Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические особенности штаммов STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, вызывающих менингиты у детей

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические особенности штаммов STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, вызывающих менингиты у детей"

Г Г 0 Он

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ САНИТАРНО-ЮТИЕНИЧЕСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ВОЛКОВА Марина Олеговна УДК (616-0923616724.002:616.831.92002)-053.2

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ШТАММОВ ЗТЮЯРТОСОСОТЗ Р1Бии0Х1АБ, ВЫЗЫВАЩИХ МЕНИНГИТЫ 7 ДЕТЕЙ

03.00.07 - Микробиология

Авторефе рат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-ПетезЗург 19ЭЗ

Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте детских инфекций.

Научные руководители - доктор медицинских наук, профессор Н.Н.КОСТШОВА,

доктор медицинских наук, доцент В.В.ИВАНОМ.

Официальные оппоненты - член-корреспондент РАМН, доктор

медицинских наук, профессор А.А.ТОТОДЯН,

доктор медицинских наук, професоор К.О.ГРАШТРЕЫ.

Ведущее учреждение - Военно-медицинская академия им.С.Ы.Кирова.

Защита состоится "\£6" 1993 г. в " ' " часов

на заседании специализированного совета (шифр К 084.21.01) при Санкт-Петербургском государственном санитарно-гигиеническом медицинском институте по адресу: 194067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного санитарно-гигиенического медицинского института.

Автореферат разослав

1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук,

профеооор А.Г.Бойцор

Актуальность проблемы. Пневмококковый менингит (DM) у детей продолжает оставаться одной из важнейших проблем здравоохранения по причине значительного удельного веса этих заболеваний в общей структуре острых бактериальных менингитов (ОБМ), высоких показателей летальности и большой частоты неврологических осложнений ( Bolán, 1985; Shelek, 1985$ Еасс P.I., 1988; Сорокина М.Н., 1992).

Не исключая важнейшей роли резистентности организма хозяина в возникновении генерализованной инфекции, существенное значение следует придавать факторам патогенности возбудителя.

■ В настоящее время доказана роль капсулы пневмококка в возникновении менингита и других тяжелых форм пневмококковой инфекции (ПИ) ( Darle, 1968).

Известно, что в развитии любой.генерализованной инфекции решающее значение имеют инвазивные и токсические свойства микроорганизма (Езепчук D.B.,■ 1977). Принято считать, что инвазив-ность пневмококка обеспечивается гиалуронидазой ( Hobby et al., 1941), однако ын не яашли в литературе прямых доказательств роли гиалуронидазы пневмококка в инвазии и способности пгтамма проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).

Исследователи предполагают, что клинические проявления при ЕМ обусловлены действием нескольких токсических продуктов. К их числу относят: уЭ-гемолизин (пневмолизин), продукты энзимного распада клеточной стенки, поверхностный протеин À ( Тоаава »t al., 1985, 1989; Brile» et al., 1988; Lee , I99Í; Boalnole, 1992). Однако частота их выявления и функциональная значимость этих продуктов неизвестна.

В литературе приводятся экспериментальные доказательства токсического действия пневмолизина ( Shuaway et al., 1971; Botilaoie, 1992), который подавляет фагоцитарные механизмы защиты хозяина, ингибирует продукцию иммуноглобулинов ( Paton et al., 1983, 1989). Однако неизвестна роль пневмолизина в возникновении тяжелых форм ПИ, в том числе ПМ.

Единственным кратеряем вирулентности пневмококка продолжает оставаться показатель вирулентности для мыией. В настоящее время установлено, что этот показатель не всегда коррелирует с патогпи-ностью для человека (Резпова С.З., 1988).

Анализ литературы показал, что удельная знгтмость ^лкторов патогэннэстн пчевмог.окка и их да №ïроп:У,оованплл ро.ть на пшляч-

ных этапах инфекционного процесса при менингите не ясна до сих пор. Отсутствие четких критериев патогенности и доступных методов их определения не позволяет выявить среди штаммов, выделенных от носителей, потенциально опасные, а также определить прогноз уже возникшего заболевания пневмококковой природы.

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в выявлении значимости некоторых факторов патогенности пневмококка в развитии ПМ у детей.

В связи с этим в работе были поставлены задачи:

1. Определить следующие признаки патогенности у штаммов пневмококка, выделенных от больных менингитом и другими формами ПИ:

- принадлежность к серовару,

- вирулентность для мышей,

- гиалуронидазная активность (ГА),

- наличие пяевмолизина.

2. Показать роль гиадуронидазы в возникновении ПМ на клиническом материале и в эксперименте.

3. Усовершенствовать методы определения факторов патогенности пневмококка - гиалуровидазы и пневмолизина, сделать.их пригодными, для бактериологических исследований в условиях практики.

4. Определить набор признаков патогенности штаммов пневмококка, характеризующих потенциальную эпидемиологическую опасность здоровых носителей этих шташов.

Научная новизна работы:

1. Впервые установлена корреляция между уровнем ГА, принадлежностью пневмококка к определенным сероварам и возможностью развития Ш.

2. Экспериментально доказана роль уровня ГА штаммов пневмококка в проникновении через ГЭБ и развитии менингита.

3. Впервые показано, что наличие пневмолизина (уЗ-гемолизина) является обязательным признаком шташов, вызывающих менингит.

4. Предложена математическая зависимость, характеризующая потенциальную способность штамма вызывать менингит у человека

. при заражении.

5. Впервые при менингите на основании бактериологических и '

патоморфологических исследований, показана созмохность длительного (до 1,5 месяца; сохранения жизнеспособных клеток пневмококка в мягкой мозговой оболочке, веществе мозга, что способствует затяжному, рецидивирующему течению процесса у детей.

Научно-практическая ценность работы. На основании сравнительной оценки методов микробиологической диагностики ПМ установлено, что реакция непрямой иммунофлюоресценции (РШЙ) является наиболее чувствительным и специфическим методом, позволяющим выявить в спинномозговой жидкости (СМ) пневмококки, не способные к репродукции на искусственных питательных средах. Использование РНИФ обеспечивает раннюю и эффективную диагностику Ш.

Совершенствование микробиологической диагностики ПМ позволило наиболее полно выявить больных этой формой Ш я впервые рассчитать показатели заболеваемости ПМ у детей в Санкт-Петербурге в 1985-1991 гг.

Выявлены доминирующие серовары пневмококка, вызвавшие менингиты у детей в Санкт-Петербурге в 80-е годы: I, 2, б, 15, 19. Определены наиболее вирулентные для детей сероварн^, пневмококка -

I, 2 я 19, что необходимо для разработки диагностических и профилактических препаратов.

Стандартизированы и усовершенствованы методы определения у пневмококка ГА и пновмолизина, которые можно использовать в условиях практики.

На основании полученных результатов составлены и утверждены МЗ РС4СР методические рекомендации "Метод непрямой иммунофлюоресценции в ранней диагностике пневмококковой инфекции у детей" (Л., 1989) (совместно с А.С.Кветной, А.П.Батуро, В.В.Ивановой и др.).

Утверждена заявка на изобретение "Способ моделирования пневмококковой инфекции" X 4808948, положительное решение от

II.II.91 (совместно с Л.В.Говоровой, А.С.Кветной, Р.А.Яасыровнм).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гиалуронидаза пневмококка является фактором, способствующим инвазии и преодолению микроорганизмами ГЭБ.

2, Пневмолизин (¿3 -гемолизин), как один из токсических Докторов пневмококка, имеет значение в развитии менингита.

3. Предложена формула расчета комплексного показателя для оценки степени патогенности пневмококкового штамма, характеризующего потенциальную способность вызывать менингит при заражении этим штаммом.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на: Всесоюзных конференциях "Менингококковая инфекция и гнойные менингиты" (Архангельск, 1986; Новосибирск, 1990); II и 15 итоговых научно-практических конференциях НШ детских инфекций (Санкт-Петербург, 1989, 1993); научной конференции в лаборатории эпидемиологии острых менингитов НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, РАМН (Москва, 1991); 12 Lancefieid интернациональном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям (Санкт-Петербург, 1993).

По теме диссертации опубликовано II работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (4 главы) , обсувдения результатов и заключения, выводов, списка литературы, включающего 90 отечественных и 127 зарубежных источников. Текст иллюстрирован 29 таблицами и 4 рисунками.

Материал и методы исследования. В работе обобщены данные микробиологического обследования 1296 больных OEM разной этиологии, находящихся На лечении в клинике острых' нейроинфекций НИИ детских инфекций Санкт-Петербурга с 1985 по 1991 гг. Благодаря тому, что практически все больные с ОШ госпитализировались в клинику НИИ детских инфекций, мы могли определить частоту встречаемости ПМ в общей структуре OEM и рассчитать показатели заболеваемости этой нозологической формой.

Этиологическую расшифровку менингита проводили на основе' выявления возбудителей или их антигенов в СМ. Антигены Ке1е»е-riae Meningitidis серОГруШ А, В, С, а также Haeaophllua 1»-flueaz»« типа ъ обнаруживали в реакции латекс-агглютинации. В реакции использовали диагностические препараты, полученные из Центрального НИИ эпидемиологии (Москва). В этих исследованиях принимала участие канд.мед.наук Н.А.Коржуева.

Для диагностики ПМ, помимо бактериоскопии и посева CMZ и крови, применяли методы иммунодиагностики:

- РНДО с использованием отечественных экспериментальных

поливалентных снвороток, содержащих антитела к 25 Серова рам пневмококка для выявления капсульного антигена пневмококка в CMS. Сыворотки изготовлены и любезно предоставлены д-ром биологических наук А.П.Батуро (НИИВС им.И.И.Мечникова, РАМН);

- РИГА для определения антипневмококковых антител с использованием дпагностикума, приготовленного по методу И.В.По-ходзей (1981).

Взятие материала и выделение чистых культур от больных гнойными менингитами осуществляли согласно Приложению ft 2 к приказу МЗ СССР № 858 от 01.12.88 "О мерах по совершенствованию лечебно-диагностических и профилактических мероприятий по борьбе с менингококковой инфекцией и внедрению эпидемиологического надзора", а также методическим рекомендациям ВНИИ пульмонологии МЗ СССР, утвержденным Главным уйравлением здравоохранения Исполкома Ленсовета, "Микробиологические и иммунологические методы диагностики инфекционного процесса при неспецифических заболеваниях легких" (Л., 1990).

Объектом исследования служили 289 штаммов пневмококка: 72 штамма были выделены от больных ПМ, госпитализированных в клинику острых нейроинфекций НИИ детских инфекций Санкт-Петербурга, 2 штамма - от больных ПМ были выделены в лаборатории детской больницы И 18 им.Н.Ф.Филатова и 7 - от взрослых больных менингитом получены из НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи (РАМН, Москва), итого 81 штамм от больных ПМ. Дня сравнительной характеристики изучены штаммы пневмококка, выделенные от больных гнойным отитом (78), госпитализированных в клиники НИИ детских инфекций Санкт-Петербурга,и от здоровых носителей (130). С целью получения штаммов от здоровых носителей обследовано 350 детей в возрасте 4-5 лет, посещающих детский сад.

Основными этапами изучения биологических свойств штаммов

были:

- выделение и идентификация культур из патологического материала,

- определение принадлежности к серовару,

- установление вирулентности в отношении белых мыхей ггря внутрибретшнном заражении,

- о.тэтпеление гизлуронидазной активности,

- выяктпнле титр.ч пнег.мзлязина. .

Вср р'.'д.чл'пп'ы1? к.ульгурн гснев\пкэг.ка гйггирова.тя в реакции

агглютинации на стекле с отечественным набором экспериментальных типовых и групповых пневмококковых сывороток, полученных в НИИВС им.И.И.Мечникова, РАМН (д-р биол.наук А.П.Батуро). Параллельно 32 штамма, вызвавших менингит (17) и гнойный отит (15), были типированы в Копенгагене в Seru» Ieetituta в лаборатории доктора Henri cheей'« . Серогруппа пневмококка не совпала только в одном случае. Наряду с серогруппой, у этих 32 шташов был определен тип по белковому антигену. Серогруппу и серотип обозначали как серовар пневмококка.

Вирулентность тестировали на белых мышах массой 14-16 г путем внутрибрюшинного введения различных доз суточной культуры жизнеспособных клеток пневмококка. Уровень вирулентности для мышей устанавливали в соответствии с критериями Ю.В.Резцовой (1988) по /.доопределение ГА штаммов пневмококка проводили по методу UcCleu (1941) в нашей модификации. В качестве субстрата впервые использовали лиофилизированный препарат, который, как показали сравнительные исследования, не уступал нативному препарату, но был более практичен и обеспечивал получение стандартных результатов.

Для выявления пневмолизина применили модифицированный нами метод u,Joh»eo* (1972).

С целью установления роли гиалуронидазы, принадлежности к определенным капсульным сероварам и ß> -гемолитической активности шташов s.piteuaoaiae в развитии ПМ проведено экспериментальное исследование на 500 мышах, 130 крысах и 72 кроликах.

> Результаты собственных исследований. Всего за период с 1985 по i99I гг. в клинике нейроинфекций НИИ детских инфекций находилось на лечении 124 ребенка с ПМ. Культура пневмококка была выделена из СШ у 70 больных (54,6%), у 122 (98.4Î) пневмококки были обнаружены в PH1Ö. Только с помощью ГОИФ пневмококковая природа менингита установлена у 54 (43,656) больных. При бактериоскопии СМИ 124 больных ПМ характерные диплококки выявлены у 102 больных детей (82,3$). В 22 случаях единичные микробные клетки, не обнаруженные при бактериоскопии, были выявлены в РНИФ. Только у двух больных с выделением нетипируемых штаммов пневмококка не было обнаружено специфического свечения в РШ®. Сделано заключена, что РНЮ-высокочувствительный и

специфический метод диагностики ПМ. Получение результатов в течение 1,5-2 ч с момента поступления исследуемого материала в лабораторию позволяет расценивать РНИФ как метод экспресс-диагностики.

Совершенствование микробиологической диагностики позволило наиболее полно выявить больных ПМ среди больных OEM и установить, что в этиологической структуре OEM в I985-I99I гг. ПМ занимали второе место после менингитов, вызванных i.aeniMgitidi« и составляли в разные годы от 5 до V3f> случаев ОБМ.

Показатели заболеваемости ПМ на 100000 у детей до 5 лет колебались от 2,8 до 4,8, а среди детей до 14 лет - от 1,7 до 2,3, что соответствует аналогичным показателям в США и Европе для детей этих возрастных групп (Carrere, 1984; sheiech, 1985). С 1986 г. в связи с внедрением в работу лаборатории РНИ» в Санкт-Петербурге статистически увеличились показатели заболеваемости ПМ, благодаря чему оказалось, что показатели у детей первого года (в среднем 12,3) даже превышали таковые (11,0) в США для этого возраста.

Всего о 1985 по 1991 гг. нами было выделено 72 культура пневмококка от детей, больных Ш1. Из 72 культур 63 имели капсулу и обладали характерными культуральными и морфологическими особенностями.

У 9 больных на фоне антибактериальной терапии выделены бескалсульные, спонтанно агглютинирующиеся штаммы пневмококка, не всегда типичные по культуральным и морфологическим особенностям. Однако слабое специфическое свечение отдельных участков полисахаридной капсулы, обнаруженное в РШЙ, позволило отнести ИХ К S. pneunoniae.

Нами было выявлено 19 серологических разновидностей 3. p*eunoei«e при ПМ. Чаще всего выделялись штаммы сероваров 19, I, 6, 15 и 2, составившие 67,7? всех тшгаруемых культур пневмококка, выделенных прп этом заболевании, что свидетельствует о повышенной вирулентности этих сероваров для детей. Однако анализ историй болезни больных ПМ показал, что летальные исходы и тяжелые осложнения (дислокационный синдром и субдураль-ный выпот) достоверно чаше (р<0,05) возникали при ПМ, вызванном сероварами 19, I, 2. Серовары 19, 6, I выделялись и от больных друг;'ил фоэташ; ПИ, в том чпсло и от бактерионосителей. Эти серологические ршяоврлности янегмококмл вигывявт ген?ро.тя-

зованные ПИ у детей во всем мире. Однако исследователи отмечают, что пневмококки сероваров I и 2 в европейских странах в 80-е годы встречались крайне редко ( Kali« et al., 1980; aub-triim, 1989).

Путем многократных исследований вами подтвержден затяжной характер течения воспалительного процесса при ПМ у 5 больных, когда пневмококк был обнаружен с помощью ЙШ на 6-й, 14-й,

15-й, 20-й дни антибактериальной терапии. У одной больной удалось повторно выделить культуру пневмококка серовара 15 на

16-й день антибактериальной терапии, высокочувствительную к пенициллину.

Исследования, проведенные совместно с В.А.Цинзерлингом, показали, что пневмококк может длительно (до 1,5 месяца) сохраняться в мягкой мозговой оболочке и веществе мозга. В этом случае на фоне развивающихся склеротических процессов, вероятно, препятствующих проникновению антибиотиков, в мягкой мозговой оболочке и веществе мозга сохраняются участки воспаления и жизнеспособных микроорганизмов. В литературе имеются указания на возможность длительной персистенции пневмококка в организме животных (Винник, 1982). Длительная парсистенция пневмококка в организме человека при ПМ бактериологически и морфологически подтверждена впервые.

С целью изучения специфического иммунного ответа у больных ПМ нами был приготовлен (по методу И.В.Походзей) диагностический препарат, включающий актуальные серовари пневмококка - I, 2, 3, 6, 19 для РИГА. Всего изучено 30 пар сывороток от больных ПМ и 25 парных сывороток от больных менингитами другой этиологии. Титр антител в РИГА колебался от 0 до 256. Исследования показали высокую специфичность метода, однако титр антипневмококковых антител не являлся показателем высокой защищенности организма. Так, у 6 больных с тигром более 64 заболевание закончилось летально.

Более детальному изучению были подвергнуты 39 шташов пневмококка, выделенных от больных менингитом, хранившихся в лиофилизарованном состоянии.

Обнаружено, что ПЫ у детей вызывали как высоко-, так и низковирулентные для мышей штаммы пневмококка. Из 39 штаммов только 12 (30,8±7,3£) были высоковирулентны для мышей ( TjerHpg штамма (ю,2±4,8#) - умеренно вирулентны

3<:6) и более половины - 23 штамма (59,0+7,850 низковирулентны для мышей ( б). Таким образом, показатель вирулентности для мышей не коррелировал с развитием генерализованной Пй.

Однако этот показатель коррелировал с принадлежностью штаммов к определенным капсульным сероварам, и 25 из 26 штаммов, принадлежащих к сероварам I, 2, 3 и 4, независимо от источника выделения, были высоковирулентны для мышей.

В результате изучения ГА у 195 штаммов пневмококка, выделенных при различных формах ПИ, установлено, что ГА является стойким свойством штамма и сохраняется, несмотря на многократные пересевы и лиофилизацию, яо в случае утраты штаммом капсулы ГА исчезала.

Оказалось, что все изученные 39 штаммов,'вызвавшие ПМ и 84,шташов, выделенные от больных гнойным отитом (22 из 26), продуцировали гиалуронидазу. Среди 130 штаммов, полученных от здоровых носителей, ГА встречалась достоверно реже - в 11,55?. Более того, активность гиалуронидазы (судя по титрам) штаммов, ввделенных в группах инфицированных лиц, была различной. Средняя геометрическая титров гиалуронидазы у штаммов, вызвавших менингит, была достоверно выше, чем у штаммов, вызвавших отит (р<0,001), в .то же время достоверных различий между средними геометрическими титров ГА у штаммов, ввделенных от носителей и от больных менингитом, не обнаружено. Это, вероятно, связано с незначительным числом наблюдений и большим разбросом показателей ГА в группе штаммов, ввделенных от здоровых носителей (коэффициент вариации в этой группе штаммов составил 55,75?). Не исключено, что носители штаммов пневмококка с высокой ГА могли быть потенциальными источниками штаммов, способных внзвiaть менингит.

Пневмококки различных сероваров, выделенные при разных формах ПИ, обладали широким спектром показателей ГА. Вместе с тем среди высоковирулентша для мышей а там;.1 о в сероваров I, 2 и 3 низкие тятры гиалуронидазы выявлены достоверно чало (р<0,005), чем среди пневмококков сероварон б, 19, иизковирулентных для ш-шей. Возможно, что гиалуронилаза не являгтся елянствчччыи фактором инвязии, и высоковирулентные для мни* Я втив« гяа?и-жо-тгл мене* нуждгоотся в птом {-азмонте.

Оценка урормег! ГА етл.чмое пнегмжокя.а. £УДлл°ия>г.т от бол.-.

ных различными формами ПИ, позволила нам придти к заключению, что гиалуронидазе принадлежит существенная роль в возникновении генерализованной инфекции, в частности ПМ. Чтобы доказать вту роль гиалуронидазы, мы провели три серии экспериментальных исследований. Генерализованную ПИ воспроизводили путем интра-назального заражения, т.е. соблюдая естественные условия, при которых пневмококк из носоглотки, преодолевая барьер слизистых оболочек, а 8атем ГЭБ, проникает в мозг экспериментальных животных. Была изучена способность II культур пневмококка, выделенных при различных формах инфекции и обладающих разными биологическими свойствами, проникать через ГЭБ мышей при ивтрана-зальном заражении. При введении высоковирулентных для мышей штаммов сероваров I и 3 все животные погибли от генерализованной ПИ. Мы сочли, что действие фактора "токсичности для мышей" экранировало роль гиалуронидазы, поэтому следующую серию опытов провели на штаммах, обладающих низкой вирулентностью для мышей при внутрибрюшинном заражении. Использование малотоксичных для мышей штаммов давало возможность проследить за развитием инфекции в течение нескольких дней. Оказалось, что только'штаммы с титром гиалуронидазы 8 и выше были способны проникать через ГЭБ (табл.1).

Учитывая высокую чувствительность мышей к штаммам пневмококка некоторых сероваров, мы повторили аналогичные исследования на животных, обладающих видовой устойчивостью к пневмококкам - крысах. С этой целью наш разработана модель генерализованной ПИ у белых крыс. Для повышения проницаемости ГЭБ применяли комплексное введение «с - и уЗ -адреноблокаторов: фентол-амина и обзидана.

Комплекс адреноблокаторов применялся наш для снижения эффекта симпатической нервной системы на ткани мозга, легких и других органов, блокады регулирующего влияния симпатической нервной системы на ГЭБ, для обеспечения лучшего проникновения пневмококков со слизистой оболочки носоглотки в кровь и из крови в различные органы и головной мозг.

Заражение интактных крыс (без адреноблокады) приводило, как правило, к проникновению пневмококка в легкие и у часта животных - в селезенку. Однако в этой группе не было отмечено признаков развития заболевания. В опытных группах животных,

Таблица I

Влияние уровня гиалуронидазной активности на результата двтраназального заражения кшшй

штаммаш Й. рпшпе^ае. С 2. />.)

* штамма Серовар Источник выделения Титр гиалуро-нвдазы Число зараженных животных Число умерших живот- ВццаденЕ туры ¡.р. случа е куль- (число 18В) Обнаружение •?./>. в РШ® (число случаев)

акт КЗ легких из мозга в легких в мозге

304 ' 19 32 30 3 20 14 30 28

226 19 □а 8 30 3 16 П 30 25

954 6 32 ф 3 18 12 30 30

963 19 Зев 8" 30 4 146 12 30 27

5309 19 Гной из уха 2 • 30 I 4 ь 16 0

5614 6 2 30. 0 I 0 8 0

1485. Нетипи-руеыый 0 . 30 0 3 0 6 0

зараженных на фоне адреноблокады, только штаммы пневмококка с высоким титром гиалуронидазы (8 и выше) смогли проникнуть со слизистой носа крысы в головной мозг, преодолев ГЭБ. Только у животных, зараженных на фоне адреноблокады штаммами пневмококка с высоким титром гиалуронидазы, на 2-3 сутки наблюдались типичные признаки заболевания: конъюнктивит (35!?), вялость, некорди-нированность движений, гибель животных. В целом на 5-е сутки погибло 10 крыс из 25. В го же время в группе животных, зара-женних штаммами пневмококка, не продуцирупцими гиалуронидазу, как на фоне адреноблокады, так и без нее не развивалась генерализованная ПИ.

Для подтверждения ведущей роли гиалуронидазы в инвазии пневмококка и развитии ПМ мы провели экспериментальное исследование на мышах о использованием коммерческой гиалуронидазы фирмы йвап»1. В эксперименте изучали 6 штаммов пневмококка, принадлежащих к различным сероварам я выделенных при разных формах Ш. Три культуры из б продуцировали гиалуронидазу в низком тигре - менее 2, а три - в гитре 16 и выше. Опытным мышам вводили янтравазальпо культуру пневмококка одновременно с гиалуронида-зой, в объеме 0,2 ил (0,1 мл культуры и 0,1 мл гиалуронидазы). В эксперименте использовали коммерческую гиалуронидазу в концентрации 1800 ед/мя, экспериментально установленной Т.К.Мироновой с соавг. (1983). При этой концентрации гиалуронидазы не происходило проникновение в кровь посторонней микрофлоры, обитающей на слизистой оболочке. Результаты, полученные в контрольных опытах, показали, что штаммы пневмококка, не продуцирующие гиалуронидазу Или продуцирующие ее в низком титре, не способны проникать через ГЭБ и не били обнаружены в ткани мозга. Однако присутствие экзогенной гиалуронидазы привело к проникновению этих же штаммов со слизистой носа через ГЭБ в головной мозг. Штаммы пневмококка, продуцирующие гиалуронидазу в высоком титре, проникали в головной мозг как в присутствии экзогенной гиалуронидазы, так в без нее. Следовательно, гиалуронидаза является важнейшим фактором патогенности пневмококка, ответственным за преодоление ГЭБ.

Взяв за основу существующие методические принципы определения иневмолизина (Ьог1м, 1971; аоЬивоп, 1972), намя разработан простой и доступный метод количественного выявления [Ъ -гемолитической активности штатов пневмококка. Показано, что куль-

туральная жидкость через 24 ч инкубации при температуре 37°С обладает максимальной гемолитической активностью по сравнению с культурами других сроков. Это происходит в связи с естественным аутолнзом микробных клеток, который наблюдается в бульоне с лецитином после 24 ч хранения, что и способствует выходу пневмоли-зина в среду.

Гемолитическую активность шташов пневмококка оценивали в титрах. Титр пневмолизина - максимальное разведение 24-часовой культуральной жидкости, при котором еще происходил полный гемолиз эритроцитов. Оказалось, что пневмолизином обладают практически все капсульные и 30,5? бескапсульных штаммов пневмококка. Пневмолизин обнаруживался у всех 39 штаммов, вызвавших менингит, у 25 из 26, выделенных от больных гнойным отитом, а также у 32 из 57 (56,050 шташов, полученных от здоровых носителей.

Между средними геометрическими титров пневмолизина шташов, выделенных от больных с различными формами ПИ и от здоровых носителей, достоверных различий на обнаружено. Вместе о тем, среди шташов, вызвавших ПМ и гнойный отит, достоверно чаще (р<0,001) встречались культуры с титром пневмолизина 64 и выше по сравнению со штатами, выделенными от здоровых носителей.

Неожиданные результаты получены в отношении четырех штаммов, принадлежащих к Сероварам I, 2 и вызвавших тяжелые менинго-энцефалиты у детей. Эти штаммы пневмококка обладали низкой ГА и низким титром пневмолизина, однако'были высоковпрулентны для мы-', шей. Видимо, у шташов сероваров I, 2 в патогенезе менингита может принимать участие и фактор, ответственный за высокую вирулентность для мышей.

Изучение токсических свойств пневмококка на модели ПМ у кроликов, полученной при субокципитальном заражении (по Бассу, 1988), показало, что в развитии клинических проявлений заболевания имели значение принадлежность шташов к определенным кап-сульным сероварам и, вероятно, ¡Ъ -гемолитическая активность шташов пневмококка. Штаммы, не обладающие капсулой и пневмолизином, не были способны вызывать менингит у кроликов даже при субокципитальном заражении. Однако доказательство значимости пневмолизина в патогенез? ПИ требует специального изучения.

Подобно другим микроорганизмам патогенное» пневмококка является полидетерминантным признаком я определяется наличием ряда

свойств, не всегда зависящих друг от друга (Петровская, 1982).

Мы показали, что в развитии ПМ имеет значение принадлежность штамма к определенным сероварам (I, 2 и 19), ГА и наличие пневмолизина. Нами обнаружена обратная корреляция между показа-, телями вирулентности для мышей и титром пневмолизина, вирулентностью для мышей и ГА, но прямая - между ГА и титром пневмолизина. Коэффициенты корреляции были средними и составили соответственно: -0,487, -0,420 и +0,475. Поэтому для определения степени патогенности циркулирующих штаммов пневмококка необходима комплексная оценка трех факторов патогенности: принадлежности к определенным сероварам, ГА и титра пневмолизина. Влияние этих трех факторов на вероятность развития ПМ мы оценили методом факторного анализа (Ермаков и др., 1987), максимальные и минимальные значения этих факторов приведены в табл.2.

Таблица 2

Интервалы изменения факторов патогенности штаммов

S. pnouaoniae

Факторы Интервалы изменения

минимальное значение (-1) максимальное значение (+1)

I. Гиалуронядазная активность П До 4 8

2. Титр пневмолизина 12 До 32 64

3. Принадлежность к сероварам ХЗ

I, 2, 19 +

Для расчета комплексного показателя (Р), характеризующего способность штамма вызывать ПМ, использовали результаты изучения факторов патогенности капсульных штаммов пневмококка, выделенных при различных формах ПИ (86 штаммов). Наш была получена следующая математическая зависимость:

Р - 0,47 + 0,2X1 - 0,01X2 + 0,17X3. (I)

Из зависимости (I) видно, что наиболее существенное влияете на величину показателя Р оказывают факторы XI и ХЗ, а фактор 12 (титр пневмолизина) практически не влияет на значение Р. Это подтверждает ноле мневяе, что в развитии заболевания имеет

значение факт наличия пневмолизина, независимо от его титра. Поэтому показатель Х2 можно исключить из формулы (I). Тогда зависимость будет представлена в следующем виде:

Р => 0,47 + 0,2011 + 0,17X3. (2)

Данная зависимость может быть использована для сравнительной оценки потенциальной эпидемиологической опасности штаммов пневмококка, ввделенных от здоровых носителей. Зависимость позволяет выделить три степени вирулентности пневмококка для человека: I) высоковирулентные штаммы, у которых Р=0,84; 2) умеренно вирулентные (В=0,44-0,50); 3) низковирулентныв штаммы

Среди 39 штаммов пневмококка, выделенных от больных менингитом, 12 шташов были высоковирулентны, 25 - умеренно вирулентны и в двух случаях ПМ был вызван низковирулентными штаммами. В одном из этих случаев у девочки из СМХ одновременно были выделены два возбудителя: s. paeuaoaiae И Н. iaflueazaa. ВОЗМОЖНО, этот штамм пневмококка не смог бы самостоятельно преодолеть ГЭБ и вызвать менингит. В другом случае имел место не гематогён-ный, а контактный путь распространения инфекции, и данный штамм пневмококка не преодолевал ГЭБ.

Из 12 больных ПМ, у которых были выделены высоковпрулент-ные штаммы, 10 детей погибло, а в 2 случаях развились крайне тяжелые неврологические осложнения; отмечено, что из 25 больных ПМ, вызванным умеренно вирулентными штаммами, 5 погибло.

Высоковарулентные штаммы пневмококка встречались и среди капсульных шташов, выделенных от больных гнойным отитом (3 из "26) и от здоровых носителей (2 из 21). Циркуляция таких шташов среда здоровых носителей представляет серьезную эпидемиологическую опасность.

ВЫВОДЫ

I. Сочетание бактериологической диагностика пневмококковых менингитов с методом непрямой иммунофлюоресценции, определяющим в CMS пневмококки, утратившие способность к репродукции на искусственных .питательных средах, позволило наиболее полно выявить больных пневмококковым менингитом.

2. Впервые рассчитаны показатели заболеваемости пневмококковым менингитом на 100000 детей в Санкт-Петербурге в возрасте до I года, от 0 до 5 лет и от 0 до 14 лет в период с 1985 по 1991 гг. Средние показатели заболеваемости за 7 лет составили соответственно 12,3; 3,9 и 2,1.

3. Выявлены доминирующие серовары пневмококка, вызвавшие мениагитн у детей Санкт-Петербурга в 80-е годы: I, 2, 6, 15, 19. Наиболее патогенными для детей были серовары пневмококка 19, I

И 2.

4. Изучение 195 штаммов пневмококка, выделенных при различных формах пневмококковой инфекции, позволило впервые показать, что штаммы пневмококка, выделенные от больных менингитом, обладали наиболее высоким уровнем гиалуронидазной активности.

5. Впервые на специально разработанных моделях экспериментально доказана роль степени гиалуронидазной активности в пре-. одолении штаммами пневмококка гемагоэнцефшшческого барьера.

6. Пневмолизин (/в -гемолизин) обнаружен с помощью модифицированного полуколичественного метода у всех штаммов, вызвавших менингит, а также у 25 из 26, выделенных при гнойном отите, но только у 56,0^ штаммов, полученных от здоровых носителей. Установление удельной значимости пневмолизина в патогенезе пневмококковой инфекции требует специального изучения.

7. Роль фактора патогенности пневмококка, определяемого по способности вызывать смертельную инфекцию у мышей при внутри-брюшинном заражении, в развитии менингита у человека пока не ясна.

• 8. Рассчитан комплексный показатель, характеризующий способность пневмококка вызывать менингит, который может служить критерием патогенности циркулирующих штаммов пневмококка и использоваться для прогноза течения заболевания у инфицированного лица и в эпидемиологической практике.

9. С помощью диагностикума, приготовленного из штаммов актуальных сероваров пневмококка, проведено определение антипневмококковых антител в динамике у 30 больных пневмококковым менингитом и выявлено, что нарастание титра антител в процессе заболевания не является показателем высокой защищенности организма.

10. На основании бактериологических и патоморфологических

исследований впервые при менингите показана возможность длительного (до 1,5 месяца) сохранения жизнеспособных клеток пневмококка в мягкой мозговой оболочке, веществе мозга, что является предпосылкой для затяжного, рецидивирующего течения процесса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Кветная A.C., Волкова М.О. Тактика лабораторного этиологического диагноза пневмококкового менингита у детей// Менинго-кокковая инфекция и гнойные менингиты: Тез.докл. (24-25 сентября, 1986, Архангельск). - Архангельск, 1986. - С.145-147.

2. Цинзерлинг В.А., Сорокина U.R., Волкова М.О., Басс Р.Л., Зайцев B.C., Коржуева H.A., Березина Н.В. Патологическая анатомия и некоторые вопросы патогенеза пневмококковых менингитов у детей// Архив патологии. - 1987. - J* 4. - 0.38-45.

3. Коржуева H.A., Кветная A.C., Волкова М.О., Кашкин Г.С. Лабораторный этиологический диагноз генерализованных форы ые-нингококковой инфекции, других бактериальных менингитов и менин- . гоэнцефалитов у детей// Реанимационная а интенсивная терапия

рри острых инфекционных болезнях у детей. - Л., 1988. - С.81-95.

4. Сорокина М.Н., Басс Р.Л., Зинчанко А.П., Дадиомова М.А., Кошель Е.М., Цинзерлинг В.А., Корасуева H.A., Волкова М.О., Ген-дельс Б.С., Васильева Т.Г. Эндолюбальные ликворотрансфузии в комплексной терапии менингоэнцефалитов с судорожно-коматозным синдромом у детей// Реанимационная и Интенсивная терапия при острых инфекционных заболеваниях у детей. - Л., 1988.- C.I23-I3I.'

5. Басс Р.Л., Гендельс Б.С., Корасуева H.A., Волкова М.О. Ликворотрансфузия в комплексной терапии экспериментального пнев-

, мококкового менингоэнцефалита// Менингококковая инфекция и гнойные менингиты: Тез.докл. (24-25 сентября, 1986, Архангельск). -Архангельск, 1986. - C.26I-264.

6. Кветная A.C., Батуро'А.П., Иванова В.В., Курбатова'Г.П., Волкова U.O., Абрамова Н.В., Орехова E.H., Сорокина М.Н. Метод непрямой иммунофлюоресценции в ранней диагностика пневмококковой инфекции у детей: Методические рекомендации. - Л., 1986. - 12 с.

7. Кветная A.C., Чистякова Ю.В., Абрамова Н.В., Волкова М.О. Биологическая характеристика штаммов streptococcus pneu-aoxiae, выделенных при пйевмококковых заболеваниях у детей// Ж.микробиол. - 1989. - » 4. - С.25-30.

8. Кветная A.C., Батуро А.П., Орехова E.H., Абрамова Н.В.,

Волкова И.О. Диагностика пневмококкового отита у детей// latí, дело. - 1990. - Л 8. - С.74-75.

,9. Сорокина М.Н., Ёасс РЛ., Алексеева Л.А., Волкова М.О., Кветная A.A., Андрусенко A.M., Титова И.В., Жадовская И.С. Пневмококковый мевингоэндефалит у детей// Детские инфекции: Сб./ НИИЭМ им.Пастера и НИИ детских инфекций. - JH., 1990. - С.73-80.

10. Костюкова H.H., Корвуева H.A., Деркач С.А., Багиро-ва Л.Ш., Мерэенок З.А., Гулылан Л.А., Волкова М.О. Этиологическая структура острых бактериальных менингитов в различных регионах// Ж.микробиол. - 1992. - Ä 7-8. - C.I4-I7.

11. Волкова И.О., Костюкова H.H., Кветяая A.C. Роль гиалу-ронидазы в возникновении генерализованной пневмококковой инфекции// Ж.микробиол. - 1993 (в печати).