношении (100:1), рекомендованном инструкцией фирмы-производителя для полного подавления протеазной активности в клеточных системах, (3) 1,5 мл раствора Хенкса, куда предварительно было добавлено эквивалентное количество комплекса ингибиторов протеаз Protease Inhibitor Cocktail Р8340.

Эксперименты показали, что нейтрофилы разрушают биопленку, сформированную на основе S. aureus, 5983/2. Слой адгезированных стафилококков был более устойчив к воздействию нейтрофилов. Деструкция биопленок регистрировалась уже на 5 мин реакции - показатели составляли 79,7 + 9,1 % от контроля (р < 0,05). На 15 и 30 мин деструкция продолжала увеличиваться: значения составляли соответственно 46,0 ± 7,2 % и 29,7 +7,7 %. На более поздних сроках биопленки были практически полностью разрушены -показатели не превышали 7 % от контроля. Разрушение нейтрофилами слоя адгезированных стафилококков происходило по-другому. На 5 мин не наблюдалось статистически значимых отличий от контроля (96,8 + 7,8 %, р > 0,05). С 15 мин кривая кинетики начинала снижаться. На 15 мин показатели составляли 69,2 + 11,7 %, что соответствовало статистически значимому снижению показателей относительно контроля (р < 0,05). Затем (на 30, 45 и 60 мин) показатели не претерпевали статистически значимых изменений и составляли соответственно 62,8 + 7,8 %, 57,5 + 4,6 % и 52,7 + 5,2 % от контроля (во всех случая между этими показателями р > 0,05). Количество стафилококков, высвободившихся в супернатант из разрушаемой биопленки на 30 мин реакции с нейтрофилами, значительно превосходило соответствующие показатели контрольных проб и составляло 142,4 + 9,7 % от контроля. Адгезированные стафилококки тоже высвобождались в супернатант. Их количество составляло 125,3 + 7,9 % от контроля. Отличия между показателями контрольных проб, проб с биопленками и адгезированными стафилококками были статистически значимы (во всех случаях р < 0,05). На 30 мин реакции биопленок S. aureus с нейтрофилами в составе биопленок зафиксировано увеличение количества нежизнеспособных бактерий по сравнению с контролем (без воздействия нейтрофилов). Нативная двухсуточная биопленка S. aureus содержала 20,9 + 6,1 % нежизнеспособных бактерий, причем почти все мёртвые клетки были

локализованы в глубоких слоях. Остатки биопленки после 30-минутной инкубации с нейтрофилами включали 35,6 ±9,1 % мертвых бактерий, отличия от контроля не были статистически значимы (р > 0,05). Толщина нативной двухсуточной биопленки, образованной S. aureus 5983, составляла 18-36 мкм. На 30 мин реакции с нейтрофилами значения толщины биопленок составляли от 0 до 16 мкм и сильно варьировали на разных участках.

Аналогичные эффекты нейтрофил-опосредованной деструкции наблюдались с биопленками, сформированными другими штаммами S. aureus (штаммы 5983/2, 5663/2, 18 А).

Лизат нейтрофилов вызывал ограниченное разрушение биопленки, снижая (30 мин, 37°С) ее объем до 72,6 + 3,8 % (р < 0,05) от контроля. Лизат нейтрофилов, в который были добавлены ингибиторы протеаз, не оказывал деструктивного воздействия на биопленки: показатели в этом случае не имели статистически значимых отличий от контроля (99,7 + 4,4 %, р > 0,05). Тот же лизат не оказывал деструктивного эффекта на стафилококки, адгезированные на полимерной поверхности: показатели составляли 95,7 + 8,6 % (р > 0,05) от контроля. Обработка протеиназами приводила к статистически значимому снижению показателей окраски биопленок: при обработке трипсином показатели снижались примерно на 57 % и составляли 43,3 + 5,8 % (от негативного контроля, р < 0,02), при обработке протеиназой К - на 45 % и составляли 55,4 + 4,3 % от контроля (р < 0,01). Это свидетельствовало о снижении биопленочной массы за счет разрушения протеинов внеклеточного матрикса. ДНКаза вызывала менее выраженное разрушение биопленок: показатели снижались примерно на 15 %, но при этом достоверно отличались от контроля - 84,9 + 7,1 % (р < 0,05). Это указывало на возможное участие ДНК в образовании внеклеточного матрикса. Результаты, подтверждающие роль ДНК в построении матрикса, были получены в серии опытов при обработке биопленок последовательно ДНКазой и протеиназой К: показатели окраски биопленок снижались на 83 % и составляли 16,9 + 2,0 % от контрольных значений (р < 0,001). Биопленочный матрикс был устойчив к периодатному окислению: биопленки, обработанные периодатом натрия, не проявляли статистически значимых отличий от контроля (р > 0,05). Устойчивость к периодатному окислению свидетельствовала об отсутствии полисахаридных структур в составе внеклеточного биопленочного матрикса.

Полученные данные позволяют сделать вывод о биохимическом составе внеклеточного матрикса исследуемой биопленки: он состоял из ДНК-протеиновых комплексов, механическая целостность биопленки не зависела от полисахаридных компонентов. Важным результатом наших наблюдений являлось подтверждение возможности нейтрофил-опосредованного разрушения биопленок, сформированных золотистым стафилококком. Факт нейтрофил-зависимой деструкции биопленок может быть обусловлен двумя причинами -

фатальным воздействием на клетки стафилококков и разрушением биопленочного матрикса.

Полученные результаты позволили расшифровать механизмы, приводящие к разрушению биопленок S. aureus. Гипотеза о том, что разрушение биопленок было связано с массовой гибелью стафилококков, противоречит полученным результатам. Конечно, возможность прямого фагоцитоза биопленочных стафилококков не исключается, тем более что подобное явление было описано ранее (Günther F. et al., 2009). Но фагоцитоз не мог обеспечить достаточно эффективный киллинг стафилококков. Увеличение количества нежизнеспособных стафилококков (по данным витальной окраски) в составе биопленки статистически не было доказано. В супернатанте количество жизнеспособных стафилококков увеличивалось почти на 50 % (данные получены на 30 мин реакции). Последний факт говорит о значительном высвобождении кокков из биопленки и косвенно подтверждает другую гипотезу разрушения биопленки, связанную с деструкцией матрикса. Кроме того, если бы разрушение биопленки было связано только с прямым воздействием нейтрофилов на стафилококки, то это проявилось бы в реакции с адгезированными стафилококками, т.е. в системе, не имеющей соединяющего клетки матрикса. В наших опытах нейтрофилы не вызывали полной десорбции адгезированных стафилококков с полимерной поверхности. Это подтверждает то, что нейтрофилы, разрушающие биопленку, действуют через деструкцию матрикса, связывающего бактерии в единую систему. Важным результатом, позволяющим объяснить механизмы нейтрофил-зависимой деструкции биопленок, стало разрушение биопленок под воздействием лизата нейтрофилов, при котором на 30 мин реакции объем биопленок уменьшался примерно на 30 %. Доказательством того, что мишенью для лизата нейтрофилов служил биопленочный матрикс, стали результаты, показывающие, что лизат не оказывал никакого влияния на стафилококки, адгезированные к полимерной поверхности. Активность лизата, вероятно, связана с нейтрофильными ферментами, которые могут активно секретироваться в ответ на раздражение (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Косвенным подтверждением этой гипотезы стали результаты исследования биохимических характеристик биопленочного матрикса. Эксперименты с ферментами продемонстрировали, что биопленки S. aureus (шт. 5983/2) значительно деградировали под влиянием протеиназы К или трипсина и практически полностью разрушались при обработке комплексом «ДНКаза-протеиназа». Это говорит о том, что матрикс биопленок изучаемого штамма был сформирован протеино-нуклеиновыми комплексами. Неоспоримым доказательством протеиназо-зависимой деструкции биопленок под воздействием лизата нейтрофилов стал факт полного подавления этой реакции ингибиторами протеаз.

Считается, что матрикс является важнейшим защитным барьером биопленок от повреждающих воздействий (Смирнова Т.А. и соавт., 2010; Flemming Н.С., 2010; Montanaro L. et al. 2011). Однако результаты настоящего исследования показали, что протеино-нуклеиновый матрикс может оказаться уязвимым атрибутом стафилококковых биопленок. Разрушение матрикса приводит к отторжению биопленки, поэтому информация о механизмах нейтрофил-опосредованной деструкции матрикса является крайне важной для осмысления путей управления биопленочными процессами. С другой стороны, разрушение матрикса не сопровождалось гибелью стафилококков. Феномен массового высвобождения из разрушаемой биопленки жизнеспособных стафилококков подтверждает способность биопленочных бактерий ускользать от фагоцитоза, трансформируясь в мобильные (планктонные) формы, способные к колонизации новых ареалов. В условиях реальной патологии это может означать диссеминацию возбудителя в организме и генерализацию инфекционного процесса.

Нейтрофил-стимулирующие свойства биопленок Staphylococcus aureus. В классической медицинской микробиологии достаточно хорошо изучены иммуностимулирующие свойства планктонных (плавающих) бактерий (Маянский А.Н., 2006; Мельников Н.И. и соавт., 1969; Baron S. 1996). В частности, охарактеризованы нейтрофил-стимулирующие свойства, которые проявляют планктонные клетки золотистого стафилококка (Невмятуллин А. Л., 1988). Однако биопленочные стафилококки в реакциях с нейтрофилами могут проявлять иные свойства, которые качественно отличаются от свойств планктонных стафилококков (Agarwal A. et al., 2010). Цель исследования, описанного в настоящем разделе автореферата, — на основе изучения люминол-зависимой ХЛ нейтрофилов человека охарактеризовать нейтрофил-стимулирующие свойства биопленок S. aureus. Объектами исследования служили 48-часовые биопленки золотистого стафилококка (S. aureus, штамм 5983/2), реагирующие с нейтрофилами крови человека. Объектами сравнения были (1) планктонные стафилококки того же штамма, (2) биопленочный матрикс и (3) планктонные стафилококки, обработанные биопленочным матриксом. Для подтверждения нейтрофил-стимулирующих свойств биопленок золотистого стафилококка была проведена дополнительная серия экспериментов с другими штаммами S. aureus - штаммом 5663 и штаммом 18 А. В качестве метода исследования, отражающего интенсивность респираторного взрыва нейтрофилов, использовали измерение реактивной люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов на 5, 15, 30, 45, 60 и 90 минутах реакции биопленки с нейтрофилами.

Статистически значимое усиление ХЛ нейтрофилов в реакции с биопленками наблюдалось лишь на 60 мин реакции, когда показатели стимулированных нейтрофилов (0,021 ± 0,002) значительно превосходили (р <

0,05) значения ХЛ контрольных нейтрофилов (0,01 ± 0,007). К 75 мин XJI в системе «нейтрофилы-биопленка» снижалась до значений (0,015 + 0,006), которые практически не отличались (р > 0,05) от ХЛ нестимулированных нейтрофилов (0,013 + 0,008). Аналогичная картина наблюдалась на 90-й минуте реакции. Небиопленочные (планктонные) формы того же штамма стафилококка вызывали более выраженную стимуляцию ХЛ нейтрофилов. Их показатели ХЛ соответственно составляли 0,035 ± 0,006; 0,075 ± 0,013; 0,065 + 0,02; 0,063 + 0,015 и 0,053 + 0,01. Статистически значимые отличия от контроля (нестимулированные нейтрофилы) наблюдались на 15 мин (р < 0,05), 30 мин (р < 0,005), 45 мин (р < 0,05), 60 мин (р < 0,005) и 75 мин (р < 0,001) реакции. К 90 мин показатели ХЛ существенно падали и не имели статистически значимых различий с нейтрофилами в контроле (р > 0,05). Биопленочный матрикс не обладал нейтрофил-активирующей способностью в реакции ХЛ: на протяжении всего периода наблюдения ХЛ проб с матриксом не отличалась от контроля (во всех случаях р > 0,05). Планктонные стафилококки, преинкубированные с матриксом, демонстрировали снижение способности индуцировать ХЛ нейтрофилов по сравнению с интактными (необработанными матриксом) планктонными стафилококками. ХЛ отражает активность кислород-зависимой борьбы нейтрофилов с пиогенными микробами (Маянский А.Н., Невмятуллин А.Л., 1977). Поэтому сильная активация ХЛ нейтрофилов в реакции с небиопленочными (планктонными) стафилококками не оказалась неожиданной (Edwards S.W. et al., 1987; Martínez-Martínez L. et al., 1993). Более интересными оказались принципиальные различия между биопленочными и планктонными стафилококками по способности стимулировать кислород-зависимую биоцидность нейтрофилов. Мы наблюдали значительное подавление нейтрофил-активирующей способности стафилококков, находящихся в составе биопленки (хотя абсолютное количество стафилококков, участвующих в реакции с нейтрофилами, было одинаковым во всех случаях). По-видимому, эти различия отражают общую закономерность: эффективность реакций нейтрофилов с биопленочными бактериями всегда ниже, чем в реакции с небиопленочными (планктонными) бактериями (Kropec A. et al., 2005). Это явление можно объяснить наличием внеклеточного матрикса. Ведущая роль матрикса в подавлении ХЛ подтверждается результатами взаимодействия нейтрофилов и планктонных стафилококков, преинкубированных с матриксом. В этом случае также происходило статистически значимое снижение ХЛ нейтрофилов по сравнению с показателями реакции с планктонными стафилококками. Матрикс мог препятствовать индукции ХЛ нейтрофилов, используя прямую антифагоцитарную агрессивность. Подобные антинейтрофильные свойства матрикса были описаны для полисахаридного межклеточного адгезина, организующего матрикс биопленок S. epidermidis, который прямо воздействовал

на фагоциты, ингибируя фагоцитарный клиренс биопленочных бактерий (Кгорес A. et al., 2005; Fredheim E.G., Granslo H.N. et al., 2011).

Нейтрофил-стимулирующие свойства биопленок и планктонных клеток других штаммов S. aureus (S. aureus, штамм 5663, и S. aureus, штамм 18 А) обладали аналогичными характеристиками.

Экспрессия AgrA в условиях нейтрофил-опосредованного разрушения биопленок Staphylococcus aureus. Внутри биопленок бактерии демонстрируют значительное усложнение межклеточного сигналинга (Ильина Т.С. и соавт., 2006; Романова Ю.М. и соавт., 2006; Kong K.F. et al., 2006; Njoroge J. et al., 2009). Вирулентность биопленочных стафилококков (как и многие другие свойства) регулируется глобальной системой сигналинга «quorum sensing», важнейшей генетической основой которой у стафилококков является agr-onepou (Yarwood J.M., Schlievert Р.М. 2003). Однако формирование стафилококковых биопленок не зависит от активации agr-системы (Vuong С. et al., 2000). Биопленки могут быть сформированы на основе agr-негативных изолятов (Yarwood J.M., Schlievert P.M. 2003). И наоборот, сброс биопленочных стафилококков и трансформация их в свободные (планктонные) формы сопровождается активацией agr. В то же время известно, что взаимодействие планктонных (небиопленочных) стафилококков и важнейших эффекторов иммунитета -нейтрофилов - ведет к активации agr (Pang Y.Y. et al., 2010). Для оценки активности agr мы изучали экспрессию фактора AgrA, который считается важнейшим регулятором agr-системы. В частности, его экспрессия коррелирует с вирулентностью золотистого стафилококка (Tamber S. et al., 2010).

Использовали 48-часовые биопленки S. aureus (штамм 5983/2) и нейтрофилы периферической крови человека. После 45-минутной инкубации 48-часовых биопленок с нейтрофилами отбирали аликвоты, содержащие стафилококки из биопленок и планктонные стафилококки из супернатанта. Контролем служили интактные биопленочные и планктонные стафилококки. Планирование части эксперимента, посвященной анализу экспрессии генов, и статистическую обработку результатов выполняли согласно международным рекомендациям по проведению экспериментов в анализе экспрессии генов (Bustin S.A. et al., 2009). РНК выделяли из проб микроколоночным методом. Элюаты, содержащие РНК, очищали от остаточной ДНК при помощи ДНКазы I, контроль чистоты выделенной РНК и стандартизацию концентрации РНК проводили с помощью спектрофотометра NanoDrop («ThermoScientifïc»). Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали с помощью обратной транскриптазы M-MuLV (СибЭнзим) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (РТ-ПЦР) проводили методом амплификации в аппарате i Cycler IQ (BIO-RAD). Использовали FAM- и НЕХ-меченые зонды и прямые и обратные праймеры. Внутренним стандартом служила 16S рРНК стафилококка.

Последовательности agrA- и 16S рРНК-специфичных праймеров и зондов подобирали с помощью программы Primer Premier 5 (Таблица 1). Циклограмма амплификации включала первоначальную денатурацию в течение 1 мин при 95°С, и далее 40 циклов: 15 сек. при 95°С и 30 сек. при 60°С. Специфичность продуктов амплификации была подтверждена электрофорезом в агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этядием, а также прямым секвенированием фрагментов ДНК. Данные о флуоресценции были получены на амплификаторе iCycler IQ (BIO-RAD) и проанализированы программой iCycler IQ software. Уровни экспрессии исследуемого гена в образцах РНК, выделенных из различных штаммов, были нормализованы относительно внутреннего стандарта (16S рРНК) по стандартной методике (Perry J.P. et al., 2009). В каждый эксперимент включался отрицательный контроль (реакционная смесь с использованием вместо матрицы деионизированной воды). Измерение уровня экспрессии в каждом образце РНК проводили дважды. Показатели экспрессии гена выражали в относительных единицах относительно внутреннего стандарта (16S рРНК) у стафилококков в нативной 48-часовой биопленке, используя общепринятую методику (Perry J.P. et al., 2009). Средние значения из этих данных использовались для дальнейшего анализа. Серии экспериментов повторяли трижды. Полученные данные обсчитывали, используя как стандартные статистические методы, так и модули, входящие в пакеты программного обеспечения используемых в работе приборов (софт iCycler IQ software, поставляемый в комплекте с амплификатором iCycler IQ (BIO-RAD). Экспрессию рассчитывали относительно показателей экспрессии AgrA у стафилококков в нативной биопленке (в этом случае ее экспрессия численно равнялась 1).

Среднее значение экспрессии AgrA у нативных планктонных стафилококков составляло 7,97 + 0,72, что соответствовало статистически значимому повышению показателей относительно экспрессии в нативной биопленке (р < 0,05). Экспрессия стафилококков, полученных из остатков биопленки после взаимодействия с нейтрофилами, равнялась 1,25 + 0,37 и не имела статистически значимых различий с показателями экспрессии AgrA в нативной биопленке (р > 0,05). В супернатанте из системы «нейтрофилы -биопленка» экспрессия AgrA у планктонных стафилококков составляла 7,46 + 0,72, она была существенно выше, чем у биопленочных стафилококков (статистически значимые различия, р < 0,05), но не отличалась от показателей экспрессии у нативных планктонных стафилококков (отсутствие статистически значимых различий, р > 0,05).

Таблица 1.

Праймеры и зонды для оценки экспрессии AgrA стафилококка

Назначение и название праймера Последовательность (5'-Зг) Размер ПЦР-продукга (и.о.)

Количественная РТ-ПЦР и секвенирование

Ag299F Ag526R ACAAAGTTGCAGCGATGGATT CTAAATGGGCAATGAGTCTGT 228

Sal6SF Sal6SR AGACTCCTACGGGAGGCAGCA CGTGGACTACCAGGGTATCTAATCC 474

Зонда для количественной РТ-ПЦР

Agl09F_FAM (FAM)CGTTGAAACGATTGAATTAAAACGTGGC(BH1)

S16_286F_HEX (HEX)CAACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC(BH2)

Обнаруженный факт сниженной экспрессии AgrA в нативной биопленке (по сравнению с планктонными стафилококками) не был неожиданным. Подобные наблюдения производились и раньше (Yarwood J.M., Schlievert P.M. 2003). Показатели экспрессии AgrA биопленочных стафилококков после взаимодействия с нейтрофилами практически не изменялись. Главной находкой проведенных экспериментов стало существенное увеличение экспрессии гена AgrA у планктонных стафилококков в системе с биопленкой, подвергшейся атаке нейтрофилов. Экспрессия AgrA повышалась примерно в 7 раз по сравнению с экспрессией в нативной биопленке и в 6,5 раз по сравнению с экспрессией в биопленке, атакованной нейтрофилами. Роль agr в индукции патогенности стафилококков является сложной. С одной стороны, agr не вносит вклад в формирование и рост биопленок (Yarwood J.M., Schlievert P.M. 2003). С другой стороны, стафилококки, высвобождающиеся из биопленки, усиливают экспрессию agr, становясь, по-видимому, более вирулентными.

Из проведенных экспериментов можно сделать два основных вывода. Во-первых, экспрессия AgrA у биопленочных стафилококков существенно ниже, чем у стафилококков, не связанных с биопленкой (планктонных). Второй вывод более важен для практической медицины: стафилококки, высвобождающиеся из разрушенной нейтрофилами биопленки, проявляют повышенную экспрессию agr, т.е. их вирулентность может усиливаться. Высвобождение стафилококков из

разрушаемой нейтрофилами биопленки может привести к созданию новых сайтов инфекции и токсинемии. Этот феномен является основой диссеминации возбудителя в организме и генерализации инфекционного процесса.

Исследование везикулярных наноструктур в системе «нейтрофил -биопленка Staphylococcus aureus». Выше было показано, что нейтрофилы способны разрушать биопленки, образованные золотистыми стафилококками. В работе Leid at al. (2002) было показано, что человеческие лейкоциты могут атаковать биопленки, образованные S. aureus, и пенетрировать в них. Аналогичные наблюдения были сделаны другими исследователями, которые описали роль опсонизации в нейтрофил-опосредованной деструкции биопленок, описали особенности секреторной дегрануляции нейтрофилов при контакте с биопленочными стафилококками (Günther F. et al., 2009; Stroh P. et al., 2011; Meyle E. et al., 2010). Meyle E. et al. (2010) наблюдали феномен высвобождения ДНК при гибели нейтрофилов. Это явление относительно редко регистрировалось на препаратах, тем не менее, оно могло стать основой для проявления антимикробной активности, связанной с образованием нейтрофильных экстрацеллюлярных ловушек (NET), которые достаточно хорошо описаны в литературе (Долгушин И.И. и соавт., 2009; Brinkmann V., 2004). Описанный феномен объясняет судьбу нерастворимых ДНК-протеиновых комплексов, высвобождающихся в результате гибели нейтрофилов. Однако этот процесс должен сопровождаться высвобождением еще одного субстрата, который не способен к формированию истинных растворов в водных средах. Это мембранные липиды. В литературе есть данные о том, что одновременно с трап-образованием у нейтрофилов наблюдался везикулярный экзоцитоз, но этот процесс расценивался авторами лишь как вспомогательный механизм NET-формирования (Pilsczek F.H. et al., 2010). Дальнейшая эволюция липидов в условиях взаимного разрушения нейтрофилов и биопленочных клеток S. aureus не изучалась.

Цель исследования, описанного в настоящем разделе, — исследовать структурно-функциональные особенности липидных дериватов, образующихся в результате взаимодействия нейтрофилов с биопленкой S. aureus.

Объектом исследования был фильтрат реакционной среды после 45-минутной инкубации (37°С) нейтрофилов с 48-часовыми биопленками S. aureus (штамм 5983/2). Факт взаимодействия нейтрофилов с биопленкой контролировали при помощи СЭМ и лазерной сканирующей (конфокальной) микроскопии. Супернатант был исследован методом трансмиссивной электронной микроскопии и методом лазерного динамического светорассеяния с целью обнаружения, морфологического описания и оценки размеров наноразмерных структурных элементов. Супернатант, отобранный на 45 мин и подвергнутый центрифугированию и фильтрации (фильтр Corning, диаметр пор 0,2 мкм), содержал организованные структуры (в дальнейшем - везикулы),

которые хорошо контрастировали^ фосфорно-молибденовой кислотой. Эти структуры имели правильную округлую форму (рис. 1) и морфологически были похожи на везикулы. Размеры структур варьировали примерно от 20 до 60 нм (33,4 + 6,8 нм), имели четкую границу с окружающей средой. На электронограммах присутствовали единичные везикулы, которые контактировали между собой. В супернатанте, полученном из контрольных проб (биопленка S. aureus 5983/2 без нейтрофилов и нейтрофилы на чашке Петри без стафилококков), везикулы отсутствовали.

Анализ размеров везикул методом динамического светорассеяния показал аналогичные результаты: размер частиц в опытных образцах супернатанта колебался от 15,7 до 121,4 нм, составляя в среднем 41,7 + 14,6 нм. В контрольных пробах (биопленка S. aureus 5983/2 без нейтрофилов и нейтрофилы на чашке Петри без стафилококков) метод динамического светорассеяния не выявил присутствия наноразмерных частиц.

Рис. 1. Везикулярные структуры, изолированные из системы «нейтрофилы -биопленка S. aureus». Трансмиссивная электронная микроскопия, увеличение х 140000. Метка - 0,2 мкм. Контрастирование фосфорно-молибденовой кислотой. Стрелками указан диаметр везикул (нм).

Для изучения биохимической природы везикулярных структур супернатант, содержащий везикулы, был подвергнут обработке ферментами фосфолипазой С, протеиназой К, ДНКазой. Обработка образцов ДНКазой не

приводила к разрушению везикул. После обработки протеиназой К электронная микроскопия демонстрировала интересную картину: на электронограмме присутствовали образования диаметром от 15,0 до 34,1 нм. Эти образования не имели характерной для везикул структуры, но имели признаки организованности. Они были округлой формы, не сливались друг с другом, их граница с окружающей средой была расплывчата. Предобработка образцов фосфолипазой С приводила к полному исчезновению везикул.

В специальной серии экспериментов была исследована биологическая активность везикул. Везикулы были испытаны на антибактериальные свойства, антибиопленочные свойства, способность активировать нейтрофилы человека (по люминол-зависимой XJI) и вызывать гемолиз эритроцитов человека. Везикулы не обладали антибактериальной активностью в отношении разных штаммов эпидермального и золотистого стафилококка. Инкубация с везикулами (60 мин) не вызывала статистически достоверных изменений в биопленках, сформированных золотистым стафилококком. Биопленки, образованные S. epidermidis, подвергались деструкции. Это наблюдалось визуально и подтверждалось спектрофотометрически. Средние значения процента светопоглощения этанола, элюирующего краситель (кристаллический фиолетовый) с предварительно окрашенных биопленок S. epidermidis, были значительно ниже в образцах, обработанных везикулами, и составляли для штамма 178 М 84,3 + 3,5 % (снижение относительно контроля примерно на 16 %), для штамма 328/5 - 42,7 ± 1,9 % (снижение относительно контроля примерно на 57 %). Везикулы не обладали способностью стимулировать люминол-зависимую XJI нейтрофилов крови человека: на всех сроках наблюдения (5, 10, 15, 30, 45, 60 минуты) интенсивность ХЛ не отличалась от контроля (во всех случаях р > 0,05). Везикулы не вызывали лизис эритроцитов человека: показатели опытных и контрольных проб были одинаковы (р > 0,05).

Присутствие везикулярных структур характерно для многих биологических объектов. В зависимости от их частных характеристик (структура, происхождение, функции) их называют «мембранные микрочастицы», микровезикулы, «экзосомы», «эктосомы», «синаптические везикулы и так далее (Рыбальченко О.В. и соавт., 2008; Benedicte Н. et al., 2005; Sadallah S. et al., 2010). Нейтрофилы человека также генерируют мембранные наноразмерные продукты экзоцитоза («secretory vesicles») и эктосомы (Borregaard N. et al., 1995; Hess С. et al.,1999). В экспериментах, описанных в настоящем разделе, везикулы появлялись только в системе «нейтрофил-стафилококковая биопленка». По размерам они соответствовали везикулам, изученным в выше названных работах. В супернатанте стафилококковой биопленки без нейтрофилов и адгезированных на пластиковой поверхности нейтрофилов без биопленки, везикулы отсутствовали. Это говорит о том, что

везикулы появлялись там, где шло активное противоборство нейтрофилов и бактерий.

Известно, что бактерии тоже способны продуцировать везикулярные структуры. Это явление более характерно для грам-негативных бактерий, которые продуцировали везикулы диаметром от 20 до 300 нм; везикулы включали в свой состав протеины, липополисахариды и даже нуклеиновые кислоты (Ellis T.N., Kuehn M.J., 2010). В биопленках грам-негативных бактерий везикулам приписывают транспортную роль (Mashburn-Warren L. et al., 2008). Об образовании везикул грамм-позитивными бактериями имеются лишь единичные сообщения. Везикулы, образованные золотистым стафилококком, имели диаметр от 20 до 130 нм и содержали в своем составе от 90 до 143 белковых компонентов, наличие которых было подтверждено протеомными методами (Lee E.Y. et al., 2009; Gurung M. et al., 2011). О везикулах, присутствующих в биопленках S. aureus, имеются лишь единичные сообщения (Tetz V. V. et al., 2004).

Результаты экспериментов с ферментами позволяют сделать заключение о биохимических компонентах, которые играют определяющую роль в структуре обнаруженных везикул. Полная деструкция визикул фосфолипазой С говорит о том, что фосфолипиды являются главным элементом везикулярной организации. Теоретически, везикулы могут иметь в своем составе не только фосфолипиды, но и протеины, и нуклеиновые кислоты (дериваты ДНК). Эксперименты с протеиназой К, в которых наблюдалось частичная дезорганизация везикул, свидетельствуют о том, что белки также участвуют в поддержании везикулярной структуры. ДНК не играла структурообразующей роли. Вероятнее всего, описанные нами везикулы являются комплексным продуктом, состоящим из липидно-белковых дериватов нейтрофилов и стафилококков и формирующимся в результате тесного контакта нейтрофилов и стафилококков. Результаты, полученные при помощи СЭМ, зафиксировали плотность контакта между нейтрофилами и стафилококками в процессе формирования везикул.

Антибиопленочный эффект везикул может быть объяснен с позиции присутствия их в составе функционально активных энзимов нейтрофилов (Gasser О. et al., 2003; Hess С. et al., 1999). Они могут оказывать повреждающее действие на обязательные атрибуты биопленки - стафилококки и матрикс, который образуется у стафилококков белковыми, полисахаридными и дезоксирибонуклеотидными полимерами (Маянский А.Н., Чеботарь И.В., 2011). Наличие протеинов в составе везикул, продемонстрированное в опытах с протеиназой К, косвенно подтверждает это предположение. Так выглядит наиболее вероятное объяснение феномена деструкции биопленки S. epidermidis под влиянием веществ, содержащихся в везикулах.

Неспособность обнаруженных везикул вызывать респираторный взрыв у нейтрофилов и лизис эритроцитов свидетельствует об их биологической инертности по отношению к нейтрофилам и эритроцитам человека. Это не исключает их биологической активности в отношении других клеток и тканей человека, а, следовательно, требует дополнительных экспериментов, выходящих за рамки цели и задач настоящего исследования.

Новый метод исследования биопленочной антибиотикорезистентности.

Важный подход к управлению биопленками связан с применением антибиотиков. В биопленках существуют не только общеизвестные, но и специфические механизмы возникновения антибиотикорезистентности. К числу последних принадлежат фильтрующая способность биопленок, блокирующая диффузию антибиотика в глубокие слои биопленки, присутствие популяций нечувствительных к антибиотикам микробов-персистеров, и повышенная мутабельность биопленочных микробов, приводящая к быстрой адаптации микроба к противомикробному препарату (Чеботарь И.В. и соавт., 2012; Mah T.F., 2012). Успех в борьбе с биопленочными инфекциями во многом зависит от эффективности методов оценки биопленочной антибиотикорезистентности микроба-возбудителя. Рутинные методы определения чувствительности микробов к антибиотикам не могут дать оценку степени антибиотикорезистентности микробов в составе биопленок. Цель исследования, описанного в настоящем разделе, - показать эффективность вновь разработанного способа, сочетающего в себе возможность (1) определения чувствительности биопленочных микробов к антимикробным препаратам и (2) возможность избирательной оценки фильтрующей способности биопленок в отношении противомикробных агентов.

Способ был реализован на биопленках золотистого стафилококка (S. aureus, 5983), смоделированных на мембранных системах, состоящих из инсертов (вставок) с мембранным дном с порами 0,4 цт (Hanging Cell Culture Insert, мембрана PET (производство Merck Millipore) и соответствующим им 12-луночных планшетов. Чувствительность биопленочных микробов (S. aureus штамм 5983/2) к антибиотикам исследовали по их выживаемости в присутствии противостафилококкового препарата - пефлоксацина; в качестве критерия использовали количество КОЕ. Фильтрующую способность биопленки оценивали по диффузии сквозь биопленку пефлоксацина; эффект оценивался по выживаемости в присутствии диффундировавшего антибиотика микроба-индикатора, в качестве которого в настоящей работе использовался тот же штамм стафилококка, что формировал биопленку. Критерием служило число КОЕ микробов-индикаторов после воздействия на них диффундирующего сквозь биопленку антибиотика. В качестве негативного контроля использовали инсерты, проинкубированные 48 часов со стерильным бульоном TSB, содержащим 1 % глюкозы. В качестве еще одного контроля использовали

систему, которая позволяла выявить свойства, качественно отличающие стафилококковые биопленки от небиопленочных стафилококков. В качестве объекта сравнения использовали придонный слой адгезированных между собой стафилококков, полученный в результате 10-минутного центрифугирования (1000 g) инсертов со взвесью стафилококков.

Пефлоксацин использовали в дозировках, которые были выбраны, исходя из его терапевтических концентраций (10 мкг/мл, 20 мкг/мл, 30 мкг/мл) в тканях (Хабриева Р.У., 2004). Негативным контролем служили пробы без пефлоксацина. Пефлоксацин вносили внутрь инсерта с 48-часовой биопленкой. Оценивали два критерия: (1) выживаемость биопленочных бактерий внутри инсерта и (2) проникновение пефлоксацина сквозь биопленку и мембрану, на которой образована биопленка. Результаты оценивали по количеству КОЕ из (1) инсерта и (2) из лунки инсерта, куда предварительно вносили стандартную взвесь микроба-индикатора. Результаты, отражающие выживаемость бактерий в инсерте (в составе биопленки либо в составе слоя адгезированных стафилококков), были также представлены в виде относительных показателей - в процентах от показателей в пробах без антибиотика. Для оценки степени диффузии антибиотика сквозь биопленку был дополнительно введен коэффициент фильтруемости (КФ), который отражал относительное количество погибших клеток микроба-индикатора, выражался в процентах и рассчитывался по формуле:

КОЕ опыт

КФ = 100% -- - х 100 %

КОЕ КОНТООЛЬ

где КОЕопыт - количество КОЕ в 1 мл взвеси микроба-индикатора после воздействия на него продиффундировавшего антибиотика, КОЕконтроль -количество КОЕ в 1 мл взвеси микроба-индикатора в системе без антибиотика.

Наблюдалось достоверное различие в показателях выживаемости между биопленочными и небиопленочными (адгезированными) стафилококками: выживаемость биопленочных стафилококков при 4-х часовой инкубации с пефлоксацином была существенно выше при всех концентрациях антибиотика (во всех случаях р < 0,05). Достоверное снижение выживаемости стафилококков в биопленке по сравнению с контролем (пробы без пефлоксацина) наблюдалось лишь при начальных концентрациях антибиотика в инсерте 20 мкг/мл и 30 мкг/мл (соответственно р < 0,05 и р < 0,001). Количество КОЕ из инсертов с биопленками без антибиотика и с минимальной (10 мкг/мл) концентрацией пефлоксацина практически не отличались между собой (р > 0,05). Чувствительность небиопленочных стафилококков к пефлоксацину была высокой даже при минимальной концентрации антибиотика (10 мкг/мл):

показатели в этих пробах были значительно ниже, чем показатели в контроле без антибиотика (р < 0,05).

Фильтрация через биопленку в течение 4-х часов проявлялась лишь при начальных концентрациях антибиотика 20 мкг/мл и 30 мкг/мл: только при таких концентрациях выживаемость микроба-индикатора достоверно снижалась (соответственно р<0,05 и р < 0,001) по сравнению с контрольными пробами (система без антибиотика). Подобные результаты были получены и в системе с небиопленочными бактериями: только при начальных концентрациях пефлоксацина 20 мкг/мл и 30 мкг/мл наблюдалось достоверное снижение КОЕ по сравнению с контролем без антибиотика (соответственно р < 0,05 и р < 0,01). На чистых мембранах при всех концентрациях антибиотика наблюдалось значительное подавление роста микроба-индикатора, значения были достоверно ниже, чем в контрольных пробах без антибиотика (во всех случаях р < 0,05). Важные результаты были выявлены при сравнении показателей подавления роста микроба-индикатора при фильтрации антибиотика через биопленку и через слой адгезированных бактерий: при концентрации 20 мкг/мл диффузия через биопленку значительно «отставала» от диффузии через слой адгезированных бактерий. Об этом свидетельствует достоверное уменьшение числа КОЕ (р < 0,05) микроба-индикатора в системе с небиопленочными микробами по сравнению с результатами из проб с биопленками. При начальной концентрации пефлоксацина 30 мкг/мл показатели фильтрации через биопленку и через слой небиопленочных бактерий практически не отличались (р > 0,05).

Повышенная выживаемость клеток S. aureus в биопленках по сравнению с небиопленочными бактериями говорит о существовании специфических для биопленок механизмов устойчивости. Это явление может быть связано с двумя важнейшими путями приобретения биопленочной резистентности. Во-первых, в биопленках существует относительно большое количество (от 1 до 10 %) метаболически заторможенных бактерий-персистеров, нечувствительных к антибиотикам (Льюис К., 2005; Чеботарь И.В. и соавт., 2012; Singh R. et al., 2009). Во-вторых, устойчивость может быть связана с фильтрующей способностью матрикса. Матрикс не только связывает клетки в единую структуру, но и заполняет межклеточные пространства, образуя трехмерную фильтрующую систему. Это позволило назвать биопленку «молекулярным фильтром» и считать фильтрацию одной из важнейших функций биопленки (Dunne W.MJr. 2002). Вероятно, что в наших экспериментах повышенная выживаемость биопленочных стафилококков была связана со способностью внеклеточного матрикса замедлять проникновение антибиотика сквозь биопленку. Косвенным подтверждением этого служит сравнение выживаемости S. aureus в биопленках при обработке пефлоксацином и способности этих биопленок задерживать диффузию пефлоксацина. В случаях, когда концентрация антибиотика была достаточно высокой (начальная концентрация в

инсерте была в 6 раз выше рекомендуемых терапевтических норм), пефлоксацин диффундировал через биопленку. В этих пробах наблюдалась практически 100%-ная гибель биопленочных бактерий. И наоборот, низкие концентрации пефлоксацина, практически не диффундирующие через биопленку, не влияли на биопленочные стафилококки (выживаемость более 96 %). При тех же низких концентрациях пефлоксацина погибало около 20 % небиопленочных стафилококков и коэффициент диффузии достигал 16 %. Такие различия логичнее всего объяснить за счет матрикс-зависимой фильтрации, которая блокировала поступление пефлоксацина внутрь биопленок; у небиопленочных стафилококков, которые не были ассоциированы с матриксом, подобный механизм отсутствовал.

Формирование биопленок Staphylococcus aureus на поверхностях синтетических эндопротезов. Девайс-ассоциированные инфекции являются биопленочными инфекциями и представляют важную проблему для современной медицины (Бережанский Б.В., Жевнарев А.А., 2006: Mack D. et al., 2004; Morales M. et al., 2005). Особый риск возникновения биопленок на поверхности инвазивных медицинских устройств возникает, когда устройство имплантируется в контаминированную рану. Это касается эндопротезов для пластики брюшной полости, которые в ряде случаев по вынужденным клиническим показаниям имплантируются в контаминированные раны (Десятникова И.Б. и соавт., 2007). Профилактика девайс-ассоциированных инфекций основывается на нескольких подходах, один из которых связан с применением специальных материалов, предотвращающих

биопленкообразование (Brooks J.L., Jefferson К.К., 2012). Фирмы-производители зачастую декларируют свои изделия как продукты с антимикробными и антибиопленочными свойствами. Вместе с тем существуют данные, которые говорят о способности стафилококков закрепляться на многих медицинских синтетических материалах, включая такие биологически инертные полимеры как политетрафторэтилен (CercaN. et al., 2005; Zdanowski Z. et al., 1993).

Цель исследования, описанного в настоящем разделе, - изучить возможность формирования биопленок золотистого стафилококка на поверхности синтетических макропористых сетчатых эндопротезов, наиболее часто применяемых в отечественной хирургии для пластики брюшной стенки. В работе не ставилась задача получить количественную оценку биопленкообразования. Исследовалась лишь принципиальная возможность роста биопленок на поверхности эндопротезов.

Объектами исследования служили сетчатые эндопротезы из полипропилена («Эсфил», толщина сетки - 500 мкм, плотность - 62 т/и2), поливинилиденфторида («Унифлекс», толщина сетки - 480 мкм, плотность - 160 г/м2), комплекса «полипропилен-поливинилиденфторид» («Флексилен», толщина сетки 500 мкм, плотность 90 г/м2) и эндопротезы из реперена (толщина

- 300 мкм). Стандартизованный по площади кусочек эндопротеза (площадь -0,25 см2) помещали в чашку Петри (диаметр 40 мм), заливали бульоном TSB, содержащим 1 % глюкозы и стандартизованную по оптической мутности взвесь S. aureus, штамм 5983/2. Инкубировали 48 часов при 37°С. После инкубации для выявления стафилококков на поверхности эндопротезов препараты микроскопировали в темном поле (объектив 60 х 0,95). Для выявления ультраструктур биопленочного матрикса препараты фиксировали в 2,5%-ном растворе глутарового альдегида, постфиксировали тетраоксидом осмия, напыляли на их поверхность слой платины и исследовали при помощи электронной сканирующей микроскопии.

Полученные результаты доказали возможность золотистых стафилококков (S. aureus, 5982/2) формировать ранние биопленки на поверхности всех типов эндопротезов, исследованных в эксперименте. Применение исследованных эндопротезов в условиях контаминированных ран может быть сопряжено с развитием биопленочных имплант-ассоциированных инфекций. Для применения в условиях контаминации следует использовать другие варианты эндопротезов, на поверхности которых не смогут образоваться биопленки. Теоретически существование антимикробных, антиадгезивных и антибиопленочных материалов возможно. Результаты научных работ, большая часть из которых проведена in vitro, регулярно содержат информацию об обнаружении таких материалов. В качестве антибиопленочных предлагаются материалы (или покрытия), содержащие наночастицы серебра, золота, фторид иттрия, фторид магния, антибиотики (Dáñese P.N., 2002; Gordon О. et al., 2010; Kalishwaralal К. et al., 2010; Sawant S.N. et al., 1913). Однако, наши результаты свидетельствуют об отсутствии явного прогресса в вопросе практического использования антимикробных материалов в изготовлении медицинских устройств за последние 25 лет.

Полученные результаты говорят о том, что проблема поиска материалов с надежными антибиопленочными свойствами продолжает оставаться актуальной.

37

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выводы

1. Выбор оптимального метода количественной оценки стафилококковых биопленок зависит от сроков культивирования биопленок. Оптимальным методом количественной оценки зрелых (более 24 часов) биопленок являются методы, основанные на спектрофотометрическом исследовании светопоглащения/светопропускания элюатов красителя, смытого с предварительно окрашенной биопленки. Оптимальным методом количестенной оценки ранних (менее 24 часов) биопленок являются методы, основанные на анализе микроскопической картины, отражающей количество биопленочных стафилококков.

2. Биопленки S. aureus с протеино-нуклеиновым внеклеточным матриксом разрушаются под воздействием нейтрофилов человека. Процесс разрушения, связанный с деструкцией матрикса ферментами нейтрофилов, сопровождается высвобождением биопленочных стафилококков и трансформацией их в жизнеспособные планктонные (плавающие) формы.

3. Способность стимулировать люминол-зависимую хемилюминесценцию нейтрофилов у биопленочных стафилококков выражена слабее, чем у планктонных стафилококков. Это связано с наличием в биопленке внеклеточного матрикса, который ингибирует нейтрофил-стимулирующие свойства стафилококков в реакции люминол-зависимой хемилюминесценции.

4. Взаимодействие нейтрофилов и биопленки не влияет на экспрессию гена AgrA у клеток S. aureus, которые находятся в остатках биопленки. При нейтрофил-опосредованном разрушении биопленки трансформация биопленочных стафилококков в планктонные формы сопровождается статистически значимым увеличением показателей экспрессии AgrA.

5. При взаимодействии нейтрофилов человека и биопленки, сформированной S. aureus, в реакционной среде появляются наноразмерные везикулы, главным структурообразующим компонентом которых являются фосфолипиды.

6. Биокомплексы, содержащиеся внутри наноразмерных везикул из системы «нейтрофилы - биопленка S. aureus», обладают способностью разрушать биопленки, сформированные S. epidermidis, но не влияют на биопленки, сформированные S. aureus.

7. Фильтрация антибиотиков (пефлоксацин) через биопленки, сформированные S. aureus, характеризуется статистически более низкими

показателями, чем через эквивалентный по количеству бактерий слой небиопленочных стафилококков. Эффект замедления фильтрации связан с наличием в биопленке внеклеточного матрикса.

8. Золотистые стафилококки обладают способностью формировать биопленки на поверхности синтетических эндопротезов, применяемых в хирургии для пластики брюшной стенки, изготовленных из полипропилена, поливинилиденфторида, комплекса «полипропилен-поливиншшденфторид» и из реперена.

Практические рекомендации

1. При исследовании биопленок рекомендуется руководствоваться диагностическим алгоритмом, который включает не только идентификацию бактерий, но и мероприятия, направленные на обнаружение элементов внеклеточного матрикса и количественную оценку биопленкообразования. Обнаружение внеклеточного биопленочного матрикса позволяет обосновать заключение о наличии биопленочного процесса. Оценка интенсивности биопленкообразования количественно отражает штаммовую способность к формированию биопленки. Полученную информацию о биопленкообразующей способности изучаемого штамма следует расценивать как фактор риска рецидивирования и/шш хронизации инфекции, вызванной этим штаммом.

2. Для количественной оценки объема зрелых биопленок (более 24 ч культивирования) следует использовать спектрофотометрический метод определения оптической плотности элюата красителя, смытого с предварительно окрашенной биопленки. Для ранних биопленок (менее 24 часов) количественная оценка должна проводиться на основе анализа микроскопической картины биопленочных бактерий. В качестве такого анализа рекомендуется использовать автоматизированный подсчет количества стафилококков на единице исследуемой поверхности с помощью компьютерной обработки микроскопических изображений биопленки.

3. Для эффективной борьбы с биопленочными инфекциями рекомендуется использовать специальные методы определения специфической биопленочной антибиотикорезистентности, включающие оценку „ выживаемости биопленочных бактерий при контакте с антибиотиком и оценку способности антибиотика проникать через биопленку. Рекомендуется назначение антибиотиков, способных проникать через

биопленку и обеспечивать полное уничтожение бактерий в составе биопленки.

4. При внедрении в производство медицинских имплантов и перед получением разрешения на их применение в медицине рекомендуется проводить испытания; устанавливающие возможность образования биопленок на их поверхностях. Методика испытаний должна включать длительную инкубацию (не менее 48 часов при 37°С) исследуемого материала в жидких питательных средах, содержащих биопленкообразующие бактерии.

5. При лечении пациентов с биопленочной стафилококковой инфекцией следует учитывать факт высвобождения жизнеспособных стафилококков из разрушаемых нейтрофилами биопленок. Это явление предостерегает от назначения нейтрофил-стимулирующих препаратов, так как их использование повышает риск диссеминации биопленочных бактерий и генерализации инфекционного процесса.

Перспективные направления дальнейшей разработки темы.

Существует несколько актуальных направлений дальнейшей разработки темы. Во-первых, важнейшей задачей является разработка надежных и доступных способов идентификации биопленок и оценки их антибиотикорезистентности в условиях ш vivo. Во-вторых, остается актуальной проблема поиска эффективных антибиопленочных препаратов с антивирулентными свойствами, направленных на осуществление фармакологического контроля биопленочных инфекций. Третье перспективное направление связано с поиском и внедрением материалов с антибиопленочными свойствами для изготовления имплантируемых медицинских устройств. Каждое из перечисленных направлений является глобальной задачей современной медицинской науки.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Свидетельство 2010613048 Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам (Роспатент) о государственной регистрации программы для ЭВМ «Подсчет мшфобов в кластерах» / И.В. Чеботарь, Е.А. Таланин. - Москва, 2010.

2. Чеботарь, И.В. Новый метод количественного учета кокков в надклеточных образованиях - кластерах и биоплёнке / И.В. Чеботарь,

A.А. Таланин, Е.Д. Кончакова // Современные технологии в медицине. - 2010. - № 3. - С.14 - 17.

3. Маянский, А.Н. Стафилококковые биопленки: структура, регуляция, отторжение / А.Н. Маянский, И.В. Чеботарь // Жури, микробиол. -2011.-№1.-С. 101-108.

4. Паршиков, В.В. Биоппенки на сетках (экспериментальное исследование) /

B.В. Паршиков, И.В. Чеботарь, А.А. Самсонов, В.А. Ходак // Сборник материалов VIII конференции "Актуальные вопросы герниологии". -Москва, 2011.-С. 161 - 163.

5. Паршиков, В.В. Особенности репаративного процесса при IPOM в зависимости от структуры и материала эндопротеза / В.В. Паршиков, И.В. Чеботарь, А.А. Самсонов, В.А. Ходак // Сборник материалов VIII конференции "Актуальные вопросы герниологии". - Москва, 2011. - С. 163 - 164.

6. Паршиков, В.В. Синтетические эндопротезы и хирургическая инфекция / В.В. Паршиков, И.В. Чеботарь, А.А. Самсонов, В.А. Ходак, И.Ю. Лазарев // Сборник материалов межрегиональной научно-практической конференции "Актуальные вопросы хирургии, травматологии, ортопедии и интенсивной терапии". - Саранск, 2011.-С.231-233.

7. Маянский, А.Н. Межвидовое общение бактерий и образование смешанной (полимикробной) биоплёнки / А.Н. Маянский, И.В. Чеботарь, Н.И. Евтеева, Е.И. Руднева // Журн. микробиол. - 2012. - №1. - С. 93 - 101.

8. Маянский, А.Н. Pseudomonas aeruginosa: характеристика биопленочного процесса / А.Н. Маянский, И.В. Чеботарь, Е.И. Руднева, В.П. Чистякова // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2012. - №1. - С.З - 8.

9. Маянский, А.Н. Стратегия управления бактериальным биопленочным процессом / А.Н. Маянский, И.В. Чеботарь // Журнал инфектологии. - 2012. - Т. 4, J\k 3. - С.5 - 13.

Ю.Парпшков, В.В. Биопленка на сетках как проблема для протезирующей пластики: клиническое значение, экспериментальное моделирование, современные подходы к лечению / В.В. Паршиков, И.В. Чеботарь, В.А. Ходак, A.A. Самсонов // Сборник материалов IX конференции "Актуальные вопросы герниологии". ~М., 2012. - С. 159 - 160.

П.Паршиков, В.В. Инфекционные осложнения ненатяжной пластики и формирование микробной биопленки на синтетических материалах как нерешенная проблема современной герниологии / В.В. Паршиков, И.В. Чеботарь, В.А. Ходак, A.A. Самсонов // Материалы Национального конгресса «Пластическая хирургия». - М.: Бионика Медиа, 2012. - С. 46 -47.

П.Паршиков, В.В. Исследование in vitro микробной биопленки на поверхности синтетических макропористых эндопротезов для пластики брюшной стенки / В.В. Паршиков, И.В. Чеботарь, В.А. Ходак, A.A. Самсонов // Современные технологии в медицине. - 2012. - № 1. - С.15 - 20.

13.Паршиков, В.В. Парапротезная инфекция в эксперименте in vitro / B.B. Паршиков, И.В. Чеботарь, В.А. Ходак, A.A. Самсонов // Материалы VII Всероссийской конференции общих хирургов с международным участием совместно с Пленумом проблемных комиссий «Неотложная хирургия» и «Инфекция в хирургии» Межведомственного научного совета по хирургии РАМН и Минздравсоцразвития РФ. - Красноярск: Версо, 2012. - С. 360 -363.

14.Чеботарь, И.В. Антибиотикорезистентиость биоплёночных бактерий / И.В. Чеботарь, А.Н. Маянский, Е.Д. Кончакова, A.B. Лазарева, В.П. Чистякова // Клин, микробиол. и антимикроб, химиотер. - 2012. - Т. 14, № 1. - С. 51 - 58.

15.Чеботарь, И.В. Лабораторная диагностика клинически значимых биоплёночных процессов / И.В. Чеботарь, Е.Л. Гурьев // Вопр. диагностики в педиатрии. — 2012. - № 4. - С. 15 - 20.

1б.Чеботарь, И.В. Механизмы антибиоплёночного иммунитета / И.В. Чеботарь // Вестник РАМН. - 2012, № 12. - С.22 - 29.

17.Чеботарь, И.В. Нейтрофилзависимое разрушение биоплёнок, образованных Staphylococcus aureus / И.В.Чеботарь, Е.Д. Кончакова, Н.И. Евтеева И Жури, микробиол. - 2012. - №1. - С. 10 - 15.

18.Чеботарь, И.В. Новый метод исследования

антибиотикорезистентности бактериальных биопленок / И.В.

Чеботарь, Н.А. Маянский, Е.Д. Кончакова // Клин микробиол. и антимикроб, химиотер. - 2012. - Т. 14., № 4. - с. 303 - 308.

19.Маянский, А.Н. Механизмы иеимуиного контроля за бактериальным биопленочным процессом / А.Н. Маянский, И.В. Чеботарь II Вопросы диагностики в педиатрии. - 2013. - Т. 5., № 3. - С.14 - 20.

20.Чеботарь, И.В. Современные технологии исследования бактериальных биопленок / И.В. Чеботарь, А.Г. Погорелов, В.А. Яшин, Е.Л. Гурьев, Г.Г. Ломинадзе // Современные технологии в медицине. - 2013. - Т. 5, № 1. - С.14 - 20.

21.Чеботарь, И.В. Везикулярные структуры в системе «нентрофил -биоплёнка Staphylococcus aureus» / И.В. Чеботарь, Е.Д. Кончакова, М.Л. Бугрова // Иммунология. - 2013. - № 1. - С. 35 - 39. 22.Chebotar, I.V. Vesicle formation as a result of interaction between polymorphonuclear neutrophils and Staphylococcus aureus biofilms / I.V. Chebotar, E.D. Konchakova, A.N. Maianskii //J. Med. Microbiol. - 2013. -Vol. 62, № 8. - P.1153 -1159.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

КОЕ колониеобразующая единица

КФ коэффициент фильтруемости

ПЦР полимеразная цепная реакция

РНК рибонуклеиновая кислота

РТ-ПЦР полимеразная цепная реакция в реальном времени

СЭМ сканирующая электронная микроскопия

XJI хемилюминесценция

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

TSB tryptic soy broth, или трипсинизированный соевый бульон

Отпечатано с готового оригинала-макета в РИО Нижегородского института управления

Нижегородский институт управления - филиал Российской академии народного хозяйства и государственной службы при Президенте РФ 603950, Нижний Новгород-292, пр. Гагарина, 46 Тел./факс: (831)412-33-01

Подписано в печать 21.11.2013.

Формат 60x84/16. Печать офсетная. Бумага офсетная.

Уч.-изд. л. 2,0. Тираж 120 экз. Зак. 6780._

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора медицинских наук, Чеботарь, Игорь Викторович, Москва

Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

0520'i 450565

Чеботарь Игорь Викторович

Биопленки Staphylococcus aureus: структурно-функциональные характеристики и взаимоотношения с нейтрофилами

03.02.03. - микробиология

Диссертация

на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант: д.м.н., профессор Маянский А.Н.

Нижний Новгород, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................5

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Глава 1. Обзор литературы..........................................................................22

1.1. Определение понятия биопленки..............................................22

1.2. Этапы эволюции стафилококковых биопленок......................23

1.3. Структура биопленок Staphylococcus aureus..............................25

1.4. Влияние факторов внешней среды на

биопленки Staphylococcus aureus..............................................28

1.5. Генетический контроль биопленочного процесса

у золотистого стафилококка....................................................30

1.6. Биопленки Staphylococcus aureus и иммунная система..............34

1.7. Антибиотикорезистентность биопленочных стафилококков . 40

1.8. Методы исследования стафилококковых биопленок

и диагностика биопленочного процесса....................................47

1.9. Стратегия управления стафилококковым

биопленочным процессом..........................................................55

Глава 2. Материалы и методы....................................................................62

2.1. Объем исследований..................................................................62

2.2. Материал для исследований......................................................62

2.3. Моделирование биопленок........................................................64

2.4. Люминол-зависимая хемилюминесценция нейтрофилов .... 65

2.5. Идентификация видовой принадлежности стафилококков . . 68

2.6. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия..............69

2.7. Сканирующая электронная микроскопия................................70

2.8. Трансмиссивная электронная микроскопия............................70

2.9. Лазерное угловое динамическое светорассеяние в оценке размера наночастиц....................................................................71

2.10. Оценка интенсивности биопленкообразования......................71

2.11. Идентификация биохимической природы внеклеточного биопленочного матрикса............................................................73

2.12. Идентификация биохимической природы везикулярных структур......................................................................................74

2.13. Определение количества колониеобразующих единиц............75

2.14. Количественное определение белка по методу Брэдфорд .... 75

2.15. Водоподготовка..........................................................................76

2.16. Статистическая обработка результатов....................................76

2.17. Программное обеспечение, использованное в

настоящем исследовании..........................................................77

Глава 3. Собственные исследования............................. 78

3.1. Методический алгоритм для идентификации и количественной оценки стафилококковых биопленок.................... 78

3.2. Структурные изменения биопленок Staphylococcus aureus

в условиях контакта с нейтрофилами человека............ 97

3.3. Нейтрофил-стимулирующие свойства биопленок Staphylococcus aureus................................. 116

3.4. Экспрессия AgrA в условиях нейтрофил-опосредованного разрушения биопленок Staphylococcus aureus.............. 126

3.5. Исследование везикулярных наноструктур в системе «нейтрофил - биопленка Staphylococcus aureus»........... 135

3.6. Новый метод исследования биопленочной антибиотикорезистентности........................... 152

3.7. Формирование биопленок Staphylococcus aureus на

поверхностях синтетических эндопротезов............... 165

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................ 172

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ...... 198

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................... 199

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы диссертационного исследования

Течение инфекционных болезней может протекать с осложнениями из-за формирования в организме микробных биопленок [6, 29, 52, 85, 118, 146, 148]. Биопленки являются формой микробных сообществ, фиксированных на поверхностях и состоящих из микробных клеток и ассоциированного с ними внеклеточного матрикса [329]. Инфекции, патогенез которых детерминируется микробными биопленками, называются биопленочными инфекциями [221, 286]. С биопленочными инфекциями связаны многие хронические заболевания - муковисцидозная пневмония, средний отит, патология зубов и околозубных тканей, остеомиелит, инфекции мочевыводящих путей и пр. [28, 148]. До 80 % всех бактериальных инфекций человека связаны с образованием биопленок [286]. Часто биопленки развиваются на поверхности медицинских устройств -протезов, катетеров, имплантов - и являются этиопатогенетической основой развития так называемых девайс-ассоциированных инфекций. В Германии, одной из немногих стран, где ведется статистический учет девайс-ассоциированных инфекций, количество подобных заболеваний превышает 100 000 случаев в год [229, 331]. В Западной Европе и США ежегодно регистрируется более 500 000 случаев катетер-ассоциированных инфекций [5]. Каждое осложнение в виде катетер-ассоциированной инфекции удорожает лечение одного больного на сумму от 33000 до 65000 долларов США [253, 266]. В итоге на лечение и борьбу с осложнениями биопленочных катетер-ассоциированных инфекций система здравоохранения США вынуждена тратить около 2 миллиардов долларов в год [195, 283]. Не случайно многие из последних рекомендаций Центра контроля и профилактики заболеваний США

(CDC), касающиеся бактериальных инфекций, акцентируют внимание на проблемах, связанных с биопленками1.

Стафилококки - актуальные возбудители оппортунистических гнойно-воспалительных заболеваний - являются бактериями, способными к формированию биопленок. Прежде всего, это касается Staphylococcus aureus [69, 176, 230, 258]. Известно, что от 67 % до 78 % клинических изолятов S. aureus могут формировать биопленки [205, 309]. Среди метициллин-резистентных золотистых стафилококков процент биопленкообразующих штаммов in vitro доходит до 96 % [100]. Формирование биопленок с участием S. aureus и Staphylococcus epidermidis может играть решающую роль в патогенезе остеомиелита, синуситов и риносинуситов, эндокардитов, отитов, муковисцидоза, септических артритов, хронической раневой инфекции [95, 127, 175, 188, 214, 221, 293]. Особую роль стафилококковые биопленки играют в развитии инфекций, связанных с имплантами: они обнаруживаются у 1,5-2,5 % больных с первично имплантантированными коленным или тазобедренным суставами, причем в 22-23,6 % случаев от них выделяется S. aureus [254, 269]. Перечисленные факты доказывают важность проблемы биопленок S. aureus для современного здравоохранения. Исследования, направленные на описание структурно-функциональных характеристик биопленок золотистого стафилококка, анализ их взаимоотношений с организмом человека, а также обоснование методов диагностики и лечения стафилококковых биопленочных инфекций являются актуальными направлениями современной медицинской науки.

1 - информация с сайта Centers of Disease Control and Prevention, URL: http://stacks.cdc.gov/cbrowse/?parentId=cdc%3al 00&pid=cdc%3al 00&type=l &fac etRange=960

Степень разработанности темы диссертационного исследования

Одни из первых работ, в которых была описана сложность межклеточных контактов внутри бактериальных колоний, принадлажат отечественному микробиологу Н.Д. Иерусалимскому [19]. Однако, доказательства патогенетической роли микробных сообществ - биопленок - появились лишь около 30 лет назад в работах Т. Мэриэ, Д. Костертона и Д. Неллигана [226, 227]. Основоположниками учения о медицинских бипленках считаются Джон Костертон (автор более 400 работ о биопленках), Томас Мэриэ (автор более 100 работ) и Карла Арсиола (автор более 150 работ). В их работах описаны фундаментальные принципы строения и физиологии микробных биопленок.

В России несколько научных коллективов активно занимаются проблемами биопленок. Научно-исследовательская работа, посвященная проблеме биопленок, проводится на базах ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН (под руководством A.JI. Гинцбурга), Санкт-Петербургского государственного университета (под руководством д.б.н. О.В. Рыбальченко), Самарского государственного медицинского университета (под руководством Жесткова A.B.) и других научных коллективов.

Существенный вклад в исследование биопленок внесли зарубежные ученые. Об этом говорит статистика электронного ресурса PubMed: в 2012 году по теме биопленок в зарубежных странах было опубликовано более 3000 научных работ. Работы Дитриха Мака и Ганса-Курта Флемминга посвящены исследованию биопленочного матрикса [171, 230]. Ким Льюис известен своими работами о биопленочной антибиотикорезистентности [27, 218]. Джефф Лейд изучает взаимоотношения биопленок с эффекторами иммунной системы [190]. Анна Донгари работает в области исследований, посвященных взаимодействиям между иммунной системой и биопленками [144]. Ультраструктура бактериальных биопленок и роль биопленкообразования в

симбиотических и антагонистических отношениях микробиоты кишечника человека, исследованные с помощью различных методов электронной микроскопии, отражены в новейшем обзоре Рыбальченко О.В. и Бондаренко В.М. [49]. Приведенная информация свидетельствует о большом интересе научно-медицинского сообщества к проблеме биопленочных процессов.

В большинстве работ, посвященных медицинским биопленкам, в качестве объекта исследования используют микроорганизмы, не относящиеся к роду Staphylococcus. В знаниях о стафилококковых биопленках имеется существенный пробел, касающийся структурно-функциональных особенностей биопленок золотистого стафилококка, которые можно было бы использовать в качестве основы для разработки методов диагностики и управления стафилококковым биопленочным процессом. Вопросы взаимоотношения биопленочных стафилококков с организмом человека, проблемы диагностики и фармакологического контроля стафилококковых биопленочных процессов являются малоизученными направлениями современной медицинской микробиологии.

Цель и задачи исследования

Цель исследования:

Охарактеризовать структурно-функциональные свойства биопленок Staphylococcus aureus для обоснования рациональных подходов к диагностике и управлению стафилококковыми биопленочными инфекциями.

Задачи исследования:

1. На основе изучения морфо-функциональных и физико-химических свойств биопленок S. aureus разработать и апробировать диагностический алгоритм для идентификации и количественной оценки стафилококковых биопленок.

2. Описать феноменологию и изучить механизмы структурных изменений в биопленке S. aureus, возникающих при взаимодействии с нейтрофилами в условиях in vitro.

3. Охарактеризовать нейтрофил-стимулирующие свойства биопленок S. aureus.

4. Проанализировать структурно-функциональные особенности дериватов, образующихся в результате взаимодействия нейтрофилов с биопленкой S. aureus.

5. Исследовать структурно-функциональные особенности липидных дериватов, образующихся в результате взаимодействия нейтрофилов с биопленкой S. aureus.

6. Разработать и апробировать способ, сочетающий в себе (1) определение чувствительности биопленочных микробов к антимикробным препаратам и (2) избирательную оценку фильтрующей способности биопленок в

у

отношении противомикробных агентов.

7. Исследовать возможность образования биопленки S. aureus на поверхности синтетических макропористых сетчатых эндопротезов, применяемых в хирургии для пластики брюшной стенки.

Научная новизна

Впервые была показана возможность использования метода масс-спектрометрии для идентификации видовой принадлежности биопленочных стафилококков из моновидовой стафилококковой биопленки. Охарактеризованы структурно-функциональные признаки биопленок S. aureus, которые могут быть использованы для подтверждения наличия биопленки и оценки интенсивности биопленкообразования. В частности, лимитированные микроколебания клеток в стафилококковой биопленке описаны в качестве нового критерия наличия межклеточного биопленочного матрикса. Оптимизирована методика выявления ультрамикроструктур межклеточного биопленочного матрикса биопленок S. aureus при помощи сканирующей электронной микроскопии. Впервые была доказана необходимость применения различных методов для оценки интенсивности биопленкообразования на разных сроках культивирования биопленок. Показано, что вновь разработанный способ количественного учета стафилококков был оптимальным методом для количественной оценки ранних биопленок (менее 24 часов). Подтверждено, что метод количественной оценки биопленок на основе спектрофотометрического исследования элюатов красителя, смытого с предварительно окрашенной биопленки, был неэффективен для ранних (менее 24 часов) и оптимален для более зрелых биопленок (24 часа и более).

Вскрыты механизмы нейтрофил-зависимой деструкции биопленок S. aureus, которые связаны с разрушением протеино-нуклеотидного биопленочного матрикса ферментами нейтрофилов. Было обнаружено, что нейтрофилы, разрушая биопленку, не обеспечивают полного киллинга биопленочных стафилококков. Впервые охарактеризовано явление высвобождения стафилококков из разрушаемых нейтрофилами биопленок и их трансформации в жизнеспособные планктонные (плавающие) бактерии, что в

и

условиях реальной патологии может привести к диссеминации возбудителя в организме и генерализации инфекционного процесса.

Впервые проанализированы особенности стимуляции люминол-зависимой хемилюминесцении нейтрофилов человека в реакциях с биопленками S. aureus: биопленочные стафилококки обладали пониженной способностью индуцировать эту реакцию по сравнению с планктонными стафилококками. Было выявлено, что это снижение связано с наличием в биопленке внеклеточного протеино-нуклеотидного матрикса.

Впервые описаны особенности коррелирующей с вирулентностью стафилококка экспрессии гена AgrA при взаимодействии между биопленкой S. aureus и нейтрофилами человека. Доказано, что стафилококки, трансформируясь в планктонные формы, демонстрировали усиление экспрессии AgrA, что было новым свидетельством повышения вирулентности стафилококков, высвобождавшихся из биопленки.

Впервые обнаружены и охарактеризованы наноразмерные везикулы, которые появляются в инкубационной среде при взаимодействии биопленки S. aureus с нейтрофилами человека. Везикулы обладали способностью разрушать биопленки S. epidermidis, что, по-видимому, было связано с присутствием в их составе протеинов, дестабилизирующих биопленочный матрикс.

С помощью вновь предложенного метода оценки антибиотикорезистентности биопленочных бактерий был доказан факт снижения скорости фильтрации антибиотика (пефлоксацин) через биопленку по сравнению с фильтрацией через слой адгезированных между собой планктонных стафилококков. Это явление сопровождалось повышением выживаемости биопленочных стафилококков при обработке терапевтическими концентрациями пефлоксацина и рассматривалось в качестве механизма снижения чувствительности биопленочных стафилококков (S. aureus) к антибиотикам.

Была установлена способность S. aureus к формированию биопленок на поверхности синтетических эндопротезов, применяемых в отечественной

хирургии для пластики брюшной стенки (полипропилен, поливинилиденфторид, комплекс «полипропилен-поливинилиденфторид» и реперен). Это стало свидетельством универсальности биопленкообразования золотистым стафилококком, который способен закрепляться и размножаться на разнообразных полимерных поверхностях.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты настоящего исследования вносят существенный вклад в изучение структурно-фунциональных характеристик биопленок, сформированных золотистыми стафилококками, дополняют научные представления о морфологии и физиологии биопленок, позволяют обосновать новые походы к диагностике и лечению биопленочных процессов. Научно обоснована и подтверждена концепция о том, что разрушение биопленок S. aureus нейтрофилами создает условия для диссеминации стафилококков в организме. Выявлены ранее неизвестные закономерности изменений экспрессии agr-системы, контролирующей вирулентность золотистого стафилококка, которые происходили в процессе нейтрофил-опосредованного разрушения биопленок S. aureus. Расширены представления о функциях внеклеточного матрикса, обеспечивающих защиту биопленочных стафилококков за счет подавления кислород-зависимой биоцидности нейтрофилов. Исследование фильтрации антибиотика через биопленку S. aureus позволило установить связь между замедлением проникновения антибиотика сквозь биопленку и устойчивостью биопленочных стафилококков к его действию. Получено представление о том, что золотистый стафилококк проявляет универсальность в использовании синтетических поверхностей для формирования на них биопленок, что продемонстрировано на моделях эндопротезов, изготовленных из различных материалов.

Предложен и �