Биохимические характеристики нативных и модифицированных форм IgG некоторых представителей семейства псовых

Нестерова, Ольга Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биохимические характеристики нативных и модифицированных форм IgG некоторых представителей семейства псовых
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические характеристики нативных и модифицированных форм IgG некоторых представителей семейства псовых"

003479632

На правах рукописи

НЕСТЕРОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА

БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАТИВНЫХ И МОДИФИЦИРОВАННЫХ ФОРМ ДО НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА ПСОВЫХ

Специальность л г лит о™«

03.00.04-биохимия 1 0 111 ¿ииз

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2009

003479632

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Удму ртский государственный университет

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Барсуков Алексей Константинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Коксин Владимир Петрович (старший научный сотрудник лаборатории биохимии РЦПБ СПИД, г. Казань)

доктор медицинских наук, профессор Бутолин Евгений Германович (заведующий кафедрой биохимии ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия», г. Ижевск)

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт высокомолекулярных соединений РАН, г. Санкт-Петербург

Защита состоится «29» октября 2009 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, Казань, ул. Кремлевская 18, аудитория 209.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова

Автореферат разослан «_»__200_г.

Ученый секретарь диссертационного совета, У/^Г"/ /

доктор биологических наук, профессор Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Прогресс в секвенировании нуклеиновых кислот позволил разработать исследовательский подход, на основании которого фактологию палеонтологии, сравнительной и онтогенетической биохимии, можно увязать с особенностями первичной структуры ДНК и, тем самым, корректно обсуждать время и направление молекулярной эволюции живых систем (Киселев, 2000). Функциональный подход к организации генома клетки предполагает перевод одномерного (линейного) кода ДНК в трехмерную структуру белка. При этом разнообразие белковых вариантов и всевозможных комплексов на их основе значительно больше количества генов, кодирующих их полипептидные цепи (Карелин, 2005). С учетом обобщенной проблематики, объемлющей направления исследований, касающихся полиморфизма генов, степени их консерватизма и закономерностей фолдинга, фундаментальная концепция «в гомологии структур зашифрована аналогия функций» оказалась весьма плодотворной и в настоящее время (Свердлов, 2000). Полагают, что принципиальные закономерности фолдинга в общих чертах будут раскрыты в ближайшие десятилетия, после чего останется еще масса неясных деталей. С методологических позиций секвенирование белков является более трудоемким процессом по сравнению с секвенированием нуклеиновых кислот и, следовательно, создание «каталога протеинов» отодвигается на неопределенно долгое время. Для достоверной реконструкции филогенетического древа необходимо в сравнительных исследованиях использовать информацию о первичной структуре 15-30 индивидуальных белков отдельных зоологических видов. Выяснение гомологии аминокислотных последовательностей, механизмов фолдинга и описания конформационно-нативной структуры макромолекулы представляют собой безусловные составляющие целесообразного развития молекулярной иммунологии. Вместе с тем, интегральные результаты таких сугубо биохимических (молекулярно-биологических) подходов малоинформативны для расшифровки структуры антигенных детерминант и антигенного строения индивидуального белка в целом. Использование для этих целей моноклональных антител в технологии эпитопного картирования информационно обеспечивает выяснение частностей. Так, например, с помощью моноклональных технологий идентифицированы подклассы IgG собаки (Mazza et al., 1994). Однако вопрос о четко дифференцированной первичной структуре отдельных подклассов IgG остается дискуссионно открытым (Schur, 1987; Furukawa et al., 1991; Robert, 2001). Отметим также, что всестороннее описание антигенной структуры функционально-сходных белков в ряду вид, род, семейство, отряд, класс выходит за рамки фундаментальной науки. Именно фундаментальная составляющая исследования биологических объектов и процессов обеспечивает

безопасность научно-технических нововведений. В целом ряде обзоров и оригинальных работ обсуждается комплексная проблематика использования функционально-сходных белков в качестве действующего начала фармацевтических биопрепаратов. Полагаем, что совершенствование методологии иммуноанапиза позволит в объективных количественных критериях описать антигенную специфику функционально-сходных белков близкородственных видов. Для клинической практики такого рода исследования особенно актуальны (Burnouf et al., 2004; Trow et al., 2008; Mathews, 2008). Иммунологические подходы при исследовании белков иммуноглобулинового ряда используются, как правило, в рамках проблематики филогении и совершенствования систематики (Гельфранд, Любецкий, 2003). В настоящей работе обсуждаются результаты экспериментов, нацеленных на выявление иммунологического сродства IgG близкородственных видов, формирующих семейство псовых. Для обеспечения исследований с надлежащим уровнем качества разработана технология с учетом принципа адекватности метода и модели. В частности, создана лабораторная схема получения видовых IgG в электрофоретически гомогенной форме без олигомеров и фрагментов целевого белка. Именно очищенные и мономерные (в гель-хроматографии) формы IgG использованы для выявления иммунологического сродства среди животных (собака, песец и лиса) из семейства псовых. В последующей серии экспериментов изучалась возможность конструирования сополимерно модифицированных форм IgG собаки. Актуальность такого рода исследований обусловлена целесообразным развитием теории искусственных антигенов, методологии многоцелевой модификации и ориентацией полученных результатов на создание предметного задела для:

- технологического совершенствования производства инфекционно безопасных иммуноглобулиновых биопрепаратов с удлиненным периодом полувыведения;

- использования в клинической практике гетерологичных IgG без индукции нежелательного иммунного ответа.

Цель исследования - оценка антигенной гомологии видовых IgG на основе экспериментальных результатов, полученных с помощью иммуноанапиза (IgG - анти IgG собаки). Получение и характеристика модифицированных совиалем образцов IgG собаки в зависимости от степени модификации белка сополимером.

Задачи исследования:

В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

1) Разработать лабораторную схему препаративной наработки IgG некоторых представителей из семейства псовых в электрофоретически гомогенной и конформационно нативной (хроматографически мономерной) форме.

2) Оптимизировать методы ИФА для индикации IgG собаки и выявления антител в составе специфического IgG собаки.

3) Провести сравнительное исследование антигенных свойств видовых из семейства псовых.

4) Синтезировать сополимерно-модифицированные формы ígG собаки (химерные комплексы), изучить некоторые биохимические и биологические свойства химерных комплексов собаки.

Научная новизна.

Создана универсальная исследовательская технология получения биохимически гомогенных и конформационно нативных форм Предложен адекватный методологический подход для описания антигенных характеристик животных, принадлежащих одному и тому же семейству. Впервые в объективных количественных критериях выявлены различия антигенного строения при сравнении образцов собаки, песца и лисы. Оптимизирована реакция поликонденсации в системе взаимодействия ^О с активированной формой совиаля (сополимер винилпирролидона с диацеталем акролеина). Показана относительная резистентность сополимерно модифицированных форм ¡¿С собаки к физико-химическим факторам с выраженным денатурирующим эффектом. Не установлен избирательный эффект модификации совиалем. Есть основания полагать, что сополимерная матрица экранирует N -терминал и РаЬ-фрагменты ^(3. Нативньге формы {¿С собаки и ^С песца, или сополимерно модифицированные собаки не вызывают индукции биосинтеза антител при их внутримышечном введении собакам и песцам. Установлено также, что иммуногенный потенциал сополимерно модифицированных ^С понижается с увеличением мольного избытка совиаля в химерном комплексе.

Практическая значимость.

Результаты исследования послужили основой для разработки, согласования и утверждения в соответствии с порядком, действующим в РФ, нормативно-технической и технологической документации на производство и исследование экспериментальных серий иммуноглобулинового биопрепарата: технические условия на препарат «Иммуно С» (ТУ 9382-00243683877-03); технологический регламент производства на препарат «Иммуно С» (№001516-0п); наставление по применению препарата «Иммуно С» (№ 13-4-03/0690; №00151б-0п от 6 марта 2003 г.).

В рамках университетско-академического кластера в гермозоне СМР на заводских площадях организовано серийное производство экспериментальных серий препарата «Иммуно С» в рамках требований широких производственных испытаний (федеральный аттестат № 886 от 2 апреля 2003 года), продукция сертифицирована (№ РОСС 1Ш. ФБ01. В08840). Из заключения ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» следует, что по совокупным показателям качества препарату «Иммуно С» аналогов в России нет.

Положения, выносимые на защиту:

1. Исследовательская технология лабораторного производства

видовых ДО семейства псовых.

2. Методология выявления антигенных различий видовых IgG из семейства псовых.

3. Модификация IgG сополимером винилпирролидона с диацеталем акролеина и изучение свойств модифицированного белка.

Апробация работы.

Результаты исследований представлены на Региональной конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири, 20-21 сентября 2001 г., г. Ижевск; на 5-ой Российской университетско-академической научно-практической конференции, г. Ижевск, 2001 г.; на 6-ой Российской университетско-академической научно-практической конференции, г. Ижевск, 2003 г.; на I съезде физиологов СНГ, Сочи, 2005; на Международной конференции инженерного образования, 25-29 июля 2005 г., г. Гливиц (Польша); на XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии», Уфа, 2006; на Третьей международной научно-практической конференции «Исследование разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2007; на Четвертой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2007; на VI конференции иммунологов Урала, Ижевск, 2007.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ. В соответствии с порядком, действующим в РФ, разработан, согласован и утвержден комплект нормативно-технической и технологической документации на ветеринарный иммуноглобулиновый препарат нового поколения «Иммуно С», включающий технические условия ТУ (ТУ 9382002-43683877-03), технологический регламент производства на препарат «Иммуно С» (№001516-0п) и наставление по применению препарата «Иммуно С» (№ 13-4-03/0690; №001516-0п от 6 марта 2003 г.).

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 10 рисунков и 19 таблиц. Список использованной литературы включает 216 наименований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Из сывороток крови собаки (Canis familiaris), песца (Alopex lagopus), лисицы (Vulpes vulpes), норки (Mustela lutreola), человека (Homo sapiens), быка (Bos taurus), барана (Ovis aries), лошади (Equus cabailus), свиньи (Sus scrofa), крысы (Rattus norvegicus) и мыши (Mus musculus) выделяли IgG. На первой стадии фракционирования использовали осаждение полиэтиленгликолем (ПЭГ 4000) для получения фракций, обогащенных IgG или альбумином. Хроматографическое фракционирование осуществляли с использованием селективных сорбентов: аффинные - протеин А-сефароза CL 6В «Pharmacia» (Швеция), голубая сефароза CL 6В «Pharmacia» (Швеция);

гидрофобные - бутил-тойоперл «Тоуо Soda» (Япония), фенил-сефароза «Pharmacia» (Швеция); ионообменные - DE-52, СМ-32 «Whatman» (Великобритания). Хроматографию выполняли в колоночном варианте на основе обобщенных методологических принципов (Остерман, 1983) и рекомендаций фирм-изготовителей хроматографических сорбентов. На заключительной стадии всегда использовали эксклюзионную хроматографию на геле сефадекс G-200 «Pharmacia» (Швеция). Процент чистоты оценивали электрофорезом в градиентном 5-25% ПААГ в нативных и восстанавливающих условиях с последующим денситометрированием гелей на приборе ImageScaner «Amersham Biosciences» (Великобритания) в красном свете. Наличие примесных белков в полупродуктах и конечных продуктах выявляли также с помощью иммуноэлектрофореза по Грабару и Вильямсу в модификации Шейдеггера. Очищенные образцы целевых белков хранили при температуре (8+2) °С в присутствии 50-70 % (от насыщения) сульфата аммония. В работе использовали стандартные образцы видовых IgG с 95-98 % чистоты.

Для получения антисыворотки, специфичной к IgG собаки, проводили иммунизацию беспородных кроликов высокоочищенным IgG собаки по схеме, предложенной Dresser D.W. Образцы индивидуальных иммуносывороток оценивали по титру и объединяли, если титр aiiTiiIgG собаки был в интервале 1/16-1/32 (Фримель, 1987). Пулированную иммуносыворотку проверяли на специфичность в иммуноэлектрофорезе по методологии Грабар и Вильяме с микромодификацией Шейдеггер (Фримель, 1987).

Выделение IgG из сыворотки крови кролика, специфичной к IgG собаки, осуществляли осажением ПЭГ с последующими анионообменной (ДЭАЭ-целлюлоза) и эксклюзионной (сефадекс G-200) хроматографиями.

Коньюгацию IgG кролика с пероксидазой хрена (ПХ) осуществляли периодатным методом (Wilson, Nakane, 1978) с некоторыми модификациями. Полученный коньюгат стабилизировали и хранили в соответствии с рекомендациями (Montoya et al., 1987).

Иммунохимическое сходство IgG собаки с другими видовыми IgG определяли с помощью двойной радиальной иммунодиффузии (ДИД) по Ухтерлони, конкурентных и неконкурентных методов твердофазного иммуноферментного анализа (Егоров и др. 1991).

Исследовали влияние модификации сополимером N-

винилпирролидона с диацеталем акролеина (совиаль) на биохимические, иммунохимические и иммунологические свойства IgG кролика, специфичного к IgG собаки. Реакционоспособные альдегидные группы в составе сополимера получали путем кислотного гидролиза акролеинового звена. Химическую модификацию иммуноглобулина проводили в условиях образования азометиновых связей между альдегидными группами сополимера и £-аминогруппами лизина IgG (рН 9,5-9,6) в течение 2-12 часов при комнатной температуре, варьируя мольное соотношение компонентов IgG/совиаль от 1/2, 1/5, 1/10, 1/15, 1/20 при концентрации белка 5 мг/мл. В

связи с нестабильностью азометиновых связей проводили восстановление боргидридом натрия. Фракционной состав модифицированного белка анализировали методом электрофореза в градиентном ПААГ (5-25%) в диссоциирующих восстанавливающих условиях. Окраску белков проводили с использованием красителя Кумасси бриллиантовый голубой 11-250 в концентрации 0,04 %.

Нативные и модифицированные формы собаки сравнивали в

иммунопреципитационном и иммуноферментном методах анализа.

Статистическая обработка данных по нескольким экспериментам проводилась согласно правилам вариационной статистики. Достоверность различий определяли, используя 1-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение электрофоретически гомогенных и нативных (мономерных в гель-хроматографии) образцов из плазмы

(сыворотки) крови собаки, песца, лисицы. С целью получения очищенных и конформационно нативных образцов собаки, песца и лисицы использовали методы фракционирования с минимальным белок-денатурирующим эффектом. Исходно с помощью ПЭГ формировали фракции, обогащенные Нехроматографический осадок у-глобулинов для дальнейших исследований растворяли в буфере с необходимым составом и ионной силой (табл. 1)

Таблица 1.

Оптимизация первой стадии хроматографической очистки иммуноглобулина

в собаки, песца и лисы с использованием различных сорбентов.

Шифр стадии Название сорбента % чистоты % выхода

0 Осадок у- глобулинов, полученный с помощью ПЭГ 43-52 96 и более

1.1 Протеин-А сефароза (сорбция ^в-обогащенной фракции: 20 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 8,0; десорбции-100 мМ натрий-цитратный буфер рН 4,0; соотношение масса белка/объем сорбента не превышало 5 мг/мл) 90-97 80-85

1.2 Фенил-сефароза (сорбция 1§С-обогащешюй фракции: 80 г/л (МН)2304; десорбции- 0,15 М ЫаС1; соотношение масса белка/объем сорбента не превышало 5 мг/мл) 46-70 80-94

1.3 Бутил-тойоперл (сорбция ^О-обогащенной фракции: 120 г/л (ЫН)2804; десорбции - 0,15 М ЫаС1; соотношение масса белка/объем сорбента не превышало 5 мг/мл) 53-75 76-92

1.4 ОЕ-52 (сорбция примесных белков из обогащенной фракции: рН 6,5, 0,0175 М натрий-фосфатный буфер; соотношение масса белка/объем сорбента не превышало 50 мг/мл) 80-95 60-83

Использование аффинного сорбента (протеин А-сефарозы обеспечивало получение образцов с максимальным уровнем чистоты (9097 %) и приемлемым выходом целевого белка (80-95 %). Аналогичные показатели получены с помощью анионообменной хроматографии в режиме сорбции примесных белков. Хроматография на основе гидрофобных сорбентов характеризовалась низкой селективностью (46-75 %) чистоты, а фенил-сефароза и неприемлемой сорбционной емкостью в отношении (около 1 мг/мл сорбента). С учетом принципиально разных механизмов очистки свойственных аффинной и анионообменной хроматографиям, дальнейшую оптимизацию выделения целевого белка проводили в режиме сорбции примесных белков. За счет варьирования рН и ионной силы уравновешивающего буферного раствора определяли условия, при которых из состава фракции (1.4, табл. 1), представленной на 80-95 % происходит сорбция гема и, по-видимому, белков, в т.ч. модифицированных гемом. Указанный эффект достигался при использовании 0,05 моль/л трис-НС1 уравновешивающего раствора, рН 8,5, в соотношении 200 мг стандартной (80-95 % чистоты) на 1 мл сорбента. Таким образом, первая стадия анионообменной хроматографии (табл. 2) имеет своей задачей получение фракции ^О (2.2., табл.2) на уровне очистки целевого белка в пределах 80-95 %. Вторая (ключевая) стадия позволяет удалять из очищенной фракции целевой и примесные белки, модифицированные гемом. Стадия эксклюзионной хроматографии (2.4., табл. 2) предназначена для выделения мономерных форм без олигомеров и фрагментов целевых белков, в т.ч. без остаточных концентраций ПЭГ.

Таблица 2.

Характеристика лабораторной схемы выделения особо чистых форм видовых

иммуноглобулинов в

Шифр стадии Стадия % чистоты % выхода Фактор очистки

2.1 Осаждение ПЭГ 15% рН 8,0 43-52 91-99 2,6-5,7

2.2 Анионообменная хроматография 1 (сорбция примесных белков: рН 6,5, 0,0175 М натрий-фосфатный буфер; соотношение масса белка/объем сорбента не превышало 50 мг/мл) 80-95 60-83 4,3-9,4

2.3 Анионообменная хроматография 2 (сорбции примесных белков: рН 8,5, 0,05 М трис-НС1 буфер; соотношение масса белка/объем сорбента составляло 200 мг/мл) 90-98 46-73 4,9-9,6

2.4 Эксклюзионная хроматография 96-99 22-54 5,1-9,9

Определение качества иммуносывороток и конструирование лабораторного набора для индикации собаки

Специфичность иммуносыворотки и сопряженного набора обеспечивали качеством иммуногена, схемой производства иммуносыворотки и системой контроля полученных иммунореагентов.

Серии контрольных проб, калибрантов и исследуемых образцов готовили из сульфатного концентрата целевых белков. Для этого аликвоты сульфатных суспензий или альбумина вносили в 0,85 %-й раствор хлорида натрия до величины ОП28о = 0,7. Концентрацию ^О или альбумина определяли спектрофотометрически на основании мольного коэффициента поглощения с использованием эмпирических постоянных 1,4 и 0,66, соответственно, для и альбумина. Далее необходимые концентрации образцов готовили с линейным инкрементом на основании шага 2.

В оптимизацию анализа входило определение стандартного разведения синтезированного ИПК. Для этого в течение ночи адсорбировали иммуноген (^в собаки) при постоянной концентрации белка 1 мкг/мл общепринятым способом. Стандартным разведением ИПК антикв собаки считали такое его разведение, которое в прямом методе анализа обеспечивало формирование ОП495 = 1,2 ± 0,1 с субстратом ОФД. На основе ИПК анти^О собаки в стандартном разведении конструировали прямой метод иммуноферментного анализа. Растворы с концентрацией белка 2,44 нг/мл - 10 мкг/мл подвергали адсорбционной иммобилизации с целью построения градуировочной зависимости. Контролем служили сывороточный альбумин собаки (10 мкг/мл) и видовые ^О (1,0 и 10,0 мкг/мл). Установлено, что чувствительность прямого варианта ИФА составляла 4,88 нг/мл, градуировочная зависимость находилась в интервале 4,88-625 нг/мл. При этом неспецифическая сорбция ИПК антикв собаки на адсорбционно иммобилизованный альбумин была в пределах нормы (0,066±0,007), а уровень специфических взаимодействий с видовыми колебался в интервале от 1,125 ± 0,129 до 0,071 ± 0,019. Прямой метод анализа в аналитической биохимии самостоятельного значения не имеет. В настоящем исследовании полученные результаты. прямой индикации собаки и видовых образцов служили основой для оптимизации прямого

конкурентного метода и для выявления уровня гомологии видовых среди животных одного и того же семейства.

Конкурентный метод ИФА обладает надлежащим уровнем специфичности. Максимальная специфичность анализа проявляется в условиях заданного лимита концентраций иммунореагентов в исходной реакционной среде. Указанный принцип соотношений аналитического иммуносорбента (^в собаки) и детектирующего иммунореагента (ИПК антикв собаки) был использован при оптимизации прямого конкурентного метода ИФА. Концентрации калибрантов ^О собаки брали в интервале 2,44 - 5000 нг/мл. Установлено, что надлежащий наклон градуировочной зависимости находится в интервале концентраций конкурента 19,5 - 625 нг/мл. При этом концентрации сывороточного альбумина собаки 1, 10 и 100

мкг/мл не участвовали в конкуренции. Соответствующие оптические плотности образцов были на уровне холостой пробы, т.е. ОП493 холостой пробы равна 1,113 ± 0,102, ОП493 альбумина при концентрации белка 1, 10 мкг и 100 мкг/мл составили (1,15 ± 0,09), (1,23 ± 0,11) ч (1,22 ± 0,15), соответственно.

Влияние состава инкубационной среды на титр антител из класса

собаки

С целью разработки технологических нововведений исследовали влияние инкубационной среды различного состава на активность (титр) антител из класса в собаки, иммунизированной яичным альбумином. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Влияние состава среды и режима инкубирования на показатели титра

антител из класса 1аО собаки, специфичных к ЯА

№ п/п Состав среды и условия инкубации Титр антител в эксперименте Удельный титр (расчетная величина)

1 0,8 % раствор риванола, рН 8,0 в течение 12 часов при температуре (10±2) °С 54300 543

2 0,05 моль/л Иа-ацетатном буферный раствор с 0,3 % каприловой кислоты при рН 5,0 в течение 12 часов при температуре(10±2)°С 54300 543

3 0,05 моль/л Ыа-ацетатном буферный раствор с 0,3 % каприловой кислоты и 0,1 моль/л ЫаС1 при рН 4,0 в течение 4 часов при температуре (18±2) °С 54300 543

4 в 25 %-ном этаноле при рН 7,0 в течение 4 часов при температуре - 10 °С 54300 543

5 0,15 моль/л раствор натрия хлорида в течение 12 часов при температуре (10±2) °С 54300 543

В пробирки, содержащие по 1 мл соответствующей инкубационной среды, вносили по 0,2 мл специфического с концентрацией белка 100 мг/мл. При инкубировании с этанолом к 30 %-ному охлажденному раствору спирта (- 10 °С) приливали в тех же соотношениях раствор специфического охлажденного до ~ 0°С.

При всех условиях инкубирования специфических определяли титр антител непрямым методом иммуноферментного анализа и рассчитывали удельный титр - титр/белок. Согласно данным, представленным в таблице 3, различные условия, в которых проводилась инкубация, не влияют на активность (количество) антител. В дальнейшем изложенные подходы были использованы в комплексном технологическом процессе производственного фракционирования плазмы крови псовых с целью разработки, согласования и утверждения в соответствии с порядком, действующим в России, нормативной документации на технологию производства препарата «Иммуно С».

Исследование антигенной структуры видовых ^С в гомологичной системе анализа (^С собаки - анти^С собаки)

При определении специфичности прямого метода индикации 1§С собаки установлена достаточно высокая степень сродства ИПК анти^Ссобаки к песца и лисицы. В меньшей степени ИПК анти^О собаки взаимодействовал с норки. Конкретные представители семейства псовых (волчьих), а именно собака, песец и лисица, выбраны с учетом экономических соображений (разводятся в неволе для производства пушнины). Следовательно, их боеиская кровь, может использоваться для получения субстанций иммуноглобулинов, на основе которых возможно организовать промышленный выпуск гетерологичных препаратов с надлежащим уровнем биологической безопасности.

В сравнительных исследованиях образцов видовых ^С апробировались иммунопреципитационные и иммуноферментные методы анализа. Небольшие модификации в постановке иммунопреципитации касались использования в качестве связывающего агента ^в-фракции, выделенной из пула иммуносывороток, специфичных к собаки. В состав агарозы вводили ПЭГ до концентрации 3 %, а преципитаты окрашивали с помощью амидочерного 4В. В прямом варианте ИФА в системе анализа собаки - ИПК антикв собаки исследовали калибровочные пробы, приготовленные на основе видовых Гомологичный и гетерологичные калибранты использовали также в прямом конкурентном методе. Образцы сывороточного альбумина собаки служили контролем.

Установлено (табл. 4), что иммунопреципитационный анализ позволяет выявить антигенное сродство практически всех видовых При этом собаки, песца и лисицы по результатам ДИД неразличимы. С целью устранения фоновых эффектов вместо иммуносыворотки в реакции преципитации мы использовали фракцию специфических 1§0. Взаимодействие антиген - антитело регламентировали концентрацией специфического (10 мг/мл) и концентрацией антигена 8-500 мкг/мл.

В прямом варианте ИФА (табл. 4, рис. 1) градуировочные зависимости воспроизводились для собаки, песца и лисицы. Образцы из семейства куньих (норка) также обладали сродством к ИПК анти-^С собаки. Однако величины ОП493 при концентрации адсорбционно иммобилизованных ^О 10 мкг/мл были на 10,0 % (песец), 19,9 % (лисица), 73,1 % (норка) ниже

по сравнению с таковым показателем в гомологичной системе анализа. Другие видовые ^О связывали ИПК анти-^С собаки на уровне контрольных величин. Заслуживает внимания факт параллельности градуировочных зависимостей в интервале концентраций 2,5-10 мкг/мл воспроизводимых на образцах калибрантов семейства псовых (волчьих) (рис. 1). В методологической литературе интерпретация параллельности градуировочных зависимостей сводится либо к наличию структурно сходных либо идентичных антигенных детерминант.

При сравнении результатов исследований, полученных с помощью ДИД и прямого метода ИФА, наблюдается кажущееся несоответствие. В частности, чувствительность прямого ИФА составляет 4,88 нг/мл, чувствительность ДИД, как правило, на 3 порядка превышает аналогичный показатель при иммунопреципитации. Вместе с тем в ДИД зафиксировано иммунологическое сродство между, например, собаки и человека, а при использовании метода с большей чувствительностью результаты не столь очевидны (табл. 4). С позиций фундаментальной иммунологии взаимодействие с гетерологичными возможно по двум структурно обусловленным обстоятельствам. Во-первых, одна и та же «гомогенная» популяция антител может реагировать с целым рядом не идентичных, но структурно сходным антигенных детерминант. В терминологии Т^еп (1985) такое иммунологическое взаимодействие характеризует индивидуальные белки как перекрестно реагирующие. Для белков, имеющих определенное количество идентичных антигенных детерминант, введен термин частичная перекрестная реактивность.

Иммуноперекрест, обусловленный структурно-сходными (не идентичными) антигенными детерминантами, графически представлен кривыми, параллельными линейной части градуировочных зависимостей, воспроизведенной в гомологичной системе конкурентного анализа. Полученные нами данные (табл. 4, рис. 2) свидетельствуют о смешанном типе перекреста. Так, непараллельность калибровочных графиков в области их линейности (рис. 2) на основе гомологичного и гетерологичных 1§С животных из семейства псовых позволяет обсуждать наличие идентичных антигенных детерминант в составе ^О собаки, песца и лисицы. Гетерологичные из семейства псовых не обеспечивают близких

численных значений ОП в интервале концентраций гомолога 2,5 - 5,0 мкг/мл (табл. 4, рис. 2). Соответствующие ОП493 при концентрации 5 мкг/мл видовых ^О из семейства псовых составили (0,21±0,02), (0,33±0,02) и (0,41±0,02), соответственно, для образцов собаки, песца и лисицы. При этом наиболее демонстративные результаты ОП493, на основе которых воспроизводятся параллели грудуировочных зависимостей, характерны для интервала концентраций ^О псовых от 1,5 до 5 мкг/мл. Очевидна также тенденция к конкуренции остальных ^С и прежде всего со стороны ^С норки (табл. 4, рис. 2). По-видимому, в условиях лимита концентрационных соотношений, предусмотренных условиями реакции, в составе ИПК анти^С} собаки будут присутствовать антитела к антигенным детерминантам

гомолога, т.е. к антигенным детерминантам, которых нет в составе ^О песца и лисицы.

Идентификацию численных значений иммунологического сродства осуществляли с учетом градуировочных зависимостей, которые для прямого и конкурентного варианта ИФА составили 4,88 - 625 нг/мл и 19,5 - 625 нг/мл, соответственно. В прямом методе ИФА иммунологическое сходство оценивали как отношение в % оптических плотностей гетерологичного и гомологичного антигенов при их постоянной концентрации 10 мкг/мл. В прямом конкурентном методе использовали линейную часть градуировочной зависимости 19,5 - 625 нг/мл. Разработанный нами лабораторный набор не в полной мере отвечал требованиям, предъявляемым к количественному анализу. Поэтому сравнивали различия оптических плотностей и их достоверность при одинаковых концентрациях видовых (220 нг/мл), обеспечивающих 50% ингибирование за счет гомологичного (табл. 4). . При сравнении одинаковых концентраций ^С песца и лисицы, соответствующих концентрации собаки (220 нг/мл) и 50%-ому

ингибированию в градуировочной зависимости, уровни сродства для гетерологичных образцов составили 84 и 65 %, соответственно.

Таблица 4

Уровень иммунологического сходства ^О человека и видовых ^О

животных

Животное ДИД Прямой ИФА, ОПп Конкурентный ИФА, ОПк

титр % Х±<7 % х±а %

Собака 1/64 100 1,125±0,129 100 0,659±0,015** 100

Песец 1/64 100 1,063±0,082 90,0 0,748±0,048** 84

Лиса 1/64 100 0,892±0,073* 80,1 0,855±0,035** 65

Норка 1/16 25 0,347±0,043* 26,9 1,148±0,075** 12,5

Человек 1/8 12,5 0,176±0,023* 10,5 1,186±0,061 5,7

Бык 1/4 6,25 0,134±0,043* 6,5 1,177±0,076 7,3

Баран 1/4 6,25 0,154±0,062* 8,4 1,196±0,078 3,9

Лошадь 1/4 6,25 0,123±0,021* 5,5 1,179±0,076 7

Свинья 1/4 6,25 0,141±0,053* 7,0 1,195±0,097 4,1

Крыса 1/1 (цельная) 3 0,193±0,021* 12,2 1,188±0,121 3

Мышь 1/1 (цельная) 3 0,176±0,019* 10,5 1,201±0,089 3

фон 0,065±0,007 (САС, 10 мкг/мл) 1,218±0,137 (отсутствие конкурента)

Примечание: X - ср. арифметическая, а - среднее квадратичное отклонение, п=6;

ОПп - оптическая плотность образцов при концентрации адсорбционно иммобилизованных ^О 10 мкг/мл; ОПк - оптическая плотность образцов ^О

при их постоянной концентрации (220 нг/мл), которая обеспечивает в гомологичной системе анализа (^в собаки) -50% ингибирование; * -достоверные различия по сравнению с гомологом (1§С собаки) при уровне значимости р < 0,05; ** - достоверные различия по сравнению с фоном (отсутствие конкурентов) при уровне значимости р < 0,05.

мкг/мл

песец —собака —*— лисица —*— норка -*—человек ■ •- бык —1—баран -о- лошадь —свинья —крыса ---К

Рис. 1. Градуировочные зависимости гомологичных и гетерологичных 1§С в прямом варианте ИФА

1,400

1,200 -

1,000 ' И^Ча— - . __ | ц - -- - ^Г-. -■ ^.¡Ь !_.--■ я ■ .

5 0,800 -тт с О 0,600 -

0,400 -

0,200 -

0,000 -1 1 1 1 1 1 1 ' 1 1 1 1 V

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500. 5000

нг/мл 1

—«—собака —песец -»-лиса —*—норка —«—человек

■ бык —|—баран -а- лошадь -»-свинья -»-крыса

мышь ---К1 --К2

Рис. 2. Градуировочные зависимости гомологичных и гетеролбгичных в прямом конкурентном варианте ИФА.

Оптимизация реакции сополимерной модификации собаки

Активированную форму сополимера и образцы собаки

инкубировали при рН 9,5 в течение 1-18 часов. В процессе модификации определяли скорость изменения рН инкубационной среды через равные промежутки времени (табл. 5).

Таблица 5

Скорость изменения рН в процессе реакции модификации при _различных соотношениях белок/полимер_

Время реакции, час Скорость снижения рН, ед./час

mod 1/2, х±с mod 1/5, х±а mod 1/10, х±а mod 1/15, х±а mod 1/20, х±а

1-3 0,57±0,15 0,61±0,03 0,7±0,209 0,78±0,19 0,82±0,12

4-6 0,31±0,09 0,386±0,11 0,443±0,131 0,496±0,151 0,517±0,194

7-8 0,152±0,11 0,18±0,14 0,245±0,173 0,261±0,139 0,274±0,125

Примечание: mod - модифицированный IgG собаки с соответствующим соотношением белок/полимер; х - средняя арифметическая скорости; о-стандартное отклонение.

Дальнейшие исследования были направлены на изучение физико-химических свойств модифицированных форм при тех же мольных соотношениях белок/полимер. Оценивали мутность и вязкость растворов до и после модификации. Метод определения мутности основан на определении кажущего поглощения света с длиной волны 540 им и относится к косвенным методам контроля за размерами молекул. Установлено, что мутность растворов возросла в 1,5 - 3 раза по мере увеличения избытка совиаля. Тенденция к увеличению мутности говорит об увеличении средних молекулярных размеров коньюгатов по мере увеличения мольного избытка полимера. При этом вязкость раствора инкубационной среды возрастает незначительно: на 0,02-0,04 ед. при максимальных (1/15 и 1/20) мольных избытках модификатора.

В следующей серии экспериментов была предпринята попытка выделения сополимерно модифицированных форм с помощью

эксклюзионной хроматографии на гелях типа сефадекса в-200 (сефакрила Б-200 или Б-ЗОО). Установлено, что уже 2-кратный мольный избыток совиаля изменяет профиль эксклюзионной хроматографии. Из-за структурных особенностей модификатора в наших исследованиях такой подход следует признать малоинформативным.

Для разработки метода оценки полноты реакции модификации на уровне соотношений нативная/модифицированная форма использовали электрофорез в градиентном ПААГ (5-25 %). В аналитическом варианте электрофоретическому фракционированию подвергали восстановленные и невосстановленные пробы в диссоциирующих условиях. В диссоциирующих условиях невосстановленные пробы нативных и модифицированных представлены на рисунке 3.

Рис. 3. Электрофореграмма образцов невосстановленные

пробы (40 мкг) в диссоциирующих условиях:

1. Нативная форма собаки;

2. Модифицированный собаки, мольное соотношение белок'.совиаль - 1:2;

3. Модифицированный собаки, мольное соотношение белок:совиаль - 1:5;

4. Модифицированный собаки, мольное соотношение белокховиаль - 1:10;

5. Модифицированный 1§С собаки, мольное соотношение белокховиаль - 1:20.

В отличие от нативного образца модифицированные формы представлены более широкой диффузной полосой в интервале от концентрирующего геля до области, близкой к подвижности немодифицированного белка. Заметно также, что модифицированные белки обладали меньшей электрофоретической подвижностью. Указанная закономерность зависела от мольного избытка совиаля. Из электрофореграммы, приведенной на рис. 3, можно утверждать, что при мольном 20-кратном избытке, по-видимому, происходит наиболее полная модификация (имеется ввиду отсутствие немодифицированных форм

В следующей серии экспериментов модифицированные формы собаки подвергали электрофорезу в диссоциирующе-восстанавливающих условиях. Полученные электрофореграммы сканировали и результаты сканирования приведены в табл. 6. Количественный анализ полученных электрофореграмм показал, что уже при 2-х кратном избытке полимера большая часть белка оказывается модифицированной, при этом доля свободного иммуноглобулина составляет 39,7 % от общего количества С увеличением мольного соотношения белок/полимер до 1/20 наблюдается постепенное снижение доли свободного 1§С и, соответственно, повышение доли высокомолекулярных комплексов в коньюгате.

Таблица 6

Соотношение нативной и модифицированной форм собаки в зависимости от мольного соотношения белок/совиапь, % (по результатам электрофореза в ПААГ в диссоциирующих _восстанавливающих условий)_

Образцы с разным соотношением белок/полимер Нативный IgG Модифицированный IgG

Нативный IgG 98,1 1,9 (олигомеры)

1/2 39,7 60,3

1/5 28,4 71,6

1/10 7,1 92,8

1/15 6,7 93,3

1/20 6,4 93,6

Исследование биохимических и биологических свойств нативных и сополимерно модифицированных форм собаки

Одним из следствий ковалентного связывания белка с полимерами является повышение их устойчивости термоинактивации или к условиям инкубирования с выраженным денатурирующим эффектом. В связи с изложенным, дальнейшие исследования касались изучения термостабильности коньюгатов. Нативный и модифицированный ^С в присутствии гентамицина (10 мг/мл) прогревали при 60 °С в течение 10 часов. В прогретых нативных образцах наблюдалась выраженная опапесценция и формирование осадка. Тогда как в образцах с модифицированными ^О опалесценции не наблюдалось. В отличие от нативной формы ^С модифированные формы выдерживают термообработку даже при минимальном 2-х кратном избытке совиаля.

Изменения антигенных свойств модифицированных образцов собаки исследовали методом ДИД по Ухтерлони, используя специфичные (антикв собаки) кролика. С увеличением степени модификации иммуноглобулина происходит закономерное понижение уровня антигенного сходства конъюгатов с нативным иммуноглобулином. Характерная для нативного чувствительность иммуноанапиза (64) при исследовании модифицированных образцов снижается. Так при 2-х и 5-ти кратных избытках совиаля и наличия в составе до 60,3 и 71,6 %

модифицированных форм целевого белка чувствительность уменьшилась до титра 32. При 15-ти и 20-ти кратном избытке полимера исследуемый показатель снизился, соответственно, до 16 и 8.

В дальнейших исследованиях использовали прямой и прямой конкурентный ИФА. Результаты, представленные в табл. 7, показали, что по мере увеличения степени модификации 1£0 снижается уровень связывания ИПК антикв.

Таблица 7

Степень иммунохимического сходства нативного и модифицированных _форм собаки в прямом методе ИФА, в %_

Соотношение белок/полимер x±a P

Нативный IgG 100 -

Mod 1/2 24,2±5,3 <0,001

Mod 1/5 18,52±2,7 <0,001

Mod 1/10 11,1±2,1 <0,001

Mod 1/15 2,5±1,9 <0,001

Mod 1/20 0 <0,001

Примечание: п = 6; х - среднее арифметическое; с - стандартное отклонение; Р - достоверность различий.

Сополимер винилпирролидона с диацеталем акролеина является гидрофильной матрицей. Не исключено, что модифицированные формы приобретают гидрофильные свойства и, как следствие этого, изменяется изотерма сорбции модифицированных образцов. С учетом изложенного, в следующей серии экспериментов нативный и модифицированный формы ^С исследовали прямым конкурентным методом (табл.8)

Таблица 8

Степень иммунохимического сходства нативного и модифицированных

форм IgG собаки в прямом конкурентном ИФА, в %

Соотношение белок/полимер Схема 1 Схема 2

X±0 P x±o P

Нативный IgG 100 - 100 -

Mod 1/2 43,1±11,6 <0,05 48,7±5,3 <0,05

Mod 1/5 38,4±10,12 <0,05 46,24±4,79 <0,05

Mod 1/10 31,3±9,1 <0,05 43,0±12,3 <0,05

Mod 1/15 19,1±4,4 <0,05 23,7±6,5 <0,05

Mod 1/20 12,1 ±4,6 <0,05 17,0±8,0 <0,05

Примечание: п = 6; х - среднее арифметическое; о - стандартное отклонение; Р - достоверность различий.

Из результатов, приведенных в табл. 8 следует, что при 2-х кратном мольном избытке совиаля антигенное сродство снижается на 56,9 %. При 20-ти кратном мольном избытке уровень антигенной гомологии модифицированного и нативного образцов составил 12 %.

Обнаруженные различия в уровнях антигенной гомологии модифицированных (табл. 7 и 8) возможно объяснить методологией ИФА. Известно, что адсорбционная иммобилизация белков на поверхности твердой фазы обусловлена гидрофобными связями межу белком и полистиролом. По-видимому, модификация придает гидрофильные

свойства белку, вследствие чего изотерма сорбции нативн ых и модифицированных образцов определяется различными количественными закономерностями. Следовательно, в конкурентном ИФА результаты исследования более адекватно отражают реальный уровень изменения антигенных свойств, обусловленных модификацией.

В следующей серии экспериментов изучали влияние модификации 1§С, специфичного к яичному альбумину. Исследования выполняли с помощью непрямого метода ИФА, который проводили с помощью общепринятой схемы: адсорбционная иммобилизация яичного альбумина с последующей инкубацией нативной или модифицированных форм собаки,

специфичного к яичному альбумину, и индикация комплекса при помощи ИПК анти^С собаки. Результаты исследования представлены в таблице 9.

Таблица 9

Антигенсвязывающая активность нативных и модифицированных собаки, специфичных к яичному альбумину, до и после термоинактивации

Стадии исследования

ОП493 в непрямой схеме ИФА

N81 1/2 1/5 1/10 1/15 1/20

До 2,918 0,852 0,647 0,539 0,141 0,102

инактивации ± ± ± ± ± ±

0,02 0,06 0,04 0,021 0,01 0,005

После 0,248 0, 72 0,58 0,502 0,134 0,115

инактивации ± ± ± ± ± ±

0,015 0,03 0,03 0,017 0,006 0,005

Остаточная

активность 8,5 84,5 89,6 93,1 95 112,7

(%)

Примечание: х - среднее арифметическое; с - стандартное отклонение; Р - достоверность различий.

Установлено, что с увеличением степени модификации закономерно снижается антигенсвязывающая активность собаки, специфичного к яичному альбумину. При 15-20-ти кратном мольном избытке совиаля антигенсвязывающая активность модифицированных ^С практически исчезает.

За антигенсвязывающую активность молекулы иммуноглобулина ответственны РаЬ-фрагменты, на конце которых сосредоточены

гипервариабельные участки полипептидной цепи. Отдельные аминокислотные остатки в этих участках специфически взаимодействуют с эпитопами антигена. Таким образом, уменьшение уровня антительной активности модифицированных форм IgG собаки, специфичных к яичному альбумину, по сравнению с их нативной формой свидетельствует о структурно-функциональных эффектах модификации в районе Fab-фрагмента молекулы иммуноглобулина, приводящее к экранированию части антигенсвязывающих участков или к нарушению их структуры. Кроме того, на антительную активность существенное влияние может оказать связывание полимера в районе Fc-фрагмента.

На основе полученных данных можно сделать вывод о том, что происходит увеличение стабильности IgG собаки, специфичного к яичному альбумину, в денатурирующих условиях в результате химической модификации. Это может быть связано с тем, что в процессе модификации в химерных молекулах происходит экранирование сайтов в области остатков лизина, аспарагина и глутамина, подвергающихся атаке гентамицина или других денатурирующих агентов.

Для исследования иммунобиологических свойств нативных и модифицированных форм IgG собаки осуществляли пассивную и активную иммунизацию собак, песцов и кроликов. При пассивной иммунизации нативные и модифицированные IgG собаки вводили внутримышечно собакам и песцам (животные-реципиенты). Активной иммунизации подвергали кроликов (животные-продуценты) в соответствии с рекомендациями Dresser (1987).

Образцы сывороток крови животных-реципиентов исследовали на 20-й и 40-й день после двухкратного введения нативных и модифицированных форм IgG. Образцы сывороток крови животных-продуцентов исследовали после первого цикла иммунизации. Наличие антител определяли в ДИД с добавлением в агарозу ПЭГ до конечной концентрации 3 %. Результаты представлены табл. 10

Таблица 10

Оценка потенциально возможной иммуногенности нативных и модифицированных форм 1§0 собаки на основе регистрации антител с __помощью ДИД___

собаки, Животное-реципиент Животное-

апробированные как продуцент

потенциальные песец собака кролик

иммуногены

1§С нативная форма 0 0 1/32

модифицированная

форма('[§0/совиаль)

1/2 0 0 1/16

1/5 0 0 1/8

1/10 0 0 1/4

1/15 0 0 1/2

1/20 0 0 1/1 (цельная)

На основании полученных результатов полагаем, что модификация IgG собак сополимером виниллирролидона с диацетапем акролеина обеспечивает экранирующий эффект и не вызывает образование новых антигенных детерминант. Обобщающий вывод не противоречит теории искусственных иммуногенов, т.к. в составе использованного сополимера и синтезированного комплекса отсутствует иммуногенная составляющая типа цепных полимеров с электростатически заряженными функциональными группировками.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что 2-х стадийный хроматографический процесс, выполненный на слабом анионообменном сорбенте (типа DEAE) и эксклюзионная хроматография на геле типа сефадекс G-200 (S-200), обеспечивает изготовление электрофоретически гомогенных образцов IgG без олигомеров и фрагментов целевого белка.

2. Разработана исследовательская технология выявления антигенных свойств IgG среди животных из семейства псовых. Предлагается на основе электрофоретически гомогенных образцов в прямом и прямом конкурентном методах иммуноферментного анализа воспроизводить градуировочные зависимости и по контрольным точкам вычислять уровень иммунологического сродства.

3. Оптимизирована реакция поликонденсации на основе индукции альдегидных групп в составе сополимера вииилпирролидона с диацеталем акролеина и свободных e-аминогрупп лизина IgG. Отработана электрофоретическая система анализа для определения соотношений нативного и модифицированного IgG в составе коньюгированных форм.

4. Проведен биохимический скрининг модифицированных IgG, т.ч. определены закономерности экранирующего эффекта сополимерной матрицы на антигенное представительство и физиологическую активность антител.

5. Разработана, согласована и утверждена нормативно-техническая и технологическая документация в соответствии с порядком, действующим в РФ, на производство и исследование экспериментальных серий иммуноглобулинового биопрепарата «Иммуно С» нового поколения.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ

1. Барсуков А.К. К вопросу о совершенствовании технологии производства фармацевтических биопрепаратов / А.В Бармин, О.Ю. Нестерова, E.H. Желтышев, А.И. Кузнецов, О.В. Кожевникова, В.А. Грачева, Ф.М. Касимов, А.Н. Панин, В.И. Смоленский, В.И. Уласов// Сельскохозяйственная биология. - 2005. - № 6. - С. 84-91.

2. Барсуков А.К. Стандартизация биопрепаратов крови / А.В Бармин, Ф.М. Касимов, А.И. Кузнецов, О.Ю. Нестерова, Г.Н. Бурдов, А.Н. Панин, В.И. Смоленский, В.И. Уласов, В.Л. Свидерский, А.Е. Хованских// Ветеринария. - 2005. - № 7. - С. 43-48.

3. Barsukov A.K. Informational priority of international development of socially usefull biotechnology / Zhuravlev V.A., Savinsky S.S., Barmin A.V., Kuznetsov А.1., Nesterova O.Yu., Kozhevnikova O.V., Ushnurtseva S.A., Zheltyshev E.N.// International Conference on Engineering Education. - Gliwice, Poland. 2005. - Conference Proceedings. - P. 76-81.

4. Нестерова О.Ю. Гомология lgG семейства псовых in vitro и in vivo /

A.K. Барсуков,A.B. Бармин, E.H. Желтышев, А.И. Кузнецов, О.В. Кожевникова, Ф.М. Касимов., С.А. Ушнурцева // I съезда физиологов СНГ. Сборник научных трудов. - Сочи. 2005. - С. 87.

5. Барсуков А.К. Совершенствование технологии производства биопрепаратов крови / О.Ю. Нестерова, А.И. Кузнецов, Ф.М. Касимов, В.А. Журавлев, E.H. Желтышев, В.А. Храмов // XIX Международная научно-техническая конференция «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии». Сборник материалов. - Уфа. 2006. - С. 54-55.

6. Барсуков А.К. Необходимые составляющие целесообразного развития нормативно-технической базы за контролем качества фармацевтических биопрепаратов / О.Ю. Нестерова, А.И. Кузнецов, О.В. Кожевникова, E.H. Желтышев, В.А. Храмов // Третья международная научно-практическая конференция «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности». Сборник трудов. - Санкт-Петербург. 2007. - С. 160162.

7. Барсуков А.К. Биохимические основы технологии производства биопрепаратов из некондиционной (утильной) плазмы (сыворотки) крови / О.Ю. Нестерова, А.И. Кузнецов // Четвертая международная научно-практическая конференция «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности». Сборник трудов. - Санкт-Петербург. 2007. - С. 250-251.

8. Барсуков А.К. Исследование иммуногенеза, индуцированного нативными и сополимерно модифицированными формами IgG / О.Ю. Нестерова, А.И. Кузнецов // VI конференции иммунологов Урала. Материалы конференции. - Ижевск. 2007. - С.23-24.

9. Барсуков А.К. Выделение белков-стандартов иммуноглобулина G и альбумина, изучение их олигомеризации и антигенных свойств в процессе хранения в насыщенном растворе сульфата аммония / A.B. Бармин, А.И. Кузнецов, О.Ю. Нестерова, С.А. Ушнурцева, А.Н. Панин, В.И. Смоленский,

B.И. Уласов, B.J1. Свидерский, А.Е. Хованских // Прикладная биохимия и микробиология,- 2009 г.- Т. 45.- №3.- С. 378-383.

10. Барсуков А.К. Разработка экспериментальных подходов на основе белков-стандартов для оценки качества биопрепаратов крови и иммунопероксидазных коньюгатов, специфичных к иммуноглобулинам G человека и животных / A.B. Бармин, А.И. Кузнецов, О.Ю. Нестерова, С.А. Ушнурцева, А.Н. Панин, В.И. Смоленский, В.И. Уласов, В.Л. Свидерский, А.Е. Хованских // Прикладная биохимия и микробиология,- 2009 г.- Т. 45.-№4.- С. 487-492.

11. Патент на изобретение № 2338375 «Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов».

Отпечатано с оригинал-макета заказчика

Подписано в печать 25.09.2009. Формат 60x84 1/16. Тираж 100 экз. Заказ № 1495.

Типография ГОУВПО «Удмуртский государственный университет» 426034, Ижевск, ул. Университетская, 1, корп. 4.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нестерова, Ольга Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и молекулярно-биологические свойства иммуноглобулина G.

1.2. Методология иммобилизации (модификации) белков, пептидов и физиологически активных веществ.

1.3. Общетеоретические принципы модификации IgG.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Используемые в экспериментальной работе материалы.

2.1.1. Сырье для изготовления особо чистых форм IgG.

2.1.2. Хроматографические сорбенты для выделения особо чистых форм IgG.

2.1.3. Материалы для проведения электрофореза и иммуноэлектрофореза.

2.1.4. Материалы и реактивы, использованные для проведения нехроматографического фракционирования.

2.1.5. Материалы, использованные при изготовлении лабораторных ИФА тест-систем.

2.1.6. Материалы и реагенты для проведения иммунизации и взятия крови.

2.2. Фракционирование образцов плазмы крови.

2.2.1. Нехроматографическое фракционирование.

2.2.2. Хроматографическое фракционирование.

2.3. Иммунизация и взятие образцов крови животных реципиентов.

2.4. Изготовление основных иммунореагентов.

2.4.1. Выделение IgG из антисыворотки, специфичной к IgG собаки.

2.4.2. Получение адсорбционно-иммобилизованных иммунореагентов.

2.4.3. Изготовление пероксидазных коньюгатов.

2.5. Химическая модификация IgG.

2.5.1. Активация водорастворимого сополимера.

2.5.2. Синтез химерных конструкций IgG и совиаля.

2.6. Физико-химические методы анализа.

2.6.1. Определение концентрации белка.

2.6.1.1 .Спектрофотометрический метод.

2.6.1.2. Биуретовый метод.

2.6.2. Электрофорез в ПААГ.

2.7. Биохимические методы анализа.

2.7.1. Преципитационные методы.

2.7.1.1. Двойная иммунодиффузия.

2.7.2. Методы иммуноферментного анализа.

2.7.3. Иммуноэлектрофорез.

2.8. Статистическая обработка результатов.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение биохимически гомогенных и конформационно нативных IgG из плазмы (сыворотки) крови собаки, песца, лисицы.

3.2. Определение качества иммуносывороток и конструирование лабораторного набора для индикации IgG собаки.

3.3. Влияние состава инкубационной среды на титр антител из класса IgG собаки.

3.4. Исследование антигенной структуры видовых IgG в гомологичной системе анализа (IgG собаки - aHTnlgG собаки).

3.5. Оптимизация реакции сополимерной модификации IgG собаки

3.6. Исследование биохимических и биологических свойств нативных и сополимерно модифицированных форм IgG собаки.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимические характеристики нативных и модифицированных форм IgG некоторых представителей семейства псовых"

Актуальность проблемы. Прогресс в секвенировании нуклеиновых кислот позволил разработать исследовательский подход, с помощью которого фактологию" палеонтологии, сравнительную и онтогенетическую биохимию, можно увязать с особенностями первичной структуры ДНК и, тем самым, корректно обсуждать время и направление молекулярной эволюции живых систем [Киселев, 2000]. Функциональный подход к организации генома клетки предполагает перевод одномерного (линейного) кода ДНК в трехмерную структуру белка. При этом разнообразие белковых вариантов и всевозможных комплексов на их основе значительно больше количества генов, кодирующих их полипептидную цепь [Baker, Sali, 2001; Arnason et ah, 2004; Карелин, Иванов, 2005]. С учетом обобщенной проблематики, объемлющей направления исследований, касающихся полиморфизма генов, степени их консерватизма и закономерностей фолдинга, фундаментальная концепция «в гомологии структур зашифрована аналогия функций» оказалась весьма плодотворной и в настоящее время [Hegyi, Gerstcin, 1999; Свердлов, 2000]. Принципиальные закономерности фолдинга в общих чертах будут раскрыты в ближайшие десятилетия [Иванов, Вьюгин, 2000; Березовский, 2001]. Однако, с методологических позиций секвепирование белков является более трудоемким процессом по сравнению с секвенированием ДНК и, следовательно, процесс создания «каталога протеинов» отодвигается на неопределенный период. Согласно теоретическим воззрениям [Огиевецкая, 1978; Колчанов с соавт., 2003; Татаринов, 2004; Татаринов, 2005] полагают, что для достоверной реконструкции филогенетического древа необходимо сравнивать структуру 15-30 видоспецифических белков различных биологических видов. Вместе с тем, интегральные результаты такого рода исследований не позволяют взаимоувязывать результаты молекулярно-биологических подходов для описания антигенных особенностей белковой макромолекулы.

Теоретической основой для предсказания антигенного строения белка является выяснение аминокислотной последовательности и принципиальная расшифровка закономерностей фолдинга. Следовательно предсказательный потенциал современной биоинформатики не в состоянии даже па теоретическом уровне разработать принципы моделирования антигенных детерминант (их представительства) конформационной природы в составе белковой глобулы. Очевидно также, что традиционные методы исследования конформации белка - РСА или ЯМР - мало информативны для описания антигенного своеобразия функционально-сходиых макромолекул и, тем более неприемлемы, с учетом описания антигенных различий в ряду вид -род - семейство - отряд - класс [Христофоров с соавт., 1987; Ширяев, 2006]. Именно поэтому в сравнительных и онтогенетических исследованиях целесообразно развивать технологии «мокрой биохимии», в т.ч. для формирования конкретных представлений функциональной гепомики во всем ее разнообразии и, в частности, за счет развития методологии иммунохимического анализа функционально-сходных белков. Иммунологические подходы для изучения этих белков в пределах одного семейства используются, как правило, в рамках проблематики филогении и совершенствования систематики.

В настоящей работе обсуждаются результаты исследования антигенного своеобразия IgG семейства псовых. Для получения результатов с надлежащим уровнем качества были выполнены необходимые исследования с целью обеспечения принципа адекватности метода и модели. В последующих сериях экспериментов изучалась возможность конструирования сополимерно модифицированных форм IgG. Актуальность такого рода исследований обусловлена теорией искусственных иммуногенов и ориентацией полученных результатов на создание предметного задела для изучения возможности:

- технологического совершенствования производства направленных (специфических) иммуноглобулиновых биопрепаратов с удлиненным периодом полувыведения;

- использования гетерологичных IgG в медико-ветерипарпой практике без индукции иммунного ответа на парэнтеральное введение чужеродной генетической информации.

Цель исследования - получение и характеристика нативпых и модифицированных сополимером поливинилпирролидоиа с диацеталем акролеина (совиаль) образцов IgG собаки в рамках проблемы инфекционной и биологической безопасности иммуноглобулиновых биопрепаратов

Задачи исследования:

В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

1) Разработать лабораторную схему препаративной наработки IgG некоторых представителей из семейства псовых в электрофоретически гомогенной и конформационно нативпой (хроматографически мопомерной) форме.

2) Оптимизировать методы ИФА для индикации IgG и выявления антител в составе специфического IgG собаки.

3) Провести сравнительное исследование антигенных свойств видовых IgG из семейства псовых.

4) Синтезировать сополимерно модифицированные формы IgG собаки и изучить их некоторые биохимические и биологические свойства.

Научная новизна. Создана универсальная исследовательская технология получения биохимически гомогенных и конформационно нативиых форм IgG. Предложен адекватный методологический подход для описания антигенного своеобразия IgG животных, принадлежащих к одному и тому же семейству. Впервые в объективных количественных критериях выявлены различия антигенного строения при сравнении образцов IgG собаки, песца и лисы. Получены также оригинальные данные в отношении образцов IgG других животных, принадлежащих к разным отрядам. Оптимизирована реакция поликонденсации в системе взаимодействия IgG с активированной формой совиаля (сополимер винилпирролидона с диацетальакролеином). Установлен избирательный эффект модификации IgG совиалем. Есть все основания полагать, что в наибольшей степени сополимерная матрица экранирует N—терминал IgG и Fab-фрагменты молекулы. В процессе циркуляции гомологичных IgG в составе химерного комплекса зарегистрирована его устойчивость к ингибиторным системам организма. Тенденцию к увеличению активности антител в сыворотке крови подопытных животных возможно объяснить постепенной элиминацией сополимера из состава модифицированной формы специфического IgG.

Практическая значимость. Результаты исследования послужили основой для разработки, согласования и утверждения в соответствии с порядком, действующим в РФ, нормативно-технической и технологической документации на производство иммуноглобулинового биопрепарата: технические условия на препарат «Иммуно С» (ТУ 9382-002-43683877-03), 27 стр.; технологический регламент производства на препарат «Иммуно С» (№ 001516-0п), 300 стр.; наставление по применению препарата «Иммуно С» (№ 13-4-03/0690; № 001516-0п), 2 стр.

В рамках университетско-академического кластера в гермозопе GMP на заводских площадях организовано серийное производство препарата «Иммуно С» в рамках требований широких производственных испытаний (федеральный аттестат № 886 от 2 апреля 2003 года), продукция сертифицирована (№ РОСС RU. ФБ01. В08840). По совокупным показателям качества препарата «Иммуно С» и его клиническому эффекту аналогов в России нет.

Исследовательская технология препаративной наработки IgG собаки, песца и лисы в биохимически гомогенной и копформациопно пативной форме заложена в «Инструкции по изготовлению и контролю видовых IgG человека и животных». В настоящее время указанный документ и натуральные образцы проходят согласование и испытания в ФГУ «Центр качества лекарственных средств и кормов для животных».

Апробация работы.

Результаты исследований представлены на Региональной конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири, 20-21 сентября 2001 г., г. Ижевск; на 5-ой Российской университетско-академической научно-практической конференции, г. Ижевск, 2001 г.; на 6-ой Российской университетско-академической научно-практической конференции, г. Ижевск, 2003 г.; на I съезде физиологов СНГ, Сочи, 2005; на Международной конференции инженерного образования, 25-29 июля 2005 г., г. Гливиц (Польша); на XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии», Уфа, 2006; на Третьей международной научно-практической конференции «Исследование разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2007; на Четвертой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2007; па VI конференции иммунологов Урала, Ижевск, 2007.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ. В соответствии с порядком, действующим в РФ, разработан, согласован и утвержден комплект нормативно-технической и технологической документации на ветеринарный иммуноглобулиновый препарат нового поколения «Иммуно С», включающий технические условия ТУ (ТУ 9382-002-43683877-03), технологический регламент производства на препарат «Иммуно С» (№ 001516-0п) и наставление по применению препарата «Иммуно С» (№ 13-4-03/0690; № 001516-0п).

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, включает 19 таблиц, 10 рисунков. Библиография содержит 206 наименований российских и зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Нестерова, Ольга Юрьевна

выводы

1. Установлено, что 2-х стадийный хроматографический процесс, выполненный на слабом анионообменном сорбенте (типа DEAE) и эксклюзионная хроматография" на геле типа сефадекс G-200 (S-200), обеспечивает изготовление электрофоретически гомогенных образцов IgG без олигомеров и фрагментов целевого белка.

3. Оптимизирована реакция поликонденсации на основе индукции альдегидных групп в составе сополимера винилпирролидона с диацеталем акролеина и свободных е-аминогрупп лизина IgG. Отработана электрофоретическая система анализа для определения соотношений нативного и модифицированного IgG в составе коньюгированных форм.

4. Методом скрининга модифицированных IgG выявлен экранирующий эффект сополимерной матрицы: с увеличением мольного соотношения совиаль/белок происходит уменьшение иммунологического сходства модифицированных IgG по сравнению с нативной формой на 75,8 -97,5 % (в прямом ИФА) и на 56,9 - 87,9 % в (конкурентном ИФА). Комплексы IgG-совиаль термостабильны (60 °С).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе анализа данных литературы и полученных экспериментальных результатов была создана исследовательская технология получения стандартизованных форм видовых IgG, значимых для обеспечения биотехнологических нововведений. С использованием стандартизованных образцов разработана технология изучения антигенного своеобразия IgG среди животных одного и того же семейства. В частности, воспроизводство градуировочных зависимостей в конкурентной системе ИФА позволяет обсуждать проблематику антигенных различий IgG собаки, песца и лисицы. По нашему мнению конкуретные методы исследования позволяют адекватно оценивать гомологию антигенного строения IgG близкородственных видов. С учетом фундаментальной неопределенности, касающейся генома псовых и «протеома слазмы (сыворотки) крови собаки» содержательный смысл разработанной технологии сводится к исследованию образцов IgG с надлежащим уровнем чистоты (гомогенным в ПААГ-электрофорезе) и представленным мономерной формой целевого белка. Полагаем, что полученные нами данные могут быть основой промышленного производства гетерологиченых иммуноглобулиновых биопрепаратов с надлежащей биологической безопасностью. Очевидно также и то, что препаративная и аналитическая биохимия, на основе которой производятся стандартизованные образцы, являются достаточной для сопровождения промышленного фракционирования плазмы (сыворотки) крови с целью производства иммуноглобулиновых биопрепаратов. Внедрение в систему контроля теста на молекулярные параметры целевых белков актуализировано проблематикой реактогенности олигомерных форм IgG [Панов, 2004].

Разделы исследования, касающиеся конструирования сополимерно модифицированных форм IgG, в том числе IgG, специфичных к чужеродной генетической информации, нацелены на создание терморезистентных субстанций целевого белка. Предварительные результаты, полученные нами свидетельствуют, что сополимер в составе IgG выполняет роль экранирующей матрицы. В условиях инактивирующих воздействий (концентрация гентамицина 10 мг/мл, 10-ти часовой режим термоинактивации при температуре 60 °С) показана остаточная активность антител из сополимерных комплексов IgG. Отметим, что химерная конструкция IgG реализуется за счет азометиновых связей, а собственно комплекс стабилизирован не прочностью, но множеством шиффовых оснований. Об этом свидетельствует факт повышения активности антител по окончании процесса физико-химической инактивации нативных и модифицированных форм IgG собаки, специфичного к яичному альбумину. Ранее отмечалось, что полученные нами данные позволяют в определенной степени представить некоторые соображения о структуре сополимеров IgG. По-видимому, сополимерная матрица не выполняет роль носителя, вокруг которой формируется белковый комплекс. Об этом свидетельствуют результаты поликлонального эпитопного картирования, выполненного в сравнительных исследованиях нативных и модифицированных IgG. Полученные химеры не обладают свойством искусственных антигенов, в т.ч. не несут на своей поверхности антигенных детерминант, индуцирующих антителогенез. Их полезное свойство определяется резистентностью к денатурирующим воздействиям. В сравнительном аспекте антигенсвязывающая активность химерных IgG при 2-5-ти кратном мольном избытке совиаля существенно возрастает после инактивирующих процедур. Последнее обстоятельство — обеспечение вирусной безопасности биопрепаратов за счет модернизации стадии инактивации в последнее время приобретает все большую актуальность [Панов, 2004].

Биохимическая составляющая исследований является основой технологических нововведений на производство иммуноглобулинового биопрепарата «Иммуно С» из трупной крови песца и лисицы. На препарат

Иммуно С» в соответствии с порядком, действующим в РФ, разработана, согласована и утверждена нормативно-техническая и технологическая документация: ТУ 9382-002-43683877-03 (27 стр.), технологический регламент производства №001516-0п (300 стр.) и наставление по применению препарата «Иммуно С» № 13-4-03/0690 (2 стр.).

На основании результатов исследований, предусмотренных требованиями широких производственных испытаний, получено экспертное заключение. В частности отмечается, что по совокупным показателям качества «Иммуно С» представляет собой иммуноглобулиновый биопрепарат нового поколения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нестерова, Ольга Юрьевна, Ижевск

1. Ануфриева Е.В. Химическая модификация лизоцима водорастворимыми полимерами, структура и свойства конъюгата / Е.В. Ануфриева//Высокомолекулярные соединения.- 1989.-№ 1.-С. 100-103.

2. Баранов B.C. Молекулярная медицина: молекулярная диагностики, превентивная и генная терапия / B.C. Баранов // Молекулярная биология.-2000.- Т. 34.- № 4.- С. 684-695.

3. Баранов O.K. Эволюционная иммуногенетика сывороточных белков животных / O.K. Баранов // Новосибирск.- Наука.- 1981.- 226 с.

4. Березин И.В. Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин, Н.Л. Клячко, А.В. Левашов, К. Мартинек, В.В. Можаев, Ю.Л. Хмельницкий // М.-Высшая школа.- 1987.- 159 с.

5. Березовский И.Н. Эволюционные аспекты структуры и фолдинга белков / И.Н. Березовский // Молекулярная биология.- 2001.- Т.35.- № 2.- с. 278-284.

6. Бобровник С.А. Недостатки традиционного метода определения аффинности антител и их устранение / С.А. Бобровник, М.А. Демченко, С.В. Комисаренко //Укр. бкгам. журн.- 2009.- Т. 81.- № 3.- С. 66-76.

7. Буркин А. А. Иммуноферментная тест-система определения афлатоксина В1 / А.А. Буркин // Прикладная биохимия и микробиология.-2000.- Т.36.-№1.- с. 93-97.

8. Варфоломеев С. Д. Биокинетика: Практический курс / С. Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич // М. ФАИР-ПРЕСС,- 1999.- 720 с.

9. Вербов В.Н. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа / В.Н. Вербов // Твердофазный иммуноферментный анализ. Сборник научных трудов.- Л. Издательство Института им. Л. Пастера.- 1988.- С. 3-27.

10. Войцеховский Б. Л. Математическая обработка результатов гетерогенного иммуноферментного анализа / Б.Л. Войцеховский // Твердофазный иммуноферментный анализ. Сборник научных трудов.- Л. Издательство Института им. Л. Пастера.- 1988.- С. 42-58.

11. Волков ГЛ. Технология получения иммуноглобулинов. I. Технологические аспекты очистки / Г.Л. Волков // Украинский биохимический журнал.- 2006.- Т. 78.- №3.- с.88-98.

12. Володькин Д.В. Включение белков в полиэлектролитные микрочастицы путем послойной адсорбции полиэлектролитов на агрегатахбелка // Д.В. Володькин, Н.Г. Балабушевич, Г.Б. Сухоруков, Н.И. Ларионова / Биохимия.- 2003.- Т. 68.- №2,- С. 283-289.

13. Вьюгин В.В. Идентификация горизонтально перенесенных генов на основе филогенетических данных. / В.В. Вьюгин, М.С. Гельфанд, В.А. Любецкий // Молекулярная биология.- 2003.- Т. 37.- №4.- С. 673-687.

14. Вьюгин В.В. Согласование деревьев: реконструкция эволюции видов по филогенетическим деревьям генов. / В.В. Вьюгин, М.С. Гельфанд, В.А. Любецкий //Молекулярная биология,- 2002,- Т. 36.- № 5.- С. 807-816.

15. Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи // М. Мир.- 1982.- 448 с.

16. Гаврилин М.В. Применение полимеров и сополимеров производных акриловой кислоты и этиленоксида в фармации / М.В. Гаврилин // Химико-фармацевтический журнал.- 2001.- Т.35.- №1.- С. 33-37.

17. Галактионов В.Г. Эволюция суперсемейства иммуноглобулинов / В.Г. Галактионов // Успехи современной биологии.- 1992.- Т.112.- № 1,- С. 29-43.

18. Гамаюрова B.C. Иммобилизация и стабилизация ферментных препаратов липаз / B.C. Гамаюрова, М.Е. Зиновьева, Е.В. Елизарова, К.Л. Васина // Вестник Казанского технологического института.- 2007.- №2.- С. 103-108.

19. Геккелер К. Аналитические и препаративные лабораторные методы / Геккелер К., Экштайн X. // М.Химия,- 1994. 327 с.

20. Гельфанд М.С. «ДНК: от молекулы до генома, от биохимических озарений к алгоритмическому анализу» / Гельфанд М.С. Любецкий В.А. // Вестник РАН,- 2003.- № 11,- С. 963-970.

21. Герман А.Б. Получение и свойства иммобилизованной аминоацилазы Streptoverticillium olivoreticuli / А.Б. Герман, А.Д. Неклюдов // Прикладнаябиохимия и микробиология.- 2001.- Т. 37.- № 1.- С. 63-66.

22. Деев С.М. Иммуноглобулины / С.М. Деев // Белки и пептиды / Под ред. Иванова В.Т., Липкина В.М. М.- Наука. - 1995.- 448 с.

23. Деев С.М. Молекулярная иммунология. От генов иммуноглобулинов — к искусственным антителам, от антител к биомедицине / С.М. Деев // Биоорганическая химия.- 2000.- Т.26.- №10.- с. 784-786.

24. Детерман Г. Гель-хроматография / Г. Детерман // М. Мир.- 1970.- 250 с.

25. Джеске Д.Д. Иммуноглобулины: Строение и функции / Д.Д. Джеске, Д.Д. Кепра // Иммунология: в 3-х т. / Под. Ред. У. Пола // М. Мир.- 1987-1988.-Т. 1.-С. 204-254.

26. Дзантиев Б.Б. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа / Б.Б. Дзантиев, A.M. Егоров // Журн. Всесоюз. хим. общ-ва им. Д.И. Менделеева.- 1982.- Т. 24.- №4.- С. 442-449.

27. Дзантиев Б.Б. Комплексы вирусов с синтетическими полиэлектролитами и их взаимодействие с антителами / Б.Б. Дзантиев, А.Н., В.А. Изумрудов, А.Б. Зезин, А.Ф. Бобкова, A.M. Егоров И.Г. Атабеков, В.А. Кабанов//ДАН СССР.- 1990.- Т. 311.-№6.- С. 1482-1486.

28. Евстигнеева Р.П. Методы поиска антигенных детерминант для белков с известной первичной структурой / Р.П. Евстигнеева, М.Е. Палькеева // Биоорганическая химия.- 2000.- Т. 26.- № 4.- С. 243-262.

29. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова // М. Высш. шк.- 1991.278 с.

30. Еремин А. Н. Стабилизация разбавленных водных растворов пероксидазы / А.Н. Еремин // Прикладная биохимия и микробиология.- 2002.Т. 38,-№2.-С. 174-181.

31. Жоров О.В., Кириллова Н.М., Марцев С.П. Окислительное иодирование IgG кролика: локализация метки в Fc-фрагменте и эффекты модификации / О.В. Жоров, Н.М.Кириллова, С.П. Марцев // Биохимия.-1991.- вып. 5.-С. 828-837.

32. Закиров У.Б. Физиологичеки активные полимеры / У.Б. Закиров // Медицинский журнал Узбекистана.- 1984.- №9.- С. 54-60.

33. Иванов В.Т. Молекулярная биология в 2000 году: прогнозы, реальность и снова прогнозы / Иванов В.Т., Вьюгин Ю.А. // Биоорганическая химия.- Т. 26.-№10.- С.643-654.

34. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля /М. Медицина.-1987.- 742 с.

35. Кабанов В.А. Физико-химические основы и перспективы применения растворимых интерполиэлектролитных комплексов / Кабанов В.А. // Высокомолекулярные соединения.- 1994,- Т. 36.- №2.- С. 183-197.

36. Канюков В.Н. Материалы для современной медицины / В.Н. Канюков, А.Д. Стрекаловская, В.И. Килькинов //Оренбург. ГОУ ОГУ.- 2004.- Хс.

37. Карелин А.А. Пептидомика новое направление постгеномных технологий / А.А. Карелин, В.Т. Иванов // Вестник Российской академии наук.- 2005.- Т. 75.- № 2.- С. 139-156.

38. Кирш Ю.Э. Поли-Ы-винилпирролидон и другие поли->1-виниламиды / Ю.Э. Кирш // М. Наука.- 1998.- 210 с.

39. Киселев JI.JI. Геном человека и биология XXI века / Л.Л. Киселев // Вестник РАН.- 2000.- Т. 70.- №5.- С. 412-424.

40. Киселев Л.Л. Молекулярная биология от 1970 до 2000 и дальше. / Киселев ЛЛ. // Биоорганическая химия. 2000 г.- Т. 26,- №10.- С. 874-881.

41. Климович В.Б. Моноклональные антитела к подклассам IgG человека: получение и исследование их специфичности / В.Б. Климович, М.П. Самойлович, И.Ю. Крутецкая, С.Ф. Пашкова, Т.С. Котова // Иммунология.-1998.-№4.- С. 27-31.

42. Климович В.Б. Моноклональные антитела к подклассам IgG человека: эпитопная специфичность и применение в иммуноанализе / В.Б. Климович, М.П. Самойлович, И.Ю. Крутецкая, С.Ф. Пашкова // Иммунология.- 1998.- № 4,-С. 31-34.

43. Ковалев Е.И. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям / Е.И. Ковалев, О.Ю. Полевая //М.: Наука.- 1985.- 304 с.

44. Колчанов Н.А Молекулярная эволюция генетических систем / Н.А. Колчанов, В.В. Суслов, В.К. Шумный // Палеонтологический журнал.- 2003.-№6.- С. 58-71.

45. Коршак В.В. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений /В.В. Коршак, М.И. Штильман // М.: Наука.- 1984.261 с.

46. Кульберг А.Я. Антииммуноглобулины / А.Я. Кульберг // М. Медицина.- 1978.- 184 с.

47. Кэтти Д. Антитела. Методы. / Д. Кэтти, Ч. Райкундалия, Дж. Браун, Н.Р. Линг, Д. Гордон, Ж. Арвие, А.Ф. Уильяме. Под ред. Д. Кэтти. // Кн. 1,2. М.-Мир,- 1991.

48. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин // М. Высшая школа.- 1980.- 280 с.

49. Ларионова Н.И. Разработка микро- и наносистем доставки лекарственных средств / Н.И. Ларионова, Д. Дюшен, П. Кувре, М. Олливон, Р. Греф // Российский химический журнал.- 2008.- Т. LII.- № 1,- С. 48-56.

50. Любарев А.Е Изучение необратимой тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии / А.Е. Любарев, Б.И. Курганов // Успехи биологич. химии.- 2000.- Т. 40.- С. 43-84.

51. Макс Э.Э. Иммуноглобулины: молекулярная генетика / Э.Э. Макс // Иммунология: в 3-х т. / Под. Ред. У. Пола // М.Мир.- 1987- 1988. Т. 1- С. 255-315.

52. Маурер Г. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле / Г. Маурер // М. Мир.- 1971.- 247 с.

53. Можаев В.В. Химические, физические и биологические подходы к созданию стабилизированных ферментных катализаторов для биотехнологии /В.В. Можаев // Успехи химии.- 1987.- Вып. 10.- С. 1659 1692.

54. Москвичев Б.В. Иммобилизованные ферменты / Б.В. Москвичев, М.С. Поляк // Серпухов.- 1991.- 112 с.

55. Николаев А.Ф. Водорастворимые полимеры / А.Ф. Николаев, Г.И. Охрименко // Л. Химия.- 1979.- 56 с.

56. Огиевецкая М.М. Скорость эволюции белков и индукция иммуноглобулинов / М.М. Огиевецкая // Молекулярная биология.- 1978.-Т.12.- № 4.- С. 829-835.

57. Остерман JI. А. Исследование биологических макромолекул э л ектро фокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами / Л.А. Остерман // М. Наука.- 1983.- 304 с.

58. Панарин Е.Ф. Синтез и иммуномодулирующие свойства сополимеров N-винилпирролидона с винилсахаридами / Панарин Е.Ф., Иванова Н.П., Б.елохвостова А.Т., Потапенкова Л.С. // Химико-фармацевтический журнал.-2002.- Т. 36.- №4.- С. 19-22.

59. Панарин Е.Ф. Биологически активные полимерные наносистемы / Е.Ф. Панарин // Инновации.- 2008.- № 6(116).- С. 50-53.

60. Панов В. П. Принципы обеспечения вирусной безопасности продуктов крови / В.П. Панов // Химико-фармацевтический журнал.- Т. 38.- № 3.- С. 3947.

61. Петров Р.В. Иммунология и иммунохимия / Р.В. Петров, И.В. Березин // Журн. Всесоюз. хим. общ-ва им. Д.И. Менделеева.- 1982.- Т.24.- №4.- С. 362-368.

62. Петров Р.В. Иммунология и иммуногенетика / Р.В. Петров // М. Медицина.- 1976.- 338 с.

63. Петров Р.В. Иммунный ответ к искусственным антигенам / Р.В. Петров, P.M. Хаитов // Успехи современной биологии.- 1976.- Т. 88,- Вып. 3.- №6.- С. 330-342.

64. Петров Р.В. Иммуногенетика и искусственные антигены / Р.В. Петров, P.M. Хаитов, Р.И. Атауллаханов // М. Медицина,- 1983.- X с.

65. Петров Р.В. Искусственные антигены и вакцины / Р.В. Петров, В.А. Кабанов, P.M. Хаитов //Журнал всесоюзного химического общества им. Д.И. Менделеева.- 1988.- Т. XXXIII.- № 5.- С. 502-522.

66. Платэ Н.А. Физиологически активные полимеры и макромолекулярные терапевтические системы / Н.А. Платэ // Высокомолекулярные соединения. 1982.-№4.- С. 675-696.

67. Платэ Н.А. Физиологически активные полимеры. / Н.А. Платэ // М. Химия.- 1986.- 84 с.

68. Практическая химия белка / Под ред. А. Дарбре // М. Мир.- 1989.- 623с;

69. Ратнер В.А. Проблемы теории молекулярной эволюции / В.А. Ратнер,

70. A.А. Жарких, Н.А. Колчанов // Новосибирск.- Наука.- 1985.- 264 с.

71. Родионов С.Ю. Оптимизация процесса технологического выделения фльфа-фетопротеина человека и методы идентификации изоформ белка /С.Ю. Родионов, Д.А. Суховая, JI.P. Хорошева, Е.Г. Орлова, В.А. Черешнев,

72. B.В. Стариков // Биотехнология.- 2007.- № 2.- С. 8-12.

73. Свердлов Е.Д. ДНК в клетке: от молекулярной иконы к проблеме «Что есть жизнь?». / Свердлов Е.Д. // Вестник РАН.- 2003 г.- Т. 73.- №6,- С.- 497505.

74. Сидельковская Ф.П. Исследование гидратации поли-N-винилпирролидона методом ИК-спектроскопии. / Ф.П. Сидельковская, A.M. Сахаров, В.П. Панов // Химико-фармацевтический журнал.- 2000.- №8.1. C. 18-21.

75. Скоробогатько О.В. Влияние условий синтеза иммунолакказных коньюгатов на характеристики и состав получаемых соединений / О.В. Скоробогатько // Прикладная биохимия и микробиология.- 1994.- Т.ЗО.- №3.-С. 477-482.

76. Татаринов Л.П. Контуры современной теории биологической эволюции / Л.П. Татаринов //Вестник РАН.- 2005.- Т.75,- №1.- С. 36-39.

77. Татаринов JI.П. Современные тенденции в развитии филогенетических исследований / Л.П. Татаринов // Вестник РАН.- 2004.- Т.74.- №6.- С. 515523.

78. Тенникова Т.Б. Изучение физико химических свойств протеолитического фермента террилитина, модифицированного сополимером на основе винилпирролидона / Т.Б. Тенникова // Биохимия.-1980.- Т. 45.- №3.- С. 438 - 445.

79. Тернер М. Структура и функции антител / М. Тернер, Ф. Ричарде, Дж. Варга, Р. Розенстайн, У. Конигсберг, М. Стьюард, А. Файнстайн, Д. Бил // Под общей ред. Л. Глина, М. Стьюарда / М. Мир.- 1983.- 200 с.

80. Топчиева И.Н. Комплексы ПЭГа с белками / И.Н. Топчиева // Биохимия.- 1998.- Т. 63.-№11.-С. 1543-1546.

81. Тяги Р. Использование химической модификации и химического сшивания для стабилизации белков / Р. Тяги, М. Н. Гупта // Биохимия.- 1998.-№3 С. 395-407.

82. Флайшман Д.Б. Иммуноглобулины: аллотипы и идиотипы / Д.Б. Флайшман, Д.М. Дейви // Иммунология: в 3-х т. / Под. Ред. У. Пола // М.Мир.- 1987- 1988. Т. 1- С. 313-335.

83. Фомичева И.И. Иммуноглобулины американской норки: генетика, экспрессия, эволюция / И.И. Фомичева, О.Ю. Волкова // Новосибирск. Наука.- 1992.- 159 с.

84. Хаитов P.M. Вакцины нового поколения и проблемы биобезопасности / P.M. Хаитов // Цитокины и воспаление.- 2005.- №3.- С. 24-26.

85. Хохлова Т.Д. Влияние химии поверхности и размеров пор модифицированных силикагелей на адсорбцию овальбумина / Т.Д. Хохлова // Вестник Московского университета.- Сер. 2 Химия.- 2002.- Т.43.- №3.- С. 144-146.

86. Христофоров B.C. Исследование структурно-функциональных свойств иммуноглобулинов G и их фрагментов методом 'Н-ЯМР / B.C. Христофоров,

87. В.П. Кутышенко, В.П. Завьялов // Биоорганическая химия.- 1987.- Т. 13.- № 11.-С. 1446-1464.

88. Чард Т. Радиоиммунологические методы / Т. Чард // М. Мир.- 1981.248 с.

89. Чекнев С.Б. Конформационное состояние и антигенные характеристики у-глобулина человека, модифицированного связыванием катионов меди и цинка / С.Б. Чекнев, Е.А. Денисова, Е.Е. Бабаева, У.А. Воробьева, Э.М. Монгуш //Иммунология,- 2007.- №5.- С.274-280.

90. Ширяев Н.В. Эволюционное прошлое IgG млекопитающих в свете современных знаний о структуре и функционировании данной белковой молекулы /Ширяев Н.В. //Иммунология.- 2006.- №1.- С.58-60.

91. Штильман М.И. Полимеры в биологически активных системах / М.И. Штильман // Соросовский образовательный журнал.- 1998.- №5,- С. 48-53.

92. Штильман М.И. Полимерные селективные мембраны в медицине и биотехнологии / М.И. Штильман //М. ВНТИЦ.- 1987,- 101 с.

93. Arnason U. Mitogenopmic analyses provide new insights into cetacean origin and evolution / U. Arnason, A. Gullberg, A. Janke// Gene.- 2004.- V. 333.-P. 27-34.

94. Baker D. Protein structure prediction and structural genomics / D. Baker, A. Sali // Science.- 2001.- V. 294.- P. 93-96.

95. Balabushevich N.G. Polyelectrolyte assembling for protein microencapsulation / N.G. Balabushevich, O.V. Lebedeva, O.I. Vinogradova, N. I. Larionova // J. Drug Delivery Sci. Tech.- 2006.- V. 16 (4).- P. 315-319.

96. Berzofsky J.A. The concepts of crossreactivity and specificity in immunology / J.A. Berzofsky, A.N. Schechter // Molecular Immunology. 1981. -Vol.18.-№8.-P. 751-763.

97. Black C.M. Cross-reactivity of 75 monoclonal antibodies to human immunoglobulin to sera of non-human primates / C.M. Black, J.S. McDougal, R.C. Holman, B.L. Evatt, C.B. Reimer // Immunol. Lett.- 1993.- V. 37.- P. 207-213.

98. Blanden R. V. A Unifying Hypothesis for the Molecular Mechanism of Somatic Mutation and Gene Conversion in Rearranged Immunoglobulin Variable Genes / R. V.Blanden, E. J. Steele // Immunology, and Cell Biology.- 1998.- V. 76.-P. 288-293.

99. Burnouf T. Assessment of the viral safety of antivenoms fractionated from equine plasma / T. Burnouf, E. Griffiths, A. Padilla, S. Seddilc, M.A. Stephano, J.-M. Guetierrez // Biologicals.- 2004.- V. 32.- P. 115-128.

100. Casadevall A. New Concepts in Antibody-Mediated Immunity / A. Casadevall, L.-A Pirofski // Infect. Imrnun.- 2004.- V. 72.- № 11,- P. 6191- 6196.

101. Chen C. Immunoglobulin Heavy Chain Gene Replacement: A Mechanism of Receptor Editing / C.Chen, Z. Nagy, E. L. Prak, M. Weigert // Immunity.-1995.- V. 3.-P. 747-755.

102. Chersi A. Partial primary structure of the immunoglobulin light chain constant region of a single rabbit of b5 allotype / A. Chersi, C.B. Alexander, R. Mage // Mol. Immunol.- 1980.- V.-17.-P. 1515-1523.

103. Chothia C. Canonical structures for the hypervariable loops of immunoglobulins / C. Chothia, A.M. Lesk // J. Mol. Biol.- 1987,- V. 196,- P. 901917.

104. Chothia С. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions / C. Chothia, A.M. Lesk, A. Tramontano, M. Levitt, S.J. Smith-Gill, G. Air, S. Sheriff, E.A. Padlan, D. Davies, W.R. Tulip //Nature.- 1989.- V. 342.- P.877-883.

105. Coloma M.J. The hinge as a spacer contributes to covalent assembly and is required for function of IgG / Coloma M.J., Trinh K.R., Wims L.A., Morrison S.L. // The Journal of Immunology.- 1997. V. 158.- Issue 2.- P. 733-740.

106. Copestake D.E. Affinity liquid chromatography method for the quantification of immunoglobulin G in bovine colostrum powders / D.E. Copestake, H.E. Indyk, D.E. Otter // J. AOAC Int.- 2006.- V. 85.- № 5.- P. 12491256.

107. Curling J.M. Methods of Plasma Protein Fractionation / J.M. Curling, L.-G. Falksveden, H. Suomela, G.H. Berglof, R. Eketorp, M.J. Harvey // London: Acad. Press.- 1980.- 326 p.

108. Curtain C.C. Evolution of the immunoglobulin antigens in the ruminantia / C.C. Curtain, H.H. Fudenberg // Biochemical Genetics. 1973. - Vol.8. - №3. -P. 301-308.

109. Dall'Acqua W.F. Modulation of the Effector Function of a Human IgGi through Engineering of Its Hinge Region / W.F. Dall'Acqua, K.E. Cook, M.M. Damschroder, R.M. Woods, H. Wu // J. Immunol.- 2006.- V. 177.- P. 1129-1138.

110. Dangl J.L. Segmental flexibility and complement fixation of genetically engineered chimeric human, rabbit and mouse antibodies / J.L. Dangl, T.G Wensel, S.L. Morrison, L. Stryer, L.A. Herzenberg, V.T. Oi //EMBO J.- 1988.- V.7.- № 7.-P. 1989-1994.

111. De Genst E. Chemical basis for the affinity maturation of a camel single domain antibody / E. De Genst, F. Handelberg, A. Van Meirhaeghe, R. Vynck, R. Loris, L. Wyns, S. Muyldermans // J. Biol. Chem.- 2004.- V. 279.- P. 5359353601.

112. Dresser D.W. Immunization of experimental analysis / D.W. Dresser // J. Immunol. Meth.- 1987.- V. 97.- №1.- P. 765-798.

113. Duncan A.R. The binding site for Clq on IgG / A.R. Duncan, G. Winter //Nature.- 1988.- V. 332.- № 6166.- P. 738-740.

114. Duncan A.R. Localization of the binding site for the human high-affinity Fc receptor on IgG / A.R. Duncan, J.M. Woof, L.J. Partridge, D.R. Burton, G. Winter // Nature.- 1988.- V. 332.- № 6164,- P. 563-564.

115. Ellison J. Linkage and sequence homology of two immunoglobulin у heavy chain constant region genes / J. Ellison, L. Hood // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1982.-V. 79,-P. 1984- 1988.

116. Foote J. Conformational isomerism and the diversity of antibodies / J. Foote, C. Milstein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994.- V. 91.- №22.- P. 1037010374.

117. Frangione B. Structural studies of immunoglobulin G / B. Frangione, C. Milstien, J.R.L. Pink // Nature.- 1969.- V. 221.- P. 145 148.

118. Garfin D.E. One-Dimensional Gel Electroforesis / D.E. Garfm // Meth. Enzymol.- 1990.- V. 182,- P. 425-441.

119. Goel M. Plasticity within the antigen-combining site may manifest as molecular mimicry in the humoral immune response / M. Goel, L. Krishnan, S. Kaur, K.J. Kaur, D.M. Salunke // J. Immunol.- 2004.- V. 173.- P. 7358-7367.

120. Gombotz W.R. Biodegradable Polymers for Protein and Peptide Drug Delivery / W.R. Gombotz, D.K. Pettit // Bioconjugate Chem.- 1995.- V. 6.- № 3.-P. 332-351.

121. Graaf A.J. Nonnatural Amino Acids for Site-Specific Protein Conjugation / A.J. Graaf, M. Kooijman, W.E. Hennink, E. Mastrobattista // Bioconjugate Chem.-2008,- V. 15.- № 10.- P. 451-456.

122. Greiner A. Biohybrid nanosystems with polymer nanofibers and nanotubes / A. Greiner . J. H. Wendorff. A. L. Yarin . E. Zussman // Applied Microbiology and Biotechnology.- 2006.- V. 71.- №4.- P. 387-393.

123. Guddat L.W. Intramolecular signaling upon complexation / L.W. Guddat, L. Shan, Z.-Ch. Fan, K.N. Andersen, R. Rosauer, D.S. Linthicum, A.B. Edmundson // Faseb J.- 1995.- V. 9.- P. 101-106.

124. Hadge D. Evolution of low molecular weight immunoglobulins / D. Hadge, H. Ambrosius // Developmental and comparative immunology.- 1986.-V.10.-P. 377-385.

125. Hansen G. Structural Isomers of bis-PNA Bound to a Target in Duplex DNA / G. Hansen, T. Bentin // J. Mol. Biol.- 2001.- V.307.- P. 67-74.

126. Hegyi H. The relationship between protein structure and function: a comprehensive survey with application to the yeast genome / H. Hegyi, M. Gerstein // J. Mol. Biol.- 1999.- V. 288.- P. 147-164.

127. Hober S. Protein A chromatography for antibody pyrification / S. Hober, K. Nord, M. Linhult // J. Chromatogr. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.- 2006.-V.51.- № 3.- P. 154-161.

128. Horgan C. Effect of H chain V region on complement activation by immobilized immune complexes / C. Horgan, K. Brown, S.H. Pincus // J. Immunol.- 1992.-V. 149.-P. 127-135.

129. Josic D. Analytical and Preparative Methods for Purification of Antibodies / D. Josic, Y.-P. Lim // Food technol. Biotechnol.- 2001,- V. 39.- № 3.- P. 215-226.

130. Kaivarainen A.I. Hapten-induced changes in pig anti-dansyl antibodies revealed by EPR spectra of spin-labelled antibodies / A.I. Kaivarainen, S.P. Rozhkov, Yu.K. Sykulev, V.V. Lavrent'yev, F. Franek // Immunol. Lett.- 1981.- V. 3.-№l.-P. 5-11.

131. Keitel T. Crystallographic analysis of anti-p24 (HIV-1) monoclonal antibody cross-reactivity and polyspecificity / T. Keitel, A. Kramer, H. Wessner, C. Schlotz, J. Schneider-Mergener, W. Hohne // Cell.- 1997,- V. 91.- P. 811-820.

132. Khalikova E. Microbial Dextran-Hydrolyzing Enzymes: Fundamentals and Applications / E. Khalikova, P. Susi, T. Korpela // Microbiol. Mol. Biol. Rev.-2005.- V. 69.- № 2.- P. 306-325.

133. Komatsu T. Self-organized lipid-porphyrin bilayer membrance in vasicular form: nano-structure, photophysical properties and dioxygen coordination / T. Komatsu, A. Nakagawa, E. Tsuchida // Chem. Eur. J.- 2002,- V. 8.- P. 5469-5480.

134. Krishnan L. Paratope Plasticity in Diverse Modes Facilitates Molecular Mimicry in Antibody Response / L. Krishnan, S. Lomash, B.P.J. Raj, K.J. Kaur, D.M. Salunke // J. Immunol.- 2007.- V. 178.- P. 7923-7931.

135. Kurosawa Y. Organization, structure and assembly of immunoglobulin heavy chain diversity DNA segments / Y. Kurosawa, S. Tonegawa // J. Exp. Med.-1982.-V. 155.- P. 201.

136. Kurstak E. Enzyme Immunodiagnosis / E. Kurstak // London: Acad. Press.- 1986.-235 p.

137. Kwas M. Use of electrophoresis in polyacrylomide gel (SDS-PAGE) for evaluating IgG structure the main component of human intravenous immunoglobulin // M. Kwas, D. Buchole, J. Slusarzyk // Med. Dosw Mikrobiol.-2000.- V. 52.- № 3.- P. 301-309.

138. Li S. Liposome-encapsulated actin-hemoglobin (LEAcHb) articial blood substitutes / S. Li, J. Nickels, A.F. Palmer // Biomaterials.- 2005.- V. 26.- P. 37593769.

139. Lopes de Menezes D.E. Selective targeting of immunoliposomal doxorobicin against human multiple myeloma in vitro and ex vivo / D.E. Lopes de Menezes, L.M. Pilarski, A.R. Belch, T.M. Alien // Biochim. Biophys. Acta.- 200.-V. 1466 (1-2): 205-20.

140. Manivel V. Maturation of an antibody response is governed by modulations in flexibility of the antigen-conbining site / V. Manivel, N.C. Sahoo, D.M. Salunke, K.V. Rao // Immunity.- 2000.- V. 13.- P. 611-620.

141. Martin L.G. Serum antibodies against human albumin in critically ill and healthy dogs / L.G. Martin, T.Y. Luther, D.C. Alperin, J.M. Gay, S.A. Hines // J. Am. Vet. Med. Assoc.- 2008.- V. 232.- № 7.- P. 1004-1009.

142. Mc Kinney M.M A sempl, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid / M.M. Mc Kinney, A. Parkinson // J. Immunol. Meth.- 1987.- V. 96.- № 2.- P. 271-278.

143. Mathews K.A. The therapeutic use of 25% human serum albumin in critically ill dogs and cats / K.A. Mathews // Vet. Clin. North. Am. Small. Anim. Pract.- 2008.- V. 38.- № 3.- P. 595-605.

144. Michaelson Т.Е., Frangione В., Franklin E.C. Primary structure of the "hindge" region of human IgG3 / Т.Е. Michaelson, B. Frangione, E.C. Franklin // J. Biol. Chem.- 1977.- V. 252.- P. 883-889.

145. Mimura Y. Role of oligosaccharide residues of IgGl-Fc in Fc gamma Rllb binding / Y. Mimura, P. Sondermann, R. Ghirlando, J. Lund, S.P. Young, M. Goodall, R. Jefferis // J. Biol. Chem.- 2001.- V. 276.- № 49.- P. 45539-45547.

146. Montoya A. Long-term storage of peroxidase-labeled immunoglobulins for use in enzyme immunoassay / A. Montoya, J.V. Castell // J. Immunol. Methods.- 1987.- V. 99.- № 1.- P. 13-20.

147. Nakagawa A. O2 binding to human serum albumin incorporating iron porphyrin with a covalently linked metyl-L-histidine isomer / A. Nakagawa, T. Komatsu, M. Iizuka, E. Tsuchida // Bioconjugate Chem.- 2008.- V. 19.- P. 581584.

148. Nakane P. K. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation / P. K. Nakane, A. ICawaoi // J. Histochem. Cytochem.- 1974.- V. 22.- № 12.- P. 1084-1091.

149. Nisonoff A. Allotypes of rabbit, human ana mouse immunoglobulins / A. Nisonoff, J.E. Hopper, S.B. Spring // Antibody Molecule / N.-Y. Academic Press.-1975.-P. 346-406.

150. Nollens H.H. Cross-Reactivity between Immunoglobulin G Antibodies of Whales and Dolphins Correlates with Evolutinary Distance // H.H. Nollens, C.

151. Ruiz, M.T. Walsh, F.M.D. Gulland, G. Bossart, E.D. Jensen, J.F. McBain, J.F.X. Wellehan // Ciin. Vaccine Immunol.- 2008.- V. 15.- № 10,- P. 1547-1554.

152. Olio R. Mouse immunoglobulin allotypes: Postduplication divergence of y2a and y2b chain genes / R. Olio, F. Rougeon // Nature.- 1982.- V.- 296.- P. 761763.

153. Pace C.N. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein / C.N. Pace // Protein Sci.- 1995.- № 4.- P. 2411-2423.

154. Pessela B.C. Simple pyrification of immunoglobulins from whey proteins concentrate / B.C. Pessela, R. Torres, P. Batalla, M. Fuentes, C. Mateo, R. Fernandez-Lafuente, J.M. Guisan // Biotechnol. Prog.- 2006.- V. 22.- № 2.- P. 590594.

155. Poljak R.J. X-ray diffraction studies of immunoglobulins I R.J. Poljak II Adv. Immunol.- 1975.- 21.- P. 1-33.

156. Porter R.R. The hydrolysis of rabbit y-globulin and antibodies with crystalline papain / R.R. Porter // Biochemistry.- 1959.- № 73.- P. 119-126.

157. Putnam F.W. The Plasma Proteins: Structure, Function and Genetic Control. Vol. 3, 2d ed., Academic Press, NY 1977

158. Qi Y. Chromatography on DEAE ion-exchange and Protein С affinity columns in tandem for the separation and purification of proteins / Y. Qi, Z. Yan, J. Huang//J. Biochem. Biophys. Methods.- 2001.- V.49.~ № 1-3.- P. 263-273.

159. Rameez S. Biocompatible and biodegradable polymersome encapsulated hemoglobin: a potential oxygen carrier / S. Rameez, H. Alosta, A.F. Palmer // Bioconjugate Chem.- 2008.- V. 19.- P. 1025-1032.

160. Rhodes D.G. Determination of Purity / D.G. Rhodes, T.M. // Laue Methods Enzymol. / Ed. M.P. Deutscher. London. Acad. Press.- 1990.- V. 182.- P. 555-586.

161. Sazinsky S.L. Aglycosylated immunoglobulin Gj variants productively engage activating Fc receptors / S.L. Sazinsky, R.G. Ott, N.W. Silver, B. Tidor, J.V. Ravetch, K.D. Wittrup //PNAS.- 2008.- V. 105.- № 51.- P. 20167-20172.

162. Shimizu M. Comparative studies on molecular stability of immunoglobulin G from different species/ M. Shimizu, H. Nagashima, K. Hashimoto // Сотр. Biochem. Physiol.- 1993.-V. 106B.-№2.-P. 255-261.

163. Shneider R. The HSSP database of protein structure-sequence aligments / R. Shneider, A. de Daruvar, C. Sander // Nucl. Acids Res.- 1997.- V. 25.- P. 226230.

164. Schreiber A. Artiodactylan phylogeny: An immunogenetic study based on comparative determinant analysis / A. Schreiber, D. Erker // Expl. Clin. Immunogenet.- 1990.- № 7.- P. 234-243.

165. Sisti A.M. Preparation of lyophilized and liquid intravenous immunoglobulin G: development and scale-up / A.M. Sisti, M.S. Vitali, M.J. Manfredi, J.A. Zarzur // Vox Sang.- 2001.- V. 80.- № 4.- P. 216-224.

166. Steele E. J. Mechanism of Antigen-Driven Somatic Hypermutation of Rearranged Immunoglobulin V(D)J Genes in the Mouse / E. J. Steele, H. S. Rothenfluh, R. V. Blanden // Immunology and Cell Biology.- 1997.- V. 75.- P. 8295.

167. Steele E. How Have Antibody Genes Evolved? / E. Steele, R. Blanden, H. Rothenfluh // Australasian Science.- 1996.- V. 17.- №4.- P. 46-49.

168. Steinbuch M. Protein Fractionanion by Ammonium Silphate Rivanol and Caprylic Acid Precipitation / M. Steinbuch// Methods of Plasma Protein Fractionation / Ed. J. M. Curling. London: Acad. Press.- 1980.- P. 35-56.

169. Shtilman M.I. Immobilization on Polymers / M.I. Shtilman // Utreht. Tokyo.VSP.- 1993.- 496 p.

170. Shtilman M.I Polymeryc fungicides (Review) / M.I. Shtilman, M. Tzatzarakis , M.M. Lotter //Polymer Sci.- Ser. В.- № 41,- P. 1367-1375.

171. Fractionation / Ed. J. Curling London. Acad. Press.- 1980.- P. 107-116.

172. Tanaka K. High quality human immunoglobulin G purified from Cohn fractions by liquid chromatography / K. Tanaka, E. Sawatani, G.A. Dias, E.M. Shigueoka, T.C. Campos, H.C. Nakao, F. Arashiro // Braz. J. Med. Biol. Res.-2000,- V. 33.-№ l.-P. 27-30.

173. Teichmann S.A. Determination of protein function, evolution and interaction by structural genomics / S.A. Teichmann, A.G. Murzin, C. Chothia // Curr. Opin. Struct. Biol.- 2001.- V. 11,- P. 354-363.

174. The Human IgG Subclasses. Molecular Analysis of Structure, Function and Relation / Ed. F. Shakib.- Oxford.- 1990.

175. Tijssen P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays / P. Tijssen // Amsterdam. Elsevier.- 1985.- 548 p.

176. Tonegawa S. Somatic recombination and mosaic structure of immunoglobulin gene / S. Tonegawa// Harvey. Lectures.- 1981.- P. 61-75.

177. Tonegawa S. Somatic Generation of Antibody Diversity / S. Tonegawa// Nature.- 1983.- V. 302.- P. 575-581.

178. Veerassamy S. A transition probability model for amino acid substitutions from blocks / S. Veerassamy, A. Smith, E.R. Tillier // J. Comput. Biol.- 2003.- V. 10.-P. 997-1010.

179. Verkhovsky O.A. Determination of cross-reactive (common) epitopes of animal and human immunoglobulins using monoclonal antibodies / O.A. Verkhovsky, Yu.N. Fedorov // Russian Journal of Immunology.- 1997.- V. 2. № l.-P. 24-28.

180. Vidarte L. Serine 132 Is the C3 Covalent Attachment Point on the CHI Domain of Human IgGl / L. Vidarte, C. Pastor, S. Mas, A.B. Blazquez, V. de los Rios, R. Guerrero, F. Vivanco // J. Biol.Chem.- 2001.- V. 276.- № 41.- P. 3821738223.

181. Vlugt-Wensink K.D.F. Preclinical and Clinical In Vitro In Vivo Correlation of an hGH Dextran Microsphere Formulation / K.D.F. Vlugt-Wensink, R. de Vrueh // Pharm. Res.- 2007.- V.24.- № 12,- P. 2239-2248.

182. Von Behren L.A. Protective effect of poly-2-vinylpyridine-N-oxide on susceptibility of silica-treated mice to experimental histoplasmosis / L.A. Von Behren, S. Chaudhary, S. Rabinovich // Infect. Immun.- 1983.- V. 42.- №2.-P. 818-823.

183. Wang J. Functional Activities and Immunoglobulin Variable Regions of Human and Murine Monoclonal Antibodies Specific for the PI.7 PorA Protein Loop of Neisseria meningitides / J. Wang, G.A. Jarvis, M. Achtman, E.

184. Rosenqvist, Т.Е. Michaelsen, A. Aase, J.M. Griffiss // Infect. Immun.- 2000.- V. 68.- №4.- P. 1871- 1878.

185. Wedemayer G.J. Structural Insights into the Evolution of an Antibody Combining Site / Wedemayer G.J., Pattern P.A., Wang L.H., Schultze P.G., Stevens R.C. // Science.- 1997.- V. 276.- P. 1665-1669.

186. Weiller G. F. Recombination Signature of Germline Immunoglobulin Variable Genes / G. F. Weiller, H. S. Rothenfluh, P. Zylstra, L. M. Gay, H. Averdunk, E. J. Steele, R. V. Blanden // Immunology and Cell Biology.- 1998.- V. 76.- P. 179-185.

187. Yarin A. L. / Material encapsulation and transport in core-shell micro/nanofibers, polymer and carbon nanotubes and micro/nanochannels / A.L. Yarin, E. Zussman, J. H. Wendorff, A. Greiner // Journal of Materials Chemistry.-2007.- V.17.-P. 2585-2599.

188. Zubtsov D.A. Effect of mixing on reaction-diffusion kinetics for protein hydrogel-based microchips / D.A. Zubtsov, S.M. Ivanov, A.Yu. Rubina, E.I. Dementieva, V.R. Chechetkin, A.S. Zasedatelev //Journal of Biotechnology.-2006.- V. 122.-P. 16-27.

Информация о работе

Нестерова, Ольга Юрьевна
кандидата биологических наук
Ижевск, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Биохимические характеристики нативных и модифицированных форм IgG некоторых представителей семейства псовых - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы