Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства и принципы идентификации культур группы Burkholderia cepacia

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства и принципы идентификации культур группы Burkholderia cepacia"

ЛОБОИКО Алексей Давидович

□Q3484119

На правах рукописи

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ПРИНЦИПЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ КУЛЬТУР ГРУППЫ ВURKHOLDERIA CEPACIA

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских паук

2 6 НОЯ 2009

Ставрополь, 2009

003484119

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор

Илюхин Владимир Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

Коготкова Ольга Ивановна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Саратовский

государственный медицинский университет»

заседании диссертационн г, 212.256.09 при Ставрополь-

ском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан « Ли? _ 2009 г.

доктор медицинских наук Цыганкова Ольга Ивановна

Защита состоится £

2009 г. в /¿7 часов на

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В род Burkholderia в настоящее время входят более 30 видов грамотрицательных глюкозу неферменти-рующих бактерий, подавляющее большинство которых являются сво-бодноживущими почвенными и водными микроорганизмами. Для медицинской практики имеет значение идентификация и биологические свойства 3-х видов буркхольдерий: В. mallei и В. pseudomallei, являющихся возбудителями особо опасных инфекций (сапа и мелиоидо-за), а также В. cepacia, способной в определенных условиях вызывать оппортунистические и нозокомиальные инфекции у больных с иммунодефицитным состоянием (Беляков, 1990).

В. cepacia является убиквитарным микроорганизмом, обладающим уникальным набором приспособительных механизмов, позволяющих ему создавать экологические ниши как во внешней среде, так и в симбиотических состояниях с растениями и животными (Беляков, 1990; Vandamme, 2001; Segonds, Chabanon, 2001; Colwell et al., 1995). Учитывая способность утилизировать широкий набор простых и сложных химических соединений, в том числе и токсических, В. cepacia используется для биоремидиации почвы (Holmes et al., 1998). Однако при этом приходится считаться с тем, что В. cepacia способна вызывать патологические изменения у растений, животных и человека (Rahme et al., 2000; Segonds, Chabanon, 2001; Speert et al., 2002).

Наиболее остро стоит проблема инфекции В. cepacia для больных муковисцидозом, у которых возможно возникновение cepacia-cmA-рома, характеризующегося формированием некротической пневмонии и септицемией с неблагоприятным прогнозом (Шагинян, Чернуха, 2003; Hendiy et al., 2000; Speert et al., 2002).

Проблемы лечения больных с В. cepacia инфекциями усложняются высокой устойчивостью этого микроорганизма к большинству современных антибиотиков, причем в ходе лечения возможно появление полирезистентных клонов, поэтому цикл химиотерапии этих пациентов длительный и базируется на комплексном сочетании антибиотиков с разным механизмом действия (Conway etal., 2003; Gibson et al., 2003).

Диагностика инфекций, вызванных В. cepacia, в настоящее время весьма несовершенна, идентификация культур и их внутривидовая дифференциация, как средство эпидемиологического анализа, требует высокого уровня подготовки специалистов и наличия специальных

средств генетической диагностики. Это возможно обеспечить только в специализированных центрах, в обычных клинических лабораториях выделение и идентификация культур В. cepacia происходит довольно редко, чаще всего подобные культуры идентифицируются как «необычные» псевдомонады или глюкозу неферментирующий вид бактерий (Беляков, 1990). В лабораториях, располагающих полуавтоматическими системами идентификации типа API, Nefermtest, Vitek, культуры В. cepacia идентифицируются чаще, однако этим методом они не дифференцируются на геномовары (виды группы В. cepacia) и не позволяют отличить от В. cepacia ряд близкородственных видов буркхольдерий.

Особенно опасны случаи неточности определения вида на уровне идентификации филогенетически близких возбудителей особо опасных инфекций В. mallei и В. pseudomallei как В. cepacia, что приводит к нарушениям режима работы и внутрилабораторным инфекциям (Schlech et al., 1981).

Цель работы: изучение культуральных, биохимических, патогенных свойств коллекции культур В. cepacia для установления набора тестов, имеющих принципиальное значение для разработки схемы идентификации и внутривидового типирования штаммов В. cepacia.

Задачи исследования.

1. Выявить фенотипические признаки, имеющие принципиальное значение для установления видовой принадлежности культур В. cepacia.

2. Отобрать тесты, необходимые для внутривидового типирования (эпидемиологических маркеров) штаммов В. cepacia.

3. Оценить диапазон чувствительности культур В. cepacia к антибактериальным препаратам с целью разработки терапевтических рекомендаций и создания селективных сред.

4. Разработать практическую схему лабораторной идентификации и дифференциации культур В. cepacia.

Научная новизна.

В результате исследования набора штаммов В. cepacia и филогенетически близких буркхольдерий отобраны основные фенотипические дифференциальные признаки и разработан алгоритм идентификации культур вида В. cepacia.

Показана перспективность использования иммунологических реакций (РДД, МФА), особенно на этапе предварительной идентификации.

Изучен спектр чувствительности штаммов В. cepacia к современным химиотерапевтическим препаратам, и даны рекомендации по их использованию в диагностических и лечебно-профилактических целях.

Выявлены фено- и генотипические признаки внутривидовой дифференциации штаммов В. cepacia как факторов эпидемиологического анализа. Приоритетность исследований подтверждается двумя патентами на изобретение, оформленными по материалам диссертационной работы.

Теоретическая и практическая значимость. Проведенные исследования по идентификации буркхольдерий показали необходимость комплексных исследований с применением морфологических, биохимических, иммунологических и генетических методик, т. е. представлены доказательства необходимости использования принципов полифазной таксономии для идентификации и типирования бактерий рода Burkholderia.

Разработана схема идентификации В. cepacia, позволяющая определять вид, геномовары и биовары в условиях клинической бактериологической лаборатории. В лекционно-практический курс отдела подготовки специалистов по особо опасным инфекциям введен раздел принципов полифазной таксономии буркхольдерий, позволяющий на современном уровне устанавливать как видовую принадлежность, так и проводить инфравидовое разграничение исследуемых культур буркхольдерий.

На основании изучения спектра чувствительности культур В. cepacia к антибактериальным препаратам, предложен набор антибиотиков, пригодных для химиотерапии и разработки селективных сред.

Материалы диссертационной работы использованы при подготовке «Методических рекомендаций по приготовлению и использованию питательной среды для дифференциальной диагностики патогенных и близкородственных буркхольдерий», утвержденных директором Волгоградского НИПЧИ В. В. Алексеевым 12.12.2007 г.

Штамм В. cepacia КМ 203 - авирулентный продуцент сапного бактериофага депонирован в государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» 27.12.2006 г. Получен патент на изобретение №2339690 от 27.11. 2008 г «Штамм бактерий Burkholderia cepacia -авирулентный продуцент бактериофага, лизирующего культуры сапа». Получено решение о выдаче патента на изобретение от 05.05.2009 г. «Питательная среда для выделения возбудителя сапа», заявка № 2007126294, дата подачи заявки 10.07.2007 г.

Положения, выносимые на защиту:

1) отобранные на основе изучения фенотипических свойств культур В. cepacia стабильные и вариабельные признаки позволили создать практическую схему идентификации с определением вида и биоваров штаммов В, cepacia;

2) иммунологические методы диагностики (РДД и МФА) позволяют исключать или отрицать принадлежность культур к виду В. cepacia на стадии предварительной идентификации;

3) изучение антибиотикочувствительности культур В. cepacia позволяет выявить препараты, рекомендуемые для лечения инфекций (карбапенемы, хинолоны, тетрациклины), а также применяемые при создании селективных сред (полимиксин В, гентамицин, ванкомицин).

4) идентификация культур вида В. cepacia с помощью автоматических тест-систем (API 20 NE или NEFERM-test) позволяет с высокой степенью достоверности (> 90 %) установить видовую принадлежность исследуемых культур, однако с целью исключения гипердиагностики за счет филогенетически близких видов буркхольдерий, требует постановки дополнительных лабораторных тестов;

5) принцип полифазной таксономии требует для окончательной идентификации штаммов В. cepacia комбинированного исследования культур с применением методов генотипического, фенотипического, серологического исследования, позволяющих в конечном итоге установить принадлежность культур не только к виду, но и к определенному био- или геномовару), что имеет важное значение для эпидемиологического анализа инфекций В. cepacia.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь,2007), на VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007) а также на научных межлабораторных конференциях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института в 2007,2008 гг.

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе одна из них в периодическом издании из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования науки России

и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, получен один патент на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 125 листах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 194 источника, в том числе 47 отечественных и 147 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 8 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе использовали 25 культур В. cepacia, собранных в коллекции Волгоградского научно-исследовательского противочумного института. Большая часть штаммов получена из научных учреждений России, Украины, Франции путем личной переписки, поэтому штаммы не всегда имеют полную характеристику не только фенотипических свойств, но и сведений о месте, времени выделения и способах идентификации. Штамм В. cepacia 1934 - атипичный, дефектный по LDC и протеазе. Штамм В. cepacia 25416 является референтным не только для вида, но и для всего рода Burkholderia, был выделен в 1950 г W. Burkholder из лука.

В сравнительных опытах по изучению селективности сред и ряда биологических свойств использовались 50 штаммов 18 гетерологич-ных видов, наиболее часто встречающихся в лабораторной медицинской практике. Из числа близкородственных буркхольдерий опыты ставили с В. pseudomallei 107 и VPA (авирулентные штаммы); В. thailandensis 264, 251, 295.

Для выращивания и поддержания культур В. cepacia использовали набор сред, широко применяемых при работе с буркхольдериями и псевдомонадами -триптиказо-соевый агар (бульон), мясо-пептонный агар (бульон). При оценке питательных потребностей (ауксограммы) отдельных штаммов использовали минимальную среду G.Gilardi.

Для выделения В. cepacia из внешней среды и клинического материала использовались селективные среды: среда Мак-Конки с добавлением 600000 ЕД/л полимиксина В и 10 мг/л гентамицина и BCSA с добавлением полимиксина В 600000 ЕД/л, гентамицина 10 мг/л, ван-комицина 10мг/л.

В исследованиях использовали температуру выращивания 37°С,

кроме реакций, методика постановки которых требует иную величину температуры. Учет результатов осуществляли через 24 ч.

Все биохимические реакции проводились по общепринятым методикам (Илюхин с соавт., 1998; Сенина, 2004; Gilardi, 1976; Palleroni, 1984).

При постановке пробы налуке наносили каплю культуры 107-108 м.к. на интактные изолированные чешуйки лука или же на срез луковицы. Учет результатов проводили через 24-48 ч по методике, описанной Wigley Р. и Burton N.E. (1999).

Для выявления продукции цепациацинов использовали 3 метода: двуслойный, штриховой и метод выращивания штаммов продуцентов в бульоне.

При изучении фагопродукции спектр литической активности фагов буркхольдерий выявляли на индикаторном газоне тест-штамма (метод агаровых слоев по Грациа).

Иммунологические диагностические исследования проведены по стандартным методам, адаптированным к условиям работы с патогенными буркхольдериями (Илюхин с соавт., 1998).

Активность антибактериальных препаратов определяли двумя способами: методом кратных разведений в жидкой питательной среде и методом диффузии в агар (метод дисков).

При идентификации штаммов буркхольдерий по системе NEFERM test 24 исследование проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору.

Идентификацию бактерий, относящихся к ГНФ типу, проводили с помощью системы API 20 NE. Принцип оценки этим методом заключается в определении кода по 21 качественному признаку, последние сгруппированы в 7 групп.

Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме 25 мкл в микроцентрифужных пробирках (500 мкл). Реакционная смесь содержала: ДНК, специфические олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буфер и фермент Taq-полимеразу. На поверхность смеси наслаивали 30 мкл минерального масла. В качестве отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды. Амплификацию ДНК проводили на программируемом термоцикле-ре «Терцик» (НПФ «ДНК-технология», Москва) с использованием «горячего старта».

Анализ продуктов ПЦР осуществляли методом гель-электрофо-

реза в 1,5 % агарозном геле согласно рекомендациям, изложенным в руководстве Т. Маниатиса с соавт. (1984).

При изучении вирулентности различных по источнику выделения штаммов В. cepacia использовали два вида лабораторных животных — белых мышей и золотистых хомячков. Заражение проводили как ин-тактных животных, так и предварительно обработанных иммунодеп-рессантами (гидрокортизон, актиномицин Д, четыреххлористый углерод и ацетат свинца), которые существенно повышают чувствительность животных к ряду инфекций. Дозы и время введения иммунодеп-рессантов - гидрокортизон 5 мг за 3 ч до заражения; ацетат свинца 5 мг одновременно; четыреххлористый углерод 0,2 мл за 48 ч; актиномицин Д - 25 мкг одновременно; все препараты вводили подкожно в область бедра.

Результаты исследований и их обсуждение. Культуры В. cepacia отличаются неприхотливостью роста и успешно культивируются на большинстве широко используемых в лабораторной практике питательных сред. На плотных средах культуры В. cepacia через 24 ч культивирования при 37°С формируют гладкие полупрозрачные колонии, которые через 48 ч достигают размеров 2-3 мм светло-коричневого или бежевого цвета. В бульоне через сутки отмечается помутнение культур, на поверхности - тонкая пленка, через 48 ч - на поверхности плотная кремового цвета пленка, бульон мутный, отмечается придонный рыхлый осадок.

При окрашивании по Граму видны розовые, палочковидные бактерии. По размерам и цвету, бактерии В. cepacia не имеют отличий от других видов грамотрицательных бактерий (псевдомонады, эшери-хии и т. п.).

Наряду с морфологическими признаками колоний и клеток В. cepacia, биохимическая активность культур, выявляемых в специальных тестах, является основой разработанных в настоящее время диагностических схем и ключей идентификации бактерий, включая и вид В. cepacia. На основе полученных нами данных и анализа литературных данных, составлена сводная таблица фенотипических свойств буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике. Обращают на себя внимание как обязательные положительные тесты для установления видовой принадлежности культур к виду В. cepacia оксидазная реакция и окисление, но не ферментация глюкозы, а также наличие лизиндекарбоксилазы и бета-галактозидазы. При этом отрицательными должны быть тесты на аргининдигидролазу,

окисление рамнозы и способность образовывать газообразные продукты в тесте на денитрификацию (табл. 1).

При проведении серологических исследований в диагностических иммунологических реакциях считается вполне пригодной реакция преципитации в геле по Оухтерлони, где в качестве антигена используется густая взвесь (> 5x109 м.к./мл) живой культуры испытуемого штамма. В наших опытах мы использовали для РДД преципитирую-щую сыворотку, полученную к ацетонвысушенным клеткам референтного штамма A cepacia 25416. Титр сыворотки к гомологичной культуре в качестве антигена составлял 1:32. При постановке РДД со всеми штаммами В. cepacia и гетерологичными видами буркхоль-дерий установлено формирование многочисленных полос преципитатов с типичными культурами В. cepacia и формирование 1 или 2 минорных линий с близкородственными видами буркхольдерий. С гетерологичными видами других родов, особенно с культурами микрофлоры из внешней среды (почва, водоемы) формирование преципитатов в РДД с сывороткой В. cepacia не отмечалось.

При проведении оценки возможности использования МФА для диагностики В. cepacia, на основе преципитирующей гипериммунной кроличьей сыворотки были получены иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие к антигенам В. cepacia. Для идентификации микроорганизмов использовали мазки-препараты изучаемых культур в концентрации 5x108 м.к./мл по ОСО мутности. Было показано, что МФА позволяет идентифицировать все типичные штаммы В. cepacia при полном отсутствии ложно позитивных случаев идентификации близкородственных буркхольдерий и гетерологич-ных видов микроорганизмов. Отрицательные результаты в МФА получены с 7 музейными штаммами В.cepacia, которые по феноти-пическим признакам не соответствовали критериям соответствия виду В. cepacia.

Определение чувствительности штаммов В. cepacia к антибиотикам, и сульфаниламидным препаратам имеет значение, как для назначения адекватной терапии, так и в диагностических целях. Известно, что для буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике, характерна высокая природная устойчивость к пени-циллинам, полимиксинам и аминогликозидам. Препараты этих типов антибиотиков включаются в селективные и транспортные среды для выделения буркхольдерий из клинического материала и внешней среды.

Таблица 1

Дифференциальные фенотипические признаки В. cepacia

Тесты В. cepacia В. В. В. mallei

pseudomallei thailandensis

Окисление: глюкозы + + + +

фруктозы + + + +

Ксилозы + + + -

Лактозы + + + +

Мальтозы + + + +

Сахарозы + + + -

Рамнозы - + + -

Аргининдигидролаза - + + +

Лизиндекарбоксилаза + - - -

Орнитиндекарбоксилаза +/- - - -

ООТО + - - -

Желатиназа +/- + + +

Денитрификация - + + +

ДНК-аза - - - -

Гидролиз эскулина +/- +/- +/- -

Число жгутиков >1 >1 >1 0

Рост при 4° С - - - -

Рост при 42° С +/- + + -

Полимиксин R R R R

Гентамицин R R R S

Рост при 2.5% ЫаС1 +/- - - -

Ассимиляция Ь-арабинозы + - + -

Наличие пигмента +/- - - -

Г+Ц моль% 67 69 68 69

К-колонии на агаре - +/- - -

Вирулентность для з/х - + - +

Ауксотрофность - - - -

Примечания: + и - обозначают наличие или отсутствие признака у > 90 % штаммов данного вида; +/- - замедленная реакция; R -резистентность; S - чувствительность к антибиотикам.

При оценке чувствительности штаммов В. cepacia имеющиеся в нашем распоряжении штаммы в большинстве своем резистентны или имеют умеренную чувствительность к препаратам, рекомендуемым при лечении заболеваний, вызываемых буркхольдериями и псевдомонадами (табл. 2).

При выделении бактериоцинов двуслойным методом в перекрестном изучении бактериоцинопродукции всех имеющихся у нас штаммов В. cepacia было установлено, что самый чувствительный штамм В. cepacia 3181. Он чувствителен ко многим штаммам-продуцентам бактериоцинов. Самые активные штаммы-продуценты В. cepacia 8237 и 8238. В. cepacia 1934 не является ни штаммом-продуцентом бактериоцинов, ни чувствительным штаммом. Есть штаммы, чувствительные только к одному, двум штаммам-продуцентам (25416, 8235,8236,3189,323,423,506,122,610,620).

Таблица 2

Чувствительность штаммов В. cepacia к химиотерапевтическим препаратам методом серийных разведений

Антибактериальные МПК50 S-R интервал Показатели

препараты чувствительности

Амоксиклав 64 6-24 R

Ванкомицин >128 >128 R

Гентамицин 64 4-16 R

Доксициклин 16 4-6 R(I)

Имипенем 8 4-16 1

Канамицин 16 8-16 R(I)

Ко-тримаксазол 4 40-80 S

Ломефлоксацин 2 2-8 1(S)

Меропенем 4 4-16 I(S)

Офлоксацин 2 2-8 I(S)

Пиперациллин 8 16-64 s

Полимиксин В >128 >128 R

Рифампицин 8 4-16 I

Спарфлоксацин 2 1-2 R(I)

Сульфаметоксазол 32 100-350 S

Хлорамфеникол 16 8-32 I

Цефепим 8 8-32 I(S)

Цефтазидим 2 8-32 s

Цефтриаксон 4 8-64 s

Ципрофлоксацин 1 1 -4 ics)

Примечания: цифровой материал выражен в мкг/мл; МПК50 - медиана 25 показателей; 8-11 интервал определен по МУК 4.2.1890-04; Я, 8,1 - резистентный, чувствительный, промежуточный тип устойчивости, соответственно.

При изучении фагопродукции методом Грациа, было выявлено, что 6 штаммов В. cepacia (323, 370, 423, 8237, 8238, 8240) продуцируют литические фаги. Наиболее активной по литическому спектру была фагопродукция у штамма В. cepacia 8238, выявить универсальный индикаторный штамм среди имеющихся культур В. cepacia не удалось.

При изучении вирулентности различных по источнику выделения штаммов В. cepacia на двух видах лабораторных животных - белых мышах и золотистых хомячках показано, что на модели нормальных и иммунодепрессивных животных можно выявлять уровень вирулентности штаммов В. cepacia только при введении максимальных доз уровня 109 м.к.

При постановке пробы на луке из 11 штаммов В. cepacia изменения в луковичной пластине были у 8 штаммов. Мацерации не было у В. cepacia 1934,8239 и 8240. Наличие мацерации проверялось надавливанием пинцета на луковичную чешуйку. При положительной реакции, особенно выраженной у штамма В. cepacia 25416, по ходу мацерации отмечалась коричневая пигментация зоны поражения. Е. coli К-12. служила отрицательным контролем.

Основным требованием при разработке схем и ключей при идентификации бактерий является отбор простых и воспроизводимых тестов, которые при своей постановке с культурами данного вида проявляют в > 90 % случаев положительный или отрицательный результат. Дополнительными тестами при первичной идентификации культур В. cepacia могут служить иммунологические реакции при наличии видоспецифической сыворотки (РДД, МФА), а также постановка теста на антибиотикочувствительность с полимиксином В и аминогликозидами (гентамицин), к которым В. cepacia как и другие буркхольдерии в отличие от псевдомонад является резистентной.

При идентификации буркхольдерии по системе Nefermtest 24 было исследовано 28 штаммов. Учет проводился по цветным реакциям, характер которых определен стандартами в соответствии с рисунками, прилагаемыми фирмой'к набору тест-системы. Полученные нами данные показывают, что в данной тест-системе вариабельные результаты на тестах, которые при стандартных исследованиях были стабильными. Особенно принципиальными были расхождения в оценке декарбоксилаз и денитрификации. Причем процент таких ошибок достаточно высок, а вероятность точности диагнос-

тики даже для референтных штаммов, в свою очередь, низкая. Также идентификацию бактерий проводили с помощью системы API 20 NE. Принцип оценки этим методом заключается в определении кода по 21 качественному признаку, последние сгруппированы в 7 групп. Учитывая, что В. cepacia обладает широким спектром ассимилируемых субстратов, а в этой системе идентификации, начиная с 3-й триады, оценивается спектр усвоения различных карбо-гидратов, становится понятным, что для В.cepacia идентификационный код характерен в своей заключительной части формулы высокими цифровыми показателями типа ХХ77777. Из 15 исследованных штаммов В. cepacia - 12 с вероятностью от 95,2 % до 99,9 % по определителю относятся к виду В. cepacia, три штамма (320, 5809 и 5812) не являются представителями этого вида. Все они исключались из вида В. cepacia как при постановке тестов в соответствии с идентификационным ключом, так и при иммунологических исследованиях.

«Золотым» стандартом в окончательной идентификации культур В. cepacia являются только генотипические методы: ДНК-зонды и ПЦР-диагностика. Получение видо- и геномоспецифических прайме-ров, как и постановка экспериментов с ПЦР, проведены на базе лаборатории молекулярной биологии совместно с к.м.н., доцентом В.А.Антоновым.

Исследованные 28 штаммов, фенотипически признанные раньше, как культуры В. cepacia или В. gladioli, в ПЦР-тестах с видовыми праймерами четко разграничились на 2 группы, соответствующие результатам, ранее полученными в опытах с МФА. 18 штаммов В. cepacia соответствовали, как по фенотипическим, так и по генотипи-ческим свойствам виду В. cepacia (табл. 3).

Таблица 3

ПЦР-диагностика штаммов В. cepacia

№ п/п Штаммы ПЦР идентификация Вид по Фенотипу МФА с Ig В. cepacia

вид геномовар

1 В. cepacia 25416 + I В. cepacia +

2 В. cepacia 3181 + I В. cepacia . +

3 В. cepacia 3189 + I В. cepacia +

4 В. cepacia 122 + I В. cepacia +

5 В. cepacia 610 + I В. cepacia +

6 В. cepacia 611 + I В. cepacia +

7 В. cepacia 620 + I В. cepacia +

8 В. cepacia 621 + I В. cepacia +

9 В. cepacia 1934 + II В. cepacia +

10 В. cepacia 8236 + III В. cepacia +

11 В. cepacia 8237 + III В. cepacia +

12 В. cepacia 8238 + III В. cepacia +

13 В. cepacia 8240 + III В. cepacia +

14 В. cepacia 506 + III В. cepacia +

15 В. cepacia 323 + III В. cepacia +

16 В. cepacia 423 + III В. cepacia +

17 В. cepacia 370 + III В. cepacia +

18 В. cepacia 8235 + IV В. cepacia +

19 В. cepacia 8239 - - не определен -

20 В. cepacia 320 - - не определен -

21 В. cepacia 5809 - - Р. aeruginosa -

22 В. cepacia 5810 - - P. putida -

23 В. cepacia 5811 - - Р. aeruginosa -

24 В. cepacia 5812 - - Р. aeruginosa -

25 В. cepacia 5813 - - P. putida -

26 В. gladioli 1298 - - P. putida -

27 В. gladioli 8494 - - В. cepacia -

28 В. gladioli 8495 - S. maltophilia j -

Показано, что использование стандартных микробиологических фе-нотипических методов не позволяет идентифицировать более 10 % культур В. cepacia, как в сторону гипердиагностики, так и гиподиагности-ки. Более того, разработанные современные генотипические методы также не обеспечивают 100 % гарантию видовой и внутривидовой таксономической дифференциации штаммов В. cepacia.

Единственно достоверным методом идентификации вида В. cepacia в настоящее время является полифазная таксономия, предусматривающая комплексное исследование изучаемых культур (Vandamme, 2001; Hendiy et al, 2000). На основании проведенных исследований с использованием фенотипических, иммунологических и генетических методов нами разработана схема идентификации бур-кхольдерий (рисунок 1). Окончательный комплексный уровень идентификации предусматривает как генотипические исследования, так и изучение фенотипических биохимических свойств, белковый профиль клеточных структур, состав жирных кислот. Все это, в конечном счете, позволяет не только исключить гипердиагностику за счет близкородственных В. cepacia-like видов, но и разграничить культуры В. cepacia на геномовары, что важно для оценки эпидемиологической значимости отдельных штаммов.

В наших условиях, как впрочем, и в других научно-исследовательских учреждениях полифазность исследований обеспечивается сочетанием генотипических и фенотипических методов. В зависимости от цели исследований и условий идентификации алгоритм первых этапов может существенно отличаться. При нацеленном поиске изучаемая культура, уже на первом этапе выросшая на селективной среде или присланная для окончательной идентификации, может исследоваться как в ПЦР, так и в МФА, методами, не требующими в принципе наличия «чистой» культуры.

Принципиально при наличии обоих положительных результатов в генетическом и иммунологическом тесте можно с высокой степенью вероятности идентифицировать культуру, как В. cepacia, и ставить пробы на выяснение чувствительности к антибиотикам в случае, если имеем дело с культурами из клинического материала.

Исследуемый

материал

(бактериология)

пцр

РДД ПЦР

МПГА ТС ГА

МПГА (ТСГА)

\ 1 \

РДД ПЦР

Биопроба Золотистые хомячки Белые мыши

Определение устойчивости к антибиотикам: полимиксин, гентамицин

•о/ф глюкозы

•оксидаза

•подвижность

•агд-ди гидролаза

■Муэ-декарбоксилаза

•гидролиз желатина

•О^С

■рост при 42°С •ассимиляция на МСЖ Ьарабинозы и р-аланина

Рисунок 1. Схема этапов идентификации буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике

Примечание: постановка, оценка реакций и расшифровка сокращений по тексту.

При обычных исследованиях бактериологическим путем высев производится на обычную (ТСА или МПА) или селективную среду. В случае выделения «чистой» культуры на этих средах проводят дальнейшую идентификацию по обычным стандартным рекомендациям для культур ГНФ [24,34,89,114]. Для ориентировочной идентификации В. cepacia принципиальное значение имеют следующие признаки: грам (-) палочка, подвижная, окисление/ферментация глюкозы (+/-), оксидаза (+), аргининдигидролаза (-), лизиндекарбоксилаза (+), (3-галактозидаза (+), ДНК-аза (-). Видовая устойчивость к полимик-сину и аминогликозидам в принципе проверяется еще на этапе отбора на селективных средах. Дополнительно исследуют еще ряд феноти-пических признаков, варьирующих в своем проявлении у вида В. cepacia, но стабильно сохраняющихся у отдельных штаммов. К ним относятся - денитрификация, орнитиндекарбоксилаза, гидролиз эскулина, разжижение желатина и способность расти при 42°С и на средах с 2,5 % NaCl. Мозаика проявлений этих 6 признаков фенотипа с успехом может быть эпидемиологическим маркером культур, в определенной мере компенсируя невозможность постановки сложных генотипических методов инфравидового типирования культур В. cepacia.

ВЫВОДЫ

1. На основании исследования фенотипических свойств 25 музейных штаммов В. cepacia, установлен набор стабильных и вариабельных признаков для данного вида микроорганизма; на основании стабильных признаков разработана схема для практической, ориентировочной идентификации культур В. cepacia.

2. Определены уровни чувствительности штаммов В. cepacia к 18 химиотерапевтическим препаратам, показана перспективность использования для лечения карбапенемов, хинолонов и ко-тримаксазо-ла. Для разработки селективных сред можно использовать сочетание полимиксинаВ, гентамицина и ванкомицина, к которым все культуры В. cepacia высоко резистентны.

3. Патогенность культур В. cepacia на лабораторных животных не коррелирует с фитопатогенностью; при оценке вирулентности штаммов В. cepacia, выделенных из внешней среды и клинического материала, чувствительность животных к инфекции повышается при введении имму-ноблокаторов - актиномицина Д или четыреххлористого углерода.

4. Иммунологические методы (РДЦ, МФА) показали перспективность их использования на этапах предварительной оценки, при этом показано, что в РДД происходит гипердиагностика за счет наличия у близкородственных буркхольдерий общих антигенов, а МФА высокоспецифичен, нами не отмечены случаи гипер- или гиподиагностики.

5. Использование для постановки ПЦР праймеров на основе ДНК гесА гена В. cepacia позволили определять как видовую принадлежность исследуемых культур, так и их инфравидовую характеристику -геномовар.

6. Установлена способность штаммов В. cepacia к фаго- и бакте-риоцинопродукции, имеющаяся коллекция штаммов разграничена на группы по их способности быть продуцентами или индикаторами, тем самым являясь механизмом типирования культур этого вида.

7. Учитывая принципы полифазной таксономии, нам удалось выявить набор биохимических, иммунологических и генетических методов, который обеспечил разработку схемы идентификации культур В. cepacia с установлением не только видовой принадлежности, но и определение геномо- и биоваров исследуемых штаммов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для идентификации культур, подозрительных на принадлежность к патогенным видам Burkholderia необходимо наряду с обязательными биохимическими тестами (декарбоксилазы, Р-галактоза, окисление Сахаров и оценка способности усваивать пентозы) проводить иммунологические исследования (РДД, МФА).

2. При эпидемиологическом анализе нозокомиальных вспышек инфекции В.cepacia в качестве эпидемиологического маркирования нужно применять метод ПЦР для разграничения культур на геномовары.

3. В программу курсов отдела подготовки специалистов по особо опасным инфекциям рекомендуем ввести лекционно-практический раздел по принципам полифазной таксономии буркхольдерий, позволяющий на современном уровне устанавливать как видовую принадлежность, так и проводить инфравидовое разграничение исследуемых культур буркхольдерий.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Андропова, Н.В. Физико-химические факторы, влияющие на результаты оценки чувствительности буркхольдериЙ к антибиотикам / Н.В. Андропова, А.Д. Лобойко // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Мат. научно-практ. конф. Ставрополь, 2007. -С. 21 -22.

2. Калинкина, Е.В. Применение модели простейших для определения вирулентности штаммов патогенных Burkholderia с множественной резистентностью к антибиотикам / Е.В. Калинкина, И.К. Сеимо-ва, O.A. Меринова, Н.П. Агеева, Д.В. Викторов, А.Д. Лобойко, Л.К. Меринова // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Мат. VIII Межгосуд. научно-практ. конф. госуд.-участн. СНГ. - Саратов, 2007. - С. 212 - 214.

3. Лобойко, А.Д. Чувствительность патогенных видов буркхольдериЙ к антибактериальным препаратам / А.Д. Лобойко // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Мат. VIII Межгос. научно-практ. конф. государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 239 - 240.

4. Сенина, Т.В. Методы выявления и определения специфичности бактериоцинов буркхольдериЙ / Т.В. Сенина, А.Д. Лобойко // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Мат. VIII Межгос. научно-практ. конф. государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 287 - 288.

5. Антонов, В.А. Фенотипическая и генотипическая идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia / В.А. Антонов, В.И. Илюхин, Т.В. Сенина, А.Д. Лобойко, Г.А. Ткаченко, О.В. Зин-ченко, И.Ю. Мазурова// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2008. - № 4. - С. 78 - 82.

6. Сенина, Т.В. Алгоритм идентификации Burkholderia cepacia / Т.В. Сенина, А.Д. Лобойко, Е.В. Калинкина // Вестник Российской Военно-медицинской академии. -2008. - № 2 (22). - Приложение (ч. I). - С. 201 - 202.

7. Сенина, Т.В. Принципы и схема идентификации буркхольдерий, имеющих значение для медицинской практики / Т.В. Сенина, А.Д. Лобойко // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ: Мат. IX Межгос. научно-практ. конференции государств-участников СНГ. - Волгоград, 2008. - С. 276 -277.

8. Патент №2339690 РФ Штамм бактерий Burkholderia cepacia -авирулентный продуцент бактериофага, лизирующего возбудителя сапа / И.К. Сеимова, В.И. Илюхин, JI.K. Меринова, Т.В. Сенина, Е.В. Калинкина, А.Д. Лобойко, Н.В. Андропова, В .Я. Курилов. -№ 2007126293/13; заявл. 10.07.07; опубл. 27.11.08, Бюл. № 33.

ЛОБОЙКО Алексей Давидович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ПРИН1ЩПЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ КУЛЬТУР ГРУППЫ BURKHOLDERM CEPACIA

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 12.11.2009 г. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Усл.-печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 178.

Волгоградский государственный медицинский университет 400131, Волгоград, площадь Павших борцов, 1.

Издательство ВолГМУ 400006, Волгоград, ул. Дзержинского, 45.