Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическая и молекулярно-генетическая характеристика вирусов краснухи, выделенных в Санкт-Петербурге

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологическая и молекулярно-генетическая характеристика вирусов краснухи, выделенных в Санкт-Петербурге"

005015646

с

БУЗИЦКАЯ Жанна Валерьевна

БИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ЕЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ КРАСНУХИ, ВЫДЕЛЕННЫХ В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ

специальность 03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 МДР 2012

Санкт-Петербург - 2012 г

005015646

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Цыбалова Людмила Марковна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, руководитель лаборатории детских

вирусных инфекций ФГУН НИИ Лаврентьева Ирина Николаевна

эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Роспотребнадзора, Санкт-петербург

доктор биологических наук, врач-вирусолог клинико-диагностической

лаборатории Детской городской Соколова Екатерина Дмитриевна

клинической больница №5 им. Н.Ф.Филатова, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских

наук Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва

Защита диссертации состоится «20» марта 2012 года в-<£1час ¿ЭДин. на заседании Диссертационного совета Д.001.043.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» Минздравсоцразвития России (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан февраля 2012 г.

Ученый секретарь / ^ кандидат медицинских наук Диссертационного совета ¿Уу/УЛ_Суховецкая Вера Федотовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Эпидемиологическая и социальная значимость краснухи обусловлена повсеместным распространением инфекции и тератогенным действием вируса -способностью формировать врожденные дефекты развития, приводящие к инвалидности или смертельному исходу у новорожденных (Зверев В.В., 2004; Frey et al., 2009). Согласно стратегическому плану Европейского региона ВОЗ, по ликвидации кори и предупреждению врожденной краснушной инфекции в регионе, к 2010 году Россия должна была войти в число стран с уровнем заболеваемости краснухой <1 на 1 000000 населения и уровнем заболеваемости СВК <1 на 100 000 живых новорожденных детей. К январю 2009 года >95% детей в среднем по каждой стране должны быть вакцинированы минимум одной дозой краснушной вакцины. К концу 2010 года почти 1 миллион детей, проживающих в странах Европейского региона, не был иммунизирован в соответствии с данной программой, в связи с этим ВОЗ пересмотрела сроки ликвидации кори, краснухи и малярии в регионе и определила для этой цели 2015 год (WHO, 2010).

В России до конца 90-х годов краснуха оставалась неуправляемой инфекцией и за исключением гриппа и ОРВИ занимала 1-2 место среди инфекций, передающихся воздушно-капельным путем (Зуева Л.П., Яфаев Р.Х, 2005).

Широкомасштабная вакцинация, проводимая в России с 2001 года в рамках национального плана по борьбе с краснухой, привела к значительному снижению уровня заболеваемости (Лаврентьева И.Н., Семериков В.В.и др., 2008). Однако среди заболевших краснухой наметилась опасная тенденция к увеличению доли взрослого населения, в том числе женщин репродуктивного возраста (Онищенко Г.Г., 2010). Ситуация осложняется за счет увеличения числа мигрантов, иммунизация которых представляет определенные трудности. Ежегодно регистрируемые вспышки заболевания по-прежнему определяют высокую вероятность развития синдрома врожденной краснухи (СВК) у новорожденных.

Эффективный эпидемиологический надзор и контроль над краснушной инфекцией определяется несколькими важными факторами, в том числе своевременной и качественной диагностикой краснухи, анализом популяционного иммунитета к краснухе, молекулярно-эпидемиологическими исследованиями возбудителя.

Современные диагностические методы, основанные на выявлении генетического материала вируса, позволяют решать задачи ранней диагностики краснушной инфекции, особенно в случаях, требующих дифференциально-диагностического поиска (Haas at al., 2005; Sanz at al., 2010). Анализ состояния популяционного иммунитета к вирусу краснухи, проводимый по результатам серологических исследований, позволяет оценивать эффективность вакцинопрофилактики и выявлять лиц с минимальным уровнем защиты от инфекции, что особенно важно для беременных женщин и детей (Sanz at al., 2010).

Важным аспектом эпидемиологического надзора и контроля над краснухой является изучение молекулярно-генетических свойств вирусов, циркулирующих в различных регионах и их филогенетический анализ. В рамках программ надзора и ликвидации краснухи с 2004 года, получены генетические характеристики 100 новых штаммов вируса краснухи, что позволило обновить информацию о классификации вирусов, выделить референс-штаммы (WHO, 2007). В настоящее время, обновленная номенклатура описывает 13 генотипов дикого типа вируса краснухи: основные генотипы 1В, 1С, 1D, 1Е, 1F, 1G, 1Н, 2А, 2В, 2С и условные генотипы la, li, и lj (Abernathy at al., 2011).

При этом, Россия была определена экспертами ВОЗ как территория с эндемичным распространением вирусов краснухи генотипа 2с (по новой классификации 2С) (WHO Rubella Nomenclature Report, 2005). По последним данным на территории России циркулируют вирусы краснухи разных генотипов: в Сибири вирусы, относящиеся к генотипу 1Е и 1Н, в Москве 1F, 1G и 1Н (Серегин и др., 2011; Тюнников и др., 2007). Несмотря на высокое антигенное родство различных штаммов вируса краснухи, выделенных в разных регионах мира (Десятскова, 1974., Зверев и др. 2002), изменения в составе генома вируса под действием коллективного иммунитета создают предпосылки возникновения новых вариантов вируса (Лаврентьева и др., 2008; Онищенко и др., 2008). Изучение генетической вариабельности циркулирующих штаммов вируса краснухи в условиях массовой вакцинации позволяет проследить пути передачи и направление изменчивости вирусов под влиянием социальных и биологических факторов. Кроме того, молекулярно-генетический анализ изолятов вируса краснухи дает возможность классифицировать случаи инфекции как эндогенные или завозные и корректировать профилактические и противоэпидемические мероприятия. Цель исследования. Дать характеристику биологических и молекулярно-генетических свойств вирусов краснухи, выделенных в Санкт-Петербурге, провести сравнительную оценку современных методов диагностики краснушной инфекции. Задачи исследования

1. Провести анализ заболеваемости краснухой детского и взрослого населения Санкт-Петербурга в период с 1995 по 2010 гг.

2. Изучить популяционный иммунитет к краснухе населения мегаполиса в условиях массовой вакцинации детей и подростков.

3. Дать сравнительную оценку эффективности современных серологических и молекулярно-генетических методов лабораторной диагностики краснушной инфекции.

4. Обосновать выбор оптимальных иммуноферментных тест-систем для диагностики краснухи и изучения популяционного иммунитета.

5. Охарактеризовать биологические свойства штаммов вируса краснухи, изолированных в Санкт-Петербурге, на модели инфекции in vitro.

6. Провести молекулярно-генетический и филогенетический анализ изолятов.

Научная новизна работы

Впервые исследованы показатели заболеваемости краснухой и популяционный иммунитет населения мегаполиса в условиях массовой иммунизации против краснушной инфекции. Впервые дана молекулярно-генетическая характеристика вирусов краснухи, выделенных в Северо-Западном регионе России (Санкт-Петербург), что расширяет представления о молекулярной эпидемиологии данного возбудителя. В результате масштабных исследований дана сравнительная оценка иммуноферментных тест-систем, мотивирован выбор оптимальной тест-системы. Сопоставлена диагностическая значимость серологических (ИФА) и молекулярно-генетических (ПЦР) методов идентификации краснушной инфекции. Практическая значимость работы

Из клинических образцов больных краснухой были выделены 22 штамма вируса краснухи (8РЬ-1Л1и551а/2007-8РЬ-22/Ки551а/2007), которые были депонированы в Музей вирусов НИИ гриппа. Полученные последовательности гена Е1 вирусов краснухи Ю/5/5РЬ-13/7/Ки5з1а/2007, ЯУз^РЬ-16/8/Ки$51а/2007 депонированы в Международную базу данных СепВапк (коды доступа К2036235, .1(2036236).

Определен генотип вирусов краснухи, циркулирующих в Санкт-Петербурге, что позволяет определять характер (эндемичный или завозной) случаев краснухи и организовывать адекватные противоэпидемические мероприятия. Обоснованы преимущества российских тест-систем «ЭКОлаб-Краснуха-^М» и «ЭКОлаб-Краснуха-^й» (производство ЗАО «ЭКОлаб», Россия) по сравнению с другими диагностическими тест-системами российского производства. Показано их соответствие по чувствительности и специфичности референс-системам производства США. Полученные данные направлены на совершенствование эпидемиологического надзора и контроля над краснухой на территории Российской Федерации. Основные положения, выносимые на защиту

1. Реализация программ вакцинации против краснухи в рамках национального календаря прививок и национального проекта «Здоровье» создала предпосылки для снижения уровня заболеваемости краснухой и случаев СВК до показателя <1 на 1 ООО ООО населения, что соответствует задачам, поставленным в Программе ВОЗ.

2. В результате 5-ти летней массовой иммунизации против краснухи детей и подростков значительно вырос уровень популяционного иммунитета - 96,3% обследованных контингентов были серопозитивны. Среди серонегативных лиц мужчины старше 15 лет встречались в 5 раз чаще, чем женщины.

3. Метод ОТ-ПЦР при обследовании больных в первые дни заболевания (1 -3 день) является наиболее информативным. Начиная с 4-го дня заболевания, увеличивается диагностическая значимость иммуноферментного анализа. Российские иммуноферментные тест-системы «ЭКОлаб-Краснуха-^М» и «ЭКОлаб-Краснуха-^й» имели преимущества перед другими тест-системами российского производства при диагностике краснухи и оценке популяционного иммунитета.

4. Вирусы краснухи, изолированные в Санкт-Петербурге в 2007 году, относились к 1Е генотипу и имели 97,7% гомологии к изолятам из Минска и 99,0 - 99,6% гомологии к изоляту из Барнаула.

5. На модели краснушной инфекции in vitro показана динамика клеточного морфогенеза, вызванного вновь изолированными вирусами и формирование репликативных комплексов и оболочек вирионов вирусов краснухи.

6. На фоне массовой вакцинации против краснухи в России отмечено исчезновение эндемичного вируса генотипа 2С и появление штаммов вируса краснухи генотипов IE, 1Н, и 1G.

Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и проведении лабораторных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов. Молекулярно-генетические исследования клинических образцов и выделенных штаммов вируса краснухи (ПЦР, секвенирование) и компьютерная обработка данных проведены лично автором. Вклад соавторов заключается в выделении вирусов краснухи на культурах клеток, тестировании сывороток крови серологическими методами, проведении электронно-микроскопических исследований. Работа выполнена в рамках Проекта МНТЦ «Совершенствование и стандартизация лабораторных и эпидемиологических методов надзора за краснухой в Российской Федерации» (№ 3373). Апробация материалов диссертации

Материалы диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития» Алматы, 2008 г.; Российско-итальянской конференции «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций», Петрозаводск, 2008 г.; представлены на Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» Новосибирск, 2009 г.; на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» Москва 2010. Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 8 тезисов докладов. Принята к печати 1 статья в журнале, входящем в список ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, включая 9 таблиц и 21 рисунок. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 8 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы содержит 197 источников на русском и английском языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Статистические данные о заболеваемости краснухой собраны за период 1995-2010 г. При сборе данных использовали форму №2 Городского центра Госсанэпиднадзора Санкт-Петербурга "Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях". Данные по охвату прививками получили при анализе статистических форм №6 федерального государственного

статистического наблюдения "Сведения о контингентах детей и взрослых, привитых против инфекционных заболеваний".

Клинические материалы. Были исследованы, образцы крови, полученные от 705 здоровых людей, в том числе 402 детей и подростков от 3 до 17 лет и 303 взрослых от 18 лет и старше. От 37 пациентов, находящихся на лечении в 442-ом Санкт-Петербургском Окружном военном госпитале им. З.П.Соловьева в ноябре - декабре 2007г. с предположительным диагнозом краснуха, были получены и исследованы парные пробы крови и носоглоточных смывов (сроки заболевания от 1 до 9 дней).

Изоляция вирусов. Выделение и пассирование штаммов проводили на культурах клеток RK-13 (клетки почки кролика). Клетки выращивали в пробирках по 2 мл в среде 199 с добавлением 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота при 37°С 24 часа. На клетки вносили носоглоточное содержимое в количестве 0,2 мл на пробирку. При подозрении на бактериальное загрязнение исходные материалы подвергались стерилизующей фильтрации через фильтры «Иллинор» диаметром 0,22 мкм. После сорбции на клетках в течение 1 часа при 37°С в каждую пробирку добавляли 1,8 мл поддерживающей среды 199 с 2% бычьего сывороточного альбумина (фракция V) и гентамицина 40 мкг/мл. Зараженные клетки инкубировали в течение 7-8 суток при 34°С. По окончании инкубации из каждой пробирки делалась выемка 200 мкл для идентификации вируса в ПЦР. Все выделенные штаммы хранились при -70°С. Изоляты вируса краснухи RV/SPb-lO/Russia/2007 и RV/SPb-16/Russia/2007, выделенные из носоглоточных смывов больных прошли четыре пассажа на культуре клеток RK-13. Клетки выращивали во флаконах фирмы "Sarstedt" Германия, объемом 75 см2 под слоем питательной среды 199. После образования монослоя клетки заражали вирусом краснухи. Зараженные культуры инкубировали при 34°С в течение 6 дней. В качестве поддерживающей среды применяли питательную среду с BSA (фракция V). Выделение РНК и синтез кДНК. РНК вируса краснухи была выделена из мазков или культуральной жидкости с помощью тест-системы «РИБО-сорб» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия); кДНК была синтезирована в 20 мкл смеси для реакции обратной транскрипции на комплекте реагентов «PEBEPTA-L» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) со случайных гексонуклеотидов (60 мин при температуре 45о С). Для денатурации реакционную смесь прогревали 5 мин при 95 ¿С.

РНК вируса краснухи выявляли в ПЦР с использованием наборов «АмплиСенс Rubella virus» и «АмплиСенс® Rubella virus» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Постановка ПЦР осуществлялась на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология) с активным регулированием (по раствору в пробирке). Учет результатов ПЦР-анализа проводился по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной кДНК.

Амплификация фрагментов. Длина гена El около 1400 нуклеотидов. Для получения оптимальных результатов секвенирования амплифицировали два перекрывающихся фрагмента с двух пар праймеров. Каждая реакционная смесь объемом 50 мкл содержала: 10 мкл кДНК, полученной в реакции обратной

транскрипции, 10 мкл 5Х ПЦР буфера, 4 мкл dNTP (по 2,5мМ каждого), 2,5U Taq ДНК полимеразы, по 50 пкМ каждого праймера (Zheng et al., 2003). Электрофорез. ПЦР - продукт был внесен в 1% агарозный гель, после электрофореза выделен и очищен при помощи ДЕАЕ бумаги. Анализ и очистка продуктов ПЦР. Анализ и очистку продуктов ПЦР для секвенирования проводили гель-электрофорезом в 2%-ной агарозе. В качестве маркера молекулярной массы использовался Gene Ruler™ 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Литва). Детекция проводилась визуально в УФ свете. Положение полос на геле отмечали и далее выделяли ДНК из геля.

Выделение кДНК из агарозного геля на DEAE-бумагу. Элюирующий буфер для DEAE бумаги Whatman DE81 содержал 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА, 1 M NaCl. ДНК осаждали центрифугированием при 13200 об/мин в течение 15 мин. Супернатант отбирали вакуумным отсосом. К осадку добавляли равный объем 70% этанола. Центрифугировали смесь при 13200 об/мин в течение 5 мин. Супернатант отбирали вакуумным отсосом. Осадок высушивали в вакуумном испарителе «VE-10» (Varían Inc, США). Высушенные фрагменты растворяли в 10 мкл деионизованной воды. Секвенирование. Секвенирование проводили методом Сэнгера с использованием коммерчески доступного набора реагентов «ABI prism® BigDye™ Terminator v3.1». Секвенирование каждой последовательности проводили с прямого и обратного праймеров. Реакцию проводили в твердотельном термоциклере с термостатированной крышкой «Techne Genius» (Techne, Великобритания). Для удаления остаточных терминаторов элонгации цепи ДНК осаждали смесью ЗМ ацетата натрия (pH 5,0), 10 мМ натриевой соли ЭДТА и декстрана в соотношении по объему 1:1:1. Осадок отмывали 70% этанолом. Затем высушивали осадок в вакуумной сушилке и растворяли в формамиде. Полученный раствор прогревали до 95°С в течение 1-2 мин., а затем охлаждали на льду и наносили в лунки планшета.

Иммуноферментный анализ. Для определения антител в сыворотке крови использовали иммуноферментные тест-системы ИФТС «ЭКОлаб-Краснуха-IgM», «ЭКОлаб-Краснуха-IgG» (производство ЗАО «ЭКОлаб», Россия); «ВектоРубелла-IgM», «ВектоРубелла-IgG» (производство ЗАО «Вектор-Бест», Россия); «Краснуха-скрин» (производство ЗАО «Биосервис», Россия) и аналоговые референс-тест-системы зарубежного производства «DSL-05-10-RBM» , «DSL-05-10-RBG» (производство Diagnostic Systems Laboratories INC, США), а также «BCM-Diagnostics - IgM», «ВСМ- Diagnostics - IgG» (производство фирмы ВСМ Diagnostics, США). Все ИФТС позволяют провести анализ образцов в течение одного рабочего дня. В качестве хромогена во всех системах используется безопасный препарат 3,3',5,5'- тетраметилбензидин. Просвечивающая электронная микроскопия. Наличие вируса в клеточной среде подтверждали методом просвечивающей электронной микроскопии. Вируссодержащую жидкость центрифугировали при 100000g в течение 1 часа, осадок ресуспендировали в 0,1 мл STE буфера (Sodium Chloride-Tris-EDTA). Каплю (15 мкл) суспензии помещали на углеродную подложку и после промывки дистиллированной водой контрастировали 1,5% р-ром натриевой соли фосфовольфрамовой кислоты (pH 7,0). Просмотр и фотографирование

препаратов осуществляли на просвечивающем электронном микроскопе JEM-1011 (JEOL, Япония).

Электронно-микроскопические исследования. Материал для исследования брали спустя 24, 48 и 72 часа, 4 и 6 суток после заражения вирусом краснухи, контролем служили незараженные клетки. Клетки фиксировали 1 час в 2,5% растворе глютаральдегида на какодилатном буфере, постфиксировали 1% раствором осмиевой кислоты, обезвоживали и заливали в эпон-аралдит. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме «Ultracut» («Reihert-Jung», Германия) и после контрастирования уранилацететом и цитратом свинца изучали в электронном микроскопе «JEM-1011» («JEOL», Япония). Филогенетический анализ осуществляли с использованием программы MEGA V 5.05, PSU, США (Tamura at al., 2011). Дерево построено методом ближайших соседей (NJ) (Saitou, Nei, 1987), эволюционная модель К2 (двухпараметрическая модель Кимуры) (Kimura, 1980).

Статистическая обработка данных. Клинические и лабораторные показатели регистрировали в специально разработанной карте в программе Microsoft Access. Статистические данные обрабатывали на персональном компьютере с использованием пакета программ Microsoft Excell (2003) корпорации Microsoft. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ заболеваемости краснухой в Санкт-Петербурге за период 1995-2010 гг.

В динамике заболеваемости краснухой в Санкт-Петербурге в период с 1995 по 2010 гг. четко прослеживались две тенденции: до 2003 года заболеваемость имела типичный для неконтролируемой воздушно-капельной инфекции волнообразный характер. После 2003 года показатели заболеваемости приобрели устойчивую тенденцию к снижению (рис. 1). Подъемы заболеваемости регистрировали в 1998 г. и 2002 г.; заболеваемость в эти годы составила 778,4 и 718,2 случаев на 100 000 населения соответственно. Наиболее уязвимыми группами населения были дети 3-6 и 7-14 лет, среди которых заболеваемость достигала 6422,9 (3-6 лет) и 3938,2 (7-14 лет) случаев на 100 000 населения.

год

1906 1998 2000 2002 2004 200G 2008 2010

2010гг.

В 2000 г. массовая иммунизация против краснухи детей в возрасте с 1 до

2-х лет была введена в национальный календарь прививок. В Санкт-Петербурге плановая вакцинация детей была начата в 2002 г. В период 2002-2005гт. в Санкт-Петербурге дополнительно были привиты дети в возрасте от 1 года до 4 лет включительно и девушки в возрасте 13-16 лет. В 2006-2007 гг. в рамках национального проекта «Здоровье» к прививкам против краснухи были привлечены и другие возрастные группы детей (девочки и мальчики) в возрасте от 5 лет до 14 лет и девушки 18 -25 лет. В 2006-2007 гг. охват прививками в возрастной группе 0-2 года достиг 95,8-98,5%, среди детей 3-6 лет - 91,8-99,5%, среди девочек 13-16 лет составлял 76,6-99,0%. В 2008 г. охват прививками детей в возрасте от 1 года до 15 лет составил 98,9%.

Проведенные профилактические мероприятия привели к тому, что, начиная с 2003г., наметилась устойчивая тенденция к снижению заболеваемости краснухой во всех возрастных группах, в том числе среди детей, относящихся к группам повышенного риска - посещающих детские дошкольные учреждения (ДЦУ), среди которых заболеваемость снизилась с 1352,0 (2003г.) до 480,1 (2006г.) и 394,6 (2007г.). В 2009г. была зарегистрирована минимальная заболеваемость - 0,02 на 100000 населения (рис.1).

Плановая вакцинация привела также к нивелированию к 2008г. характерных для краснухи сезонных (март-май) подъемов заболеваемости (рис. 2). Если в первые месяцы 2008 года заболеваемость колебалась от 1,03 (январь) до 1,62 (февраль), то в конце года упала до 0,09 (декабрь) - 0,26 (ноябрь).

Показатель на ¡00 тыс. населяли

¿Л....."У '✓/У^ууу'

*2006

-2007

• 2008

Рис.2. Распределение заболеваемости краснухой по месяцам в Санкт-Петербурге.

В возрастной структуре заболеваемости в период до 2002г. около 90% заболевших были дети 0-14 лет. Так, в 1995 неэпидемическом году, на детей 0-2 лет приходилось 10% заболеваемости, на возрастные группы 3-6 и 7-14 39 и 42% соответственно. В условиях плановой вакцинации доля заболевших краснухой детей 3-6 лет снизилась с 39% (1995г.) до 28,9% (2007г.); доля школьников 7-14 лет - с 42% (1995г.) до 36,6% (2007г.). Вместе с тем, увеличилась доля случаев заболевания краснухой, приходившихся на лиц старше 15 лет (18,2% против 9%). За 2008 год зарегистрировано 379 случаев заболеваний краснухой, в том числе 2/3 (255 случаев) пришлось на детей 0-14 лет и 1/3- на возрастную группу 15 лет и старше. Заболеваемость во всех

возрастных группах за год снизилась в 2,6 (взрослые) - 5,7 (дети 0-14 лет) раз, в том числе среди школьников 7-14 лет почти в 10 раз.

Таким образом, на фоне проведения иммунизации в развитии эпидемического процесса было отмечено исчезновение цикличности и сезонности краснушной инфекции: последний эпидемический подъем был отмечен в 2002 гг., а зимне-весенняя сезонность исчезла к 2008 году. На фоне массовой иммунизации детей произошли изменения в возрастной структуре заболеваемости краснухой. Если в довакцинальный период значительную долю в общей структуре заболеваемости занимали школьники и дети с 3-х до 6 лет, то на фоне массовой иммунизации основная доля стала приходиться на школьников и взрослых. В Санкт-Петербурге массовая иммунизация детей раннего возраста, а также детей в возрасте 6 лет и девочек подросткового возраста привела к практически полной элиминации краснухи к 2009 году.

Оценка популяционного противокраснушного иммунитета в условиях массовой иммунизации (2006-2009 гг.).

Для проведения скринингового анализа участники были разделены на следующие возрастные группы: 3-6 лет (97 человек), 7-14 лет (118 человек), и 15-17 лет (187 человек), 18-25 лет (289 человек) и старше (14 человек). Демографические характеристики (пол и возраст) участников скринингового исследования приведены в таблице 1.

Таблица 1

Демографическая характеристика (пол и возраст) участников скринингового

исследования

ЩШщШй f't ■ Г.. -И"

мужчины 54 74 127 102 3 360

женщины 43 44 60 187 11 345

ВСЕГО 97 118 187 289 14 705

Среди 705 человек, обследованных на наличие в сыворотке крови противокраснушных антител класса G, 26 были серонегативными, что составило 3,7% от числа обследованных. Большинство серонегативных лиц (22 человека, 84,6%) составили лица мужского пола (8 мужчин в возрасте от 18 до 40 лет и 14 мальчиков). Количество лиц женского пола, серонегативных по антителам данного класса, составило 4 человека (15,4%), все они были в возрастной группе от 18 до 40 лет. У всех обследованных девочек в сыворотке крови были выявлены вирусоспецифические IgG к вирусу краснухи.

Среди серопозитивных лиц обоего пола достоверных различий по среднему уровню вирусоспецифических IgG между различными возрастными группами выявлено не было. Однако средний уровень антител класса G к вирусу краснухи у лиц одного пола в различных возрастных группах имел достоверные различия (рис.3). У мальчиков средний уровень IgG увеличивался с возрастом и составил 92,7; 109,7; 139,6 МЕ/мл в возрастных группах 3-6 лет,

7-14 лет и 15-17 лет соответственно. При этом в группе мальчиков 15-17 лет средний уровень антител был достоверно выше, чем в группе 3-6 лет (р<0,01). У взрослых мужчин старше 18 лет средний уровень ^О к краснухе составил 151,6 МЕ/мл и был достоверно выше, чем в группе мальчиков 3-6 лет (р<0,01) и 7-14 лет (р<0,001)._

—*-лица муж, пола —В—лицажен.пола

с;

£

иТ г 151,6

о

О! 92,7 _

л X 84,3**

<и 86,2

о 69,4*

о.

>1 возраст здоровых обследованных лиц

3-6 лет 7-14лет 15-17 лет 18-45лет

Примечание: *-р < 0,02; **р<- 0,001

Рис. 3. Средний уровень антител класса О к вирусу краснухи у здоровых лиц различных возрастных групп.

У девочек наблюдалась другая тенденция - увеличение среднегруппового уровня ^О к краснухе к 7-14 годам (111,8 МЕ/мл) по сравнению с младшей возрастной группой (86,2 МЕ/мл), а затем снижение содержания антител у подростков 15-17 лет (69,4 МЕ/мл) и сохранение приблизительно на том же уровне у взрослых женщин (84,9 МЕ/мл). В возрасте 3-14 лет различий по содержанию к краснухе между мальчиками и девочками выявлено не было. Однако у подростков 15-17 лет и взрослых уровень противокраснушных антител был достоверно ниже у девочек (69,4 МЕ/мл) и женщин (84,9 МЕ/мл), чем у мальчиков (139,6 МЕ/мл) и мужчин (151,6 МЕ/мл).

Таким образом, результаты проведенного серологического скрининга выявили высокий уровень популяционного иммунитета против краснухи в Санкт-Петербурге в условиях массовой вакцинации: 96,3% обследованных жителей имели антитела к вирусу краснухи. Среди серонегативных лиц (3,7% от числа обследованных) большинство составили лица мужского пола (85%), что вероятно является следствием проведения в 2006-2007 гг. дополнительной программы иммунизации девушек-подростков.

Диагностическая значимость серологических и молекулярно-генетических методов лабораторной диагностики краснушной инфекции.

Пациенты, 37 человек, мужчины, в возрасте от 15 лет до 21 года (средний возраст 18 лет), поступали в стационар на 1-3 дни от начала заболевания с жалобами на слабость, боли в суставах, насморк. При объективном обследовании у всех больных выявлялись мелкопапулезная сыпь на теле и лице, увеличение затылочных лимфатических узлов. У 32-х больных на момент поступления была повышенна температура тела (37.1 - 39.2 °С), которая нормализовалась в первые три дня пребывания в стационаре. У 7 человек отмечались симптомы конъюнктивита. Из данных эпиданамнеза сведений о вакцинации против краснухи получено не было.

Материал для исследований (образцы крови и назофарингеальные мазки) был получен в различные сроки от начала заболевания - от 1-го до 9 дней. Через 2 недели после первого забора крови у всех пациентов повторно был взята кровь для серологического исследования.

Наличие вирусной РНК в назофарингеальных мазках методом ОТ-ПЦР было подтверждено у 26 из 37 пациентов, что составило 70% от числа обследованных. Выявление РНК зависело от сроков взятия материала. Так в образцах, собранных в ранние сроки (1-3 дня), РНК вируса краснухи была обнаружена в 86% случаев (у 12 человек из 14). Среди 11 человек, длительность заболевания которых на момент обследования составила от 4-х до 6 дней, вирус краснухи был определен в 64% случаев (у 7 человек). При сроке более 6 дней от начала заболевания генетический материал вируса краснухи был выявлен в мазках у 7 из 12 больных (58%). Полученные результаты представлены в таблице 2.

Анализ сывороток крови на содержание вирусоспецифических иммуноглобулинов класса М показал, что на момент первого обследования 24 больных (65%) из 37 обследованных имели серологические маркеры начала краснушной инфекции. При этом у больных, имевших вирусоспецифические иммуноглобулины класса М, частота выявления данного маркера зависела от дня начала заболевания.

Таблица 2

Результаты лабораторной диагностики краснушной инфекции на разных сроках

от начала заболевания

Метод Количество лиц с позитивным результатом анализа (%)

1-3 дни (14 человек) 4-6 дни (И человек) 7-9 дни (12 чеповек)

Вирусная РНК выявлена у 26-ти пациентов (70%)

ОТ-ПЦР (+) 12 (86%) 7 (63,6%) 7 (58,3%)

1ц класса М обнаружены у 24-х пациентов (65%)

ИФА ^М (+) 3 (21,4%) 9(81,8%) 12 (100%)

Из 14 человек, имевших ранние сроки заболевания (1-3 дня) ^М были выявлены только у 3 больных (21,4%). Среди пациентов (11 человек), болеющих 4-6 дней, данный показатель увеличился до 81,8%, а в группе обследованных со сроком заболевания 7 дней и более вирусоспецифические антитела ГцМ были выявлены в 100% случаев. Таким образом, диагностическая значимость определения вирусоспецифических антител для подтверждения диагноза краснухи увеличивалась от 21,4% в первые дни до 100% - к 9-му дню от начала заболевания.

Анализ парных сывороток крови на содержание вирусоспецифических антител класса С показал, что в первых сыворотках класса О определялись у 30 больных (83%), при этом у 21 человека (58%) были выявлены антитела обоих классов (1§М+ !§(]). Количество лиц, в крови которых были обнаружены

антитела класса IgG, но отсутствовали IgM антитела, составило 6 человек (17%); у 4-х больных (11%) были обнаружены только Ig класса М. Антитела против краснухи не были выявлены у 2-х больных (5%). Серологическое обследование больных через 2 недели от первого забора крови выявило увеличение титров IgG в 2 и более раз у 12 и появление IgG у 6 человек. Также отмечено появление антител класса М у 2-х ранее серонегативных лиц. Анализ парных сывороток выявил увеличение количества лиц, в сыворотке крови которых отмечалось появление вирусоспецифических антител класса М (с 65 до 75%) и имеющих прирост титров антител класса IgG (с 83 до 100%).

Результаты проведенного исследования показали, что наибольшую диагностическую значимость в подтверждении диагноза краснушной инфекции в первые дни заболевания имеет метод ОТ-ПЦР, позволяющий выявлять генетический материал вируса в назофарингеальных мазках от больных. Начиная с 4-го дня от начала заболевания, возрастает диагностическая ценность исследования сыворотки крови на содержание IgM с помощью серологических методов (ИФА). Наличие в сыворотке крови больных Ig класса G не позволяют установить срок давности развития инфекционного процесса, и носит скорее анамнестический характер. Таким образом, при диагностике краснушной инфекции информативность молекулярно-генетических и серологических методов зависит от сроков заболевания.

Сравнение диагностических параметров отечественных иммуноферментных тест-систем с зарубежными аналогами при выявлении антител к вирусу краснухи в сыворотках крови.

Для выбора оптимальной тест-системы для серологических исследований было проведено сравнение отечественных иммуноферментных тест-систем (ИФТС) и зарубежных аналоговых референс-тест-системы («DSL» и «ВСМ-Diagnostics», США) для выявления антител к вирусу краснухи в сыворотках людей. При анализе уровня IgM к вирусу краснухи выявлено большее соответствие показателей качества для тест-системы «ЭКОлаб-Краснуха-IgM» (производство ЗАО «ЭКОлаб», Россия), чем «ВектоРубелла-IgM», (производство ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Чувствительность, специфичность и совпадение результатов с референс-тест-системами составили 100%, 97,5% и 97,7%, соответственно, для ИФТС «ЭКОлаб» и 88,0%, 84,4% и 85,4% для ИФТС «ВектоРубелла-IgM». Значительное число положительных случаев (11%), полученных при использовании ИФТС «ВектоРубелла-IgM» и не подтвержденных результатами референс тест-систем могут расцениваться как ложноположительные, обусловленные наличием в сыворотках ревматоидного фактора (РФ). Принцип не прямого ИФА, на котором основана тест-система «ВектоРубелла-IgM», не позволяет исключить влияние аутореактивных антител, включая ревматоидный фактор (РФ), на результаты анализа. В ИФТС «ЭКОлаб-Краснуха-IgM» и референс-системах производста США использован принцип ИФА «с захватом IgM», данная реакция основана на прямом специфическом взаимодействии противовирусных IgM с вирусом краснухи, меченным пероксидазой, что позволяет свести к минимуму получение неспецифичных результатов детекции (Banatvala, Brown, 2004; Grangeot-Keros,

Enders, 1997). При этом тест-система «ЭКОлаб», обладает более высокой чувствительностью, чем «DSL», при выявлении ранних IgM (1-3 день заболевания) в сыворотках больных.

При выявлении IgG к вирусу краснухи три исследованные российские ИФТС показали достаточно высокие диагностические параметры в сравнении с аналогичными зарубежными референс-системами. Показатели чувствительности и специфичности ИФТС «ЭКОлаб-Краснуха-IgG» по отношению к «DSL» составили 98,6% и 88,9%, соответственно. Общее совпадение результатов, полученных при использовании обеих тест-систем -97,6%. Показатели чувствительности и специфичности при сравнении с «ВСМ» составили, соответственно, 93,9% и 94,1% для ИФТС «Краснуха-скрин»; 89,6% и 88,2% - для «ВектоРубелла». Общее совпадение результатов с «ВСМ» составило для данных тест-систем 94,0% и 89,3%.

При выявлении сероконверсий у переболевших краснухой обе российские тест-системы оказались более эффективными по сравнению с системой «ВСМ». Дополнительным важным преимуществом ИФТС «ЭКОлаб-Краснуха-IgG» перед другими отечественными тест-системами «ВектоРубелла-IgG» (производство ЗАО «Вектор-Бест», Россия); «Краснуха-скрин» (производство ЗАО «Биосервис», Россия) является наличие в наборе контрольных сывороток с известным содержанием вирус-специфичных IgG, что позволяет представлять результаты в абсолютных единицах (МЕ/мл) (с помощью калибровочной кривой) и стандартизировать расчеты нескольких независимых опытов.

Таким образом, проведенное исследование показало, что среди отечественных тест-систем оптимальными для серодиагностики краснухи являются ИФТС «ЭКОлаб-Краснуха-IgM» и «ЭКОлаб-Краснуха-IgG».

Осбенности культивирования вирусов краснухи и клеточный морфогенез.

Для изучения молекулярно-биологических свойств вирусов краснухи, на первом этапе исследования был проведен подбор оптимальных условий для выделения вируса краснухи (ВК) с использованием материала 5 клинических образцов (назофарингеальных мазков). В опыте были использованы три клеточные линии: RK-13, Vero и ФЛЭЧ 900/14. Через 72 часа после заражения клеточных культур в 4-х образцах, культивируемых на клеточной линии RK-13, и в 3-х образцах, культивируемых на клеточной линии Vero, появились слабо выраженные цитопатические изменения в виде округления клеток, разрежения монослоя и образования локальных просветов в монослое. Результаты ОТ-ПЦР подтвердили присутствие вируса краснухи в 3-х образцах на клеточной линии RK-13 и в 2-х - на клеточной линии Vero. Культура клеток ФЛЭЧ 900/14, зараженная клиническим материалом по изменению состояния монослоя и по данным ОТ-ПЦР, была отрицательна. Было показано, что эффективная репродукция вируса наблюдалась только в клеточной линии RK-13. Данная линия клеток была использована для дальнейшего культивирования и изучения вируса краснухи.

Из клинического материала, полученного от 37 больных, на культуре клеток RK-13 было выделено 22 штамма вируса краснухи. В большинстве проб, начиная с 3-х суток, развивались слабо выраженные цитопатические изменения

монослоя клеток, наличие РНК вируса было подтверждено на 2-ом пассаже методом ОТ-ПЦР в 22 образцах. Наличие зрелых вирионов в культуральной жидкости подтверждали с помощью электронной микроскопии. На рис. 4 представлены микрофотографии препаратов, полученных методом негативного контрастирования, на которых видны вирусные частицы характерной округлой формы около 60 - 70 нм в диаметре. Осадок вирионов краснухи был получен концентрированием культуральной жидкости с помощью ультрацентрифугирования.

Выделенным штаммам были присвоены названия RV/SPb-l/Russia/2007 -RV/SPb-22/Russia/2007, согласно рекомендациям ВОЗ по стандартизации номенклатуры для генетических характеристик вирусов краснухи «дикого» типа (WHO, Wkly Epidemiol Ree., 2005). Все выделенные вирусы были лиофилизированы и депонированы в Музей вирусов НИИ гриппа.

Рис. 4. Электронная микрофотография. А-Б. Зрелые вирионы вируса краснухи в культуральной жидкости. Вирионы имеют округлую форму около 60 - 70 нм в диаметре. Препараты, получены методом негативного контрастирования. В. Скопление вирионов краснухи округлой и продолговатой формы (после концентрирования культуральной жидкости, с помощью ультрацентрифугирования). Препарат получен методом негативного контрастирования. (Масштабные отрезки 100 нм, фотографии получены к.б.н. Сироткиным А.К.).

Изучение морфогенетических изменений в культуре клеток RK-13 через 24, 48, 72 часа, 4 и 6 суток после заражения штаммами вируса краснухи SPb-10/Russia/2007 и SPb-16/Russia/2007 показало, что на всех сроках в инфицированных клетках наблюдалась гипертрофия аппарата Гольджи. Увеличивалось количество и диаметр его цистерн и вакуолей, где, как известно, происходит гликозилирование поверхностных белков и формирование оболочек вирионов краснухи (Lee and Bowden, 2000). Через 24 часа в клетках наблюдали изменения, связанные с началом репликации вируса краснухи -образование репликативных комплексов с характерным расположением везикул под мембраной вакуолей (рис.5, А).

Через 48 часов после заражения репликативные комплексы в инфицированных клетках претерпевали морфологические изменения: в них

накапливались многослойные миелин-подобные мембранные структуры (рис 5, Б). Было отмечено также появление крупных вакуолей с вирионами. Вирионы имели вид округлых образований диаметром 60-80 нм с электронно-плотным нуклеокапсидом диаметром 30 нм в центре. Единичные вирионы можно было наблюдать в участках цитоплазматического матрикса, окруженного элементами эндоплазматического ретикулума. Их размер и строение не отличались от строения вирионов, выявляемых в вакуолях и цистернах комплекса Гольджи. Было показано, что инфицирование вирусом краснухи оказывает специфическое воздействие на митохондрии зараженной клетки, на электронных микрофотографиях отмечена аккумуляция митохондрий в области расположения вакуолей, а на более поздних сроках инфекции деформация, увеличение размера и деградация внутренней структуры этих клеточных органелл (рис.6).

Л '-'о >.■ л. :/ .о . - Л" .-Гх»^!..'? - " ^ - V?, ЯШ II МИНИИШИ!' 1'ИОТ» У 'Д ' V. • & ; • *

1 " !

> ' • . в > ч *: 1 "1 % > . л . л *«'] у Щ Л : Ж_" • '1 « * <, ТГ" • •'« Щ". _ « : -Я .' - - •" -У' МХ'.. - ■ *

Рис. 5. Микрофотографии фрагментов клеток культуры ЯК-13, инфицированной вырусом краснухи. (А). Образование репликативных комплексов вируса краснухи в инфицированных клетках через 24 часа после заражения (отмечены стрелками). (Б). Поздние репликативные комплексы с включением миелин-подобных мембранных образований и единичных нуклеокапсидов вируса краснухи (отмечено белой стрелкой) (48 часов после заражения) (В). Образование эндосомы с вирусной частицей (отмечено стрелкой), поздняя лизосома с пустыми нуклеокапсидами (отмечено пунктирной стрелкой) (72 часа после заражения) (Г). Скопление нуклеокапсидов вируса краснухи в цитоплазме инфицированной клетки (отмечено стрелками), образование сети фибрилл (72 часа после заражения).

На поздних стадиях репродукции вируса краснухи в зараженных клетках наблюдали образование фибриллярных структур (рис. 5, Г), которые, вероятно, используются вирусом для передачи от клетки к клетке не упакованного в вирусную частицу генетического материала (Matthews at al., 2010).

В целом морфологические изменения в инфицированных клетках соответствовали описанным ранее (Lee and Bowden, 2000). После 6 суток инфекции в зараженных клетках происходит накопление дегенеративных изменений органоидов: разрушение внутренней структуры митохондрий, вакуолизация цитоплазмы. Данные изменения являются маркерами клеточной гибели.

Рис.6. Аккумуляция митохондрий в области расположения вакуолей.

Молекулярно-генетическая характеристика и филогенетический анализ штаммов вируса краснухи.

На следующем этапе исследования была проведена молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса краснухи, выделенных от больных во время вспышки заболевания. Генетическая характеристика вируса краснухи была основана на анализе последовательностей гена Е1 вируса (Zheng D-P. et al., 2003). На основании нуклеотидных последовательностей гена Е1 вируса краснухи, полученных из базы данных GenBank при помощи программы Vector NTI 8,0 были подобраны праймеры, фланкирующие два перекрывающихся фрагмента длинной по 800 п.н. R22F1 5'-ACTgCACCggggTgCgCCAC -3'; R832R1 5'-CgTgACCCACACCTCgCCgg -3'; R629F2 5'-ACACCggCAATCAgCAgTCC -3'; R1434R2 5-'TATAgCgCCgCgCAAgTAgT -З'.

Для анализа нуклеотидных последовательностей гена Е1 была использована РНК, выделенная из 2-х образцов носоглоточных смывов. Последовательность участка гена Е1 длиной 700 н.о. (в пределах рекомендованного «эпидемиологического окна») была определена для штаммов вируса краснухи RVs/SPb-13/7/Russia/2007, RVs/SPb-16/8/Russia/2007.

Сравнительный анализ, полученных последовательностей с последовательностями репрезентативных и вакцинных штаммов вирусов краснухи, представленных в Международной базе данных GenBank, показал, что штаммы, выделенные на территории Санкт-Петербурга в 2007 году, принадлежат к генотипу 1Е. Были определены генетические дистанции по гену Е1 между

выделенными штаммами Ю/б^РЫ 3/7Л1ш5!а/2007, КУУБРЬ- 16/8/11и53га/2007 и референс-штаммами вируса краснухи основных (или окончательных по обновленой номенклатуре АЬегпаШу а1 а1., 2011) генотипов дикого типа вируса краснухи: 1В, 1С, Ш, 1Е, 1Р, Ю, 1Н, 2А, 2В, 2С и построено филогенетическое дерево (рис.7).Относигельно вакцинного штамма ЯА 27/3, используемого в России, штаммы вируса краснухи 8РЬ-13/7/Яизз1а/2007, имели незначимые нуклеотидные замены (не приводящие к замене аминокислотных остатков), большинство из которых (75%) составили замены Т—>С. Относительно референс-штамма генотипа 1Е КУ1/МУ5/01 и российских изолятов, принадлежащих к данному генотипу, выделенный нами штамм 5РЬ-16/8Л1и5з1аУ2007 имел уникальные замены в -2428, С-2467, Т-2468. Полученные последовательности были сопоставлены с опубликованными в базе данных вепБапк последовательностями изолятов генотипа 1Е, выделенных на географически близких территориях (Россия, республика Беларусь): 1Ш/Мп5к.В1Л1/18.05/1 (код доступа АМ258944), 11УШт5к.В1Л1/27.05/1 (АМ258956), ЯУ1/Мш5к.ВЬИ/28.05/1 (АМ258957) и изолятом из Барнаула Ю/№аг4-51.ГШ8/05 (ЕР199896). Филогенетический анализ последовательностей гена Е1 вирусов краснухи генотипа 1Е, циркулирующих на территории Санкт-Петербурга, показал их близость к изолятам из Минска (процент гомологии 97,7%) и к изоляту 2005 года выделения из Барнаула (процент гомологии 99,0 -99,6%).

Филогенетический анализ штаммов вирус краснухи, выделенных на территории России с 1967 года по настоящее время позволил заключить, что до 2004 года для территории России была характерна циркуляция штаммов вируса краснухи генотипа 2с, начиная с 2004 года, отмечено появление штаммов, принадлежащих к генотипам 1Е, 111. Два штамма вируса краснухи были изолированы и генетически охарактеризованы во время вспышек заболевания краснухой в Томске и Кемерово в 2004-2005 гг. Филогенетический анализ участка гена Е1 показал, что штаммы, циркулирующие в настоящее время на территории Западной Сибири, принадлежат к генотипу (ТаэЫпа ЬЛ^ й а1., 2007) и 1Н генотипу (Серегин и др., 2011). В период 2004-2006 гг. на территории Западной Сибири был выделен 21 штамм вируса краснухи. Практически все штаммы (20 штаммов) относились к генотипу и только один штамм, выделенный на территории Алтая, принадлежал к 1Е генотипу (Тшпшкоу 01 е1 а1, 2007). Также вирусы краснухи, принадлежащие 1Е генотипу, были выделены на территории Белоруссии, где была выявлена ко-циркуляция трех различающихся групп штаммов краснухи. Первая группа принадлежала к генотипу 1Е, тогда как две другие не кластеризовались ни с одним из известных генотипов, но были генетически близки как к штаммам, принадлежащим к условному генотипу так и имели генетические характеристики, позволяющие отнести их к генотипу 1В возможно данные

0.01

штаммы могут быть отнесены к новому условному генотипу клайда 1 (Hübschen JM et al„ 2007). В 2009 году в базе данных GenBank появились последовательности российских штаммов вируса краснухи 20062008 годов выделения, среди которых наиболее часто встречался генотип lh, реже 1Е и lg, и отсутствовал генотип 2с (по классификации ВОЗ 2005г). Известно, что генотип 1Е широко распространен в Европе и до 2005 года не встречался на территории РФ (WHO, 2006; Лаврентьева И.Н. и др., 2008).

Подобное изменение - вытеснение эндемичного вируса генотипа 2с и появление штаммов вируса краснухи генотипов lE,lh, lg на территории России позволяет предположить элиминацию

эндемичного вируса, как результат массовой иммунизации и расценивать случаи заболевания краснухой, как завозные, связанные с высоким уровнем миграции населения и развитием туризма.

Рис. 7. Филогенетическое дерево штаммов вируса краснухи по гену Е1. Маркером (•) отмечены штаммы, выделенные в Санкт-Петербурге в 2007 году.

ВЫВОДЫ

1. Массовая вакцинация против краснухи детей раннего возраста и девочек подросткового возраста привела к резкому снижению заболеваемости краснухой во всех возрастных группах населения Санкт-Петербурга до 0,02 на 100000 населения, что соответствует требованиям Программы ВОЗ по предупреждению врожденной краснушной инфекции.

2. Серологическое обследование населения различных возрастных групп показало, что 96,3% обследованных имели IgG антитела к вирусу краснухи. Среди серонегативных лиц преобладали мужчины старше 15 лет.

3. Наибольшую диагностическую значимость в подтверждении диагноза краснушной инфекции в первые дни заболевания имеет метод ОТ-ПЦР. На более поздних сроках заболевания возрастает информативность методов серодиагностики. Для лабораторного подтверждения диагноза краснушной инфекции на разных сроках заболевания желательно комплексное применение методов ИФА (IgM) и ОТ-ПЦР.

4. Показано соответствие иммуноферментных тест-систем «ЭКОлаб-Краснуха-IgM» и «ЭКОлаб-Краснуха-IgG» референс-тест-системам «DSL» и «ВСМ» и выявлено их преимущество перед аналогичными тест-системами российского производства.

5. Показано, что выделенные штаммы эффективно репродуцируются в клеточной линии RK-13. Активное образование репликативных комплексов и формирование оболочек вирусных частиц в инфицированных клетках происходит в первые 72 часа после заражения и сопровождается развитием характерных изменений органоидов клетки.

6. Вирусы краснухи, изолированные в Санкт-Петербурге в 2007 году, относились к 1Е генотипу и имели 97,7% гомологии к белорусским изолятам RVi/Minsk.BLR/18.05/1, RVi/Minsk.BLR/27.05/1 и 99,0 - 99,6% гомологии к изоляту из Барнаула RVi/Bar4-51.RUS/05.

7. В последнее десятилетие в России отмечается исчезновение из циркуляции вирусов краснухи генотипа 2С и появление генотипов IE, 1Н, 1G, что может быть следствием проводимой массовой вакцинации и возросшей миграционной активности населения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Цыбалова, Л.М. Эпидемический процесс при краснухе в условиях массовой иммунизации детей / Л.М. Цыбалова, Е.В. Тимофеева, Ж.В. Бузицкая, Т.М. Гудкова [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -

2009.-№ 5,- С.47-51.

2. Кривицкая, В.З. Определение диагностических параметров отечественных иммуноферментных тест-систем при сравнении с зарубежными аналогами при выявлении антител к вирусу краснухи в сыворотках крови / В.З. Кривицкая, Ж.В. Бузицкая, В.Л. Максакова [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика.-

2010,- № 2.-С.35-39.

3. Бузицкая. Ж.В. Молекулярно-биологические характеристики штаммов вируса краснухи, выделенных в Санкт-Петербурге в 2006-2007 годах. / Ж.В. Бузицкая, А.Р. Прочуханова, А.К. Сироткин [и др.] // Молекулярная диагностика. Сб. трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Москва.- 2010.-Т. З- С.325-327.

4. Бузицкая. Ж.В. Молекулярно-биологическая характеристика штаммов вируса краснухи, выделенных в Санкт-Петербурге. / Ж.В. Бузицкая, А.К.Сироткин, Т.М.Гудкова [и др.] // Молекулярная биология.- 2012.-№ 3. (принята в печать 22.12.2011 r.J

Тезисы:

1. Бузицкая Ж.В. Молекулярно-биологические характеристики эпидемических штаммов вируса краснухи, выделенных в Санкт-Петербурге в 2007 году / Ж.В. Бузицкая, Т.М. Гудкова, A.B. Карпов, JI.M. Цыбалова // Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний: Материалы Всероссийской научной конференции, СПб, 17-18 апреля 2008г. / Под ред. - СПб.: Военно-медицинская академия, 2008.-С.256.

2. Бузицкая Ж.В. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена El / штаммов вируса краснухи, циркулирующих в Санкт-Петербурге. Ж.В. Бузицкая, Т.М. Гудкова, A.B. Карпов, Л.М. Цыбалова // Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития: Материалы междунар. науч.-практич. конф., посвящ., 50-летию науч.-исслед. ин-та пробл. биол. безопасности, Алматы, 19-21 мая 2008 г. / Алматы: 2008.-С.503.

3. Бузицкая Ж.В. Анализ случаев заболевания краснухой в Санкт-Петербурге в 2007г. / Ж.В. Бузицкая, В.З. Кривицкая, А.К. Сироткин, Т.М. Гудкова, A.B. Карпов, Л.М. Цыбалова // Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней: Материалы Международной научно-практической конференции, Новосибирск, 14-15 мая 2009 г. / Новосибирск: Изд-во «ЦЕРИС», 2009.-С.70-73.

4. Бузицкая Ж.В. Исследования особенностей морфогенеза вируса краснухи методом электронной микроскопии. / Бузицкая Ж.В., Сироткин А.К., Прочуханова А.Р., Гудкова Т.М., Цыбалова Л.М. // Научно-практический журнал национального научного общества инфекционистов: Материалы II ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням, Москва, 29-31 марта 2010 г. / Москва: Инфекционные болезни, 2010,- Том 8,- №1.- С.50-51.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТ Антитела

ВК Вирус краснухи

ВОЗ Всемирная Организация Здравоохранения

ИФА Иммуноферментный анализ

ИФТС Иммуноферментные тест-системы

ОТ-ПЦР Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

МКА Моноклональные антитела

РК-13 Культура клеток почки кролика

РФ Ревматоидный фактор

СВК Синдром врожденной краснухи

ФЛЭЧ 900/14 Культура клеток фибробластов легкого эмбриона человека

ЦПЭ Цитопатические эффекты

ВНК-21 Культура клеток почки новорожденного сирийского хомячка

ВБА Бычий сывороточный альбумин

СБС Центр по контролю и предотвращению заболеваний

Уего Культура клеток почки зеленой мартышки

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность и признательность заместителю директора по научной работе — д. м. н. Людмиле Марковне Цыбаловой за научное руководство. Автор выражает искреннюю признательность директору ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России, академику РАМН, д.б.н., профессору О.И. Киселеву за всестороннюю поддержку работы. Автор благодарит заведующего лабораторией молекулярной вирусологии и генной инженерии к.б.н. М.П. Грудинина, к.м.н. М.А.Стукову, н.с. А.Б. Комиссарова и других сотрудников лаборатории, а также сотрудников других подразделений Института к.б.н. В.З Кривицкую, к.б.н. А.Р. Прочуханову, к.б.н. Т.М. Гудкову и к.б.н. А.К. Сироткина, сотрудников Городского центра Госсанэпиднадзора Санкт-Петербурга О.В. Паркова и Е.В. Тимофееву за помощь в исследованиях. Автор выражает искреннюю благодарность сотруднику лаборатории клеточных культур Института Т.Д. Смирновой за предоставленные клеточные культуры и консультативную помощь.

Подписано в печать 15.02.12 Формат 60х84'/іб Цифровая Печ. л. 1.31 Уч.-изд.л. 1.31 Тираж 100 Заказ 11/02 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)