Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства бактериофагов Serratia Marcescens и разработка научных основ технологии получения препарата бактериофагов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Усманова, Светлана Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1.РОЛЬ БАКТЕРИЙ РОДА SERRATIA В ЭТИОЛОГИИ ГНОЙНО

СЕПТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ . И

ГЛАВА 2. СПОСОБЫ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ

ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

ГЛАВА 3.НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ПРОИЗВОДСТВА ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИОФАГОВ.

3.1. Способы и условия культивирования

3.2. Влияние фазы развития бактериальной популяции

3.3. Концентрация бактериальных клеток и биологические свойства фагов

3.4. Концентрация субстрата

3,4.1.Влияние источников азота

3.4.2.Влияние глюкозы

3.5. Влияние растворенного в среде кислорода

3.6. Способы очистки препаратов бактериофагов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 5.СЕЛЕКЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ВИРУЛЕНТНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ SERRATIA . .'.

ГЛАВА 6.ИЗУЧЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ И РАЗРАБОТКА УПРАВЛЯЕМЫХ ПО БИОЛОГИЧЕСКИМ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМ ПАРАМЕТРАМ

ПРОЦЕССОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ БИОМАССЫ БАКТЕРИОФАГОВ SERRATIA

6.1. Влияние способа культивирования

6.2. Влияние концентрации бактериальных клеток

- 3

6.3. Влияние исходного содержания в питательной среде глюкозы

6.4. Влияние содержания аминного азота в питательной среде

6.5. Влияние растворенного в культуральной среде кислорода

ГЛАВА 7.РАЗРАБОТКА СПОСОБА ОЧИСТКИ ПРЕПАРАТА БАКТЕРИОФАГОВ

SERRATIA С ЦЕЛЬЮ СНИЖЕНИЯ ЕГО РЕАКТОГЕННОСТИ

7.1. Разработка способа очистки препарата

7.2. Сравнительное изучение токсических свойств очищенного и неочищенного препарата бактериофагов Serratia

7.2.1.Острая токсичность

7.2.2.Хроническая токсичность

7.2.3.Терапевтическая доза препарата (0,3 мл/кг)

7.2.4. 10-кратная доза препарата (3 мл/кг)

ГЛАВА 8.ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА В ОПТИМИЗИРОВАННОМ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОМ

РЕЖИМЕ И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Усманова, Светлана Сергеевна

- 126 -ВЫВОДЫ

1. Впервые селекционированы вирулентные бактериофаги S.marcescens для создания основы препарата бактериофагов, активного в отношении клиничесрх штаммов гомологичных бактерий.

2. Изучены биологические свойства бактериофагов S.marcescens и установлено, что константа скорости их адсорбции на бактериальных клетках варьирует в пределах 3,96 - 13,09 х Ю-9 мл/мин, степень адсорбции составляет 75, 7-99,4 %; длительность латентного периода внутриклеточного размножения 16,8-35,2 минуты; урожайность 15,9-89,0 фаг.част./бакт.кл.

3. Установлено преимущество использования способа периодического динамического гомогенного глубинного культивирования на экспоненциально размножающейся бактериальной популяции при получении биомассы бактериофагов Serratia. Определены оптимальные значения лимитирующих рост биомассы фагов факторов: концентрация бактериальных клеток (LgX) в пределах 9,17±0,06; степень аэрации культуральной среды 75±5 %; содержание в питательной среде амин-ного азота 60±7 мг%.

4. Разработан эффективный способ очистки препарата бактериофагов Serratia с использованием методов мембранного разделения - микро- и ультрафильтрации. Степень очистки препарата 92,4±1,6%.

5. Впервые получен лечебный препарат бактериофагов Serratia, нетоксичный при парентеральном введении и обладающий антибактериальной активностью в отношении 76,4-84,9 % клинических штаммов бактерий S.marcescens.

- 127

- 115 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее время возросла частота выделения бактерий Serratia marcescens из различного клинического материала при многих патологических процессах у больных. В настоящий период участились случаи гнойно - септических заболеваний, вызванных бактериями Serratia marcescens, у новорожденных в родильных домах. Повышается удельный вес внутрибольничных инфекций, обусловленных этим возбудителем.

Выделяемые штаммы бактерий S.marcescens характеризуются высокой антибиотикорезистентностью, что ставит перед клиницистами трудную задачу выбора способа лечения при подобных заболеваниях. С этой целью в настоящее время широко используются новые антибиотики, сульфаниламиды и другие химикотерапевтические средства. Однако по мере внедрения новых препаратов растет и лекарственная устойчивость возбудителей к ним, а так же токсические и аллергические реакции на их применение.

Несмотря на неэффективность антибиотиков и существующие противопоказания к их применению, лечебные препараты бактериофагов Serratia до настоящего времени разработаны не были. В связи с изложенным представляется перспективной возможность получения бактериофагов Serratia для лечения гнойно-септических и энтераль-ных заболеваний, вызванных представителями рода Serratia.

Цель настоящего исследования - селекция и изучение биологических свойств вирулентных' бактериофагов Serratia marcescens, разработка оптимальных режимов культивирования и очистки при получении препарата бактериофагов Serratia marcescens.

В соответствии с поставленной целью впервые создан препарат бактериофагов Serratia на основе селекционированных и изучен

- 116 ных нами вирулентных фагов, активных в отношении бактерий Serratia marcescens.

Изучены биологические свойства клонов бактериофагов S.marcescens. Установлено, что константа скорости адсорбции фагов на бактериальных клетках варьирует в пределах 3,96 - 13,09 х 10"9 мл/мин. Степень адсорбции бактериофагов S.marcescens на бактериальных клетках составляет 75,7-99,4 %, длительность латентного периода внутриклеточного размножения 16,8-35,2 минуты, урожайность 15,9-89,0 фаг. част./бакт. кл.

В результате изучения спектра антибактериальной активности полученных маточных рас фагов установлено, что бактериофаги S.marcescens активны в отношении 78,3-85,0 % штаммов гомологичного вида бактерий.

В результате проведенных исследований разработан оптимальный технологический режим получения биомассы бактериофагов Serratia marcescens, предусматривающий использование способа периодического динамического гомогенного глубинного культивирования на экспоненциально размножающейся бактериальной популяции.

Изучены закономерности репродукции бактериофагов Serratia в условиях управляемых по биологическим и физико - химическим параметрам процессов культивирования при получении биомассы бактериофагов, составляющих основу препарата.

Экспериментально установлено, что на выход биомассы бактериофагов S.marcescens (LgPmax) влияет концентрация бактериальных клеток (lgX) в культуральной среде в момент добавления фага.

Обнаружено наличие сильно выраженных корреляций (коэффициенты корреляции близки 1) выхода биомассы фагов (LgPmax) и концентрации экспоненциально размножающейся популяции бактерий -продуцентов бактериофагов (LgX).

- 117

Зависимость выхода биомассы фагов (LgPmax) от концентрации экспоненциально размножающейся популяции бактерий - продуцентов бактериофагов (LgX) представляет собой экстремальную кривую второго порядка. При этом выход фага возрастает при увеличении концентрации бактериальных клеток (lgX) от 8,49±0,04 до 9,17±0,06 (прямая корреляция lgPmax-lgX, г=0,923; Р<0,001). Дальнейшее увеличение концентрации бактериальных клеток в момент заражения фагом (lgX) - до 9,61+0,03 приводит к снижению выхода фага (обратная корреляция IgPmax-lgX, г=-0,680; Р<0,05).

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что оптимальным при динамическом культивировании является использование бактериальной популяции в фазе экспоненциального роста при значениях концентрации бактериальных клеток - LgX в пределах 9,17±0,06, что позволяет получить статистически достоверно наибольший выход биомассы бактериофагов Serratia - LgPmax 9,66±0,02. Данной концентрации бактериальных клеток соответствовала максимальная удельная скорость роста бактериальной популяции (М) 1,93±0,13 ч-1 и минимальное время генерации бактерий (td) 0,36±0,03 ч.

Использование статистических методов обработки экспериментальных данных позволяет считать основным фактором, определяющим максимальный выход биомассы бактериофагов, концентрацию экспоненциально размножающихся бактериальных клеток в момент инфицирования фагом.

Установлено, что степень насыщения культуральной среды кислородом в значительной степени влияет на значения концентрации бактериальных клеток (LgX). 'Повышение содержания растворенного в среде кислорода от 3-5 % до 70-80 % сопровождалось статистически достоверным увеличением значений логарифма максимальной концент

- 118 рации бактериальных клеток от 9,25±0,05 до 9,63±0,02 (Р<0,05; Р<0,01; Р<0,001). Установлено наличие положительной сильно выраженной корреляционной связи между максимальной концентрацией бактериальных клеток и степенью насыщения среды кислородом (г=0,988; Р<0, 05).

Обнаружено наличие положительной сильно выраженной корреляционной связи между максимальным выходом фаговых частиц (LgPmax) и степенью насыщения среды кислородом (г=0,999; Р<0,001).

Наличие сильных прямых корреляционных зависимостей (коэффициенты корреляции близки 1) между максимальной концентрацией бактериальных клеток и степенью насыщения среды кислородом; максимальным выходом фага и степенью насыщения среды кислородом характеризует линейные связи, выражаемые уравнением линейной регрессии.

Таким образом, насыщение культуральной среды кислородом является одним из ведущих по степени значимости факторов, влияющих на выход биомассы бактериофагов Serratia.

Оптимальным для разрабатываемого режима культивирования биомассы бактериофагов является максимально достижимая интенсивность аэрации, обеспечивающая степень насыщения культуральной среды кислородом (Р02) - 75±5%.

Проведенные исследования показали, что изменение содержания в питательной среде глюкозы от 0, 5 до 5 мг/мл не оказывает статистически значимого влияния на процессы репродукции бактериофагов.

Корреляционной зависимости между изменением исходного содержания глюкозы в питательной среде от 0,5 мг/мл до 5 мг/мл и значениями Mmax; tdmin; LgXmax и LgPmax не обнаружено.

Установлено, что аминокислотный состав питательных сред

- 119 оказывает существенное влияние на характер роста бактерий - продуцентов фагов. Лимитирующим рост биомассы фагов фактором является содержание аминокислот - валина, тирозина и триптофана. Оптимальным при получении биомассы фагов является использование питательных сред на основе ферментативных гидролизатов. Культивирование на этих средах позволило получить максимальные значения LgX в фазе их экспоненциального роста (Р<0,01); удельной скорости роста бактерий - М (Р<0,05), минимальные значения времени генерации бактериальной популяции td (Р<0, 01) и максимальный выход биомассы фагов Serratia - LgPMax (Р<0,001).

Культивирование в среде с концентрацией аминного азота 20 мг% приводило к статистически значимому уменьшению значений параметров экспоненциального роста бактериальной популяции. При этой концентрации наблюдались самые низкие значения максимальной концентрации бактериальных клеток (lgXmax) -9,40±0,03 (Р<0, 05; Р<0,01); максимальной удельной скорости роста (Мтах) -1,38±0,07 ч-1 (Р<0, 05) и, соответственно, самое высокое значение минимального времени генерации бактериальной популяции (tdmin) -О,50±0,02 ч (Р>0,05).

Использование питательных сред с содержанием аминного азота 20 мг% вызывало существеннеё снижение количества выхода фаговых частиц из одной инфицированной клетки до 15,60±3,78 фаг. част. /бакт.кл. (Р<0,05); значений максимального выхода фаговых частиц (LgPmax) до 9,20±0,05 (Р<0,001) и увеличение длительности латентного периода 'внутриклеточного развития фага до 24,2±1,2 мин. (Р>0, 05; Р<0, 05).

Увеличение концентрации аминного азота в питательных средах от 20 мг% до 60 мг% и выше привело к статистически значимому повышению значений максимальной концентрации бактериальных клеток

- 120

LgXmax) (P<0,05; P<0,01), максимальной удельной скорости роста (Mmax) (Р<0,05; Р<0,01) и выхода биомассы бактериофагов (LgPmax) (Р<0,001). Тем не менее, экспериментальные данные показали, что изменение содержания аминного азота в диапазоне 60 - 200 мг% не приводит к статистически значимым изменениям значений максимальной концентрации бактериальных клеток, максимальной удельной скорости роста, минимального времени генерации бактериальной популяции, а также длительности латентного периода, урожайности и выхода фага (Р>0,05).

Сравнительный анализ полученных результатов позволяет сделать вывод, что оптимальным для культивирования бактерий и получения биомассы бактериофагов Serratia является использование питательных сред с содержанием аминного азота не менее 60 мг%, поскольку увеличение концентрации аминного азота до 200 мг% не оказывает выраженного влияния на процессы репродукции и увеличение конечного выхода биомассы бактериофагов.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлены закономерности управляемых по биологическим и физико-химическим параметрам процессов культивирования бактериальной и фаговой популяций серраций. Определены уровень влияния и оптимальные значения факторов, влияющих на увеличение биомассы бактериофагов.

Для разделения микробной и фаговой популяции фаголизатов бактерий Serratia использовали разработанный способ, предусматривающий каскадную проточную микрофильтрацию фаголизатов через фильтр-картон и мембраны с размером пор 0,2 и 0,7 мкм, позволяющий получить выход биомассы бактериофагов S. marcescens 84,7+8, 3 % при обеспечении стерильности продукта фильтрации.

С целью снижения реактогенности препарата бактериофагов

- 121

Serratia, предназначенного для парентерального введения, был разработан способ очистки, предусматривающий ультрафильтрацию в режимах тангенциального потока на мембранах с порогом задержания веществ - 150-200 Kd и последующую проточную стерилизующую микрофильтрацию через мембраны с размером пор 0,2 мкм.

Разработанный способ ультрафильтрации в тангенциальном потоке позволяет получить высокую степень очистки по белку, которая достигает 92,4+1,6 %. Выход биомассы фагов при ультрафильтрации составил 92,7±2,5 %, после стерилизующей микрофильтрации 78, 4±7, 2 %.

Хроматографическое изучение фаголизатов бактерий Serratia на различных этапах очистки проводилось методом жидкостной хроматографии на Суперозе-12. Установлено, что питательная среда и фа-голизаты содержали белковые компоненты с молекулярной массой до 50 Kd. В процессе очистки наблюдалось их равномерное удаление.

Таким образом, определены оптимальные значения параметров, способствующие повышению производительности и эффективности процессов получения биомассы бактериофагов Serratia.

Разработанный нами оптимальный режим получения бактериофагов Serratia предусматривает использование способа периодического динамического гомогенного глубинного культивирования на экспоненциально размножающейся бактериальной популяции при значениях концентрации бактериальных клеток - LgX в пределах 9,17±0,06; в условиях 75±5 % насыщения культуральной среды кислородом; при содержании аминного азота 60±74мг%; с последующей микрофильтрацией фаголизатов через фильтр-картон и мембраны с размером пор 0,7-0,2 мкм и очисткой способом ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с порогом задержания веществ 150-200 kD.

В соответствии с разработанными оптимальными технологическими режимами культивирования и очистки получены три экспериментальные серии препарата бактериофагов Serratia очищенного жидкого, которые успешно прошли доклиническое изучение безвредности и реактогенности в экспериментах острой и хронической токсичности в сравнении с неочищенными вариантами препарата.

При внутрибрюшинном введении очищенный и неочищенный варианты препарата не вызывали гибели животных и падения массы тела.

При микроскопическом изучении внутренних органов через 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения неочищенной формы бактериофага серраций в дозе 1 мл на животное обнаружены гемодинамические нарушения в легких, печени и почках, выражающиеся в виде эритростаза сосудов межальвеолярных перегородок, артерий портальных трактов и полнокровия мозгового вещества почки. В паренхиме печени отмечается умеренно выраженная зернистая дистрофия печеночных клеток и увеличение количества безьядерных форм гепатоцитов. В почках патологический процесс характеризуется деструкцией единичных капиллярных клубочков и некробиозом клеток канальцевого эпителия. В легких отмечены очаги отека межальвеолярных перегородок и расширение просветов мелких и крупных бронхов. В селезенке довольно четко выражен процесс гиперплазии белой пульпы. На 7-е сутки выраженность гемодинамических нарушений значительно ослабевает: в легких венозный застой имеет очаговый характер, в почках сосуды мозгового слоя практически нормализуются, в печени просветы артерий портальных трактов заметно "разгружаются" от эритроцитов. Некробиотические процессы в паренхиме органов либо слабо выражены, либо отсутствуют вообще. В других внутренних органах после введения неочищенной формы препарата нарушений не выявлено.

При однократном введении очищенных вариантов препарата бак

- 123 териофагов Serratia гемодинамические нарушения в легких, печени и почках выражены значительно слабее по сравнению с неочищенным препаратом. Некротические, некробиотические и гиперплазические процессы носят единичный характер и не являются достоверными, так как встречаются и в контрольной группе. Через 7 суток состояние органов практически нормализуется.

На основании проведенных экспериментов, можно сделать следующие выводы, что при введении высоких доз неочищенного препарата бактериофагов серраций развиваются выраженные гемодинамические и некробиотические нарушения в легких, печени и почках. Нарушенные явления заметно ослабевают на 7-е сутки после введения препарата.

Однократное введение высокой дозы очищенных серий препарата способно вызвать обратимые слабо выраженные нарушения микроциркуляции во внутренних органах, которые практически нормализуются на 7-е сутки.

Гистологическое изучение внутренних органов после хронического воздействия неочищенного препарата бактериофага серраций в терапевтической дозе (0,3 мл/кг) показало, что органами мишенями являются легкие, печень й почки. В легких развиваются гемодинамические нарушения, характеризующиеся венозным застоем межальвеолярных перегородок и сужением просветов бронхов. В почках выявляется полнокровие сосудов мозгового слоя и некробиотические процессы канальцевого эпителия в виде пикноза ядер и набухания цитоплазмы. В печени отмечен'эритростаз центральных вен, слабовы-раженная зернистая дистрофия гепатоцитов и гиперплазия купферовс-ких клеток. На 7-е сутки после прекращения воздействия выраженность изменений значительно ослабевает.

В опытах по оценке хронической токсичности очищенного пре

- 124 парата бактериофагов серраций морфологических изменений во внутренних органах подопытных животных по сравнению с контролем не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии токсических свойств у исследуемого препарата при использовании его в терапевтической дозе (0, 3 мл/кг).

При изучении спектра литической активности по Аппельману экспериментальных серий препарата бактериофагов Serratia очищенного жидкого обнаружено, что все три серии обладали широким диапазоном и высокой степенью литической активности в отношении бактерий S.marcescens. Препарат бактериофагов серраций проявлял антибактериальную активность в отношении 76,4-84,9 % штаммов S.marcescens.

Проведенные исследования обнаружили высокую антибиотикоре-зистентность выделенных от больных клинических штаммов Serratia marcescens. Чувствительность их в отношении олеандомицина, бен-зилпенициллина, ристомицина, 'ампициллина достигала - 0-5%; карбе-нициллина, линкомицина, эритромицина, рифампицина, оксациллина -8,3-25%; левомицитина, стрептомицина, тетрациклина, неомицина -33,3-50%; канамицина, полимиксина - 66,7-75%; гентамицина 81,7%. В результате сравнительного изучения антибактериальной активности препарата бактериофагов Serratia и выше перечисленных антибиотиков установлено, что препарат активен в отношении анти-биотикорезистентных штаммов бактерий, равен по широте спектра антибактериальной активности гентамицину, канамицину, полимиксину и превосходит по активности остальные из вышеуказанных антибиотиков.

Экспериментальные серии препарата бактериофагов Serratia очищенного жидкого сохраняли свою специфическую литическую активность при температуре хранения 6±2 С в течение 2 лет.

Экспериментальные серии препарата прошли контроль в Отделе биологического контроля ГУП "Иммунопрепарат" и лаборатории бактериофагов ГИСК им.JI.А.Тарасевича с положительным результатом.

Препарат разрешен Комитетом МИБП Министерства Здравоохранения Российской Федерации для проведения клинических испытаний.

Результаты выполненных исследований использованы при подготовке и составлении Инструкции по изготовлению и контролю препарата бактериофагов Serratia поливалентного очищенного жидкого, утвержденной Ученым Советом Уфимского НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова ГУП "Иммунопрепарат" (протокол N 1 от 27.05.98) и Программы клинических испытаний препарата бактериофагов Serratia поливалентного очищенного жидкого для оценки реактоген-ности, безопасности и терапевтической эффективности, утвержденной Комитетом МИБП МЗ РФ (протокол N 6 от 24.06.99 г.); Инструкции по применению препарата (направлена в Фармакопейный комитет РФ на утверждение); проекта ВФС на препарат, рассмотренного Ученым Советом Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова (протокол N 1 от 27.05.98 г.) и направленного в Фармакопейный комитет РФ на утверждение.

Новизна проведенных исследований подтверждена приоритетной справкой от 20.01.99 г. на заявку N 99101604 "Способ получения пиобактериофага поливалентного", предусматривающий введение в состав пиобактериофага нового компонента - бактериофага Serratia marcescens.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Усманова, Светлана Сергеевна, Уфа

1. Абрикосова Н.Ю., Костюкова Н.Н. Эпидемиология неонатальных менингитов // Ж.микробиологии. -1991. -N 3. -С.41-44 Адаме М. Бактериофаги. М.: Иностранная литература, 1961.

2. Адарченко А.А., Красильников А.П., Собещук О.П. Оценка чувствительности к антисептическим препаратам клинических штаммов микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae // Ж. микробиологии. 1990. - N 1. - С.23-28

3. Алферова Э.В. Биологические свойства бактериофагов Enterobacter и разработка научных основ технологии получения препарата бактериофагов: Автореф. дис. канд. биолог, наук. Уфа, 1995. - 30 с.

4. Антипенко В.П., Куницкая С.А., Рудницкая Л.С. Энтеробактерии и Pseudomonas aeruginosa в этиологии хронических заболеваний легких и плевры // Микробиология. 1990. - N 9. - С.24-27

5. Ахтамов М.А. Нормальная микрофлора кишечника, ее физиологическое значение и роль в развитии кишечных заболеваний: Сб. Дизентерия и острые кишечные заболевания. Ташкент, 1980. - С.9-15

6. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами: Сб. Микробиологические аспекты иммунобиотехнологии. М., 1992. - С.3-10

7. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М.: Медицина, 1992. - 192 с.

8. Баснакьян И.А. Экспериментально-аналитическое исследование жизнедеятельности Salmonella typhi при непрерывном культивировании: Автореф. дис. д-ра. биол. наук. М., 1974. - 55 с.

9. Баснакьян И.А., Боровкова В. М., Запорожцев Л.Н. Классификация процессов культивирования микроорганизмов: Сб. Процессы культивирования патогенных микроорганизмов. М., 1981. - С.5-17

10. Баснакьян И.А., Запорожцев Л.Н., Артемьева Т.А., Мельникова В.А. Вакцины для профилактики и лечения кишечных бактериальных инфекций. М., 1976. - С.124-127

11. Баснакьян И.А., Шафоростова Л.Д., Боровкова В.М. Пути оптимизации получения вторичных экзометаболитов и перспективы использования непрерывного культивирования: Сб. Теория и практика непрерывного культивирования микроорганизмов. М., 1980. - С.20-35

12. Байрамова А.С., БатуроА.П., Мурадова Э.К., Юсова Г.А., Агаева P.A. //МЭИ. 1991. - N 12. - С. 80

13. Белобородова Н.В. Стратегия и тактика антибактериальной терапии на основе системы микробиологического мониторинга: Автореф. дис. докт. мед. наук. 1996. - 256 с.

14. Белобородова Н.В., Бирюков А. В. Роцефин (цефтриаксон) в неона-тологии //Русский медицинский журнал. 1997. - Том V. - N 21

15. Белоусов Ю.Б., Моисеев B.C., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия. М. : Универсум., 1993. - С. 280-293

16. Боговазова Г.Г. Изучение биологических свойств и терапевтической эффективности препаратов бактериофагов Klebsiella: Автореф. дис. канд. мед. наук. Челябинск, 1993. - 28 с.

17. Боговазова Г.Г., Ворошилова H.H., Бондаренко В.М. Изучение эффективности препарата бактериофага Klebsiella pneumoniae при терапии генерализованных форм экспериментальной клебсиеллезной инфекции // Ж. микробиологии. -1991. -N 4. -С.5-8

18. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условно-патогенных бактериях: Материалы VII съезда ВОЭМП. М., 1997. -Т.1. - С. 180-183

19. Вилкова В.Ф., Габрилович А.Б. Некоторые свойства дизентерийного бактериофага, полученного в условиях аэрации // Сан. -гигиенические исследования, кишечные инфекции, лептоспироз. Ростов-на-Дону, 1956. - Т.21. - С.166-171

20. Вискова P.C. Концентрация и очистка дизентерийных бактериофагов Ньюкасл и их физико-химические свойства: Автореф. дис. к-та биол. наук. М., 1978

21. Влодавец В.В. К механизму распространения внутрибольничных инфекций //Ж. микробиологии. -1981. -N 7. -С.3-8

22. Волкова Н.В. Физиологические аспекты повышения продуктивности процесса культивирования: Сб. Вакцины и сыворотки. Материалы по производству. -М., 1983. -Вып. 20. -С.122-168

23. Воропаева С.Д. Микрофлора женских половых путей и ее чувствительность к антибактериальным препаратам //Антибиотики и химиотерапия. 1999. - Т.44. - N3 - С.42-45

24. Ворошилова H.H. Научные основы и разработка технологий производства препаратов бактериофагов Shigella и Klebsiella: Автореф. дис. д-ра мед. наук. -М., 1992. -53 с.

25. Ворошилова Н.Н., Афанасьева Э.В., Баснакьян И. А. //Микробиология. -1995. -Т.64. -N4. -С.479-484

26. Габрилович А.Б., Вилкова В.Ф., Кочарьян О.Н. Влияние аэрации на размножение дизентерийного бактериофага. // Сан. -гигиенические исследования, кишечные инфекции, лептоспироз. Ростов-на-Дону, 1956. -Т.21. -С.159-165

27. Гайрабеков Р.Х. Характеристика фагов, активных против бактерий рода Serratia: Сб. Бактериофаги условно-патогенных микроорганизмов. Нальчик, 1990. - С.72-79

28. Галеев М.А., Мустафин Т. И. Современные аспекты лечения хирургических инфекций: Сб. Диагностика, профилактика и лечение гнойно-септических заболеваний лекарственными средствами, выпускаемыми НПО "Иммунопрепарат". -Уфа, 1993. -С.37-44

29. Гизатулина С.С., Биргер М.0., Колышкина H.A. Некоторые биологические свойства энтеробактерий, выделенных от больных с диареями //Ж. микробиологии. -1989. -N4 . -С.30-34

30. Головлев Е.Л. Метоболическое лимитирование процессов микробиологического синтеза: Тезисы• докладов IV Всесоюзной конференции "Управляемое культивирование микроорганизмов" Пущино, 1986.- С. 4-5

31. Далин М.В., Фиш Н.Г. Белковые токсины микробов. М.: Медицина, 1980. - 224 с.

32. Дубинина Г.П. Управляемое культивирование патогенных микроорганизмов // Ж. микробиологии. 1982. - N12. - С.40-44 Дытнерский Ю.И. Баромембранные процессы. - М.: Химия, 1986.272 с.

33. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М.: Медицина, 1985. - 240 с.

34. Еремин С.Р., Зуева Л.П., Ланцов A.A., Яфаев Р.Х. Эпидемиологические особенности госпитальных гнойно-септических инфекций в отоларингологических отделениях // Ж.микробиологии. -1992. -N 3.-С.36-39

35. Ермольева З.В., Вайсберг P.E. Бактериофаг//Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. М.: Медицина, 1964. - Т. 3. - C.6Ö6-619

36. Жданова Л.Г. Глубинное и непрерывное культивирование тифозных бактерий: Сб. Физико-химические исследования патогенных энтеро-бактерий в процессе культивирования. Иваново, 1974. - С.7-19

37. Ждан-Пушкина С.М. Основы роста культур микроорганизмов. Ленинград: из-во Ленинградского университета, 1983. - 187 с.

38. Жукова Э.В., Ризаева A.A., Чарыева Л.Н., Капитонова Ю.А., Бер-дыева М.Б. Частота и этиологическая структура внутрибольничных бактериальных кишечных инфекций в детском инфекционном стационаре // Ж. микробиологии. -1992. -N 5. -С.72

39. Запорожцев Л.Н. Критерии оценки эффективности процессов культивирования микроорганизмов: Сб. Вакцинно-сывороточное дело. Состояние и перспективы развития. М., 1979. - С.28-33

40. Запорожцев Л.Н., Баснакьян И.А., Боровкова В.М. К вопросу о классификации процессов культивирования микроорганизмов // Новости медицины и медицинской техники. Экспресс-информация. 1980. - N8. - С.1-39

41. Казакова Т.Б., Ворошилова H.H., Байгузина Ф.А., Баснакьян И.А. // Ж. микробиологии. -1988. -N И

42. Канцеров Р.Ю. К методике лечения острых кишечных инфекций саль-монеллезной этиологии у детей раннего возраста: Сб. Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционных болезней. М., 1992. -С. 17-18

43. Козлова Н.С., Гладин Д.М., Иванов В.П., Воскресенский A.M. Циркуляция антибиотикорезистентных штаммов энтеробактерий в Санкт-Петербурге и Ленинградской области: Материалы VII съезда ВОЭМП. М., 1997. - Т.2. - С.350-351- 136

44. Красовская Т.В., Кобзева Т.Н., Романова Л.А., ОльховаЕ.Б. Гангрена новорожденных// Педиатрия. -1988. -N 1. -С.55-58

45. Кроличенко Т.П. Содержание ДНК у кишечной палочки в различных условиях культивирования: Автореф. дис. канд. биол. наук. -М.,- 1981. 20 с.

46. Кроличенко Т.П., Лищенко H.H., Орлов В.Г. Хромосомы, рибосомы и клеточный цикл у бактерий: Тезисы докладов 7 съезда Всесоюзного микробиол. об-ва. Алма-Ата, 1985. - Т.З. - С.40

47. Крылов И.А., Алкина М.Ш. Распространение энтеробактерий в респираторном тракте человека при хронических заболеваниях ЛОР-органов // Ж. микробиологии. -1980. -N 12. -С.98-99

48. Кузнецова С.М., Позднякова В.П., Самойлова Л.И., Сперанская О.Н.: Сб. Актуальные проблемы нозокомиальных инфекций и лекарственной устойчивости микроорганизмов. Минск, 1986. С. 137-138

49. Кузнецова Т.Н. Оптимизация периодического процесса культивирования синегнойной палочки для получения экзотоксина А: Автореф. дис. канд. биол. наук. Уфа, 1991. - 28 с.

50. Лопаткин H.A., Деревянко И.И. Неосложненные и осложненные инфекции мочеполовых путей. Принципы антибактериальной тера-пии//Русский медицинский журнал. 1997. - T.V. - N 24

51. Лувсандагва Э., Алтанцэцэг Ж., Сувдаа М., Нортмаа М. Клини-ко-этиологическая характеристика кишечных расстройств у детей раннего возраста // Педиатрия. -1990. -N И. -С.40-43

52. Мартыненко Л.Д. Роль фимбриальных адгезинов I и III в развитии диарейного синдрома: Материалы VII съезда ВОЭМП. М., 1997. -Т.1. - С. 214-215

53. Мельникова В.А. Современные представления о физиологическом состоянии микроорганизмов и критериях его оценки: Сб. Микробиологические аспекты иммунобиотехнологии. М., 1992. - С.11-16- 138

54. Мельникова В.А., Перельман Е.В. Изучение влияния некоторых компонентов питательных сред на рост микроорганизмов в процессе культивирования: Сб. Процессы культивирования патогенных микроорганизмов. М., 1981. - С.128-131

55. Меньшиков Д.Д., Янискер Г.Я. Характеристика энтеробактерий, выделенных при гнойно-воспалительных процессах у больных с экстренной патологией // Ж.микробиологии. -1980. -N2. -С.69-73

56. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. М., 1969. -С.156-164.

57. Мнацаканов С.Т. Энтеротоксигенность условно-патогенных энтеробактерий при острых кишечных заболеваниях у детей // Ж. микробиологии. -1983. -N 6. -С.53-55

58. Навашин С.М., Сазыкин Ю.0. Антибиотики: новые механизмы передачи резистентности // Антибиотики и химиотерапия. 1998. - Т.43. - N 6. - С. 3-6

59. Назарук М.И., Криминская Н.Е., Сибирный В.А. // ЖМЭИ. 1980. -N 3. - С.29-34

60. Нигматуллин Т.Г. Особенности структуры ДНК и разработка технологии производства очищенных поливалентных препаратов кишечных бактериофагов: Автореф. дис. д-ра биол. наук. М, 1984. - 47 с.

61. Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине. Часть 1. Уфа: НПО "Иммунопепарат"» 1995. - С.164-170

62. Нигматулина П.Н., Бикбулатова А.Н. Нарушение микробной ассоциации при аллергических заболеваниях: Материалы VII съезда ВОЭМП. -М. 1997. - Т.1. - С.273-274

63. Нью Г.К. Внутренние болезни: Химиотерапия при инфекционных болезнях. М. : Мед., 1993. - Т. 3. - С. 78-115

64. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. - 536 с.

65. Падейская E.H. Дифторхинолон ломефлоксацин (Максаквин): место среди фторхинолонов, возможности и перспективы // Антибиотики и химиотерапия. 1999. -Т.43. - N 43 - С.4-9

66. Парр Г.С., Рожанская Т.Н. Ультрафильтрационные процессы выделения биологически активных веществ. М.: ЦБНТИ Медбиопрома, 1986.- Вып. 6. 32 с.

67. Перемитина Л.Д., Берилло Э.А., Григорьева Л.В. Применение бактериофагов у больных с послеоперационными осложнениями: Сб. Специфическая профилактика и лечение заболеваний, вызванных условно-патогенными бактериями. М., 1983. - С.155-157

68. Перемитина Л.Д., Берилло Э.А., Хволес А.Г. Опыт лечебного применения препаратов бактериофага при гнойно-хирургических инфекциях //Ж. микробиологии. 1981. - N 9. - С.109-110

69. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978. 336 с.

70. Покровский В.И. Проблемы внутрибольничных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни.' 1996. - N 2

71. Прозоровский C.B., Генчиков Л.А. Принципы борьбы с внутриболь-ничными инфекциями // Ж. микробиологии. 1984. - N 7. - С.21-26

72. Работнова И.Л. Лимитирование и ингибирование микробиологических процессов. Пущино, 1980. - С.3-21

73. Работнова И.Л. Об изучении физиологического состояния исследуемых организмов // Микробиология. 1980. - T.XLIX. - Вып.4. -С.634-638

74. Работнова И.Л., Баснакьян И.А., Боровкова В.М., Запорожцев Л. Н. Системы культивирования микроорганизмов // Известия АН СССР, серия биологическая. 1982. - N 4. - С.559-573

75. Работнова И.Л., Позмогова'И.Н., Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов // Итоги науки и техники, сер. Микробиология. -М. , 1981. Т. И. - С. 3-54

76. Свитцов A.A., Орлов Н.С., Кузнецов А.Е. Полупроницаемые мембраны в биотехнологии. Обзор информации. М. : ОНТИТЭИ микробиопром, 1987. - 40 с.

77. Семина H.A., Ковалева Е.П., Генчиков Л.А. Эпидемиология и профилактика внутрибольничных инфекций: Сб. Эпидемиология и инфекционная патология. -М., 1989. -С.105-112

78. Сидоренко C.B. Сравнительная активность In vitro ампициллина, цефоперазона, их комбинаций с сульбактамом, а также других антибиотиков в отношении аэробных грамотрицательных микроорганизмов //Антибиотики и химиотерапия. 1994. - N И. - С.10-20

79. Сидоренко C.B., Резван С.П., Грудинина С.А., Стерхова Г.В., Александрова И.А. Сравнительная активность меропенема и других антибиотиков в отношении возбудителей нозокомиальных инфекций // Антибиотики и химиотерапия. 1998. - Т.43. - N 1. - С.4-14

80. Сидоренко C.B., Яковлев C.B. Бета-лактамные антибиотики // Русский медицинский журнал. 1997. - Том V. - N 21

81. Сидорчук И.И. //Сб. Актуальные проблемы нозокомиальных инфекций и лекарственной устойчивости микроорганизмов. Минск, 1986.- С, 235

82. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.А. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотикс-в из бактерий рода Bacillus // Микробиол. Журнал. 1993. - Т.55. -N 4. - С. 92-112

83. Соловьева И.В., Беляева Е.И., Соколова К.Я., Федотова М.Н. Микрофлора влагалища женщин с неспецифическими кольпитами и ее коррекция биологическими препаратами: Сб. Медицинские аспекты микробной экологии. М., 1991. - С.191-197

84. Сологуб В.К., Колнер И.И., Гришина И.А., Панова Ю.М., Червен-ков И., Златанов 3., Караиванова Е., Выгленова Е. Клинико-бактериологические особенности грамотрицательной инфекции у обожженных // Клиническая медицина. -1985. -N 2. -С.113-118

85. Спивак С.И., Ворошилова H.H., Гареева Л.Р., Казакова Т.Б. Математическое моделирование и оптимизация процессов получения биомассы бактериофагов-энтеробактерий: Сб. Бактериофаги условно-патогенных микроорганизмов. Нальчик, 1990. - С.6-13

86. Станиславский Е.С. Иммунопрофилактика и иммунотерапия заболеваний, вызванных грамотрицательными бактериями // Ж. микробиологии. -1980. -N 12. -С.91-96

87. Иммунопрепарат". -Уфа, 1993. -С.25-26

88. Учайкин В.Ф. // Педиатрия. 1991. - N 3. - С.5 Фетисов Е.А., Чагаровский А.П. Мембранные и молекулярно-ситовые методы переработки молока. - М.: Агропромиздат, 1991. -267 с.

89. Фомина И.П. Современные аминогликозиды. Значение в инфекционной патологии, особенности действия //Русский медицинский журнал. 1997. Том V. - N 21

90. Фромина М.П. Разработка методики производства стандартизованных типовых брюшнотифозных ВИ-бактериофагов: Сб. Бактериофагия. Теоретические и практические вопросы. М., 1983. - С.168-175

91. Хлебопрос Т.Р., Теремова М.И., Письман Т.И. Исследование взаимодействия в системе фаг бактерия // Микробиология. - 1980.- T.XLIX. Вып. 3. - С. 507-512

92. Чанишвили Т.Г., Мейпариани А.Н., Авалишвили Г.И. Изучение процесса бактериофагии в условиях аэрации: Сб. Бактериофагия. -Тбилиси, 1957. С.261-265 Черкасов А.Н., Пасечник В.А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. Л.: Химия» 1991, - 240 с.

93. Шапиро Н.И., Дудкина М.И. Новый принцип получения протективных антигенов из глубинных культур энтеробактерий // Ж. микробиологии. 1976. - N 2. - С.34-38

94. Яковлев В.П. Фармакокинетическое взаимодействие между фторхино-лонами и другими лекарственными средствами //Антибиотики и химиотерапия. 1999. - Т.44. - N 3. - С.36-44

95. Яковлев C.B., Суворова М.П., Шахова Т.В. Антибактериальная терапия госпитальной пневмонии у пожилых //Русский медицинский журнал. 1997. - Том V. - N 20

96. Archibald A.R., Ellwood D.C., Thomas T.D. Bacteriophage Propagation in Chemostat Cultures of Streptococcus Lactis // FEMS- Microbiol.Lett. 1978. - V. 3. - N 6. - P.339-341

97. Coute Y.E. Manual of antibiotics and infectious disease. Baltimore, 1995. P.20-27, 85-87

98. Daschner F.D. The epidemiology of Serratia marcescens: In The Genus Serratia / ed. A.Von Graevenitz and S.J.Rubin. Boca Raton: CRS Press, 1980. - P.187-196 Dwyer James L. Filtration processes // J. Cell. Biochem. -1990.- Suppl.14D. P.17

99. Fussle R., Biscoping J., Behr R., A. Sziegoleit A. Development of resistance by Enterobacter cloacae during therapy of pulmonary infections in intensive care patients //Clin. Invest. 1994.- V.72. P.1015-1019

100. Gancevici C. Mecanismele de patogenitate ale bolii diareice acute produse de E.coli. // Bacterid., virusol., parazitol., epidemiol. 1989. - V.34. - N 1. - P. 31-38

101. Gratia A. Des relations numeriques entre bacteries lysogenes et particles de bacteriophage //Comp.rend.soc.biol. 1936. - V.122.- P.812-813

102. Greenwood D. Antimicrobial Chemotherapy. Oxford University, 1995. - P.32-38

103. Cultures of Bacteria //Antonie van Leeuwenhook. 1983. - V.49.- N 6. P.513-536

104. Jolroff-Rubin N. Rubin R. Urinary tract infection:significance and management // Bull. NY Acad. Med. 1986. -Vol.62. - P. 131-148

105. Kalmeter G., Dahlager Y. Aminoglycoside toxicity a review of clinical studies between 1975-1978 // J. Antimicrob Chemotherapy.- 1984. N 13

106. Autolytic System. // J.Gen.Microbiol. 1984. - V.130. - N. 5.- P.1079-1087

107. Maki D.C., Hennekens C.C., Phillips C.W., Chaw W.V., Bennett J.V. Nosocomial urinary tract infection with Serratia marcescens: an epidemiologic study // Journal of Infectious Diseases. 1973. - V.128. - P.579-587

108. Matthews M., Bradley D. // Proc. 3rd European Red. Conf. on Electron Microscopy. Prague, 1969. - V.2. - P.543

109. Mc Cormac R.C., Kunin C.M. Control of a single source nursery epidemic due to Serratia marcescens // Pediatrics. 1966. -V.37. - P.750-755 Mc Hugh A.J.//CRC Chemical Rew anal.Chem. - 1985. - V.15. - Ni.- P.63-117

110. MerrilC.R., Biswas B., Carlton R., Jensen N.C., Creed G.J.,

111. Zullo S., Adhya S. Long-circulating bacteriophage as antibacterial agents // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1966. -V. 93. - P.3188-3192

112. Paca J. Effect of Oxygen Supply on the Courste of Batch Cultivations of Facultatively Anaerobic Bacteria. // Sb.VSCHT Praze. 1975. - V.43. - P. 67-89 Paca J. Comparison of Physiological Characteristics of- 149

113. Klebsiella aerogenes in Batch and Chemostat Cultures. // Sb.VSCHT Praze. 1982. - V.54. - P.97-124

114. Palmer P.H., Mc Cracken L. M. Contaminated antiseptic solutions //Lancet ii. 1970. - P.776-777

115. Pitt T. L., Erdman I.J.» Bucher C. //J. Hyg. 1980. - V. 84.- P.269-283

116. R. de Groot. Place of new antibiotics in the treatment of bacterial infections in children //Русский медицинский журнал. -1997. ТОМ V. - N 1

117. Rietschel E.Th., Schade V.» Sensen M. Bacterial endotoxins: Chemical structure, biological activity and role in septicaemia // Scand. J. Infect. Dis. 1982. - V.31. - P.8-21

118. Ringrose R.E., McKown В., Felton F.G., Barclay B.0., Muchmore H.J., Rhoades E.R. A hospital outbreak of Serratia marcescens associated with ultrasonic nebulizers // Annals of Internal Medicine. 1968. - V.69. - P. 719-729

119. Rogers К.B., Gittens B. An epidemic due to Serratia marcescens in a Neurosurgical Unit // Journal of Clinical Pathology. 1974.- V. 27. P. 930

120. Sanders С.V., Luby J.P., Johanson W.G., Barnett J.A., Sanford J. P. Serratia marcescens infections from inhalational therapy medications: nosomial outbreak // Annals of Internal Medicine. 1970. - V.73. - P.15-21

121. Sautter R.L., Mattman L.H., Legaspi R.C. Serratia marcescens meningitis associated with a contaminated benzalkonium chloride solution // Infection Control. 1984. - N 5. - P.223

122. Seifert-Gertchman H., Lippert W. // Z. alg. Microbiol. 1960.- Bd. 1. S. 87

123. Serban D., Ivanof A., Andronescu D. Enterotoxina termolabila si unele adezine la tulpini bacteriene izolate din boala diareica //Bacterid., virusol., parazitol., epidemil. 1989. - V. 34. -N 1. - P. 39-42

124. Simon C., Stille W. Antibiotika Therapie in Klinik und Praxis. - Schattaner, Stuttgart, New-York, 1989. - P. 153-168

125. Slopek S., Durlakowa I., Weber Dabrowska B.,

126. Kucharewicz-Krukowska A., Dabrowski M., Bisikiewicz R. Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections // Archivum Immunologiae et therariae experimentalis. 1983. -V. 31. - N 3. - P.267-327

127. Slopek S., Kucharewicz-Krukowska A., Weber-Dabrowska B., Dabrowski M. Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections // Archivum Immunologiae et therariae experimentalis. 1985. - V.33. - N 2. - P.219-273

128. Serratia marcescens // Ophthalmie Surgery and Lasers. 1997. -V. 28. - N 3. - P. 195-200

129. Tabaqchali s., Chambers T.J., Brooks H.J.L. Serratia marcescens in hospital practice // Lancet ii. 1977. - P. 306-307

130. Van Ogtrop M.L.» van Zoeren-Grobben D., Verbakel-Salomons E.M., van Boven C.P. Serratia marcescens infections in neonatal departments: description of an outbreak and review of the literature // J. Hosp. Infect. 1997. - V.36(2). - P.95-103

131. Von Graevenitz A. Infection and colonisation with Serratia: In The Genus Serratia /ed. A. Von Gravenitz and S.J. Rubin. Boca Raton, CRC Press., 1980. - P. 167-186

132. Westphal 0., Jann K., Himmelspach K. Chemistry and immunochemistry of Bacterial lipopolysaccharides as cell wall antigens and endotoxins // Host Parasite Relat. Gram-Negative Infect. Basel e.a. 1983. - P. 53-79

133. Whitby J.L., Blair J.N., Rampling A. Cross-infection with Serratia marcescens in an intensive therapy unit // Lancet ii. 1972. P.127-129

134. Wilhelm! I., Bernaldo de Quiros J.C.L., Romero-Vivas J., Duarte J., Roj'o E., Bouza E. Epidemic outbreak of Serratia marcescens infection in a cardiac surgery unit // Journal of Clinical Microbiology. 1987. - V.25. - P.1298-1300

135. Traub W.H. Serotyping of Serratia marcescens: Confirmation of five recently described new O-antigens and characterization of an