Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические особенности стрептомицетов - основы новых инсектицидных биопрепаратов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические особенности стрептомицетов - основы новых инсектицидных биопрепаратов"

• ^

сч На правах рукописи

#

/

Бойкова Ирина Васильевна

Биологические особенности стрептомицетов -основы новых инсектицидных биопрепаратов

Специальность; 03.00.07 - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений (г.Санкт-Петербург)

Научный руководитель - кандидат биологических наук

В.А.Павлюшин

Научный консультант -доктор биологических наук,

профессор Ю.Е.Конев

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Н.В.Кандыбин

доктор химических наук,

профессор А.И.Гинак

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия

Защита диссертации состоится " .9 " ¡¿ФОМлЯ^-_1998 г.

в 40 00 часов на заседании Специализированного совета К.020.26.01 во Всероссийсхсом научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу:

189620, г.Санкт-Петсрбург-Пушкин, шоссе Подбельского, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии

Автореферат разослан " _Л_" ЛС&Ж- 1998 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

А.Н.Зарецкая

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Использование биологических средств защиты растений является одним из основных элементов современных технологий фитосанитарной оптимизации агроэкосистем. В связи с этим, актуальна проблема поиска в различных местах обитания микроорганизмов, продуцирующих метаболиты с широким спектром инсектоакарицидного действия.

Широкое распространение акишомицетов в природе, богатое функциональное разнообразие, высокая биосшггетическая активность и простата культивирования делает их весьма перспективными продуцентами новых биопрепаратов, эффективных в борьбе с вредными насекомыми и клещами. В последнее время во всем мире усилилось внимание к энтомопатогенным и энтомотоксичным актиномицетам [Черменский, 1988,1989; Кандыбин,1991; Отита,1996], но имеющиеся сведения об их распространенности в почве недостаточны.

В результате исследований, проведенных в ВИЗР, из почв различных географических регионов выделены изоляты стрептомицетов с инсектоакарицидной активностью в отношении оранжерейной бело-крылки, тлей, трипсов, паутинного клеща и т.д. Высокая эффективность, стабильность, низкая токсичность метаболшпых комплексов показали возможность их использования в качестве основы новых биопрепаратов .

Выбор вредных сосущих членистоногих в качестве тест-объектов определялся их значительной вредоносностью, связанной с высоким потенциалом размножения, большой распространенностью и широкой полифагией. Актуальность проблемы контролирования численности сосущих вредителей растений на экологически безопасном уровне связана с крайне ограниченным ассортиментом эффективных биопрепаратов, что, в свою очередь, обусловлено рядом не решенных проблей в сфере их создания и внедрения в производство.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выделение новых штаммов стрептомицетов, обладающих инсектоакарицидной активностью; изучение распространенности продуцентов в почвах разных географических зон; исследование микробных метаболитов инсектоакарицидного типа и определение возможности их практического применения.

Для достижения указанной цеди были поставлены следующие

задачи:

- выделить и идентифицировать актиномицеты с инсектицидными свойствами из почвенных образцов различных географических регионов;

- оценить биологическую эффективность выделенных изолятов в отношении оранжерейной белокрылки (Tryaleurodes vaporariorum), гороховой тли (Acyrihosiphon pisum), персиковой тли (Myzodes persicae) и др. и отобрать наиболее перспективные штаммы;

- изучить и оптимизировать условия глубинного культивирования и выделения активных метаболитных комплексов отобранных культур;

- охарактеризовать свойства инсектицидных метаболитов, продуцируемых некоторыми отобранными штаммами;

- разработать технологию получения нового инсектицидного биопрепарата алейцид.

Научная новизна. Впервые проведено исследование распространенности и группового состава стрептомицетов с инсектицидными свойствами в почвах различных географических зон. Отобраны новые штаммы-продуценты метаболитов с выраженной контактной активностью в отношении сосущих вредителей растений.

Впервые описаны новые продуценты пиерицидинов (Str.au-rantiacus ВИЗР-10), депсипептидов (Str.loidensis П-56), низкомолекулярных пептидов - ингибиторов протеаз (Str.cremeus biovar.octemberanum var. nov. 0729), обладающих инсектицидной активностью.

На основе Str. aurantiacus ВИЗР-10 (Авт.свид. №1699040) разработан новый оригинальный биопрепарат алейцид, эффективный в отношении вредных сосущих членистоногих: белокрылки, тлей (персиковой, гороховой, бобовой, бахчевой и др.). Из Str.cr emeus biovar.octemberanum var. nov. 0729 (Авт.свид. № Ш0170) выделен метабо-литньш комплекс, характеризующийся выраженной активностью в отношении фитопатогенных грибов, бактерий, вредных насекомых и ингибиторной активностью в отношении протеаз: трипсина, химо-трипсина, папаина, калликреина. Показано, что действующим веществом является низкомолекулярный пептид, по физико-химическим свойствам и биологической активности отличающийся от известных ингибиторов протеаз.

Практическая значимость работы. На основе культуры Str.aurantiacus ВИЗР-10 создан новый оригинальный биопрепарат алейцид, эффективный в отношении оранжерейной белокрылки, тлей, морковной листоблошки. Препарат показал высокую активность в

яабораторных, вегетационных и производственных испытаниях в закрытом грунте на растениях томата, огурца, перца и т.д.

Разработана научно-техническая документация на препарат: технические условия и технологический регламент на производство, токсикологический паспорт.

Выделены перспективные штаммы стрептомицетов, высокоактивные в отношении членистоногих, которые могут быть использованы для разработай новых биопрепаратов. Штаммы депонированы в Государственной Коллекции ВИЗР, входящей в Международный Банк Культур WFCC, WDCM под № 760 (Япония).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Российских конференциях: "Микроорганизмы в защите растений (Велигож,1989); "Интегрированная защита растений в теплицах" (Вильнюс, 1989); "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992); "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду" (Москва, 1994); "Экологически безопасные и беспесгацидные технологии получения растениеводческой продукции" (Пущино, 1994); на международной конференции: "Биотехнология", (Санкт-Петербург, 1994); международном симпозиуме "Cold Region Development" (Эспоо-Хельсинки, Финляндия, 1994); Всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург,1995); международном конгрессе по защите растений (Гаага, 1995).

Технологический регламент на производство алейцида апробирован на опытно-промышленной установке ВНИТИАФ и Вышневолоцком заводе медпрепаратов.

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 28 научных работах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания основных материалов и методов исследования (2 глава), обсуждения экспериментальных результатов (3-6 главы), выводов, практических рекомендаций, списка литературы включающего 394 источника (в том числе 190 зарубежных авторов) и приложения. Работа изложена на 231 странице машинописного текста, содержит 58 таблиц и 35 рисунков.

-4-

Содержание работы Введение. Во введении показана актуальность темы диссертации, сформулированы цель, основные задачи исследовании и их практическая значимость. Глава I. Обзор литературы

В обзоре литературы приведены сведения, касающиеся использования биоинсектоакарицидов, получаемых на основе актиномицетов, в сельском хозяйстве. Обоснована перспективность использования ме-таболитных препаратов из актиномицетов в фитосанитарных технологиях и, в частности, в комплексных биологических системах защиты растений. Основное внимание уделено биологическим свойствам применяемых препаратов, а также кратко описаны методы их выделения и очистки. Обзор источников составлен отдельно для отечественной (в рамках бывшего СССР) и зарубежной литературы. Глава П. Материалы и методы исследований

Стрептомицеты изолировали из свежих почвенных образцов Западной Сибири, Ростовской и Волгоградской областей, Крыма, Молдавии, Казахстана, Коми, Вьетнама, Индии, Египта, Китая; сухих образцов почв Украины и Болгарии, 25 лет хранившихся в лабораторных условиях. Штаммы выделяли на питательных средах, рекомендованных Г.Ф.Гаузе с сотр. (1983), методами последовательных разведений, центрифугирования взвеси и посева поверхностной пленки [Конев, 1981].

В исследованиях использовали культуры из коллекции актиномицетов ВИЗР, сохраняемые в лиофилизированном состоянии в виде водных суспензий, на кварцевом песке, пшене, садовой почве.

Для выявления продуцентов инсектицидов культуры выращивали в глубинных условиях на соевой среде с крахмалом при t=28 ° С в течение 5 суток. Лабораторные образцы биопрепаратов получали в виде высушенных метанольных и этанольных экстрактов биомассы, культуральной жидкости и нативного раствора. Первичный отбор инсектицидных штаммов проводили на персиковой (Myzodes persicae) и гороховой (Acyrthosiphonpisum) тлях.

Для определения таксономического положения отобранных актиномицетов пользовались классификацией, принятой отечественными и зарубежными учеными [Гаузе,1983]. Первичную идентификацию штаммов проводили по культуральным (среды 1 и 2 Гаузе), антагонистическим и инсектицидным свойствам. У отобранных актиномицетов на 7 средах [Гаузе и др., 1983] изучали культуральные и

морфологические признаки. Форму спороносцев исследовали в световом микроскопе МБИ-15, поверхность спор - в электронном ЭМ-5 без фиксации и напыления при увеличении х8000-10000. Окраску мицелия устанавливали при дневном свете по шкале Бондарцева [1954]. Фи-зиолого-биохимические свойства штаммов изучали по общепринятым методикам [Конев, 1981].

Антагонистические свойства изолятов изучали методом агаровых блоков по зонам угнетения роста 35-и тест-организмов: грам-положительных, грамотрицательных, кислотоустойчивых бактерий, дрожжей, дрожжеподобных и мицелиальных грибов.

Изменчивость Str.aurantiacus ВИЗР-10 изучали по методу В.Д. Кузнецова [1972] в нашей модификации, используя в качестве целевого признака афшщдную активность.

Выделение метаболитов из культуральной жидкости производили методом экстракции органическими растворителями с последующим концентрированием экстракта в вакууме и лиофильной сушкой водного остатка.

Для исследования технологических параметров глубинного культивирования Str.aurantiacus ВИЗР-10 использовали ферментеры вертикального типа вместимостью 82 л и 600 л, оснащенные двухъярусной открытой турбинной мешалкой и трубчатым барботером. Отбор проб культуральной жидкости осуществляли с 12 ч роста. В пробах определяли сухую биомассу; токсинообразование - по весу высушенного метанольного экстракта и его инсектицидной активности контактным методом в чашках Петри [Воронина и др., 1988]; рН -потенциометрически; редуцирующие вещества - по Бертрану [Плешков, 1976], азот - с реактивом Несслера [Кочетков, 1971]. Планирование экспериментов по оптимизации состава питательной среды проводили на основе симплексного метода [Грачев, 1979] с помощью программы МИРЕА для ГОМ-компьютеров [Григорьев, 1990].

Активность ингибитора протеаз определяли модифицированным методом Кунитца [Perimann,1970] на казеине и БАПНА [Eríanger, Kokowsky,1971]. УФ-спектры снимали на двухлучевом спектрофотометре "Specord" М-40 (Германия), ИК-спектры регистрировали на спектрофотометре "Specord IR-75" (Германия).

Для изучения активного комплекса из штамма 0729 применяли колоночную хроматографию на АИОз, ВЭЖХ на хроматографе "Jasco" (Япония), ТСХ на пластинах "Silufol" и селикагеле М5/40 (Чехословакия). Хроматограммы проявляли в УФ-свете, парами иода, нингидрином [Беккер, 1971], биоавтографией на средах с казеином

[Reddy,1991]. Вьщеление и очистку ингибитора протеаз проводили методами гель-фильтрации на сефадексах G-10, G-25 [Бойкова и др., 1985; Laemly,1970]. Молекулярную массу ингибитора определяли гель-фильтрацией на сефадексе G-25, аминокислотный состав - на анализаторе ААА-881 и пластинах Fixion (США).

Оценку биологической активности проводили на оранжерейной белокрылке (Trialeurodes vaporariorutn Westw.); тлях - гороховой (Acyrthosiphon pisum Harr.), бобовой (Aphis fabae Scop.), персиковой (Myzodes persicae Sulz.), большой картофельной (Macrosiphum euphor-biae), бахчевой (Aphis gossypii Glov), виковой (Medoura viciae); обыкновенном паутинном клеще (Tetranychus urticae Koch.); трипсах -табачном (Thrips tabaci Lind.), цветочном (Frankliniella occidentals Perg.), сетчатом слизне (Deroceras reticulatutn), морковной листоблошке (Trioza apicalis). В опытах использовали насекомых, собранных в теплицах АО "Лето" и разводимых в лабораторных условиях согласно известным методикам [Бондаренко, Асякин,1975; Бондаренко, 1980,1984; Бегля-ров,1978; Бегляров и др.,1977, 1978,1982].

Токсичность лабораторных образцов препаратов в отношении оранжерейной белокрылки в лабораторных условиях определяли на листьях фасоли, заселенных вредителем, через 2-4 часа после обработки 0,1-1,0% водной суспензией препарата. Биологическую эффективность алейцида в вегетационных и производственных опытах оценивали на модельных растениях томата, перца, огурца на тлях, оранжерейной белокрылке и морковной листоблошке. Испытания на сетчатом слизне проводили методом погружения, опрыскивания и опыливания слизней на листьях капусты; на паутинном клеще - погружением или опрыскиванием заселенных клещом листьев огурца.

Данные, полученные в работе, статистически обрабатывали, используя стандартные методы [Доспехов, 1985]. Глава Ш. Биологические особенности актиномицетов-продуцентов инсектицидных веществ Эколого-географическая распространенность актиномицетов-продуцентов инсектицидов

С целью выделения энтомоцидных штаммов актиномицетов исследованы свежесобранные образцы почв из различных географических регионов, в результате чего выделено 1289 штаммов актиномицетов рода Streptomyces (Табл.1). По культурально-морфологическим свойствам для дальнейшего изучения отобрано 520 изолятов, 281 из которых обладал инсектицидной активность в отношении персиковой тли. Максимальное разнообразие качественного состава выделен-

ных стрептошщетов наблюдалось в почвах Западной Сибири (23 различных изолята из 1 образца).

Таблица 1

Представленность стрептошщетов в почвах различных географических зон_

Регион Тип почвы Количество образцов Выделено актиномицетов Отобрано стрептомицетов

Всего шт. Продуцентов- инсектицидов %

Западная Сибирь Чернозем, зерново- подзолистая 4 128 92 82,6

Египет глинистая 3 42 18 83,3

Молдавия чернозем 9 17 5 80,0

Волгоградская область суглинистая темно- каштановая 4 16 6 83,3

Казахстан серобурая 3 10 5 80,0

Китай бурозем 10 56 19 94,7

Вьетнам краснозем 9 210 95 2,1

Индия краснозем 3 96 52 9,6

Сев.Кавказ глинистая 8 15 4 100

Крым I субпесчаная каменистая 15 320 103 84,5

Крым II краснозем 6 148 38 71

Коми подзолистая торфяная глинистая 12 59 18 88,8

Ростовская область чернозем 10 64 18 61,1

Болгария карбонатные 11 20 7 28,5

Луганск чернозем 10 88 40 12,5

Итого 117 1289 281

Ниже этот показатель оказался для красноземных почв Индии (17), Вьетнама (10), субпесчаных, каменистых, красноземных почв Крыма (6-7), глинистых почв Египта (6). В свежесобранных образцах почв преобладали стрептомицеты группы Cinereus (53%), представленность других групп была следующей: Roseus (19%), Albus (18%), Helvolo-ßavus (7%), Azur eus (2%), Imperfectas (1%).

Анализ группового состава штаммов, выделенных из сухих (после 25-летнего хранения) почв Болгарии (Варны) и Луганска показал, что он ограничен группами Helvolo-ßavus, Albus, Cinereus с преобладанием двух первых групп, что свидетельствует о сравнительно низкой жизнеспособности стрептомицетов групп Roseus и Cinereus.

В зависимости от места выделения, 61,1-100% стрептомицетов проявляли инсектицидную активность в отношении гороховой и персиковой тли. Исключение составляли красноземные почвы Индии (21,1%), Вьетнама (9,6), сухие черноземы Луганска (12,5%) и карбонатные почвы Болгарии (28,5%). Среди стрептомицетов с высокой инсектицидной активностью (80-100%) выявлено 52% штаммов ipyimbi Cinereus, 19% - Roseus, 14% - Albus, 10% - Helvolo-ßavus, 5% - Azur eus. (Табл.2).

В результате исследования биологической активности 100 штаммов коллекции актиномицетов выявлено 38 продуцентов инсектицидов рода Streptomyces секций Cinereus (39%), Roseus (24%), Helvolo-ßavus (26%), Albus (11%). Максимальное число инсектицидных штаммов выделено из подзолистых почв Западной Сибири, лесных черноземов Армении. В результате проведенных исследований, выявлены культуры П-55, П-56, S-100, 0729, ВИЗР-10, высокоактивные в отношении вредных членистоногих. Сравнительный анализ биосинтетической изменчивости, условий культивирования штаммов, эффективности лабораторных образцов позволили нам выбрать штамм Slr.sp.BH3P-10 для создания на его основе нового биопрепарата. По культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам продуцент является типичным представителем вида Streptomyces aurantiacus с выявленными штаммовыми отличиями (Авт.свид. №1699040).

Естественная изменчивость и хранение Streptomyces aurantiacus

ВИЗР-10

При рассеве природной популяции Str. aur. ВИЗР-10 на среде ISP-9 обнаружено 5 культурально-морфологических вариантов: 1 (II) -олигоспоровый (78,3%); 2 (IV) - аспорогенный лейкомутант (10,3%); 3 (VII) - моноколерный аспорогенный - 1 (8,4%); 4 (VII) - моноколерный аспорогенный - 2 (2,9%); 5 (VIII)- карликовый (0,1%).

Таблица 2

Характеристика отобранных стрептомицетов-продуцентов _инсектицидов_

Штамм Секция Источник Регион Инсектицидная активность, % смертности М.решсае

Str.herbaHcolor S-100 Cinereus Зап.Сибирь 100

S-158 Cinereus Зап.Сибирь 88,3

S-170 Albus Зап.Сибирь 98,9

S-161 Azureas Зап.Сибирь 98,6

5349-1 Cinereus с в Египет 82,6

5316-3 Cinereus . е ж Молдавия 98,0

5336-4 Roseus е с Молдавия 92,5

5322-1 Helvolo-flavus о б Молдавия 96,9

К-141 Cinereus Р а Казахстан 84,0

Г-5 Cinereus н н Китай 100

Г-8 Albus ы е Китай 87,6

Str. einereorüber П-55 Cinereus Индия 100

Str.loidensis П-56 Cinereus 0 б Индия 100

И-18 Cinereus Р а Крым I 91,8

И-49 Roseus 3 й Крым I 87,9

И-72 Roseus Крым I 81,4

И-78 Roseus Крым I 89,8

И-32-2 Cinereus п о Крым II 98,4

5361-1 Albus ч в Коми 81,4

5384-3 Cinereus Ростовск.обл. 87,4

5389-2 Cinereus Ростовск.обл. 94,7

5390-2 Helvolo-flavus Ростовск.обл. 80,2

Str.surgulus 0166 Albus Зап.Сибирь 84,9

Str. cremeus biovar. octembcraiuim var.nov.0729 Helvolo-flavus к о л л Армения 89,8

Str.aurantiacus ВИЗР-10 Roseus е Кавказ,Сочи 87,1

Slr.sp.0789 Cinereus к Красиод.край 84,5

Str.canulus var. sevanus Albus Ц Армения 81,1

Str.orinoci Helvolo-flavus и Италия 86,5

Str.sp.A-13-5 Helvolo-flavus я Сибирь 81,4

Основу популяции составляли колонии олигоспорового типа с инсектицидной активностью 89,2-108,4% по отношению к уровню активности популяции в целом; активность моноколерных аспороген-ных колоний составляла 56,2-78,4%, карликовых 28,9-47,7%. Аспо-рогенные лейкорасы инсектицидных свойств не проявляли.

Изучение влияния пассирования на инсектицидную активность Б1г.аигапНасиз ВИЗР-10 показало, что после 4-го пассажа на кукурузной среде с глюкозой наблюдалось снижение инсектицидной активности на 15-20%, после 5-го - на 40-60% вследствие расщепления типового клона и увеличения содержания в рассеве неактивных аспорогенных лейкому-тантных колоний. В связи с этим, для сохранения высокой активности штамма, необходимо делать его моноспоровый рассев после 3-го пассажа. На среде Чапека с глюкозой расщепление типового клона было минимальным, поэтому данную среду рекомендовано использовать для хранения штамма.

Изучена жизнеспособность, культуральные свойства и биосинтетическая активность Би.аиг.ВИЗР-10 при хранении различными методами. Установлено, что для поддержания высокой жизнеспособности культуры, ее следует пересевать на агаризованную среду не реже 1 раза в 3 месяца путем моноспорового рассева олигоспоровых вариантов. При хранении в течение 5 лет в лиофильно высушенном состоянии в атмосфере азота или в кварцевом песке, а также в течение 10 лет в виде водной суспензии с ограничением доступа кислорода Бп.аиг.ВИЗР-Ю сохраняет высокую жизнеспособность и инсектицидную активность (соответственно 63,1-84,9% и 79,8%). Последний метод является простым, экономичным и не требует специального оборудования. Хранение изучаемой культуры в стерильной почве в течение 5 лет не дало удовлетворительных результатов.

Глава IV. Характеристика отобранных перспективных штаммов актиномицетов-продуцентов инсектицидов

В результате изучения культурально-морфологических и физиолого-биололнческих признаков определено систематическое положение отобранных штаммов: БггерЮтусея стегеогиЬег П-55, Б 1г ер Юту сея loiden.iL? П-56, Биершпусез ИегЬагко1ог Б-100, Б1герЮтусе.ч сгетеш Ыо\,аг.ос1етЬегапит var.nov.0729. При глубинном культивировании штаммы образуют вторичные метаболиты с инсектицидными свойствами (Табл.3). Активный комплекс метаболитов шт.Б.сгетеш biov.oct.var.nov.0729 обладает ингибиторной активностью в отношении протеаз: трипсина, химотрипсина, папаина, калликреина (Авт.свид. №1110170), а также является активным антагонистом ряда фитопатоген-ных микроорганизмов. Сочетание высокой инсектицидной и антагонистической активности может служить основанием для созда-

Таблица 3

Характеристика лабораторных образцов новых биопрепаратов на основе стрептомицетов

Штамм, образцы биопрепаратов Целевая активность, тест-объекты Биологическая эффективность Химическая природа активного компонента LD50 (мг/кг) мыши (Моисеева, 1993)

концентр, метанолы I. экстракта (%) Смертность M.persicae (%) per os вгутри-брю-шинно

Streptomyces cinereoruber Л-55 инсектоакарипид (A.pisum, M.persicae, A.fabae, D.frangulae F. occidentalis, Т. vapora-riorum, T.urticae) 0,1 0,05 100 78,5 - 3167,0 93,8

Streptomyces loiderjis П-56 инсектоакариция (A.pisum, M.persicae, A.fabae, D.frangulae F.occidentalis, T.vapora-riorum, T.urticae) нематицил (M.incognita) 0,1 0,05 100 89,4 депсипептид (осгрео-грицин А) 158,0 14,97

Streptomyces herbaricolor S-ЮО инсектицид (A .pisum, M.persicae, F. occidentalis) противовирусный (BTM) 0,1 0,05 100 - 2500 137,5

Streptomyces cremeus biovar. octemberanum var.nov. 0729 инсектицид (A.pisum, M.persicae, A.fabae, F.occidentalis, T.vapora riorum) фунгицид (Fusarium gr., Alt.brassicirola и др). 0,1 84,9 пептид М.в. <1400 (треонин пролин глицин аланин валин тирозин фенил аланин) 725 38,4

Streptomyces aurantiacus ВИЗР-10 (алейцид) инсектицид (T.vapora riorum, M.persicae, A.pisum, A.fabae, F.occidentalis, T.urticae. T.apicalis) 0,1 92,8 9-метилпиери- цидин В (Шенин, Шопо-това,1993.) 5600 2400

ния на основе данного штамма нового полифункционального биопрепарата.

При изучении культивирования отобранных штаммов в условиях глубинной ферментации, наибольшие инсектицидна я активность (80-100%) и выход биомассы были получены на соевой среде с глюкозой и средах, содержащих кукурузный экстракт. Установлена возможность замены таких дорогостоящих компонентов, как глюкоза и соевая мука, на более дешевые - зеленую патоку и дрожжи БВК без снижения биологической активности целевых компонентов. Штаммы S.ciner.ri-55, S.loid.TT-56, S.her.S-100 накапливают максимальное количество инсектицидных метаболитов через 96 ч, S.cr.0729 - через 50-60 ч глубинного культивирования на соевой среде с глюкозой (1%)-Активные комплексы йз культуральной жидкости штаммов П-55, ТТ-56, S-100 выделяли методом экстракции метиловым, этиловым спиртами, ацетоном, хлороформом и дихлорметаном. Наиболее высокий выход и инсектицидную активность (61,9-94,5% на M.persicae) обеспечивала экстракция метанолом и этанолом.

При спектрофотометрических исследованиях в УФ-области поглощения метанольных экстрактов (рис.1) выявлены максимумы, характерные для полиеновых веществ при А=270, 330, 380, 400 нм (П-55); 278, 322, 340 нм (S-100); 305, 318, 350, 380, 400 нм (Я-56); 380, 400 нм (0729), образование которых свойственно многим видам серий Violaceus, Heh'olus, Aureus [Гаузеи др.,1983].

На основании предварительных данных по биологическому спектру действия, УФ, ИК - спектроскопии, оптической активности, растворимости активное вещество метаболитного комплекса Str.loidensis П-56 отнесено к депсипептидам, в частности, к остреогрицину А (микамицину A) [Araiet al.1956; 1958].

Активный комплекс вторичных метаболитов шт.S.cr.0729 выделяли последовательной трехступенчатой экстракцией культуральной жидкости н-бутанолом при рН=7,5; 4,5; 3,0 с последующим концентрированием объединенного экстракта в вакууме, переосаждением в диэтиловый эфир и очисткой на эктеол-целлюлозе. ТСХ в системах н-буганол - уксусная кислота - вода и н-пропанол - уксуснокислый аммоний 10% - аммиак конц.(7:2:1) обнаружила сложную смесь компонентов. Биоавтография на среде с казеином и препаративная ТСХ на селикагеле позволили выделить компонент с антитрипсиновой активностью (Rf=0,55; ИА=0,5 ИЕ/мг, максимум поглощения в УФ спектре при /1=280 нм). Аминокислотный анализ гидролизата активного вещества после исчерпывающего кислотного гидролиза 6н HCl при t=I10°C и хроматография на пластинах Fixion 50x8 показали, что это

Рис. 1 УФ- спектры метаболитных комплексов из штаммов П-55, П-56, Б-100, 0729, ВИЗР-10 (1-*).

пептид, основными аминокислотами которого являются треонин, пролин, глицин, аланин, валин, тирозин, фенилаланин. Методом гельфильтрации на сефадексе С-25 (свидетель виташш В12, Мл .=1350) оценили молекулярную массу ингибитора (1400). Увых В12=47мл; Увых0729=45мл; Уо (декстран голубон)=23 мл. Изучение ингибиторных свойств штамма в лабораторных условиях обнаружило его высокую активность в отношении ряда протеаз (Табл.4).

Оценка гшсектицидных свойств антитрипсинового комплекса показала, что через 2 часа после обработки 0,1% раствором препарата наступала гибель 92,3% старших возрастов персиковой тли.

Методом ЮЖХ в условиях градиентного элюирования смесью ацетонитрил - ацетатный буфер (рН=4,83) выделили два компонента с разной специфической биологической активностью: первый - подавлял рост фитопатогенных грибов и бактерий, второй - проявлял инсектицидные свойства и являлся ингибитором протеаз. Сравнение аминокислотного состава и молекулярной массы ингибитора, продуцируемого штаммом 0729, с соединениями этого типа, описанными в литературе, показал, что изучаемое вещество является оригинальным.

Таблица 4

Антипротеазная активность S.cremeus biovar.oct.var.nov. 0729 в сравнении с известными ингибиторами__

Ингибитор Ингибиторная активность по казеину ИЕ/мг

Фермент

трипсин химо-трипсин фибрино-лизин папаин калликреин

0729 0,5 1,2 0,1 1Д7 0,4

Контрикал 0,14 0,1 0,12 0,02 0,01

Соевый ингибитор 0,16 0,94 0,06 0,32 0,05

Химостатин 0,2 0,32 0,09 0,6 0,1

Глава У. Закономерности роста и развития Streptomyces aurantiacus ВИЗР-10 и разработка технологии получения препарата алейцид на его основе.

Показано, что в процессе культивирования im.Str.aur.ВИЗР-10 инсектицидные метаболиты накапливаются, в основном, в мицелии. В результате оценки влияния 9 источников азота и 5 источников углерода на образование биомассы и активность метанольного экстракта, установлено следующее. Использование в питательных средах солей аммония приводит к интенсивному накоплению биомассы культуры, ингибирует биосинтез инсектицидных метаболитов (активность 0,1% метанольного экстракта составляет 24,7%-29Д%). Добавление в среду сложных органических субстратов (кукурузного экстракта, рыбной муки, БВК, соевой муки) приводит к увеличению активности метанольного экстракта до 60-90%, NaNÜ3 - 75%, крахмала - 80%, глюкозы - 90%). Максимальный выход биомассы (95,1 г/л) наблюдался на среде с глюкозой. На основании полученных данных для культивирования продуцента выбрана соевая среда и синтетические среды с NaN03 и глюкозой. Планирование экспериментов по оптимизации питательной среды по 4 параметрам (концентрация азота, углерода, хлористого натрия и углекислого кальция) проводили симплексным методом. В результате была подобрана среда следующего состава (%): соевая мука-1,0; глюкоза - 1,0; натрий хлористый 0,5;

кальдий углекислый 0,3; рН-натуральный, обеспечивающая высокую инсектицидную активность культуральной жидкости (96,8%).

Анализ динамики роста и развития 81г.аиг.ВИЗР-10 в условиях глубинной ферментации на синтетической среде с глюкозой (1,0%) и №N03 (0,3%), а также на оптимизированной среде показал, что процесс развития актиномицета протекает в 2-е фазы, продолжительность которых зависит от состава среды. Начало интенсивного синтеза инсектицидных метаболитов начинается во 2-ой фазе через 24 ч после начала культивирования на соевой и через 48 ч на синтетической среде и совпадает с началом образования оранжевых пигментов. На соевой среде потребление углеводов и азота вдет значительно активнее, чем на синтетической; культура переходит во 2-ю фазу развития через 45 ч (на синтетической - через 63 ч). При этом максимальное накопление инсектицидных метаболитов наблюдается через 72 ч (на синтетической -через 96 ч), а также интенсивнее идет процесс синтеза оранжевых пигментов. Физико-химические свойства пигментного комплекса (УФ-спектр поглощения при Х=535-550 ни, растворимость, индикаторные свойства) указывают на продигиозиноподобную природу содержащихся в нем компонентов. Инсектицидная активность конечного продукта (с.п.) коррелирует с содержанием пигментного комплекса в метанольном экстракте, что дает возможность использовать данный фактор для контроля процесса биосинтеза целевых продуктов. Изучение процесса культивирования показало, что наиболее благоприятные условия для образования инсектицидных метаболитов достигаются при рН=6,0-8,0 (рНопт=7,0) в интервале температур 28-35°С (активность соответственно 86,4 и 84,1%).

Оптимальный срок хранения посевного материала составляет 714 суток, после чего происходит интенсивное расщепление культуры и повышение содержания в ней неактивной лейкорасы. Хранение посевной культуры более 1 месяца приводит к снижению ее продуктивности на 3550%. Для выращивания штамма целесообразно использовать материал в количестве 5% (об) в возрасте 40-60 ч при достижении культурой стационарной фазы развития. При этом наблюдается максимальное накопление инсектицидных метаболитов (смертность М.ретсае через 2 часа после обработки составляла 87,2-91,1%). В результате исследования экстрагирующей способности шести растворителей показано, что полнота экстракции инсектицидного комплекса метанолом при г=20°С и постоянном перемешивании достигается в течение 1 ч при модуле экстракции равном 4. Использоватге 2-х ступенчатой экстракции повышает эффективность процесса на 25% .

На стадии концентрирования метанольного экстракта опти-

мальная температура составляет 70°С, при повышении температуры на 10°С активность препарата понижается вдвое.

Проведенные исследования позволили разработать технологию получения нового биопрепарата, названного нами алейцид, в соответствии с которой составлены ТУ на препарат и технологический регламент, апробированный в условиях опытно-промышленного производства ВНИТИАФ и Вышневолоцкого завода медпрепаратов. Качество полученных опытных партий препарата соответствовало требованиям ТУ (Табл.5).

Таблица 5

Стандартные партии алейцида, полученные на опытно-промышленной установке ВНИТИАФ (1991-92 г.г.)._

№ Объем куль- Выход Выход Инсектицидная

п/п туральнои влажного алеицида активность

жидкости мицелия (смертность (%)

л г/л СЛ.г/л М.ретсае

через 2 часа,±ш

1 42 66 1,9 76,0+5,1

2 40 60 1,0 68,0±4,2

3 40 87 2,3 86,0+4,9

4 40 78 2,3 82,0+3,7

5 175 114 2,3 76,6±4,2

6 38 89 2,7 68,0±7,6

7 230 95 1,8 68,5±5,8

8 250 122 1,7 81,2±6,1

9 150 74 1,4 77,1±4,9

10 203 70 1,1 69,1+3,9

11 40 92 3,4 92,0±1,9

ГлаваVI. Биологическая эффективность алейцида в отношении сосущих членистоногих в лабораторных, веге-тацонных и полевых опытах.

Результаты лабораторных, вегетационных и производственных опытов показали высокую биологическую эффективность алейцида в отношении сосущих вредителей сельскохозяйственных растений: различных видов тлей, оранжерейной белокрылки, табачного трипса, морковной листоблошки и сетчатого слизня. В лабораторных условиях обработка популяций персиковой, бобовой, виковой, картофельной,

гороховой тлей 0,1-1,0% суспензией препарата через 2 часа вызывала смертность 57,1-97,3% вредителей. Наиболее чувствительными к воздействию препарата оказались гороховая, бобовая и виковая тли (смертность соответственно составила 86,2; 90,7; 80,2% при концентрации 0,1%). В вегетационных мелкоделяночных опытах в экспериментальных теплицах ВИЗР и производственных стеклянных и пленочных теплицах совхоза "Колпинский", а также на опытном поле САНИИЗР в Таджикистане были получены аналогичные результаты. Смертность персиковой тли на томатах составила 55,4-60,0%; на перце 76,5 - 99,6% при концентрации препарата 0,1-0,3%, а бахчевой тли на хлопчатнике -80,2-99,3% при концентрации 0,5-1,0%).

Алейцид показал высокую эффективность в отношении всех стадии развития оранжерейной белокрылки. В лабораторных опытах в концентрации 0,1-1,0% он вызывал суммарную гибель 95,0-99,0% вредителя. Смертность белокрылки на стадии яйца составляла 12,350,1%; личинок - 88,5-97,2%; куколок - 45,2-85,5%; имаго - до 42,4%. Показано, что суммарное действие алейцида на оранжерейную белокрылку складывается из ряда летальных показателей - токсического эффекта и последействия препарата с гибелью на последующих стадиях развития, снижением жизнеспособности насекомых и проявлением тератогенного эффекта [Гиндина, лаб. отчет, 1988, 1989; Гиндина, Бойкова, Митина, 1989; Бойкова, авт. свид., 1991].

В условиях производственных теплиц (Гори, Грузия) смертность личинок белокрылки на растениях томата на 10 день после обработки алейцида (в 0,6% концентрации) составила 98,9%, нимф - 94,5%.

Установлена высокая чувствительность к алейциду личинок морковной листоблошки и сетчатого слизня. В лабораторных опытах гибель указашшх вредителей после обработки 0,1% суспензией препарата составила 100%. В производственных условиях (БелНИИЗР) смертность личинок листоблошки достигла 64,8-89,5%) при концентрации препарата 0,1-0,5%; при этом поврежденностъ растений в опыте была в 2 раза ниже, чем в контроле.

Оценка акарицидных свойств алейцида в лабораторных условиях показала, что при обработке обыкновенного паутинного клеща 2,0%-ной суспензией препарата смертность подвижных стадий составила 73,5%, самцов и самок 67,0%, личинок и нимф - 90%.

Необходимо отметить невосприимчивость к алейциду энто-мофагов: галлицы афидимизы на всех стадиях развития, фитосейулюса на стадии яйца, энкарзии на стадии куколки [Агансонова,1996].

Полученные данные свидетельствуют о специфичности действия алейцида и его высокой эффективности в отношении оранжерейной

белокрылки, (персиковой, гороховой, бахчевой и др.), тлей и морковной листоблошки.

Выводы

1). Для изыскания энтомоцидных актиномицетов из свежих образцов почв различных географических зон выделено 1289 штаммов актиномицетов рода Streptomyces, по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам из них отобрано 520 изолятов секций Cinereus (53%), Roseus (19%), Albus (18%), Helvolo-Jlavus (Т/о), Azureus (2%), Imperfectus (1%), из которых 281 штамм (54%) обладает инсектицидной активностью.

Из 100 культур коллекции стрептомицетов, сохраняемой в течение 30 лет, выявлено 38 штаммов - продуцентов инсектицидов, относящихся к секциям Cinereus (39%), Roseus (24%), Helvolo-flavus (26%), Albus (11%).

2). Установлена видовая принадлежность 5-ти отобранных штаммов: Streptomyces aurantiacus ВИЗР-10, Streptomyces cremeus biovar.octemberanum var. nov. 0729, Streptomyces cinereoruber П-55, Streptomyces loidensis П-56, Streptomyces herbaricolor S-100, которые в процессе роста и развития в условиях глубинной ферментации продуцируют вторичные метаболиты, обладающие инсектицидной активностью.

3). Показано, что максимальное накопление инсектицидных метаболитов у Str.aurantiacus ВИЗР-10 происходит на 4 сутки при периодическом глубинном культивировании на оптимизированной симплексным методом питательной среде следующего состава: соевая мука 1,0%; глюкоза 1,0%; натрий хлористый 0,5%; кальций углекислый 0,3%; при t=28°C, рН=6-8. Исследованы условия культивирования штаммов Str.cremeus biovar.oct.var.nov.0729, Str. cinereoruber П-55, Str. loidensis П-56, Str. herbaricolor S^lOO, динамика образования инсектицидных веществ и условия их выделения из культуральной жидкости.

4). На основе изучения физико-химических свойств выделенных метаболитов методами УФ, ИК - спектроскопии, гель-фильтрации, тонкослойной, ионообменной, хроматографии, ВЭЖХ, показано, что активный комплекс штамма 0729 содержит два компонента, один из которых обладает фунгицидагыми и бактерицидными свойствами в отношении ряда фитопатогенов, второй - является ингибитором протеаз (трипсина, химотрипсина, папаина, калликреина) и проявляет инсектицидные свойства. Ингибитор протеаз представляет собой низкомолекулярный пептид с М.в. около 1400, основными аминокислотами которого являются треонин, пролин, глицин, аланин, валин, тирозин, фенилаланин.

Активное вещество метаболитного комплекса штамма П-56 относится к группе депсипептидов типа остреогрицина (микамицина А).

5). В результате изучения естественной изменчивости штамма-продуцента Бп.аигапйаси.у ВИЗР-10 выявлено 5 морфологических вариантов, различающихся по форме, цвету колоний, способности к образованию воздушного мицелия и биологической активности. Максимальную инсектицидную активность проявляли колонии типового олигоспорового клона, среднюю - аспорогенные и карликовый варианты. Аспорогенный лейкомутант неактивен.

6). Хранение Б1г.аигапИасиз ВИЗР-10 на синтетических агаровых средах обеспечивает высокую инсектицидную активность штамма в течение 3-х месяцев при 1=20°С и 6-ти месяцев - при 1=4°С. Хранение штамма в виде водной суспензии без доступа кислорода обеспечивает его высокую жизнеспособность и биосинтетическую активность в течение 10 лет, в кварцевом песке - 5-и лет.

7). На основе Б^мигапНасиз ВИЗР-10 разработана технология получения нового биопрепарата, названного нами алейцид, эффективного в отношении вредных сосущих членистоногих, апробированная в условиях опьггао-промышлепного производства ВНИТИАФ и на Вышневолоцком заводе медпрепаратов. Составлен технологический регламент на производство алейцида и технические условия, в соответствии с которыми наработаны опытные партии препарата.

8). Лабораторные и вегетационные испытания эффективности образцов биопрепаратов на основе штаммов 5/л стегеогиЬег П-55, 81г.Шс1е№Ь П-56, 81т.НегЬапсо\ог 3-100, Бп.сгетгш biovar.oct.var.nov.0729 в отношении комплекса сосущих вредителей (биологическая эффективность 80-100% при 0,1% концентрации) в сочетании с результатами токсикологических исследований показали перспективность их использования в качестве основы новых биопрепаратов.

9). Полевые и производственные испытания эффективности алейцида в Ленинградской области, Таджикистане, Белоруссии, Грузии показали высокий защитный эффект алейцида от оранжерейной белокрылки (активность 80-97,5% при рабочей концентрации 0,1-0,6%), персиковой и бахчевой тлей (смертность вредителя при обработке 0,10,5% суспензией 76,5-99,6%» соответственно), морковной листоблошки (смертность 64,8-89,5% при концентрации алейцида 0,1-0,5%).

Практические рекомендации

1). Составленный и апробированный технологический регламент на производство алейцида рекомендуется опьггно-иромышленным производствам для внедрения.

2). Разработанная научно-техническая документация на алейцид, состоящая из технических условий, технологического регламента, токсикологического паспорта, актов апробации, актов испытаний эффективности, необходимая для организации опытно-промышленного производства алейцида, подготовлена для передачи в Госхимкомиссшо МСХ РФ для проведения регистрационных испытаний.

3). Новые штаммы спрептомицетов, выделенные в процессе исследований и депонированные в Государственной Коллекции ВИЗР, рекомендуется использовать для разработки на их основе новых биопрепаратов.

Список работ, опубликованных по теме диссератации

1). Бойкова И.В., Трахтенберг М.Г., Фатеева Л.И., Соколов Л.Б. Сравнение методов определения биологической активности ингибитора протеаз И Тез .докл.отчетной научной конференции ВНИТИАФ.- Л.-1980.-С.146.

2). Трахтенберг М.Г., Бойкова И.В., Соколов Л.Б., Коцегуб В.В. Изучение физико-химических свойств биологически активного комплекса из актиномицета// Тез докл.отчетной научной конференции ВНИТИАФ, Л.-1980. - С.151.

3). Бойкова И.В., Трахтенберг М.Г., Фатеева Л.И., Соколов Л.Б., Яковлева Е.П. Хроматографическое изучение метаболита из актиномицета // Тез.докл.отчетной научной конференции ВНИТИАФ,-Л.- 1980. -С.152.

4). Трахтенберг М.Г., Бойкова И.В., Соколов Л.Б. Применение метода ультрафильтрации для выделения метаболитов актиномицета из нативных растворов // Сб.тр. ВНИТИАФ - 1981. - С.122.

5). Яковлева Е.П., Кузьмина Э.Д., Конев Ю.Е., Мазунина Ж.Д., Мицкевич В.М., Соколов Л.Б., Трахтенберг М.Г., Бойкова И.В., Фатеева Л.И., Ефимова Т.П., Стати Л.Б., Дивова Н.П. Штамм Streptomyces creineus biovar.octemberanwn var.nov. - продуцент ингибитора протеолитического фермента трипсина //Авт.свид. №1110170. - 1984.

6). Бойкова И.В., Оршанский А.И., Родичев А.Г., Мамина М.У., Комаров Е.В Исследование компонентного состава ингибиторов протеаз с целью оптимизации технологии выделения //Сб.тр. ВНИТИАФ Технология производства биологически активных веществ.-Л. - 1985. - С.82-83.

7). Трахтенберг М.Г., Бойкова И.В., Соколов Л.Б. Выделение и изучение ингибитора протеаз из штамма Str. cremeus biovar. octemberanum

-21// Сб.тр. ВНИТИАФ Технология производства биологически активных веществ.-Л. - 1985. - С.- 83-86.

8). Михайлова В.П., Трахтенберг М.Г., Бойкова И.В. Изучение ингибитора протеаз Streptomyces cremeus sp.Ol29 переменнотоковой полярографией // Пути повышения качества и стандартизация биологически активных веществ.-Л. - 1986. - С. 136-140.

9). Гиндина Г.М., Бойкова И.В., Митина Г.В. Перспективы использования актиномицетов в борьбе с сосущими вредителями // Тез. докл.конф." Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений".- Велигож. - 1989. - С.230.

10). Гиндина Г.М., Бойкова И.В., Митина Г.В. Биопрепарат для борьбы с вредителями закрытого грунта// Тез .докл. конф. "Интегрированная защита растений в теплицах." - Впльнюс.-1989.-С.20-22.

11). Бойкова И.В., Конев Ю.Е., Гиндина Г.М.,Павлюшин В.А., Митина Г.В., Родичев А.Г., Крунчак В.Г. Штамм стрептомицета Streptomyces auranliacus для получения инсектицидного препарата против сосущих насекомых //Авт.свид. №1699040. 1991.

12). Конев Ю.Е., Бойкова И.В., Родичев А.Г., Крунчак В.Г. Способ получения энтомоцидного препарата // Авт.свид.№1830660,-1992.

13). Бойкова И.В., Трушкина А.Н., Конев Ю.Е., Новикова И.И., Павлюпшн В.А. Географическое распространение актиномицетов-про-дуцентов энтомоцидных веществ // Тез. докл. конф. "Микроорганизмы в сельском хозяйстве".- Пущино.- 1992.- С.20.

14). Бойкова И.В., Конев Ю.Е., Павлюпшн В.А. Технологический регламент производства алейцида. - 1992.- С.-Пб. - Пушкин. - 69 с.

15). Шопотова Л.П., Шенин Ю.Д., Бойкова И.В. Новый природный инсектицид, продуцируемый Streptomyces aurantiacus. Выделение, физико-химические и биологические свойства и идентификация // Журнал прикладной химии. - 1993.- 66(5). - С.1111-1117.

16). Бойкова И.В., Конев Ю.Е., Павлюпшн В.А. Актиномицеты-продуценты инсектицидных веществ //Тез.доюисонф." Интродукция микроорганизмов в окружающую среду" М.1994. - С.55.

17). Шенин Ю.Д., Крутикова Л.Ф., Бойкова И.В., Конев Ю.Д., Карпов Э.Г. Аскостатин - фунгицид из Streptomyces viridovulgaris II Антибиотики и химиотерапия.- 1994. - Т.39. - № 6.- С. 8-12.

18). Boikova I.V, Konev Ju.E. New ecologically clean biopreparations for plant protection are alternative to chemical pesticides // Int .Symposium on Cold Region Development. Espoo-Helsinky, Finland. - 1994. - P.207-208.

19). Новикова И.И., Иващенко В.Г., Калько Г.В., Бойкова И.В., Назаровская Л.А., Литвиненко А.И. Испытание новых биопрепаратов в борьбе с фузариозом колоса // Микология и фитопатология.-1994.-Т.28,-Вып. 1 .-С.70-75.

-2220). Novikova I.I.,Boikova I.V., Konev Ju.E. Pavlushin V.A., Bikova

G.A., Kalko G.N., Sergeyera M.E., Shenin JuJD.,Shopotova L.A. New ecologically clean biopreparation for plant protection // International conference "Biotechnology". St.Peterburg. - 1994. - P.l 11-112.

21). Бойкова И.В., Павлкшпш B.A. Шенин Ю.Д., Смоляницкая

H.М. Исследование метаболита актиномицета, обладающего инсектицидньш действием // Тез.доклжонф. "Экологически безопасные и беспестицидные технологии получения растениеводческой продукции". Пущино. - 1994. - С.-185-186.

22). Новикова И.И., Бойкова И.В., Быкова Г.А. Поиск штаммов микробов-антагонистов, перспективных д ля защиты сельскохозяйственных культур от болезней // Тез.доюиконф."Экологически безопасные и беспестицидные технологии получения растениеводческой продукции" Пущино. - 1994.- С.188-189.

23). Бойкова И.В., Новикова И.И., Шенин Ю.Д. Новые микробные инсектициды на основе аюиномицетов и некоторые аспекты механизма их действия // Тез. докл. Всерос. съезда по защите растений "Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность" С.-П6.-1995,-С.287.

24). Конев Ю.Е., Бойкова И.В., Фельд У.П. Особенности хранения продуцентов БАБ для защиты растений // Тез.докл.Всерос.съезда по защите растений "Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность." С.-П6.-1995-С. 326.

25). Новикова И.И., Бойкова И.В., Матевосян ГЛ. Биопрепараты на основе антагонистов возбудителей болезней растений как стимуляторы роста // Тез. докл. Всерос. съезда по защите растений "Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность" С.-П6.-1995-С.327.

26). Boikova I.V., Konev Ju.E Novikova I.I.,Pavlushin V.A. New biopesticides from actinomycetes producing bioactive secondary metabolites // XIII Int. Plant Protection Congress. The Hague, the Netherlands. -1995. - P. 149.

27). Novikova I.I., Boikova I.V., Bikova G.A., Kalko G.V., Sergeeva M.E. Different approaches in biological control of plant deseases // XIII Int. Plant Protection Congress. The Hague, the Netherlands. -1995.-P. 149.

28). Kalko G.Y., Nazarovskaya L.A., Novikova I.I., Boikova I.V., Ivashenko V.G. Biological control of Fusarium head blight of what caused by