Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические, физико-химические и молекулярно-генетические свойства герпесвируса сибирского осетра

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологические, физико-химические и молекулярно-генетические свойства герпесвируса сибирского осетра"

УДК 639.3.091:619:578

На правах рукописи

Щелкунов Артем Игоревич

БИОЛОГИЧЕСКИЕ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГЕРПЕСВИРУСА СИБИРСКОГО ОСЕТРА

03.02.02 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 о

Покров - 2010 г.

004602343

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском науч! исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии (ГТ ВНИИВВиМ) РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ и Федеральном государственн унитарном предприятии "Всероссийский научно-исследовательский инстит пресноводного рыбного хозяйства" (ФГУП "ВНИИПРХ") Федерального агента по рыболовству

Научный руководитель:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

кандидат биологических наук

Балышева Вера Ивановна

Пономарев Виктор Николаевич Пыльнов Владимир Александрович

Ведущее учреждение: Государственное научное учреждение Всероссийск научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринар им. Я.Р. Коваленко РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (ГНУ ВИЭВ, г. Москва)

Защита состоится 27 мая 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного сове Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийском научь исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии (ГЬ ВНИИВВиМ) РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ по адресу: 601120, г. Покр

Владимирской области, ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ. Тел./фа: (49243) 62125

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Автореферат разослан "22" апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.А. Балашова

1 Общая характеристика работы 1.1 Актуальность темы

Промышленному выращиванию осетровых рыб уделяется возрастающее внимание во всем мире. Это обусловлено, с одной стороны, угрозой исчезновения ценных видов осетровых рыб, а с другой, - значительным увеличением спроса на деликатесную продукцию - икру и мясо осетровых.

Вмсстс с тем опыт показывает, что интенсификация аквакультуры сопряжена с появлением ряда негативных факторов, одним из главных среди которых являются болезни объектов разведения. Как и в аквакультуре в целом, основной ущерб осетроводству наносят вирусные болезни [Hedrick et al., 2001].

Первые работы по изучению вирусных болезней осетровых рыб были выполнены в США Р. Хедриком в середине 80-х годов прошлого столетия, в лаборатории которого получены первые линии клеток белого осетра и впервые выделены вирусы осетровых рыб. На сегодня у североамериканских видов осетровых обнаружено 10 разных вирусов, наиболее опасными из которых являются: аденовирус, иридовирус и два герпесвируса белого осетра [Hedrick et al., 1985; Watson et al., 1995; Georgiadis et al., 2000]. Эти вирусы вызывают болезни у мальков и сеголетков белого осетра, которые обычно развиваются весной или в начале лета, реже - осенью.

Осетроводство в России в последние годы становится одной из наиболее перспективных отраслей аквакультуры. В результате обследований культивируемых осетровых рыб вирусных агентов до последнего времени обнаружено не было [Щелкунов И.С, 2000; 2006].

Весной 2006 г. на племенном рыбоводном предприятии - Конаковском заводе товарного осетроводства (КЗТО, Тверская обл.) наблюдали массовую гибель сеголетков сибирского осетра, Acipenser baeri, которая в отдельных партиях доходила до 100%. Аналогичные вспышки болезни регистрировали позднее в других осетровых хозяйствах.

Исключение паразитов и бактерий как возможных возбудителей указывало на необходимость проведения исследований по установлению роли вирусов в этиологии этой болезни.

1.2 Цель и задачи исследований

Целью данной работы явилось установление этиологии выявленной опасной болезни российских осетровых рыб и изучение биологических, физико-химических и

молекулярно-генетических свойств возбудителя.

Для достижения данной цели необходимо было решить следующие задачи:

- установить роль вирусов в этиологии болезни;

- изучить клиническую, патологоанатомическую картину и эпизоотологическ! особенности болезни;

- изучить биологические, морфологические, физико-химические и молекулярн генетические свойства выделенного вируса;

- оптимизировать технологические параметры культивирования вируса;

- разработать высокочувствительный метод выделения вируса;

- провести паспортизацию и депонирование выделенного вируса в муз! микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ.

13 Научная новнзнп

Впервые диагностирована вирусная болезнь у осетровых рыб в России и выделен вирус-возбудитель от неамериканских видов осетровых рыб.

Изучены биологические, морфологические, физико-химические и молекулярн генетические свойства выделенного вируса.

Показано тесное генетическое родство выделенного вируса североамериканскими изолятами герпесвируса осетровых рыб второго типа (АсМУ-2).

1.4 Практическая значимость

Описана опасная вирусная болезнь российских осетровых рыб.

Разработан высокочувствительный метод выделения герпесвируса 1 клинического материала от рыб и подана заявка на его патентование (№ 2009118870 ( 20.05.2009).

Получена гипериммунная антисыворотка сибирского осетра с высокими титрал нейтрализующих антател к возбудителю болезни.

Определены технологические параметры культивирования герпесвируса.

Возбудитель болезни и антисыворотка к нему паспортизированы и депонировав в музее микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ (инв. № 2780 и 2780а, соответственно) используются при проведении НИР и диагностических исследований.

1.5 Основные положения, выносимые на защиту:

- выявление опасной болезни молоди российских осетровых рыб, имеющ< вирусную природу и представляющей серьезную угрозу отечественному осетроводству;

- биологические, морфологические, физико-химические и молекулярно-генетические свойства вируса-возбудителя болезни позволяющие отнести его к герпесвирусу осетровых рыб 2 типа семейства/4//о/гег/р&тогкгЬе порядка НегреюгЫег,

- оптимизированные технологические параметры культивирования герпесвируса;

- высокочувствительный метод выделения герпесвируса с использованием эксплантатов покровных тканей исследуемых рыб, увеличивающий содержание вируса в клиническом материале в 100 и более раз и повышающий частоту его выделения от рыб по сравнению с традиционным методом.

1.6 Апробация и публикация результатов работы

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии в 2006-2009 г.г.; Международном симпозиуме "Тепловодная аквакультура и биологическая продуктивность водоемов аридного климата" (16-18 апреля 2007 г., г. Астрахань); Международной научно-практической конференции "Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел" (9-10 октября 2008 г., г. Москва); Третьей двусторонней российско-американской конференции "Здоровье водных животных" (12-20 июля 2009 г., г. Шефердстаун, шт. Западная Вирджиния, США).

Основные результаты диссертации опубликованы в 9 научных работах, в том числе: 2 статьи в журналах по перечню ВАК, 1 статья в центральном зарубежном журнале, 2 статьи в сборниках научных трудов (1 из них в зарубежном), 4 - в материалах научных конференций.

1.7 Личный вклад

Все разделы диссертационной работы выполнены автором самостоятельно.

Исследования проведены в лабораториях ихтиопатологии ФГУП "ВНИИПРХ", "Здоровье гидробионтов" и "Биология и культивирование вирусов" ГНУ ВНИИВВиМ.

Автор выражает глубокую признательность за оказание консультативной и научно-методической помощи сотрудникам лаборатории морфологии микроорганизмов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва при изучении морфологии и морфогенеза герпесвируса, сотрудникам кафедры медицины и эпидемиологии Калифорнийского университета США - при проведении молекулярно-

генетического анализа вирусной ДНК, сотрудникам лаборатории "Конструирован биопрепаратов" ГНУ ВНИИВВиМ - при проведении работы по лиофилизаи герпесвируса сибирского осетра и антисыворотки к нему.

1.8 Объем и структура работы Диссертация изложена на 137 страницах, иллюстрирована 18 таблицами, рисунками и дополнена 4 приложениями. Список используемой литературы включ; 206 источников, из которых 195 - иностранные.

2 Собственные исследования 2.1 Материалы и методы Рыба: сибирский и русский осетры, стерлядь, белуга, бестер, гибрид русск осетр х ленский осетр, гибрид стерлядь х бестер, карп и радужная форель получены рыбоводных хозяйств России и Казахстана

Кролики - беспородные серые, получены из хозяйства Владимирской обл. Культуры клеток. Перевиваемые линии клеток рыб: пула печени, почки селезенки (SSO-1, SSO-2, SSO-3) и плавников (SSF-1, SSF-2) сибирского ocei [Щелкунова и др., 1997]; кожи белого осетра (WSSK-1) [Hedrick et al., 1991]; хвостовс стебля синежаберного солнечника (BF-2) [Wolf, Quimby, 1967]; плавников (CTF, CTF, и яичников (ICO) неполовозрелого карпа [Shchelkunov et al., 1995]; эпидермальн новообразований больного оспой карпа (ЕРС) [Fijan et al., 1983]; хвостового creí черного толстоголова (FHM) [Gravell, Malsberger, 1965]; эмбриона чавычи (CHSE-2 [Nims et al., 1970]; гонад радужной форели (RTG-2) [Wolf, Quimby, I960]; артсриалы луковицы мозамбикской тиляпии (TmB) [Lewis, Marks, 1985]. SSO-1, SSO-2, SSC SSF-1, SSF-2, CTF, CTF/T и ICO получены в лаборатории ихтиопатологии ФП "ВНИИПРХ". Остальные клеточные линии были любезно предоставлены зарубежны коллегами.

Перевиваемые линии клеток почки теленка (MDBK/EC) и почки зелен мартышки (VERO), первичная культура клеток фибробластов эмбрионов кур (Ф2 получены из "Лаборатории культур клеток с музеем штаммов" ГНУ ВНИИВВиМ.

Питательные среды, растворы и сыворотки: среда Игла MEM с двойк набором аминокислот и витаминов (2МЕМ), среда 199, сыворотка крови плода коро (СПК), раствор трипсина (0,25%), раствор версена (0,02%), 1М Нерез-буфер (рН 5,5; (

6

7,0; 7,5; 8,5), трис-HCl буфер с pH 8,0. Питательные среды: МПБ, МПА, Сабуро.

Криопротекторы при лиофилизации: обезжиренное молоко, пептон :лактоза:желатин (20%:20:2%), СПК.

Праймеры: комплементарные последовательностям участка гена ДНК-полимеразы - HV 5'-CGG ААТ ТСТ AGA YTT YGC NWS NYT NTA YCC-3' и Cons 5-CCC GAA TTC AGA ТСТ CNG TRT CNC CRT A-3'; комплементарные последовательностям участка гена терминазы - TemiF2 5-GCM MGR GGA CAG AWC CCM G-3' и Tersal-3Rdeg 5'-GGT GCA CAC RCC MAD IGA CG-3' [Kurobe et al, 2008].

Культтирование перевиваемых клеточных линий рыб и теплокровных животных проводили согласно рекомендациям, описанным авторами для каждой линии.

Вирусологические методы. Отбор и обработку патологического материала, выделение вируса из патологического материала, накопление вируса в культурах клеток, экспериментальное воспроизведение заболевания, титрование вируса в культурах клеток проводили согласно принятым методам [Метод, указания по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб, 1998]. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча.

Изучение влияния физических и химических факторов и условий хранения на инфекционную активность вируса проводили по общепринятым в вирусологии методам [Лярски, 1980; Ahne, 1982].

Получение гипериммунных антисывороток. Антисыворотки получали гипериммунизацией кроликов культуральным герпесвирусом, сконцентрированным с помощью ПЭГ 6000 в 500-800 раз и инактивированным 0,4% формалином (одна внутримышечная с полным адъювантом Фрейнда и две внутривенных инъекции), и после однократной внутрибрюшинной инъекции двухгодовикам-реконвалесцентам сибирского осетра культурального вируса (105'63ТЦЦ5о/рыба) через 152 суток после заражения.

Титр вируснейтрализующих антител в сыворотках крови определяли в реакции нейтрализации в культуре клеток SSO-2 по общепринятой методике [Лярски, 1980; Метод, указ. по идентификации вирусов и лаб. диагностике вирусных болезней рыб, 1998].

Тестирование герпесвируса сибирского осетра на контаминацию посторонними микроорганизмами проводили по ГОСТу 28085 высевом на

питательные среды МПБ, МПА, Сабуро.

Электронно-микроскопические исследования. Образцы ткан

экспериментально зараженных сеголетков сибирского осетра и зараженной культу] клеток SSF-2 фиксировали по Ито и Карновскому ßto, Karnovsky, 1968], обезвоживал! спиртах восходящей концентрации и заливали в метакрилатную заливочную среду I White (PLANO W. Plannet GmbH). Ультратонкие срезы контрастировали цитрат свинца по Рейнолдсу [Reynolds, 1963] и исследовали в электронном микроскопе п инструментальном увеличении 20000-40000х.

Молекулярно-генетические исследования. Тотальную ДНК из клеток лин SSO-2, зараженной тремя вирусными изолятами (SKI/0406, SK2/0506 и ВК/050 выделяли с помощью коммерческого набора "РИБО-преп" ЦНИИ эпидемиолог Роспотребнадзора. Выделенную ДНК использовали для ПЦР-амплификации фрагмент двух вирусных генов - ДНК-полимеразы и терминазы. Амплифицированные фрагмен клонировали в бактериальном векторе £ coli, штамм DH5a, секвенировали выравнивали в сравнении с последовательностями североамериканских штамм герпесвирусов осетровых рыб с использованием прикладной программы Clustal [Thompson et al., 1994]. Филогенетический анализ последовательностей проводили помощью программы Phylip [Felsenstein, 1990].

Статистические методы. Статистическую обработку полученных данн] проводили общепринятыми методами [Лакин, 1990].

2.2 Результаты исследований 2.2.1 Выделение вируса от естественно больных рыб

Во время вспышки болезни среди сеголетков сибирского осетра на КЗТО образцов пораженных тканей ротового аппарата и жабр в клеточных линиях SSO SSF-2 и WSSK-1 был выделен цитопатогенный агент (изоляты SKI/0406, SK2/05I ВК/0506). Содержание выделенного агента в тканях рыб находилось на высоком уроЕ (10б-107ТЦД5о/г ткани). Было сделано предположение о его вирусной природе.

Электронно-микроскопическое исследование препаратов зараженной культу] клеток SSF-2 позволило выявить в ядрах инфицированных клеток скопления пустых заполненных нуклеиновой кислотой капсидов вируса икосаэдрической фop^ диаметром около 100 нм. В цитоплазме и межклеточном пространстве присутствова

многочисленные зрелые вирионы диаметром 200-250 нм, покрытые внешней оболочкой и содержащие электроноплотный тегумент между нею и нуклеокапсидом (рис. 1). Выявленное строение и особенности морфогенеза вируса характерны для представителей семейства АИоИегреытсЬе порядка НегргЫгакз.

«Г—

ш Ж

щ

— ■ • 3 .-__И я •

Рис. 1. Электронные микрофотографии частиц герпесвируса сибирского осетра в клетках

зараженной культуры 85Г-2

Пустые и заполненные нуклеиновой кислотой капсиды герпесвируса в ядре (А) и зрелые вирионы с внешней оболочкой (показаны стрелками) в межклеточном пространстве (Б). Масштабная линейка - 100 нм.

Для доказательства этиологической роли выделенного вируса было проведено экспериментальное заражение здоровых сеголетков сибирского осетра методом ванн.

Через 14 суток гибель экспериментально зараженных рыб составила 100%. Погибающая рыба имела типичные признаки болезни, наблюдавшейся в условиях КЗТО. Вирус реизолирован из разных органов и тканей экспериментально зараженных рыб.

Результаты проведенных исследований подтвердили предположение о вирусной природе болезни осетровых рыб на Конаковском заводе товарного осетроводства.

2.2.2 Биологические свойства герпесвируса сибирского осетра

Патогенностъ герпесвируса для сибирского осетра разного возраста. При экспериментальном заражении методом ванн (4,70±0,14 1§ ТЦЛ^о/см3, экспозиция 1 ч) первые признаки заболевания у сеголетков отмечались спустя примерно 6 дней. Гибель 2-месячных рыб начиналась через 9 суток после заражения, 3-месячных - 12 суток, а двухгодовиков - 28 суток. Гибель сеголетков составила 100% (2-месячных - на 14 сутки, а 3-месячных - на 20 сутки). Среди зараженных двухгодовиков погибло 36,4% рыб (рис. 2). Погибающая рыба имела типичные признаки болезни.

Сеголетки сибирского осетра, подсаженные к последнему оставшемуся месячному больному осетру, также заболели и погибли через 12 -17 дней.

Время с момента заражения, сутки Возраст осетров: -»—2-месячные -»-3-месячные -^2-годовнкн

Рис. 2. Динамика гибели сибирского осетра разного возраста при заражении герпесвирусом методом ванн

Установлено, что с возрастом восприимчивость сибирского осетра к инфекщ снижается. Так, кумулятивная гибель двухгодовиков достоверно ниже, чем сеголетк (Р<0,001). Двух- и трехмесячные осетры хотя и не различались между собой 1 кумулятивной гибели (100% в обеих группах), но достоверно отличались по средне» времени выживания, которое существенно увеличивалось с 10,63±0,84 суток у месячных до 16,18±2,24 у 3-месячных осетров и возросло до 31,50±2,89 двухгодовиков. Дисперсия среднего времени выживания также увеличивалась возрастом, что свидетельствовало о снижении остроты течения болезни.

Патогенность герпесвируса для молоди карпа и радужной форели. Вирус вызывал заболевания мальков карпа и сеголетков радужной форели при заражен) методом ванн и не был выделен от них, а подсаженные к ним сеголетки сибирско осетра не болели. Это свидетельствует о невосприимчивости карпа и форели к данно( вирусу и их неспособности передавать инфекцию.

Клиническая и патологоанатомическая картина герпесвирусной болез!

сибирского осетра. У 2-месячных сеголетков сибирского осетра спустя 6 суток пос

экспериментального заражения отмечали угнетение и отказ от корма. На 10-11 сутки

коже появлялись мелкие (от <1 до 3-4 мм в диаметре) дымчато-голубовап

полупрозрачные бляшки, выступающие над поверхностью тела и напоминают

10

скопления слизи. Бляшки с трудом снимались скальпелем, что позволило предположить, что они являются очагами гиперплазии кожного эпителия. Развивался прогрессирующий некроз плавников, в жабрах отмечали поражение концевых участков лепестков. На 11-12 сутки у больных рыб наблюдали локальные некротические поражения кожного покрова, которые являлись следствием разрушения очагов гиперплазированной ткани. Отмирающие покровные ткани обычно поражались сапролегнией. За 1 - 2 суток до гибели на теле появлялись участки гиперемированной ткани и множественные точечные кровоизлияния. Они встречались на боковых поверхностях, брюшке, хвостовом стебле, у основания плавников, под глазами и нередко в жабрах, но наиболее сильно были поражены ими нижняя сторона рострума и ротовой аппарат рыб.

У двухгодовиков сибирского осетра первые признаки болезни появлялись через 14 суток и проявлялись в угнетении, отказе от корма и изменении поведения. На 20-23 сутки наблюдали кровоизлияния на вершинах жучек. У отдельных особей на 25 сутки появлялись бляшки гиперплазированного эпидермиса. Позднее на коже больных рыб развивались язвы, количество которых со временем увеличивалось и они сливались друг с другом. Язвы имели желтоватый оттенок из-за обсеменения миксобактериями, хорошо различимыми при микроскопическом исследовании соскобов с их поверхности.

При вскрытии погибших сеголетков видна общая бледность внутренних органов. При этом печень имеет почти белый цвет. Пищеварительный тракт обычно свободен от пищевых масс, его задний отдел нередко воспален и заполнен полупрозрачным слизеподобным содержимым, имеющим желтоватый оттенок.

При вскрытии погибших двухгодовиков отмечали геморрагическое воспаление заднего отдела кишечника, в брюшной полости небольшое скопление экссудата. Печень неравномерно окрашена, почки кровенаполнены, селезенка увеличена, передний отдел плавательного пузыря увеличен, стенки его дряблые, сердце бугристое, пятнистой окраски, сердечная мышца также дряблая, легко растирается.

Содержание герпесвируса в органах и тканях экспериментально зараженных сибирских осетров. От сеголетков, погибающих с типичными признаками остро протекающей болезни, вирус выделяли из всех органов и тканей, отобранных на исследование. В то же время от двухгодовиков даже при острой форме болезни вирус из внутренних органов выделяли не всегда (таблица 1).

Таблица 1 - Содержание герпесвируса в органах и тканях экспериментально зараженных сибирских осетров * (п=3)

Вид пат-материала Титр вируса, ^ТЦД50/г ткани

сеголетки двухгодовики

1* 2* Г 2хх Зххх 4хх:

слизь 8,85±0,20* 8,85±0,18 8,10±0,11 7,10±0,14 8,35±0,16 6,85±0,12 н.с

плавники 9,10±0,20 7,35±0,12 8,85±0,20 6,10±0,14 7,10±0,11 4,10±0,17 н.с

жаб. крышки 8,35±0,11 н.и. н.и. 5,35±0,20 4,35±0,15 3,85±0,14 н.с

жабры 8,35±0,18 5,35±0,12 7,35±0,09 6,85±0,18 5,35±0,12 н.о. н.с

кожа 9,10±0,12 н.и. н.и. 5,10±0,21 5,35±0,15 н.о. н.с

усы 5,35±0,14 н.и. н.и. 5,85±0,11 н.о. н.о. н.с

ротовой аппарат 8,85±0,21 7,85±0,21 7,10±0,16 5,35±0,11 4,85±0,11 3,35±0,20 н.ь

мозг 6,35±0,19 н.о. 5,10±0,13 3,85±0,20 4,35±0,16 н.и.

печень 8,35±0,14 7,85±0,17 7,35±0,21 4,85±0,21 4,85±0,12 н.о. н.^

почка 7,35±0,18 6,35±0,11 5,10±0,19 н.о. 4,85±0,21 н.о.

селезенка 6,85±0,11 5,85±0,11 4,35±0,18 н.о. н.о. н.о. н.ь

сердце н.и. н.и. н.и. 5,85±0,09 4,10±0,20 н.о. н.и

содержимое кишечника 6,35±0,14 3,35±0,16 н.о. 5,85±0,14 4,10±0,13 н.о. н.и

Примечание: - определено титрованием в культуре клеток 880-2; материал отобр через: *- 10, **- 12, х - 29, хх - 34, *хх - 56, *ххх - 73 суток после заражения; * - средн геометрическая ± среднее квадратическое отклонение; н.и. - не исследовали; н.о. - ЦПЭ обнаружен в течение 3 "слепых" пассажей.

Содержание вируса в покровных тканях рыб в большинстве случаев было бол высоким по сравнению с титрами его во внутренних органах этих же рыб. Особен! выделялась в этом отношении слизь с поверхности тела, как у сеголетков, так и двухгодовиков. Из внутренних органов наиболее высокое содержание вируса было печени.

Полученные данные свидетельствуют о покровно-тканевом тропизме вируса. П| электронной микроскопии эпидермальных бляшек в межклеточном пространст обнаружено большое количество зрелых оболочечных вирионов, что являет дополнительным доказательством покровно-тканевого тропизма вируса.

Уровень вируснейтрализующих антител в сыворотке крови переболевии сибирских осетров. У выживших двухгодовиков сибирского осетра через 114 суток пос. заражения методом ванн титр вируснейтрализующих антител в сыворотках кро: колебался в пределах 1:600 - 1:3000 (рис. 3). Антитела у рыб накануне заражеи выявлены не были (порог детектирования 1:8).

12

5 5000

1 2 3 4 5

Порядковый номер рыбы

Восмя после экспевнментального запаженпя метолом ванн, сутки: 0114 В183 Ш197 Ш215 Н230 Н253 Н274 0307 13337 Ш393

Рис. 3. Вируснейтрализующая активность сьшороток крови двухгодовиков сибирского осетра после экспериментального заражения герпесвирусом методом ванн и однократной внутрибрюшинной инъекции реконвалесцентам вирулентного вируса

Содержание герпесвируса в воде. В бассейне при температуре воды 15°С с 8-кратным водообменом в сутки, в котором находились 11 больных осетров средней массой 400 г, спустя месяц после заражения, концентрация вируса достигала 2,85±0,24 ^ ТЦДзо/см3.

Чувствительность к герпесвирусу разных культур клеток рыб. Все 6 линий клеток осетрового происхождения из 15 испытанных оказались чувствительными к вирусу. Из них наибольшей вирусрепродуцирующей способностью обладали клетки линии 850-2 (таблица 2). В девяти линиях клеток неосетровой природы на протяжении трех проведенных пассажей ЦПЭ не наблюдали.

Таблица 2 - Чувствительность клеточных линий осетрового происхождения к герпесвирусу сибирского осетра (п=3)

Клеточная линия Первые признаки ЦПЭ, сутки после заражения Полная деструкция монослоя, сутки после заражения Титр вируса после 3 пассажей, ^ТЦДо/см3

1 пассаж 2-3 пассаж 1 пассаж 2-3 пассаж

880-1 3-4 4 14-15 19-20 5,35±0,21

880-2 2-4 2 6-7 7-9 6,50±0,32

880-3 4 4 15-17 18-20 5,85±0,18

88Р-1 4 5 15-16 14-15 5,85±0,20

88Р-2 3-4 2 7-8 9-12 5,35±0.28

\VSSK-1 4 3 11-15 10-11 5.85±0,30

При заражении малыми дозами вируса (< 0,0001 ТЦДдУкл.) полную деструкцию

монослоя наблюдали только в клетках 580-2 и N¥5814.-1, тогда как в остальных культурах

ЦПЭ носил очаговый характер. Таким образом, наиболее чувствительной к виру! оказалась линия клеток 880-2.

По своему проявлению ЦПЭ в разных клеточных линиях несколько различался, I в целом выражался в округлении клеток и отделении их от субстрата. В культурах 85Р и 880-2 помимо этого наблюдали образование симпластов.

Оптимизация условий культивирования герпесвируса. Температура репродукцп В результате проведенных исследований установлено, что репродукция вируса культуре клеток 880-2 происходит в интервале температур от 10° до 20°С. Одна: динамика накопления вируса и скорость развития ЦПЭ при этих температур; различались (рис. 4). При температуре 15°С максимальный титр вируса (5,85±0,16 ТЦП^/см3) получен на 15 сутки инкубации, в это же время наблюдалась полн деструкция клеточного монослоя. При 10°С максимальный титр отмечали га 20 сутки, тотальный ЦПЭ наблюдали только на 25 сутки. Титр вируса был на 0,50±0,14 ^ ния чем при 15°С.

Температура инкубации: -*-5°С -«-10°С -*-15°С -К-20°С -*-25°С

I ЦПЭ на #

Рис. 4. Динамика инфекционной активности герпесвируса сибирского осетра в культу] клеток 880-2 при разных температурах

Максимальный титр вируса при 20°С отмечали, как и при 15°С на 15 сутки, одна

величина его была на 0,78±0,16 ^ ниже, и полного разрушения монослоя при этом е!

не наблюдали. Тотальный ЦПЭ развивался только на 20 сутки, а титр вируса к это»

времени снижался на 1,00±0,24

Таким образом, оптимальной температурой репродукции герпесвируса являет

15°С, при которой наблюдали наиболее быстрое развитие ЦПЭ и наивысший титр вирус

Множественность заражения. Множественность заражения (МЗ) в диапазоне от 1 до 0,01 ТЦЦ50/кл. обеспечивала развитие тотального ЦПЭ на 7-12 сутки и получение вируса с инфекционной активностью 6,10±0,20 1с ТЦД5г/см3. МЗ 1 ТЦЦ50/КЛ. является избыточной, т.к. требует использования неоправданно большого количества вируса (0,1 от объема поддерживающей среды). Уменьшение МЗ до 0,00001 ТЦД50/КЛ. достоверно не влияло на накопление вируса в культуре клеток, но приводило к замедлению (до 37 суток) развития тотального ЦПЭ. При инокуляции клеток с МЗ 0,000001 ТЦЦ50/КЛ. ЦПЭ не проявлялся в течение всего срока наблюдения (40 суток). Исходя из полученных данных, оптимальной является МЗ 0,1 - 0,01ТЦЦ50/кл.

"Возраст" культуры клеток и процентное содержание СПК в среде. Использование культуры клеток 880-2 в "возрасте" (время с момента посева клеток до их заражения) от 1 до 33 суток приводило к накоплению вируса до 5,85-6,35 ^ ТЦЦ50/СМ3. Однако с увеличением "возраста" культуры срок развития тотального ЦПЭ удлинялся с Юсутокдля 1-2-суточнойкультуры до 12сутокдля 14-33-суточной.

Полный ЦПЭ быстрее всего развивался при заражении клеток одновременно с посевом (за 7 суток), хотя титр вируса при этом был наименьшим (5,10±0,12 ^ ТЦЦ50/СМ3).

Исследования показали, что герпесвирус накапливался практически до одинаковых титров (5,85-6,101ё ТЦД5о/см3) в бессывороточной среде и среде, содержащей 2% СПК. С увеличением содержания СПК в среде до 5 - 10% титр вируса снижался с 6,10±0Д) до 5,35±0,14 ^ ТЦЦ5(/см3 и увеличивался срок наступления тотального ЦПЭ с 8 до 11 суток.

Таким образом, установлено, что максимальное накопление вируса обеспечивает использование 1-2-суточной культуры клеток и поддерживающей среды с 0-2% СПК.

рН среды. Репродукцию вируса отмечали во всем диапазоне испытанных значений рН среды (5,5 - 8,5). Наибольший титр (6,36±0,18 1ц ТЦЦ50/см3) был получен при рН 6,5, а наименьший - при рН 8,5 (5,77± 0,20 ТЦД5(/см3).

Влияние разных способов культивирования клеток на титр вируса. Титр вируса в культуре клеток Б80-2 повышался с 5,85±0,30 ^ ТЦДгс/см3 в стационарных условиях до 6,10Я),28 ^ ТЦЦ51/СМ3 на шейкере и 6,85±0,20 1§ ТЦЦс/см3 на роллере. При этом инкубация в условиях роллера (объем заполнения 0,1; скорость вращения 25-30 об/ч) ускоряла развитие тотального ЦПЭ до 6-7 суток вместо 8 суток в стационарных условиях.

Сохраняемость герпесвируса в патологическом материале при разных услови; хранения. При 0°С вирус сохранялся в патматериале без изменения инфекционнс активности в течение первых 5 суток (рис. 5). В дальнейшем титр вируса постепеш снижался и через 26 суток уменьшился на 3,50±0,20 Еще хуже вирус сохранялся пр минус 18°С (за 26 суток он снизился на 4,5О±0Д0 I"). При минус 80°С не наблюдаг снижения титра вируса в течение первых 10 суток, однако через 26 суток титр виру< уменьшился на 1,25±0,20 Вирус хорошо сохранялся при 4°С в патматериал помещенном в среду 199: в течение всего срока наблюдения (26 суток) титр а практически не изменялся, а добавление в среду 10% СПК способствовало увеличени содержания вируса на 1,50±0,15 ^ спустя 10 суток хранения.

о 2 5 10 26

Продолжительность хранения, сутки

Условия хоанення:

е-80°С И-18°С Ш0°С Ш4°С среда 199 С34°С среда 199 с 10% сыворотки

Рис. 5. Сохраняемость герпесвируса сибирского осетра в патологическом материале при

разных условиях хранения

Сохраняемость культурального герпесвируса с разным содержанием СПК при 4°( В течение 2 месяцев хранения инфекционная активность культурального виру< снижалась с 6,85±0,20 до 6,14±{),21 ^ ТЦЦо/см3 независимо от содержания СПК (2,10 20%). Однако при дальнейшем хранении вирус быстрее инактивировался с 2% СПК, че с 10% и 20% и полностью утрачивал инфекционность спустя еще 6 месяцев с 2% СП! тогда как с 10% СПК - спустя 7 месяцев, а с 20% СПК - 8 месяцев.

Таким образом, если предполагаемый срок хранения вируса при 4°С не превысит месяцев, его можно с успехом сохранять непосредственно в поддерживающей среде.

Срок сохранения вируса, осветленного центрифугированием (2000§, 20 миг значительно короче, чем неосветленного. За 4 месяца хранения его инфекционное! снизилась на5,76±0,15 1с, тогда как неосветленного - на 1,50±0,18

Сохраняемость культурального герпесвируса с 20% СПК при разных температурах. За месяц хранения при 4°С инфекционность вируса снижалась на 0,50±0,16 lg, тогда как при минус 18°С на 2,50±0,14 lg. За полгода она снизилась, соответственно, на 2,00± 0,21 lg и 3,50±0,16 lg. Через год хранения при 4°С и при минус 18°С инфекционная активность вируса не выявлена При минус 80°С титр вируса в течение года практически не изменялся.

Следовательно, для продолжительного сохранения культуральный вирус следует хранить при минус 80°С и ниже.

Результаты тестирования герпесвируса сибирского осетра на контаминацию посторонними микроорганизмами. Вирус не контаминирован бактериальной и грибной микрофлорой, а также вирусами теплокровных (на протяжении трех пассажей в культурах клеток ФЭК, MDBK и VERO признаков ЦПЭ не наблюдали, реакция гемагглютинации эритроцитов петуха, барана и человека с культуральной жидкостью инокулированных культур клеток была отрицательной).

223 Влияние физических и химических факторов на инфекционную активность герпесвируса сибирского осетра Чувствительность герпесвируса к воздействию химических агентов. Вирус полностью теряет инфекционную активность при воздействии на него хлороформа (10% от объема смеси) за 1 ч, кислой среды (рН 3,0) за 30 мин, щелочной среды (рН 12,8) за 10 мин и 70° этанола за 5 мин (таблица 3). В то же время часовая экспозиция в растворе хлорамина с концентрацией по активному хлору 50 мг/дм3 снижала титр вируса на 2,7(Ш),20 lg. Увеличение концентрации хлорамина в 5 раз приводило к полной инактивации вируса в течение 5 мин.

Таблица 3 - Влияние химических агентов на инфекционную активность герпесвируса

сибирского осетра (п=3)

Экспозиция, мин Титр вируса до и после обработки разными агентами, leTU^/cM^

Этанол, 70° Хлорамин, мг С1/дм3, * 0,013М ФЦБ, рНЗ.О 0,5 М NaOH, рН 12,8 Хлороформ, 10%

50 250 500

0 5,53±0,12 5,80±0,21 5,80±0,11 5,80±0,11 3,70±0,14 4,70±0,16 5,10±0,20

5 и.о. 5,35±0,14 и.о. н.о. н.и. н.и. н.и.

10 н.и. н.и. н.и. н.и. н.и. н.о. н.и.

15 н.о. 5,10±0,18 н.о. н.о. н.и. н.и. н.и.

30 и.о. 4,10±0,11 н.о. н.о. н.о. н.и. н.и.

60 н.о. 3,10±0,13 н.о. н.о. н.о. н.и. и.о.

Примечание: * - концентрация по активному хлору; ФЦБ - фосфат-цщратный буфер, и.о. - вирус не обнаружен в течение 3 "слепых" пассажей в культуре клеток 550-2; н.и. - не исследовали.

Таким образом, дозировки активного хлора (2-4 мг/дм3), рекомендуемые д) лечебного купания рыб при паразитарных и бактериальных заболеваниях [Рахконен др., 2003], неэффективны против герпесвируса.

Выживаемость герпесвируса в воде. При температуре 15°С инфекционн; активность вируса (исходный титр 6,35±0,20 ТЦЦ5Г/см3) после суточной экспозиции дистиллированной и водопроводной воде снижалась на 3,25±0,20 а в воде из бассеш со здоровыми осетрами на 2,50±0,21 1ц. Дальнейшая экспозиция приводила постепенному снижению титра вируса, и через 10 суток вирус не был обнаружен ни одном из вариантов эксперимента.

Изучение термолабильности герпесвируса сибирского осетра. Прогревши культурального вируса при температуре 45°С и выше приводило к полной инактиващ вируса (исходный титр 6,10±0,18 ^ ТЦЦ5о/см3) через 15 мин, тогда как при 30°С вир} инактивировался за двое суток.

Вирус хорошо переносит кратковременное замораживание (минус 30°С) оттаивание, но при этом остается связанным с клеточным дебрисом. Пять цикле замораживания-оттаивания исходного культурального вируса или осветленно1 центрифугированием в течение 20 мин при 2000g приводили к снижению е1 инфекционной активности всего на 0,08-0,20

Сохраняемость инфекционной активности герпесвируса в процессе лиофилизаци Криопротекторы смешивали с культуральным вирусом в равных объема Лиофилизацию проводили в течение 17 ч при давлении в камере 0,07-0,054 мбар температуре от минус 50° до 24°С. При использовании в качестве криопротекто} обезжиренного молока титр вируса в процессе лиофилизации снижался на 0,70±0,14 1 СПК - на 1,79±0,16 1«, а комбинированного криопротектора пептон:лактоза:желати (20%:20%:2%) - на 2,45±0,П 1«. Инфекционность вируса, лиофилизированного обезжиренным молоком, не снижалась в течение 4 месяцев хранения при 4°С (срс наблюдения).

Фильтруемость герпесвируса через мембранные фильтры. Фильтрован! внеклеточного вируса через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм почти не влияло на тит вируса, тогда как фильтр с порами 0,22 мкм снижал его на 2,00±0,14 Фильтрован! супернатанта 0,1% суспензии патологического материала через фильтр с порами 0,45 мк снижало титр на 0,79±0,35

2.2.4 Молекулярио-генетические свойства герпесвируса сибирского осетра

При сравнении фрагментов последовательностей генов ДНК-полимеразы (421 нуклеотид) и терминазы (492 нуклеотида) герпесвируса сибирского осетра и североамериканских герпесвирусов осетровых рыб получены следующие результаты: 1) все три изолята герпесвируса сибирского осетра (5К1/0406, БК2/0506, ВКУ0506) на исследованных участках генома идентичны между собой; 2) вирус относится к герпесвирусу осетровых рыб 2 типа (типовой штамм АсНУ-2); 3) герпесвирус сибирского осетра генетически наиболее близок к канадскому изоляту ББНУ герпесвируса тупорылого осетра, Ааретег Ъгехчгоьгтт (гомология 98%).

Филогенетический анализ фрагментов гена ДНК-полимеразы 12 герпесвирусов низших позвоночных, подтвердил наиболее тесное родство выделенного герпесвируса сибирского осетра с герпесвирусом тупорылого осетра (рис. 6).

1001- АаЖ/-2-ЕР685906 "1- БЬБНУ

-Ас1НУ-2-00832173 -1сНУ-1

- АС1НУ-1

■ Р!аНУ-2

- АпдНУ-1

- СуНУ-2

- СуНУ-3

- СуН\А1

- ОэН\/-1

Рис. 6. Филогенетическое древо, построенное по результатам анализа фрагмента гена ДНК-полимеразы для 12 герпесвирусов низших позвоночных

Герпесвирусы: АаН\Ч и АсНУ-2 - осетровых 1 и 2 типов; AngHV-l - угревых 1 типа; СуН\Ч, СуНУ-2 и СуНУ-З -карповых 1,2 иЗ типов; 1сН\М - икталуровых 1 типа; ОзН\М- устрицы 1 типа; ЯаНУ-1 и ЯаНУ-!-лягушек 1 и2типов;8Ь5НУ- сибирского осетра

Номера доступа в ОепВапк: ЕР685906 - последовательность гена изолята БЗНУ тупорылого осетра; ЕХ3832173 - последовательность гена изолята \VSHV-99-ID-2 белого осетра

2.2.5 Получение пшериммунлых антисывороток к герпесвирусу сибирского осетра

Антисыворотки, полученные в результате гипериммунизации кроликов герпесвирусом сибирского осетра, имели низкую вируснейтрагщзуюшую активность (1:60-1:80).

Антисыворотки, полученные после экспериментального заражения двухгодовию сибирского осетра герпесвирусом методом ванн и однократной внутрибрюшиннс инъекции реконвалесцентам вирулентного вируса, имели высокие титр вируснейтрализующих антител. Антитела выявляли на протяжении 8 месяцев пос. инъекции вируса (рис. 3). К концу этого срока их титры снизились до значений них таковых перед инъекцией. Максимальный титр антител (1:3560 и 1:4540) приходился i 215 сутки опыта. Антисыворотки с такой активностью были использованы в качесп референсных для идентификации новых изолятов герпесвируса сибирского осетра. 2.2.6 Паспортизация и депонирование герпесвируса сибирского осетра и

гнпериммунной антисыворотки к нему По результатам комиссионных испытаний свойств герпесвируса сибирского осет] и гипериммунной осетровой антисыворотки к нему они паспортизированы депонированы в музее микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ.

22.1 Разработка высокочувствительного метода выделения герпесвируса из патологического материала с использованием тканевых эксплантатов Разработанный метод основан на предварительной инкубации эксплантат« покровных тканей инфицированных рыб в условиях, приближенных к оптимальным Д1 репродукции вируса. При этом измельченные пробы плавников или кожи поа десятикратной отмывки питательной средой, содержащей 500 ЕД/см3 пенициллина, 5( мкг/см3 стрептомицина и 500 мкг/см3 нистатина инкубировали при 15°С в среде 199 с 2' СПК и антибиотиками (200 ЕД/см3 пенициллина, 200 мкг/см3 стрептомицина и 25 мкг/см нистатина) на шейкере (50 качаний в минуту). Через определенные интервалы врема эксплантаты использовали для выделения вируса традиционным методом (таблица 4).

Таблица 4 - Содержание герпесвируса сибирского осетра в тканевых эксплантатах инфицированных осетров (1§ТЦД5о/г ткани) спустя разные сроки инкубации (п=3)

Вид Время инкубации ,сутки

ткани 0* 2 5 10 15 20 27

пл+кожа 6,35±0,21 7,35±0,20 9,35±0,11 9,85±0,14 н.и. 8,10±0,31 6,85±0,2

кожа 5,35±0,13 7,10±0,21 8,85±0,22 7,35±0,18 н.и. н.и. н.и.

пл 7,10±0,21 7,10±0,22 9,35±0,21 9,05±0,21 н.и. н.и. н.и.

кожа н.о. н.и. 4,10±0,21 н.о. н.о. н.и. н.и.

пл 4,10±0,22 н.и. 6,85±0,22 4,10±0,15 6,35±0,23 н.и. н.и.

Примечание: пл - плавники; * - традиционный метод выделения вируса; н.и. — I исследовали; н.о. - ЦПЭ не обнаружен в течение 3 "слепых" пассажей в культуре клеток 880-2.

Инкубация тканевых эксплантатов от экспериментально зараженных двухгодовиков сибирского осетра увеличивала содержание в них вируса в 100 и более раз и частоту выделения вируса. Максимальная концентрация вируса наблюдалась на 5 сутки инкубации эксплантатов. Дальнейшее увеличение экспозиции приводило к снижению титра вируса.

При сравнении двух методов выделения герпесвируса сибирского осетра от зараженных двухгодовиков на разных стадиях течения инфекции установлено, что выделение герпесвируса с использованием метода тканевых эксплантатов более эффективно как при острой, так и при хронической форме болезни. Применение разработанного метода позволило выделить вирус из кожи рыбы с хронической формой болезни, тогда как традиционным методом это не удавалось даже после трех "слепых" пассажей в клетках линии 580-2.

2.2.8 Результаты вирусологического обследования осетровых хозяйств на наличие

герпесвирусной инфекции

Вирусологическому исследованию было подвергнуто 364 экземпляра 7 разных видов и гибридов трех возрастных групп осетровых рыб (таблица 5). Рыбоводные хозяйства находились в шести регионах России и в Казахстане. Материал отбирали в разное время года при температуре воды 15-22°С от рыб как с типичными признаками герпесвирусной болезни, так и без признаков (с целью исключения вирусоносительства).

В ходе проведенных исследований герпесвирус сибирского осетра выделен помимо КЗТО еще в двух рыбоводных хозяйствах. Частота выделения вируса была выше весной при температуре воды 15-17°С. Из материалов, отобранных летом или осенью при температуре воды 20-22°С, вирус выделяли не во всех случаях даже в неблагополучных хозяйствах. Его удалось обнаружить только в одном из трех материалов из Ленинградской обл., отобранных в июле при 20°С. Содержание вируса было на уровне порога детектирования (103,3ТЦЦ5о/г ткани). В двух из четырех материалов из Казахстана, отобранных в ноябре при 20-22°С, вирус удалось обнаружить только с помощью метода тканевых эксплантатов.

Следует отметить, что в Ленинградскую обл. и Казахстан рыба была завезена из КЗТО в виде оплодотворенной икры или подращенной молоди.

Таблица 5 - Результаты вирусологического обследования осетровых хозяйств

Регион Вид осетра Возраст рыб Признаки герпесвирусной болезни Температура воды, °С, месяц Количество исследованных рыб Выделение вирус;

сибирский сеголетки тп 15-17°, май 35 +

Тверская обл. бе стер сеголетки тп -«- 2 +

-«- сеголетки тп 19°, дек. 14 -

сибирский нт 18°, май 10 -

русский мальки нт -«- 10 -

Астраханская обл. белуга нт -«- 9 -

стерлядь нт -«- 3 -

сибирский сеголетки бп 17е, июнь 156 -

Тульская обл. сибирский двухлетки тп 20°, сент. 13 -

Ставропольский край бе стер сеголетки тп 20-21°, окт. 21 -

русский X ленский сеголетки тп -«- 21 -

Московская обл. стерлядь х бестер мальки нт 17-18°, февраль 8 -

Ленинградская обл. сибирский сеголетки тп 20°, июль 45 +

Казахстан русский X ленский сеголетки тп 20-22°, ноябрь 17

Примечание: + - вирус выделен; - - ЦПЭ не обнаружен в течение 3 "слепых" пассажей; нт признаки нетипичные для герпесвирусной болезни; тп - типичные признаки болезни; бп - признш заболевания отсутствовали; * - результат выделения вируса традиционным методом/методе тканевых эксплантатов.

2.2.9 Эпизоотологические особенности герпесвирусной болезни сибирского осетра

Анализ наблюдений в неблагополучных рыбоводных хозяйствах и результате экспериментальных исследований показал, что наиболее остро болезнь протекает весно реже осенью, при температуре воды 13-17°С и с повышением температуры постепсш затухает. Переболевшие рыбы не менее 2 месяцев остаются вирусоносителями. В I крови выявляют вируснейтрализующие антитела, нередко в титрах 1:2000 и выше.

С возрастом восприимчивость рыб к болезни снижается. Гибель сеголетков даже возрасте полугода достигает 100%, двухгодовиков - до 40-50%.

Вызывая генерализованную инфекцию, возбудитель, вместе с тем, облада выраженным покровно-тканевым тропизмом и в наибольших количествах накапливает! в тканях кожи, плавников, ротового аппарата и особенно в слизи с поверхности тела ры От инфицированных рыб вирус выделяется в окружающую водную среду со слизью поверхности тела, выделениями кишечника и, возможно, с мочой и через жабры.

Кроме сибирского осетра вирус выделен также от бестера (гибрид белуги

22

стерляди) и гибрида русского и сибирского (ленского) осетров. Карп и радужная форель нечувствительны к возбудителю болезни и не передают его восприимчивым рыбам. Стерлядь и ее гибрид с бестером менее чувствительны к болезни, чем сибирский осетр. Восприимчивость рыб других видов не исследована.

При вспышке болезни содержание вируса в воде достигает 103 - 104 ТЦД50/СМ3.

3 Выводы

1. Впервые выделен вирус от неамериканских видов осетровых рыб и установлена первая вирусная болезнь у осетровых рыб в России.

2. Болезнь высококонтагиозна и клинически проявляется в виде ярко выраженного некрогеморрагического синдрома, осложненного секундарными инфекциями. Из внутренних органов наиболее сильно поражаются печень, задний отдел кишечника, плавательный пузырь и сердце. Вспышки болезни обычно возникают весной. Сибирский осетр, Ааретег Ьаеп, наиболее чувствителен к возбудителю, карп и радужная форель нечувствительны к нему и не передают его восприимчивым видам рыб.

3. Вирус имеет калсид икосаэдрической формы и внешнюю оболочку с заключенным под нею тегументом. Диаметр капсида около 100 нм, вириона с оболочкой 200-250 нм. Строение вириона, особенности морфогенеза и молекулярно-генегические свойства вируса позволяют отнести его к семейству АНоИегретИсЬе порядка НегреюгЫез.

4. Герпесвирус высокопатогенен для молоди сибирского осетра, обладает покровно-тканевым тропизмом и у переболевших рыб индуцирует выработку нейтрализующих антител в высоких титрах (1:600-1:3000).

5. К герпесвирусу чувствительны только линии клеток осетрового происхождения. Оптимизированы технологические параметры культивирования вируса, обеспечивающие накопление его в титре 6,85±0Д) ТЦЦ5(/см3 и включающие заражение 1-2-суточной культуры клеток 880-2 с множественностью 0,1 - 0,01ТЦД5о/кл, поддерживающую среду 199 с 2% СПК, рН 6,5, температуру инкубации 15°С, роллерное культивирование со скоростью вращения сосудов 25-30 обУч.

6. Культуральный герпесвирус высоколабилен и инактивируется при значениях рН среды 3,0 и 12,8, под воздействием хлороформа, 70° этанола и хлорамина с концентрацией активного хлора не ниже 250 мг/дм3. Его инфекционность утрачивается

при температуре 45°С в течение 15 мин и сохраняется на протяжении 7 мес при 4°С.

7. Молекулярно-генетический анализ участков генов ДНК-полимеразы терминазы герпесвируса сибирского осетра показал, что вирус относится к герпесвиру осетровых рыб 2 типа (типовой штамм Ас1Н\/-2) и генетически наиболее близок канадскому изоляту ББИУ герпесвируса тупорылого осетра, Ас ¡ре тег ЪгЫгозШт.

8. Разработан и испытан на экспериментальном и полевом материа высокочувствительный метод выделения герпесвируса с использованием эксплантат покровных тканей исследуемых рыб. Метод обеспечивает повышение содержания виру в исследуемом материале в 100 и более раз и частоты выделения его на поздних стада эпизоотии по сравнению с традиционным методом вирусовыделения.

9. Болезнь выявлена в трех из восьми обследованных осетровых хозяйств - однс племенном и двух товарных, получивших из первого посадочный материал к оплодотворенную икру. Осенняя вспышка болезни в одном из товарных хозяйс показывает, что носительство вируса может продолжаться не менее полугода.

4 Практические предложения

Разработаны и предложены «Методические рекомендации по диагности герпесвирусной болезни сибирского осетра», утвержденные Россельхозакадеми 21.09.2009.

Выделенный и охарактеризованный герпесвирус сибирского осетра гипериммунная антисыворотка к нему используются для идентификации вируснь изолятов от осетровых рыб и при проведении НИР.

Предложен высокочувствительный метод выделения герпесвируса сибирско осетра, основанный на предварительной инкубации эксплантатов покровных ткан исследуемых рыб в условиях, приближенных к оптимальным для репродукции вирус который позволяет повысить чувствительность выявления вируса и частоту е выделения от рыб в период эпизоотии и после ее завершения.

Список опубликованных работ по материалам диссертации

1. Герпесвирусная болезнь у осетровых рыб в России/ И.С. Щелкунов, Т. Щелкунова, А.И. Щелкунов, Ю.П. Колбасова, Л.В. Диденко, А.Ф. Быковскга Российский вет. журнал. Сельскохозяйственные животные. - 2007. - № 1. - С. 10-12.

2. Герпесвирусное заболевание молоди сибирского осетра/ И.С. Щелкунов, Т.

Щелкунова, А.И. Щелкунов, Ю.П. Колбасова, Л.В. Диденко, А.Ф. Быковский// Тепловодная аквакультура и биологическая продуктивность водоемов аридного климата: материалы и докл. междунар. сим. - Астрахань: АГТУ, 2007. - С. 522-525.

3. Щелкунов, А.И. Биологические свойства герпесвируса сибирского осетра in vitro/ Щелкунов А.И., Щелкунова Т.Н. // Вопросы рыбного хозяйства Беларуси: сб. науч. трудов. - Минск: РУП Институт рыбного хозяйства, 2008.-Вып. 24.-С. 501-503.

4. Щелкунов, А.И. Покровно-тканевой тропизм герпесвируса сибирского осетра/ Щелкунов A.II.// Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел: материалы междунар. науч.- практ. конф. - М., 9-10 октября 2008. - С. 437-440.

5. Щелкунов, А.И. Сохранность герпесвируса сибирского осетра при разных условиях хранения /Щелкунов А.И.// Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: тр. междунар. науч.- практ. конф., посвященной 50-летию ВНИИВВиМ. - Покров, 13-14 ноября 2008.-С. 205-209.

6. Щелкунов, А.И. Оптимизация условий культивирования герпесвируса сибирского осетра/ Щелкунов А.И.// Труды ВИЭВ. - М., 2009. - Т. 75. - С. 670-675.

7. First dctcction of a viral agent causing disease in farmed sturgeon in Russia/ l.S. Shchelkunov, T.I. Shchelkunova, A.I. Shchelkunov, Y.P. Shchelkunova, L.V. Didenko, A.Ph. Bykovsky// Dis. Aquat. Org. - 2009. - Vol. 86. - P. 193-203.

8. Щелкунов, А.И. Получение гипериммунных антисывороток к герпесвирусу сибирского осетра/ А.II. Щелкунов, И.Б. Прокаева// Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конф. молодых ученых. - Покров, 3-4 декабря 2009. - С. 127-130.

9. Щелкунов, А.И. Герпесвирусная болезнь сибирского осетра/ А.И. Щелкунов, И.С. Щелкунов//Ветеринария.-2010. -№ 1.-С. 18-21.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ, г. Покров Владимирской области. Тираж 80 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щелкунов, Артем Игоревич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1 ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Актуальность темы.

1.2 Цель и задачи исследований.

1.3 Научная новизна.

1.4 Практическая значимость.

1.5 Основные положения, выносимые на защиту.

1.6 Апробация и публикация результатов работы.

1.7 Личный вклад.

1.8 Объем и структура работы.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Герпесвирусы рыб и вызываемые ими болезни.

2.1.1 Герпесвирусы рыб, выделенные в культуре клеток.

2.1.1.1 Герпесвирус американского канального сома.

2.1.1.2 Герпесвирус лососевых 1 типа.

2.1.1.3 Герпесвирус лососевых 2 типа.

2.1.1.4 Герпесвирус карпа 1 типа.

2.1.1.5 Герпесвирус некроза гемопоэтической ткани золотой рыбки.

2.1.1.6 Герпесвирус карпа кои.

2.1.1.7 Герпесвирус угря.

2.1.1.8 Герпесвирусы белого осетра.

2.1.2 Герпесвирусы рыб, обнаруженные с помощью электронной микроскопии.

2.2 Филогенетический анализ герпесвирусов рыб.

2.3 Классификация герпесвирусов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологические, физико-химические и молекулярно-генетические свойства герпесвируса сибирского осетра"

Промышленному выращиванию осетровых рыб с целью воспроизводства природных запасов и получения товарной продукции уделяется возрастающее внимание во всем мире. В последние годы наблюдается заметный рост активности в этой области, обусловленный, с одной стороны, угрозой исчезновения ряда ценных видов осетровых рыб, а с другой, - значительным увеличением спроса на деликатесную продукцию, получаемую из осетровых.

В связи с наблюдающимся в последнее время в мире катастрофическим снижением природных запасов осетровых, первостепенное значение сейчас придается разведению этих рыб в аквакультуре. Вместе с тем, опыт показывает, что интенсификация аквакультуры сопряжена с появлением ряда негативных, лимитирующих факторов, среди которых одним из главных являются болезни объектов разведения. Как и в аквакультуре в целом, основной ущерб осетроводству наносят вирусные болезни [75].

Первые работы в области вирусологии осетровых рыб были выполнены в США профессором Рональдом Хедриком [13], в лаборатории которого получены первые линии клеток белого осетра и впервые выделены вирусы осетровых рыб. На сегодня у североамериканских осетровых обнаружено 10 разных вирусов, наиболее опасными из которых являются: аденовирус, иридовирус и два герпесвируса белого осетра [13, 14, 144, 188].

Эти вирусы вызывают заболевания у мальков и сеголетков белого осетра. Болезни развиваются обычно весной и в начале лета, реже - осенью. Этиологическая роль вирусов в заболеваниях доказана экспериментально. Стресс разной природы является решающим фактором, провоцирующим вспышки эпизоотий. Болезни обычно осложняются миксобактериозами и протозойными инвазиями. Рыбы старшего возраста не болеют, но могут являться вирусоносителями. Дикие производители считаются главным источником выявленных вирусных инфекций.

Три из четырех вирусов (иридо- и оба герпесвируса) поражают преимущественно ткани внешних покровов (имеют покровно-тканевой тропизм). То же самое справедливо и в отношении аденовируса, но для него характерен другой тканевой тропизм (эпителий кишечника). Эпизоотологические данные указывают на вероятность вертикальной передачи иридо- и герпесвирусов от производителей потомству. Оба герпесвируса могут быть достаточно легко изолированы от больных рыб в культуре клеток, но материал для исследования должен быть свежим. Иридовирус выделяется с трудом и не всегда, а выделить аденовирус до сих пор не удалось. Наиболее опасными и широко распространенными агентами из четырех перечисленных считаются иридовирус (WSIV) и герпесвирус второго типа (AciHV-2) [144, 188].

Первое сообщение об обнаружении вирусного заболевания у осетра в Европе было опубликовано в Италии [69]. Авторы описали случай гибели в одном из хозяйств почти половины завезенной из Калифорнии молоди белого осетра с гистопатологическими признаками, типичными для аденовирусной инфекции. Там же в Италии в 2003 г. от завезенного из США белого осетра был изолирован герпесвирус, относящийся к AciHV-2. В 1998г. появилось сообщение об электронномикроскопическом обнаружении у осетровых нового вируса - иридовируса русского осетра (A. guldenstadti) (RSIV) в Бельгии [14]. Других случаев обнаружения вирусов у осетровых рыб за рубежом не зарегистрировано.

Осетроводство в России в последние годы становится одной из наиболее перспективных отраслей аквакультуры. Формируются государственные программы его поддержки и развития. К сожалению, необходимость изучения вирусных болезней осетровых в условиях аквакультуры явно недооценивается.

Недавно были получены пять отечественных линий клеток сибирского осетра: две из плавников и три из пула печени, почки и селезенки [10]. Полученные линии еще не полностью охарактеризованы, но уже используются при проведении вирусологических исследований рыб. В результате обследований культивируемых в России осетровых рыб вирусных агентов до последнего времени обнаружено не было [9, 10].

Весной 2006 г. на племенном рыбоводном предприятии - Конаковском заводе товарного осетроводства (Тверская обл.) произошла вспышка болезни среди сеголетков осетровых рыб, сопровождавшаяся массовой гибелью молоди. Наиболее восприимчивым к ней был сибирский осетр, Асгретег Ьаеп. Гибель в отдельных партиях сеголетков доходила до 100%. Аналогичные вспышки болезни регистрировали позднее в других осетровых хозяйствах.

Исключение паразитов и бактерий как возможных возбудителей указывало на необходимость проведения исследований по установлению роли вирусов в этиологии этой болезни.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Щелкунов, Артем Игоревич

5 ВЫВОДЫ

1. Впервые выделен вирус от неамериканских видов осетровых рыб и установлена первая вирусная болезнь у осетровых рыб в России.

2. Болезнь высококонтагиозна и клинически проявляется в виде ярко выраженного некрогеморрагического синдрома, осложненного секундарными инфекциями. Из внутренних органов наиболее сильно поражаются печень, задний отдел кишечника, плавательный пузырь и сердце. Вспышки болезни обычно возникают весной. Сибирский осетр, АЫретег Ьаеп, наиболее чувствителен к возбудителю, карп и радужная форель нечувствительны к нему и не передают его восприимчивым видам рыб.

3. Вирус имеет капсид икосаэдрической формы и внешнюю оболочку с заключенным под нею тегументом. Диаметр капсида около 100 нм, вириона с оболочкой 200-250 нм. Строение вириона, особенности морфогенеза и молекулярно-генетические свойства вируса позволяют отнести его к семейству АПокегреяутс^ае порядка Негре8\1га1е$.

4. Герпесвирус высокопатогенен для молоди сибирского осетра, обладает покровно-тканевым тропизмом и у переболевших рыб индуцирует выработку нейтрализующих антител в высоких титрах (1:600-1:3000).

5. К герпесвирусу чувствительны только линии клеток осетрового происхождения. Оптимизированы технологические параметры культивирования вируса, обеспечивающие накопление его в титре 6,85±0,20 о

ТЦД50/СМ и включающие заражение 1-2-суточной культуры клеток 880-2 с множественностью 0,1 - 0,01ТЦД5о/кл., поддерживающую среду 199 с 2% СГЖ, рН 6,5, температуру инкубации 15°С, роллерное культивирование со скоростью вращения сосудов 25-30 об./ч.

6. Культуральный герпесвирус высоколабилен и инактивируется при значениях рН среды 3,0 и 12,8, под воздействием хлороформа, 70° этанола и хлорамина с концентрацией активного хлора не ниже 250 мг/дм. Его инфекционность утрачивается при температуре 45°С в течение 15 мин и сохраняется на протяжении 7 мес. при 4°С.

7. Молекулярно-генетический анализ участков генов ДНК-полимеразы и терминазы гериесвируса сибирского осетра показал, что вирус относится к герпесвирусу осетровых рыб 2 типа (типовой штамм AciHV-2) и генетически наиболее близок к канадскому изоляту SSHV герпесвируса тупорылого осетра, Acipenser brevirostrum.

8. Разработан и испытан на экспериментальном и полевом материале высокочувствительный метод выделения герпесвируса с использованием эксплантатов покровных тканей исследуемых рыб. Метод обеспечивает повышение содержания вируса в исследуемом материале в 100 и более раз и частоты выделения его на поздних стадиях эпизоотии по сравнению с традиционным методом вирусовыделения.

9. Болезнь выявлена в трех из восьми обследованных осетровых хозяйств — одном племенном и двух товарных, получивших из первого посадочный материал или оплодотворенную икру. Осенняя вспышка болезни в одном из товарных хозяйств показывает, что носительство вируса может продолжаться не менее полугода.

6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны и предложены «Методические рекомендации по диагностике герпесвирусной болезни сибирского осетра», утвержденные Россельхозакадемией 21.09.2009.

Выделенный и охарактеризованный герпесвирус сибирского осетра и гипериммунная антисыворотка к нему используются для идентификации вирусных изолятов от осетровых рыб и при проведении НИР.

Предложен высокочувствительный метод выделения герпесвируса сибирского осетра, основанный на предварительной инкубации эксплантатов покровных тканей исследуемых рыб в условиях, приближенных к оптимальным для репродукции вируса, который позволяет повысить чувствительность выявления вируса и частоту его выделения от рыб в период эпизоотии и после ее завершения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щелкунов, Артем Игоревич, Покров

1. Горчаков, В.В. К эпизоотологии оспы карпа/ В.В. Горчаков// Тезисы докладов V Всесоюзного симпозиума по инфекционным болезням рыб. М., 1986.-С. 24-25.

2. Здоровая рыба. Профилактика, диагностика и лечение болезней/ Р. Рахконен и др.. Хельсинки: НИИ охотничьего и рыбного хозяйства, 2003. - 163 с.

3. Лабораторный практикум по болезням рыб/ ред. В.А. Мусселиус. -М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983. — 296 с.

4. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высшая школа, 1990.352 с.

5. Лярски, 3. Диагностика вирусных болезней животных/ 3. Лярски. -М.: Колос, 1980.-400 с.

6. Методические указания по идентификации и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб. Вирусные болезни. Сб. инструкций по борьбе с болезнями рыб. М.: Отдел маркетинга АМБ-агро, 1998. - 4.1. - С. 60-113.

7. Практическая вирусология/ пер. с нем.; под ред. В.Н. Сюрина. М.: Колос, 1970.-352 с.

8. Щелкунов, И.С. Вирусные инфекции у осетровых рыб/ И.С. Щелкунов // Рыбное хозяйство. Аналитическая и реферативная информация. Серия: Болезни гидробионтов в аквакультуре. М.: ВНИЭРХ, 2000. - Вып. 1.-С. 3-16.

9. Щелкунов, И.С. Эпизоотическая ситуация по вирусным болезням культивируемых рыб/ И.С. Щелкунов // Ветеринария. 2006. - № 4. - С. 2225.

10. Щелкунова, Т.И. Клеточные линии из тканей сибирского осетра/ Т.И. Щелкунова, O.A. Купинская, H.A. Мащенко//Первый конгресс ихтиологов России. Астрахань, 1997. - С. 302-303.

11. A case of herpesvirus isolation of freshwater-reared coho salmon Oncorhynchus kisutch in Japan/ M. Horiuchi et al. // Suisanzoushoku. 1989. -Vol. 36.-P. 297-305.

12. Adeno-like virus associate with a disease of cultured white sturgeon (Acipenser transmontanus)/ R.P. Hedrick et al. //Canad. J. Fish. Aquat. Seien. -1985.-Vol. 42. P. 1321-1325.

13. Adkison, M.A. Identification of an iridovirus in Russian sturgeon (.Acipenser gueldenstaedti) from northern Europe/ M.A. Adkison, M. Cambre, R.P. Hedrick// Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 1998. - Vol.l8. - P. 29-32.

14. Aggiornamento sue cosidetto vaiolo dei cyprinidi/ P. Ghittino et al.// Ravista Ital. Piscicolt. Ittiopat. 1984. Ann. XIX. -N. 3. - P. 115-120.

15. A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi, a strain of a common carp/ R.P. Hedrick et al. // J. Aquat. Anim. Health. 2000. -Vol. 12.-P. 44-57.

16. A herpesvirus isolated from carp papilloma in Japan/ T. Sano et al.// Ellis (ed.) Fish and Shellfish pathology. London: Academic Press, 1985. - P. 307-311.

17. Ahne, W. Vergleichende Untersuchungen über die Stabilität von vier fischpatogenen Viren (VHSV, PFR, SVCV, IPNV)/ W. Ahne// Zbl. Vet. Med. B. -1982.-Bd. 29.-S. 457-476.

18. Ahne, W. Virusinfektionen bei Fishen: Ätiologie, Diagnose und Bekämpfung/ W. Ahne// Zbl. Vet. Med. B. 1985. - Bd. 32. - S. 237-264.

19. Alborale, L. Isolation of an herpesvirus in breeding catfish (Ictalurus melasy L. Alborali, G. Bovo, A. Lavazza // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. — 1996. — Vol. 16, N4. — P. 134-137.

20. Amita, K.Oe.M. A survey of koi herpesvirus and carp edema virus in color carp cultured in Nigara Prefecture, Japan/ K.Oe.M. Amita, H. Matoyama, N. Yamaguchi // Fish Pathol. 2002. - Vol. 37. - P. 197-198.

21. Anders, K. A herpesvirus associated with an epizootic epidermal papillomatosis in European smelt (Osmerus eperlanus)/ K. Anders// Viruses of lower vertebrates/ W. Ahne, E. Kurstak (eds.). Berlin: Springer, 1989. - P. 184197.

22. Anders, K. Spawning papillomatosis of smolt, Osmerus eperlanus L., from the Elbe estuary/ K. Anders, H. Möller// J. Fish Dis. 1985. - Vol. 8. - P. 223-235.

23. Anders, K. Role of viruses in the induction of skin tumours and tumourlike proliferations of fish/ K. Anders, M. Yoshimizu// Dis. Aquat. Org. 1994. -Vol. 19.-P. 215-232.

24. An iridovirus infection of the integument of the white sturgeon Acipenser transmontanusIK.V. Hedrick et al. // Diseas. Aquat. Org. 1990. — Vol. 6.-P. 39-40.

25. A novel class of herpesvirus with bivalve hosts/ A J. Davison et al. // J. Gen. Virol. 2005. - Vol. 86. - P. 41-53.

26. A preliminary report on pathogenicity and oncogenicity of cyprinid herpesvirus / T. Sano et al. // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 1990. - Vol. 10. - P. 11-13.

27. Ariav, R. First report of newly emerging viral disease of Cyprinus carpio species in Israel/ R. Ariav, S. Tinman, I. Bejerano// Diseases of Fish and Shellfish: 9th International Conference EAFP. Rhodes, 1999. - P. 151.

28. A viral disease occurred in larvae and juveniles of Japanese flounder, Paralichthys olivaceus / Y. Iida et al. // J. Aquat. Anim. Health. 1989. — Vol. 1. -P. 7-12.

29. A viral epizootic in cultured populations of juvenile goldfish due to a putative herpesvirus etiology/ J.M. Groff et al. // J. Vet. Diagnos. Investigations. 1998. - Vol. 10. - P. 375-378.

30. Bercovier, H. KHV and possible existence of carrier state Электронный ресурс. режим доступа: http:// www.defra.gov.uk/science/Publications/Default.asp. — загл. с экрана.

31. Bowser, P.R. Fish cell lines: establishment of a line from ovaries of channel catfish/ P.R. Bowser, J.A. Plumb// In Vitro. 1980. - Vol. 16. - P. 365368.

32. Bradley,T. Viral epizootic epitheliotropic disease of lake trout {Salvelinus namaycush)/ T. Bradley, P. Chang, D. Medina // Am. Fish. Soc. Fish Health. Sec. Newsl. 1988. - Vol. 16. - P. 5.

33. Bradley,T. Epizootic epitheliotropic disease of lake trout (Salvelinus namaycush): history and viral etiology/ T. Bradley, P. Chang, D. Medina // Dis. Aquat. Org. 1989. - Vol. 7. - P. 195-201.

34. Brady, Y. J. The role of sediment in transmission of channel catfish virus disease/ Y.J. Brady, R.D. Ellender// Mississippi Alabama Sea Grant Consortium, University of State Mississipi. 1982. - P. 67-111.

35. Burke, C.N. Virus infection of squamous cell carcinoma in rainbow smelt {Osmerus mordax)/ C.N. Burke, R.L. Herman, S. Perry// 14th Annual Eastern Fish Health Workshop. Annapolis USA, 1989. - P. 15

36. Buchanan, J.S. Studies on Herpesvirus scophthalmi infection of turbot Scophthalmi maximus L. ultrastructural observations/ J.S. Buchanan, C.R. Madeley// J. Fish Dis. 1978. - Vol. 1. - P. 283-295.

37. Bylund, G. Obrevation on epidermal papilomata in wild and cultured Atlantic salmon, Salmo salar L., in Finland/ G. Bylund, E.T. Valtonen, E. Niemela// J. Fish Dis. 1980. - Vol. 3. - P. 525-528.

38. Calle, P.P. Herpesvirus associated cutaneous papillomas in koi carp (Cyprinus carpió)! P.P. Calle, T.S. McNamara, Y. Kress// Intern. Ass. Aquat. Animal Med. Proceedings. 1995. - Vol. 26. - P. 81-82.

39. Characteristics of a herpesvirus isolated from cultured coho salmon {Oncorhynchus kisutch)/ H. Kumagai et al. // Abstracts of Annual Meeting of Japanese Society Fish Pathology. Tokyo, 1991. — P.2.

40. Characteristics of a new herpesviral isolate from salmonid fish/ Y. Hayashi et al.// Jpn. J. Vet. Sci. 1986. - Vol. - 48. - P. 915-924.

41. Characterization of a herpes-like virus isolated from cultured Japanese eels in Taiwan/ Y. Ueno et al.// Fish Pathol. 1992. - Vol. 27, N 3. - P. 7-17.

42. Characterization of three continuous cell lines from marine fish/ R.D. Fernandez et al. // J. Aquat. Animal Health. 1993. - Vol. 5. - P. 127-136.

43. Chen, S.N. A cell line derived from Japanese eel {Anguilla japonica) ovary/ S.N. Chen, G.H. Kou//Fish Pathol. 1981.-Vol. 16.-P. 129-137.

44. Chen, S.N. A cell line derived from Japanese eel {Anguilla japonica) kidney/ S.N. Chen, Y. Ueno, G.H. Kou // Proc. Nutl. Sci. Counc. R.O.C. 1982. -Vol. 6.-P. 93-100.

45. Chen, S.N. A cell line derived from tilapia ovary/ S.N. Chen, Y. Ueno, G.H. Kou//Fish Pathol.-1984.-Vol. 18.-P. 13-18.

46. Continuous cell line derived from the kidney of yamame, Oncorhynchus masoul T. Watanabe et al. // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1978. - Vol. 44. - P. 415418.

47. Davidse, A. First isolation of herpesvirus of eel {Herpesvirus anguilla) in diseased European eel {Anguilla anguilla L.) in Europe/ A. Davidse // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol.-1999.-Vol. 19, N 4.-P. 137-141.

48. Davison, A.J. Channel catfish virus: a new type of herpesvirus/ A.J. Davison// Virology. 1992. - Vol. 186. - P. 9-14.

49. Davison, A J. The genome of salmonid herpesvirus 1/ A.J. Davison// J. Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 1974-1982.

50. Davison, A.J. Evolution of the herpesviruses/ A.J., Davison// Vet. Microbiol. 2002. - Vol. 86. - P. 69-88.

51. Davison, A.J. Genome sequences of two frog herpesviruses/ A.J. Davison, C. Cunningham, W. Sauerbier // J. General Virology. 2006. — Vol. — 87.-P. 3509-3514.

52. Demonstration of herpesvirus-like particles in skin lesions of the European eel (Anguilla anguilla)/ L. Bekesi et al. // J. Appl. Ichthyol. 1986. -Vol. 4.-P. 190-192.

53. Detection of koi herpesvirus DNA in tissues of infected fish/ W.L. Gray et al. // J. Fish Diseas. — 2002. Vol. 25. - P. 171-178.

54. Development of a polymerase chain reaction for the detection of Anguillid herpesvirus DNA in eels based on the herpesvirus DNA polymerase gene/ F. Rijsewijk et al. // J. Virol. Methods. 2005. - Vol. 124. - P. 87-94.

55. Dixon, P.F. Status of koi herpesvirus disease in Europe, and research on the virus in the United Kingdom/ P.F. Dixon, O.L.M. Haenen, N. Beevers// KHV infection: present status and future prospects for prevention. Tokyo Japan, 2004. -P. 5-7.

56. Eaton, W.D. Prevalence and experimental transmission of the steelhead herpesvirus in salmonid fishes/ W.D. Eaton, W.H. Wingfield, R.P. Hedrick// Dis. Aquat. Org. 1989. - Vol. 7. - P. 23-30.

57. Epizootic of herpes-like virus infection in goldfish, Carassius auratus, in Taiwan/ P.-H. Chang et al. // Fish Pathology. 1999. - Vol. 34. - P. 209-210.

58. Felsenstein, J. PHYLIP Phylogeny inference package/ J. Felsenstein // Cladistics. - 1989. - Vol. 5. - P. 164-166.

59. Fijan, N.N. An acute viral disease of channel catfish/ N.N. Fijan, T.L. Wellborn, J.P. Naftel// U.S. Fish Wild. Serv., Tech. Paper 43. 1970. - 70 p.

60. First detection and identification of koi herpesvirus (KHV) in Russian sturgeon (Acipenser gueldenstaedtii) and atlantic sturgeon (Acipenser oxyrinchus)/til

61. J. Kempter et al. // 7 International Symposium on Viruses of Lower Vertebrates. Oslo Norway, 2007. - OP 15.

62. Fryer, J.L. The in vitro cultivation of tissue and cells of Pacific salmon and steelhead trout/ J.L. Fryer, A. Yusha, K.S. Pilcher // Ann. N.Y. Acad. Sci. -1965.-Vol. 126.-P. 566-586.

63. Fujimoto, Y. Pathomorphological observations on epidermal papiloma of flatfish (Liopsetta obscura)/ Y. Fujimoto// Jap. J. Vet. Res. 1986. - Vol. 34. - P. 81-103.

64. Fung, S.K.L. Quarantine, surveillance and monitoring of koi herpesvirus in Singapore/ S.K.L. Fung, L.K. Huat, P.Y. Kwang// International Symposium KHV disease strategy for KHV disease control. - Pacifico Yokohama Japan, 2004.-P. 15.

65. Genetic relationships among herpes-like viruses isolated from sturgeon/ G.O. Kelley et al. // J. Aquat. Anim. Health. 2005. - Vol. 17. - P. 297-303.

66. Genome sequences of three koi herpesvirus isolates representing the expanding distribution of an emerging disease threatening koi and common carp worldwide/ T. Aoki et al. // J. Virology. 2007. - Vol. 81. - P. 5058-5065.

67. Genomic studies of the Lucke tumor herpesvirus (RaHV-1)/ A.J. Davison et al. //J. Cancer Research Clin. Oncology. 1999. - Vol. 125. - P. 232238.

68. Ghittino, P. Probabile adenovirosi nel giovane storione d'allevamento (Acipenser trasmontanus)/ P. Ghittino, C. Ghittino// RIV. IT. PISCIC. ITTIOP. -1985. Vol. XX, N 4. - P. 137-139.

69. Goldfish hematopoietic necrosis herpesvirus (Cyprinid Herpesvirus 2) in the USA: molecular confirmation of isolates from diseased fish/ A.E. Goodwin et al. // J. Aquat. Animal Health. 2006. - Vol. 18. - P. 11-18.

70. Gravell, M. A permanent cell line from the fathead minnow (Pimephales promelas)/ M. Gravell, R.C. Malsberger I I Arm. N.Y. Acad. Sci. 1965. - Vol. 126.-P. 555-565.

71. Heartwell, C.M. Immune response and antibody characterization of the channel catfish (.Ictalurus punctatus) to a naturally pathogenic bacterium and virus/ C.M. Heartwell// U.S. Fish Wildl. Serv., Tech. Paper 85. 56p.

72. Hedrick, R.P. Herpesviruses of fishes/ R.P. Hedrick, T. Sano // Viruses of lower vertebrates.-Berlin: Springer-Verlag, 1989.-P. 161-170.

73. Hedrick, R.P. Response of adult channel catfish to waterborne exposures to channel catfish virus/ R.P. Hedrick, J.M. Groff, T. McDovell// Prog. Fish-Cult.- 1987. Vol. 49.-P. 181-187.

74. Hedrick, R.P. A workshop on sturgeon diseases/ R.P. Hedrick, S. LaPatra, T. McDowell // Conducted at the Forth International Symposium on Sturgeon. Oshkosh, Wisconsin, 2001. - 23 p

75. Herman, R.L. Epidermal tumors of rainbow smelt in associated virus/ R.L. Herman, C.N. Burke, S. Perry// J. Wildl. Dis. 1997. - Vol. 33. - P. 925-929.

76. Herpesvirus anguillae (HVA) isolations from disease outbreaks in cultured European eel, Anguilla anguilla in the Netherlands since 1996/ O.L.M. Haenen et al.// Bull. Eur. Ass. Fish Path. 2002. - Vol. 22, N 4. - P. 247-257.

77. Herpesvirus salmonis: First occurrence in anadromous salmonids / R.P. Hedrick et al.// Bull. Eur. Ass. Fish Path. 1986. - Vol. 6. - P. 66-68.

78. Hetrick, F.M. New viruses described in finfish from 1988-1992/ F.M. Hetrick, R.P. Hedrick// Ann. Rev. Fish Dis. 1993. - Vol. 3. - P. 187-207.

79. Hoffmann, R. Koiseuche bedroht Karpfenteichwirtschaft/ R. Hoffmann// Fischer und Teichwirt. 2000. - Bd. 11. - S. 432.

80. Igari, T. The restriction endonuclease cleavage patterns of the salmonid herpesvirus strain's DNAs/ T. Igari., H. Fukuda., T. Sano// Fish Pathol. 1991. -Vol. 12.-P. 45-46.

81. Initial characteristics of koi herpesvirus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in koi, Cyprinus carpio koi/ O. Gilad et al. II Diseas. Aquat. Org. 2002. - Vol. 48. - P. 101-108.

82. Isolation and some properties of an iridovirus-like agent from white sturgeon Acipenser transmontanusl R.P. Hedrick et al.// Diseas. Aquat. Org. -1992.-Vol. 12.-P. 75-81.

83. Isolation of a cyprinid herpesvirus 2 from goldfish, Carassius auratus (L.), in the UK/ K.R. Jeffery, K. Bateman et al.// J. Fish Dis. 2007. - Vol. 30. -P. 649-656.

84. Isolation of a herpesvirus during disease outbreaks in adult koi carp, Cyprinus carpio, in the UK/ K. Way et al. // Diseases of Fish and Shellfish: 10th International Conference EAFP. Dublin, 2001. - P. 50.

85. Isolation of an epitheliotropic herpesvirus from white sturgeon {Acipenser transmontanus)/ R.P. Hedrick et al.// Diseas. Aquat. Org. 1991. -Vol. 11.-P. 49-56.

86. Isolation of channel catfish virus from channel catfish (Ictalurus punctatus) Rafinesque, broodstock/ P.R. Bowser et al. //J. Fish Dis. 1985. -Vol. 8.-P. 557-561.

87. Isolation of virus-like particles from koi (Cyprinus carpio) suffering gill necrosis/ A. Body et al. // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 2000. - Vol. 20, N 2. - P. 87-88.

88. Ito, S. Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitrocompounds/ S. Ito, M.J. Karnovsky// J. Cell Biol. 1968. - Vol. 39. - P. 168A-169A.

89. Jung, SJ. Herpesviral haematopoietic necrosis of goldfish, Carassius auratus (L.)/ SJ. Jung, T. Miyazaki// Dis. Aqut. Org. 1995. - Vol.18. - P. 211220.

90. Kasai, H. Virucidal effects of ultraviolet, heat treatment and disinfectants against koi herpesvirus (KHV)/ H. Kasai, Y. Muto, M. Yoshimizu// Fish Pathol. -2005. Vol. 40. - P. 137-138.

91. Kelley, R.K. Characterization of Herpesvirus vitreum isolated from hyperplastic epidermal tissue of walleye, Stizostedion vitreum vitreum (Mitchill)/ R.K. Kelley, O. Nielsen, S.C, Mitchell // J. Fish Dis. 1983. - Vol. 6. - P. 249260.

92. Kent, M.L. Hepatic lesions in a redstriped rockfish (Sebastes proriger) suggestive of herpesvirus infection/ M.L. Kent, M.S. Meyers// Dis. Aquat. Org. -2000. Vol. 41. - P. 237-239.

93. Kimura, T. Salmonid herpesvirus: OMV, Oncorhynchus masou virus/ T. Kimura, M. Yoshimizu// Viruses of lower vertebrates/ Ahne W, Kurstak E (eds). -Berlin: Springer-Verlag, 1989. P. 171-183.

94. Kimura, T. Viral diseases of fish in Japan/ T. Kimura, M. Yoshimizu// Annual Rev. Fish Diseases. 1991. - P. 67-82.

95. Kimura, T. Salmonid virus: a syncytium-forming herpesvirus from landlocked Oncorhynchus masouII T. Kimura, M. Yoshimizu, M. Tanaka// Fish Health News. 1980. - Vol. 9. - P. 3.

96. Kimura, T. Studies on a new virus (OMV) from Oncorhynchus masou — I. Characteristics and pathogenicity/ T. Kimura, M. Yoshimizu, M. Tanaka// Fish Pathol. 1981. - Vol. 15. - P. 143-147.

97. Kimura, T. Studies on a new virus (OMV) from Oncorhynchus masou -I. Characteristics and oncogenicity/ T. Kimura, M. Yoshimizu, M. Tanaka// Fish Pathol. 1981. - Vol. 15. - P. 149-153.

98. Kobayashi, T. Characterization and pathogenicity of a herpesvirus isolated from cutaneous lesion in Japanese eel, Anguilla japonical T. Kobayashi, T. Miyazaki// Fish Pathol. 1997. - Vol. 32, N 6. - P. 89-95.

99. Koi herpesvirus represents a third cyprinid herpesvirus (CyHV-3) in the family Herpesviridae/ T.B. Waltzek et al. // J. General Virolgy. — 2005. Vol. 86.-P. 1659-1667.

100. Kumagai, A. Optimal conditions for isolation of salmonid herpesvirus type 2 from maricultured coho salmon/ A. Kumagai, H. Fukuda, K. Takahashi// Fish Pathol. 1994. - Vol. 29. - P. 205-209.

101. Kumar, S. MEGA2: molecular evolutionary genetics analysis software/ S. Kumar, K. Tamura, I. Jakobsen // Bioinformatics. 2001. - Vol. 17. - 1244 -1245.

102. Kurobe, T. Revised phylogenetic relationships among herpesviruses isolated from sturgeons/ T. Kurode, G.O. Kelly, T.B. Waltzek // J. Aquat. Anim. Health. 2008. - Vol. 20. - P. 96-102.

103. Lannan, C.N. Fish cell lines: establishment and characterization of nine cell lines from salmonids/ C.N. Lannan, J.R. Winton, J.L. Fryer // In Vitro. 1984. -Vol. 20.-P. 671-676.

104. Lee, M.H. Some properties of the herpesvirus of channel catfish/ M.H. Lee, K.M. Tenno, P.C. Loh// Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 1978. - P. 262-265.

105. Lee, N.-S. Virus-associated spawning papillomatosis in smelt, Osmerus eperlanus L., in the River Thames/ N.-S. Lee, P.J. Whitfield// J. Fish Biol. 1992. -Vol. 40.-P. 503-510.

106. Lee, N.-S. Gill filament necrosis in farmed Japanese eels, Anguilla japonica (Temminck and Schlegel), infected with Herpesvirus anguillae/ N.-S. Lee, T. Kobayashi, T. Miyazaki// J. Fish Dis. 1999. - Vol. - 22. - P. 457-463.

107. Leibovitz, L. A viral dermatitis of the smooth dogfish, Mustelus cards (Mitchill)/ L. Leibovitz, S.S. Lebouitz// J. Fish Dis. 1985. - Vol. 8. - P. 273-279.

108. Lewis, D.H. Micricultures of Sarotherodon mossambicus (Peters) cells: their use in detecting fish viruses/ D.H. Lewis, J.E. Marks // J. Fish Dis. 1985. -Vol. 8. - P. 477-478.

109. Margenau, T.L. Prevalence of blue spot disease (Esocid Herpesvirus-1) on nortern pike and muskellunge in Wisconsin/ T.L. Margenau, S.V. Marcquenski, P.W. Rasmussen // J. Aqut. Animal. Health. 1995. - Vol. 7. - P. 29-33.

110. Mass mortalities in koi carp, Cyprinus carpio, associated with gill and skin disease/ A. Bretzinger et ah. // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 1999. - Vol. 19, N5.-P. 182-185.

111. McAllister, P.E. Epizootic mortality in hatchery-reared lake trout Salvelinus namaycush caused by a putative virus possibly of the herpesvirus group/ P.E. McAllister, R.L. Herman// Dis. Aquat. Org. 1989. - Vol. 6. - P. 113-119.

112. McArn, G.E. Skin lesions and associated virus in Pacific cod {Gadus macrocephalus) in the Bering Sea// G.E. McArn, B. McCain, S.R. Welling// Fed. Proc. 1978. - Vol. 37. - P. 937.

113. Mellergaard, S. Herpesvirus-like particles in angelfish Pterophyllum altumf S. Mellergaard, B. Bloch// Dis. Aquat. Org. 1988. - Vol. 5. - P. 151-155.

114. Molecular comparison of isolates of an emerging fish pathogen, koi herpesvirus, and the effect of water temperature on mortality of experimentally infected koi/ O. Gilad et al.// J. Gener. Virology. 2003. - Vol. 84. - P. 26612667.

115. Molecular confirmation of a new herpesvirus from catfish (Ameiurus melas) by testing the performance of a novel PCR method, designed to target the

116. DNA polymerase gene of alloherpesvirus/ A. Doszpoly et al. // Arch. Virol. -2008. Vol. 153. - P. 2123-2127.

117. Munday, B.L. Viral diseases of fish and shellfish in Australian mariculture/ B.L. Munday, L. Owens// Fish Path. 1998. - Vol. 33. - P. 193-200.

118. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. 6th ed. Paris: Office International des Epizooties, 2009.

119. Nagasava, K. KHV infection in Southeast Asia and response of SEAFDEC to this new threat to regional aquaculture/ K. Nagasava// KHV infection: present status and future prospects for prevention. Tokyo Japan, 2004. -P. 21-23.

120. Neukirch, M. Isolation of a virus from koi with altered gills/ M. Neukirch, K. Böttcher, S. Bunnajirakul// Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 1999. -Vol. 19, N5.-P. 221-224.

121. Neukirch, M. Isolation and preliminary characterization of several viruses from koi (Cyprinus carpio) suffering gill necrosis and mortality/ M. Neukirch, U. Kunz // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 2001. - Vol. 21, N. 4. - P. 125135.

122. Neure Beiträge zur Ätiologie der Karpfewnpocken/ F. Racz et al.// Fish and Environment. Stuttgart; New York: G. Fish. Verlag, 1980. - Vol. 8, N 4.-P. 49-58.

123. Nieuwstadt, A.P. Persistense of herpesvirus of eel Herpevirus anguillae in farmed Europe eel Anguilla anguilla /A.P. Nieuwstadt, S.G. Dijkstra, O.L.M. Haenen// Dis. Aquat. Org. 2001. - Vol. 45. - P. 103-107.

124. Nims, L. Studies of replication of four selected viruses in two cell lines derived from salmonids fish/ L. Nims, J.L. Fryer, K.S. Pilcher // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1970. - Vol. 135. - P. 6-12.

125. Oh, M.-J. A viral disease occurring in cultured carp Cyprinus carpio in Kore/ M.-J. Oh, S.-J. Jung, T.-J. Choi // Fish Pathol. 2001. - Vol. 36. - P. 147151.

126. Pathogenesis of Herpesvirus anguilla (HVA) in juvenile European eel Anguilla anguilla after infection by bath immersion/ B.N. Hangalapura//Dis. Aquat. Org. 2007. - Vol. 78. - P. 13-22.

127. Perelberg, A. Epidemiological description of a new viral disease afflicting cultured Cyprinus carpio in Israel/ A. Perelberg, M. Smirnov, M. Hutoran// Israeli J. Aquat. 2003. - Vol. 55. - P. 5-12.

128. Plumb, J.A. Tissue distribution of channel catfish virus/ J.A. Plumb// J. Wild. Dis. 1971. - Vol. 7. -P. 213-216.

129. Plumb, J.A. Neutralization of channel catfish virus by serum of channel catfish/ J.A. Plumb// J. Wild. Dis. 1973. - Vol. 9. - P. 324-330.

130. Plumb, J.A. Effects of temperature on mortality of fingerling channel catfish (.Ictalurus punctatus) experimentally infected with channel catfish virus/ J.A. Plumb// J. Fish. Res. Board Can. 1973. - Vol. 30. - P. 568-570.

131. Plumb, J.A. Epizootology of channel catfish virus/ J.A. Plumb// Mar. Fish. Rev. 1978. - Vol. 40. - P. 26-29.

132. Plumb, J.A. Susceptibility of blue catfish to channel catfish virus/ J.A. Plumb, J. Chappell// Proc. Annu. Conf. Southeast. Assoc. Fish Wildl. Agencies. -1978.-Vol. 32.-P. 680-685.

133. Plumb, J.A. Channel catfish virus disease/ J.A. Plumb, J.L. Gaines// The pathology of fishes/ W.E. Ribelin, G. Migaki (eds). Madison: Univ. Wisconsin Press, 1975. - P. 287-302.

134. Plumb, J.A. Histopathology and electron microscopy of channel catfish virus in infected channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque)/ J.A. Plumb, J.L. Gaines, E.C. Mora// J. Fish Biol. 1974. - Vol. 6. - P. 661-664.

135. Plumb, J.A. Resistence of the Europen catfish {Silurus glanis) to channel catfish virus/ J.A. Plumb, V. Hilge, E.E. Quinlan/ J. Appl. Ichthyol. -1985.-Vol.-P. 87-89.

136. Plumb, J.A. Survival of channel catfish virus in chilled, frozen and decomposing channel catfish/ J.A. Plumb, L.D. Wright, V.L. Jones// Prog. Fish-Cult. 1973.-Vol. 35.-P. 170-172.

137. Reed, L.J. A simple method of estimating fifty percent endpoints/ L.J. Reed, H.A. Muench // Amercan J. Hygiene. 1938. - Vol. 27. - P. 493-497.

138. Reynolds, E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy/ E.S. Reynolds// J. Cell Biol. 1963. — Vol. 17. - P. 208-213.

139. Richards, R.H. Studies on Herpesvirus scophthalmi infection of turbot Scophthalmus maximus (L.): histopathological observations/ R.H. Richards, J.S. Buchanan// J. Fish Dis. 1978. - Vol. 1. - P. 251-258.

140. Risk factors for outbreaks of disease attributable to white sturgeon iridovirus and white sturgeon herpesvirus-2 at a commercial sturgeon farm/ M.P. Georgiadis et al. //AJVR. 2000. - Vol. 61, N 10. - P. 1232-1240.

141. River, T. Viruses and Koch^s postulates/ T. River// J. Bact. 1937. -Vol. 33.-P.l-12

142. Robin, J. Resistance of herpes channel catfish virus (HCCV) to temperature, pH, saline and ultraviolet irradiation/ J. Robin, A. Rodrigue// Rev. Can. Biol. 1980. - Vol. 39. - P. 153-156.

143. Rukyani, A. Koi herpesvirus infection in Indonesia: Suspicion Электронный ресурс. — режим доступа: at:http://www.promedmail.org. -загл. с экрана.

144. Sano, Т. Herpesvirus cyprini: biological and oncogenic properties/ T. Sano, H. Fukuda, M. Furukawa //Abstracts International Simposium of Fish Pathology. Tokyo, 1984. - P. 55-56.

145. Sano, T. Herpesvirus cyprini: biological and oncogenic properties/ T. Sano, H. Fukuda, M. Furukawa // Fish Pathology 1985. - Vol. 20. - P. 381-388.

146. Sano, T. Yamame tumor virus: lethality and oncogenicity/ T. Sano, H. Fukuda, N. Okamoto // Bull. Jap. Soc. Scient. Fish. 1983. -Vol. 49. - P. 11591163.

147. Sano, M. Isolation and characterization of a new herpesvirus from eel/ M. Sano, H. Fukuda, T. Sano// Pathology in marine science/ Perkins F.O., Cheng T.C. (eds.). N.Y.: Academic Press, 1990. - P. 15-31.

148. Sano, Т. A preliminary report on pathogenicity and oncogenicity of cyprinid herpesvirus/ T. Sano, N. Morita, N. Shima // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. -1990.-Vol. 10, N l.-P. 11-13.

149. Sano, M. Characterization of a newly isolated herpesvirus from eel/ M. Sano, T. Sano, H. Fukuda// Abstracts Third International Colloquium Pathology Marine Aquaculture. Virginia, 1988. - P. 11.

150. Sano, M. Regional update on KHV: Japan Электронный ресурс. -режим доступа: at:http//www.defra.gov.uk/science/ Publications/Default.asp. -загл. с экрана.

151. Shchelkunov, I.S. Atlantic salmon papillomatosis: visualization of herpesvirus-like particles in skin growths of affected fish/ I.S. Shchelkunov, T.A. Karaseva, Y.P. Kadoshnikov //Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 1992. - Vol. 12, N1. -P. 28-31.

152. Schubert, G.H. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zur Pockenkranheit des Karpfens/ G.H. Schubert// Z. Naturforsch. 1964. - Bd. 19. -S. 675-682.

153. Schubert, G.H. The infective agent in carp pox/ G.H. Schubert// Bull. Off. Int. Epizooties. 1966. - Vol. 65. - P. 1011-1022.

154. Serological relationships of five herpesviruses isolated from salmonid fishes/ R.P. Hedrick et al. // J. Appl. Ichthyol. 1987. - Vol. 3. - P. 87-92.

155. Shimizu, T. Survival of koi herpesvirus (KHV) in environmental water/ T. Shimizu, N. Yoshida, H. Kasai // Fish Pathol. 2006. - Vol. 41. - P. 1-5.

156. Skin infection on the sheatfish (Siluris glanis) caused by a herpesvirus/ L. Bekesi et al. // Fish, pathogens and environment in European Polyculture. -Szarvas, 1981.-P. 59-69.

157. Skin infection of the sheatfish {Siluris glanis) caused by a herpesvirus/ L. Bekesi et al. // Symposia Biol. Hunggarica. Acad<2m. kiado. Budapest, 1984. -N23.-P. 25-30.

158. Some properties of the Epithelioma papulosum cyprini (EPC) cell line from carp Cyprinus carpiol N. Fijan et al. // Ann. Virol. (Inst. Pasteur). 1983. — Vol. 134.-P. 207-220.

159. Steinhagen, D. Virus-associated epidermal hyperplasia in golden ide Leuciscus idus melanotus! D. Steinhagen, P. Kruse, M. Neukirch// Dis. Aquat. Org. 1992. - Vol. 13. - P. 225-229.

160. Stephens, F.J. Haematopoietic necrosis in a goldfish {Carassius auratus) associated with an agent morphologically similar to herpesvirus/ F.J. Stephens, S.R. Raidal, B. Jones// Australian Vet. J. 2004. - Vol. 82. - P. 167169.

161. Systemic herpes-like virus in catfish Ictalurus melas (Italy) differs from Ictalurid herpesvirus 1 (North America)/ R.P. Hedrick et al.//Dis. Aquat. Org.2003.-Vol. 55.-P. 85-92.

162. Sunarto, A. Indonesian experience on the ourbreak of koi herpesvirus in koi and carp {Cyprinus carpio)/ A. Sunarto, A. Rukyani// International Symposium KHV disease — strategy for KHV disease control. Pacifico Yokohama Japan,2004.-P.17.

163. Suzuki, K. Herpesvirus infection of rainbow trout/ K. Suzuki, M. Hatakeyama, M. Yoshimizu// J. Soc. Fish Pathol. 1993. - Vol. 15. - P. 22.

164. Suzuki, S. Characteristics of DNA polymerase induced by salmon herpesvirus, Oncorhynchus masou virus/ S. Suzuki, T. Kimura, M. Saneyoshi// J. Gen. Virol. 1986. - Vol. 67. - P. 405-408.

165. Swofford, D.L. PAUL: phylogenetic analysis using parsimony (and other methods), version 4.0./ D.L. Swofford. Sunderland Massachusetts: Sinauer Associates, 1998.

166. Tanaka, M. Herpesvirus infection of salmonid fish/ M. Tanaka, M. Yoshimizu T. Kimura// Salmonid diseases/ Kimura T. (ed.). Sapporo: Hokkaido University Presss, 1992.-P. 111-117.

167. The effects of water temperature and fish age on a herpesvirus infection of Japanese flounder larvae, Paralichthys olivaceus// K. Masumura et al. // Fish Pathol. 1989. - Vol. 24. - P. 111-114.

168. The emergence of koi herpesvirus and its significance to European aquaculture / O.L.M. Haenen et al.// Bull. Eur. Ass. Fish Path. 2004. - Vol. 24, N. 6.-P. 293-307.

169. The occurrence of virus infections in elvers and eels (Anguilla japonica) in Europe with particular reference to VHSV and IHNV/ P.E.V. J0rgensen et al. // Aquaculture. 1994. - Vol. 123. P. 11-19.

170. The order Herpesviralesl A.J. Davison et al.// Arch. Virol. 2009. -Vol. 154.-P. 171-177.

171. Tu, C. Detection of koi herpesvirus in koi Cyprinus carpio in Taiwan/ C. Tu, M.-C. Weng, J.-R. Shiau // Fish Pathol. 2004. - Vol. 39. - P. 109-110.

172. Two cell lines from white sturgeon/ R.P. Hedrick et al.// Trans. Am. Fish Soc. 1991. - Vol. 120. - P. 528-534.

173. Two continuous cell lines from carp, Cyprinus carpio "LI I.S.iL

174. Shchelkunov et al.// Diseases of Fish and Shellfish: 7 International Conference EAFP. Palma de Mallorca, 1995. - P. 49.

175. Viral diseases offish: first report of carp pox in golden ide (Leuciscus idus) in North America/P.E. McAllister et al. // J. Wild. Dis. 1985. - Vol. 21. -P. 199-204.

176. Walker, D.P. Studies on the culture, assay of infectivity and some in vitro properties of Lymphocystis virus/ D.P. Walker, B.J. Hill // J. Gen. Virol. — 1980.-Vol. 51.-P. 385-395.

177. Walster, C.I. Clinical observations of severe mortalities in koi carp, Cyprinus carpio, with gill disease/ C.I. Walster// Fish Vet. J. 1999. - Vol. 3. - P. 54-58.

178. Walster, C.I. Koi carp mortality syndrome: an update/ C.I. Walster// Fish Vet. J. 2000. - Vol. 5. - P. 72-75.

179. Walster, C.I. Koi carp mortality syndrome: an update/ C.I. Walster// Fish Vet. J. 2000. - Vol. 5. - P. 72-75.

180. Waltzek, T.B. Evolutionary relationships of the fish and amphibian herpesviruses/ T.B. Waltzek, G.O. Kelley, A.J. Davison //Aquatic Animal Health: 5th Internanional Symposium. San Francisco, 2006. — P. 266.

181. Watson, L.R. Characteristics and pathogenicity of a novel herpesvirus isolated from adult and sub adult white sturgeon Acipenser transmontanusl L.R. Watson, S.C. Yun, J.M. GroffV Dis. Aquat. Org. 1995. - Vol. 22. - P. 199-210.

182. Whittington, R.J: Epizootic mortality in the pilchard (Sardinops sagax neopilchardus) in Australia and New Zealand in 1995; I. Pathology and epizootiology/ R.J. Whittington, B. Jones, P.M. Hime // Dis. Aquat. Org. 1997. -Vol. 28.-P. 1-16.

183. Wolf, K. Fish viruses and fish viral diseases/ K. Wolf. Ithaca; London: Cornell University Press, 1988.-476 p.

184. Wolf, K. Channel catfish viruses: a new herpesvirus of ictalurid fish/ K. Wolf, W. Darlington// J. Virol. 1971. - Vol. 8. - P. 525-533.

185. Wolf, K. Poikiloteraiivertebrate cell; lines and viruses: a current listing for fishes/ K. Wolf, J.A. Mann// In Vitro. 1980. - Vol. 16. - P. 168-179.

186. Wolf, K. Established eurythermic line of fish cells in vitro/ K. Wolf, M.C. Quimby // Science. 1962. - Vol. 135. - P. 1065-1066.

187. Wolf, K. Lymphocystis virus: isolation and propagation in centrarchid fish cell lines/ K. Wolf, M.C.,Quimby // Science. 1966; — Vol. 151. — P. 10041005./ • .

188. Wolf, K. Fishi ceir and- tissue culture/ K. Wolf; M.C. Quimby // Fish Physiology/ W.S. Hoar, D.J. Randall (eds.);-N;Y.: Acad; Press, 19691-Vol: 3; -P. 253-305.

189. Wolf, K. Herpesvirus salmonis: pathological': changes in parenterally infected rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, fry/ K. Wolf, C.E. Smith// J. Fish Dis. 1981. - Vol. 4; - P. 445-447.

190. Wolf, K. Salmonid viruses: a syncytium-forming agent from rainbow trout/^^ K.Wolf, W.G. Taylor// Fish Health News.^1975;-N. 3v-P: 4.

191. Can. 1972. - Vol. 29. - P. 149-150.

192. Yanong, R.P.E. Possible herpesvirus-associated disease in blue-eyed plecostomus, Panaque suttoni/ R.P.E. Yanong// Intern. Ass. Aquat. Animal Med. -1995.-Vol. 26.-P. 83.

193. Yoshimizu, M. Oncorhynchus masou virus (OMV): incidence of tumor development among experimentally infected representative salmonid species/ M. Yoshimizu, M. Tanaka, M.Kimura// Fish Pathol. 1987. - Vol. 22. - P. 7-10.

194. Yoshimizu, M. Salmonid herpesvirus 2. Epizootiology and serological relationship/M. Yoshimizu, H. Fukuda, T. Sano // Vet. Res. 1995. - Vol. 26. - P. 486-492.

195. Yoshimizu, M. Evaluation of koi herpesvirus in environmental water/ M. Yoshimizu, T. Shimizu, N. Yoshida, H. Kasai// Aquatic Animal Health: 5th International Symposium. San Francisco, 2006. - P. 285.

196. Yamamoto, T. Epidermal hyperplasia of northern pike (Esox lucius) associated with herpesviruses and c-type particles/ T. Yamamoto, R.K. Kelley, O. Nielsen// Arch. Virol. 1983. - Vol. 97. - P. 255-272.

197. Yamamoto, T. Morphological differentiation of virus-associated skin tumors of walleye (Stizostedion vitreum vitreum)/ T. Yamamoto, R.K. Kelley, O. Nielsen// Fish Pathol. 1985. - Vol. 20. - P. 361-372.