Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические аспекты влияния окислительно-восстановительных факторов среды на рыб

ВАК РФ 03.00.10, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Биохимические аспекты влияния окислительно-восстановительных факторов среды на рыб"

На правах рукописи

'I , ' <п'

ИВАНЁХА Елена Викторовна

БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЛИЯНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ФАКТОРОВ

СРЕДЫ НА РЫБ

Специальность 03.00.10 - ихтиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте пресноводного рыбного хозяйства (ВНИИПРХ)

Научный руководитель: доктор химических наук,

старший научный сотрудник СКУРЛАТОВ Ю.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник ГОЛОВИНА Н.А.

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник БЕКИНА E.H.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО)

Защита состоится -Lf- 0ЖС<Л]Л 1998 года в И_

часов на

заседании диссертационного совета Д 117.04.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте пресноводного рыбного хозяйства (ВНИИПРХ) по адресу: 141821, Московская обл., Дмитровский район, пос. Рыбное

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИПРХ

Автореферат разослан ' НО^ё^О к.^^ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Трямкина С.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Наиболее безопасные для окружающей среды методы очистки воды связаны с применением экологически "чистых" окислителей - перекиси водорода и озона, которые являются природными соединениями и не загрязняют воду побочными высокотоксичными продуктами восстановления. В рыбоводстве эти окислители могут быть полезны не только для очистки и дезинфекции воды, но и для лечебно-профилактической обработки рыб, обеззараживания рыбоводного оборудования и инвентаря (Colberg, Lingg, 1978; Сапожников, 1991; Мирзоева, 1995; Mitchell, Collins, 1997). Перекись водорода обладает рядом технологических преимуществ по сравнению с озоном, (Беренблит, 1984; Селюков, Тринко, 1988), а также на 3 порядка меньшей токсичностью для рыб, чем озон (Метелев и др., 1971).

Перекись водорода образуется в клетках живых организмов, ее стационарная концентрация в клетке достигает 10s-107 М; физиологические концентрации перекиси водорода нетоксичны и необходимы для некоторых биохимических процессов (Лукьянова и др., 1982). Перекись водорода не является чужеродным соединением для среды обитания гидробионтов. Содержание перекиси водорода в водоемах достигает 200 мкг/л (Синельников, 1980), но обычно не превышает 310 ® М, или 102 мкг/л (Штамм, 1988).

Однако вопрос о возможности применения перекиси водорода в рыбоводстве остается открытым. С одной стороны, именно высокая окисляющая способность перекиси водорода позволяет широко использовать ее в зарубежной практике очистки сточных вод от большого числа загрязняющих веществ (Селюков, Тринко, 1988). Начатые в начале 90-х гг. исследования американских ученых к настоящему времени доказали, что этот окислитель очень перспективен как эффективный фунгицид, бактерицид и паразитоцид для обработки рыбы при содержании в емкостях и при транспортировке (Mitchell, Collins, 1997). С другой стороны, высокая эффективность перекиси водорода как окислителя при концентрациях, превышающих физиологические, может оказаться неблагоприятной для рыб. Есть данные, что перекись водорода может вызывать лизис эритроцитов, конверсию гемоглобина в метгемоглобин (Лукьянова и др., 1982; Мецлер, 1980), окислительную деградацию гемоглобина (Mills, 1957; Пак и др., 1986), а также окисление тиолов и метионильных групп белков, ингибирование некоторых ферментов, усиление свободнорадикальных процессов перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот, разрушение цитохрома Р-450 (Владимиров, Арчаков, 1972; Фридович, 1979). Эти результаты получены в основном на изолированных клетках или органах теплокровных животных.

Влиянию перекиси водорода на рыб посвящены единичные работы. Так, при терапевтическом применении перекиси водорода учитывалась только

выживаемость рыб (Mitchell, Collins, 1997). В двух отечественных работах установлены концентрации перекиси водорода, при которых появляются изменения а эритропоззе сеголетков карпа, гематомы на жабрах у личинок вьюна, повышается уровень свободнорадикальных процессов в тканях личинок (Верещагин, 1988), снижается электрическая активность обонятельной луковицы рыб (Каплан и др., 1988).

Для комплексной оценки методов детоксикации и дезинфекции воды с помощью перекиси водорода этого недостаточно. Отсутствуют данные о влиянии перекиси водорода на наиболее чувствительные к действию окислителей физиолого-биохимические показатели рыб.

Кроме того, недостаточно исследованы возможности использования перекиси водорода для очистки воды от токсичных для рыб нитритов и сульфидов. Нитриты являются одним из основных токсичных факторов в установках индустриального рыбоводства с рециркуляцией воды. Суммарное содержание сульфидов в артезианской воде достигает 10 мг/л в пересчете на H2S (Вехотко и др., 1974), тогда как безопасные для рыб концентрации сероводорода находятся на уровне мкг/л (Смит мл., 1979). Нитриты могут окислять гемоглобин в крови рыб до метгемоглобина (Руссо, 1981). Иногда встречается также мнение об аналогичном действии на рыб нитратов (Шахмурзов, 1991), являющихся продуктом окисления нитритов перекисью водорода. Сероводород способен блокировать гемоглобин (Хочачка, Сомеро, 1988), однако действие сероводорода на гемоглобин в крови рыб не изучено. Одновременное присутствие в воде нескольких соединений, оказывающих отрицательный эффект на одни и те же гематологические показатели, может оказаться критическим для рыб.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в определении диапазона безвредных для рыб и наиболее эффективных для очистки воды от нитритов и сульфидов концентраций перекиси водорода. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- изучить влияние перекиси водорода в диапазоне концентраций от физиологических до лечебно-профилактических при кратковременном и длительном воздействии

- на содержание метгемоглобина, гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, гемолиз и пероксидазную активность в крови рыб;

- на уровень перекисного окисления липидов в тканях рыб и содержание цитохрома Р-450 в гепатопанкреасе;

- установить эффективные для очистки воды от нитритов концентрации перекиси водорода и изучить суммарное влияние нитритов и перекиси водорода на гематологические показатели рыб;

- изучить влияние нитратов на содержание метгемоглобина, гемоглобина и гемолиз в крови рыб;

- изучить влияние сульфидов на содержание дериватов гемоглобина в крови рыб;

- установить эффективные для очистки воды от сульфидов концентрации перекиси водорода.

Научная новизна. Впервые исследовано влияние на рыб перекиси водорода в широком диапазоне концентраций, которое оценивалось по комплексу физиолого-биохимических показателей, способных служить наиболее ранними диагностическими признаками токсического действия перекиси водорода. Установлены наименьшие концентрации перекиси водорода, вызывающие изменения гематологических и биохимических показателей карпов. Впервые изучено влияние сульфидов на гемоглобин в крови рыб. Показано, что метгемоглобинемия не является причиной токсичности растворенных в водной среде нитратов для карпов.

Практическое значение. Установлены безопасные для рыб концентрации перекиси водорода, пригодные для очистки воды. Установлены эффективные для окисления нитритов и сульфидов дозы перекиси водорода. Показано, что перекись водорода может предотвращать или снижать токсическое действие нитритов на рыб. Показано, что применение перекиси водорода на ранних стадиях отравления карпов сульфидами позволяет снять симптомы токсикоза и предотвратить гибель рыб.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на

I Всесоюзной конференции по рыбохозяйственной токсикологии (Рига, 1988),

II Симпозиуме по экологической биохимии рыб (Ростов Великий, 1990), I Международной школе по экологической химии водной среды (Алма-Ата, 1990).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста и состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа содержит 12 таблиц, 8 рисунков. Список литературы вхлючает 189 источников, в том числе 79 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ ВОДНОЙ

СРЕДЫ

И ИХ РОЛЬ В ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ (обзор литературы)

Перекись водорода широко применяется в зарубежной практике очистки сточных вод. Перекись водорода позволяет эффективно очищать воду от соединений азота и серы, металлов, хлора, фенолов, ПАВ, красителей и др.(Максин и др., 1986; Селюков, Тринко, 1988), в сочетании с ферри-ионами и УФ-светом используется для разложения полихлорированных бифенилов (Pignatello, Chapa, 1994). Содержание перекиси водорода естественного происхождения в водоемах определяется динамикой фотохимических и биохимических процессов ее образования и разрушения. Большой вклад в

образование перекиси водорода вносят зеленые и диатомовые микроводоросли, а также некоторые виды бактерий (Pat Patterson, Myers, 1973; Сычев и др., 1983; Palenic, Morel, 1985; Штамм, 1988; Батовская и др., 1988; Штамм и др., 1991; Иванов и др., 1997). Перекись водорода естественного происхождения играет важную роль в осуществлении радикальных процессов самоочищения (Болдырева и др., 1987; Скурлатов, 1988; Эрнестова, 1988). Перекись водорода относится к нормальным продуктам обмена веществ, необходимым для осуществления разнообразных биохимических реакций (Фридович, 1979; Лукьянова и др., 1982; Голиковидр., 1986). При увеличении продукции перекиси водорода в клетках живых организмов может проявляться токсическое действие окислителя. Обсуждаются возможные механизмы токсичности перекиси водорода и механизмы защиты. В США в настоящее время разрешено применение перекиси водорода в качестве фунгицида для обработки рыб всех видов и на всех жизненных стадиях, включая икру. Для лечебно-профилактической обработки рыбы от эктопаразитов при температурах 10°С-16°С и экспозициях от А до 60 минут эффективны концентрации перекиси водорода от 50 до 5000 мг/л (Mitchell, Collins, 1997). Токсичность перекиси водорода зависела от вида и возраста рыб и быстро повышалась при повышении температуры. LD50% при экспозиции 1 час изменялась от 180 мг/л при 22°С до 1260-5000 мг/л при 12°С (Mitchell, Collins, 1997). Известно, что внесение в воду зимовальных бассейнов перекиси водорода и лерманганата калия замедляло рост численности железобактерий и тем самым повышало выживаемость карпов (Белковский, 1988).

Окисленные формы минерального азота представлены в водоемах нитритами и нитратами. В индустриальном рыбоводстве с системами рециркуляции воды процесс нитрификации используется для снижения содержания аммония в воде; при нарушении функционирования второй стадии нитрификации в воде УЗВ накапливаются большие количества нитритов (Руссо, Турстон,1979). Одним из механизмов токсичности нитритов для рыб является метгемоглобинемия (Cameron, 1971; Руссо, Турстон, 1979; Huey et al., 1980; Руссо, 1981; Amano et al., 1981).

Восстановительные факторы водной среды - сероводород и сульфиды - в поверхностных водах образуются в восстановительных процессах при бактериальном разложении и биохимическом окислении органического вещества; наиболее интенсивно эти процессы протекают в подземных водах и придонных слоях водоемов в условиях слабого перемешивания воды и дефицита кислорода. Много сульфидов в сточных водах. При разложении органического вещества ила образуется очень много сероводорода, причем разложение происходит не только летом, но и подо льдом (Метелев и др., 1971). Сероводород может получаться из сульфида железа под действием серной кислоты, образующейся при окислении сульфида железа кислородом (Szollosi, Vamos, 1975). Сероводород и сульфиды очень токсичны для рыб и

менее токсичны для других гидробионтов (Метелев и др., 1971; Oseid, Smith, 1974; Smith et al., 1976; Reynolds, Haines, 1980). Уровни как остро-, так и хронически токсичных для рыб концентраций сероводорода оказываются намного ниже концентраций этого восстановителя, обычно обнаруживаемых в загрязненных водоемах (Смит, 1979). Аэрация не обеспечивает надлежащей очистки воды от сульфидов, в ней остается много гидросульфидов, в сети водоподачи происходит отложение сульфида железа (Вехотко и др., 1974).

Глава II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Исследования по теме диссертации были выполнены за период с 1984 по 1991 гг. в аквариальной лаборатории токсикологии ВНИИПРХ. Объектами исследований служили сеголетки и годовики карпа (Cyprinus carpió L.) массой 18-25 г из прудов ЦЭО ВНИИПРХ.

Содержание растворенного кислорода, температура и pH воды контролировались гидротестером фирмы "Horiba". Содержание нитритов и аммонийного азота в воде определяли колориметрическими методами с реактивом Грисса и реактивом Несслера, соответственно (Руководство по химическому анализу поверхностных вод суши, 1977). Концентрацию нитратов измеряли прямым УФ-спектрофотометрическим методом (Moore, 1975), перекиси водорода - модифицированным пероксидазным методом (Mottola, 1970; Эрнестова, 1988). Для определения сульфидов использовали качественный метод со свинцово-уксусной бумагой, титрометрический метод (Методы определения вредных веществ в воде водоемов, 1981), а также спектрофотометрический метод (Буникене и др., 1968).

Кровь отбирали из хвостовой артерии рыб пастеровскими пипетками, обработанными раствором гепарина (1:1000).

Содержание метгемоглобина, сульфгемоглобина и гемоглобина в крови рыб определяли микроспектрофотометрическим методом Кушаковского (Биохимические методы анализа в клинике, 1969), гемолиз оценивали, измеряя содержание гемоглобина в сыворотке крови стандартным гемиглобинцианидным методом (Турецкий и др., 1990), содержание эритроцитов и лейкоцитов определяли на гемоцитометре ГЦМК-3, пероксидазную активность крови - колориметрическим методом с красителем индигокармином (Попов, Нейковска, 1971).

Ткани рыб после цервикальной диссекции немедленно извлекали и гомогенизировали или замораживали в жидком азоте.

Концентрацию белка в микросомах гепатопанкреаса определяли колориметрическим биуретовым методом (Практикум по биохимии, 1989 ). Содержание цитохрома Р-450 в гепатопанкреасе определяли по методу Omura, Sato (1964).

Уровень лерекисного окисления липидов в жабрах, мышцах и гепатопанкреасе рыб оценивали по содержанию малонового альдегида (МДА),

который определяли по образованию окрашенного продукта с 2-тиобарбитуровой кислотой (Владимиров, Арчаков, 1972).

При получении гематологических и биохимических показателей рыб минимальная выборка составляла 20 экземпляров.

Опыты проводились в двух-четырех повторностях. Результаты всех анализов обработаны статистически, достоверность различий между вариантами определена по критерию Стьюдента (Зайцев, 1973).

За период работы исследовано около 4000 рыб, выполнено около 10000 гематологических, 2000 биохимических и 25000 гидрохимических анализов.

Глава III. ВЛИЯНИЕ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА НАФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ РЫБ.

Наименьшая из исследуемых концентраций перекиси водорода соответствовала концентрации этого окислителя, обычно встречающейся в водоемах (Штамм, 1988), наибольшая - средней из рекомендуемого для обработки рыб диапазона лечебно-профилактических концентраций перекиси водорода (Mitchell, Collins, 1997). Выбор показателей для оценки действия присутствующей в среде обитания рыб перекиси водорода был обусловлен встречающимися в литературе данными о влиянии окислителя, а также важностью показателя для оценки физиологического состояния рыб.

Гематологические показатели тесно связаны с уровнем метаболизма рыбы и быстро реагируют на изменения внешней среды. Показатели красной крови могут служить важнейшими тестами для определения физиологического состояния рыбы и физиологических изменений, которых можно ожидать на ранних стадиях действия неблагоприятных факторов водной среды (Коржуев, 1979; Строганов, 1979; Попова, 1983; Смит, 1986). Снижение содержания гемоглобина в крови рыб или его способности обратимо связывать кислород может быть причиной гипоксии. Поэтому если под действием перекиси водорода будет происходить окисление двухвалентного гемового железа гемоглобина в трехвалентное с образованием метгемоглобина, неспособного обратимо связывать кислород (Лукьянова и др., 1982; Голиков и др., 1986), а также окислительная деструкция белковой части молекулы гемоглобина (Mills, 1957), то присутствие перекиси водорода в водной среде может нарушить способность крови рыб переносить кислород.

Снижение содержания эритроцитов в крови рыб может быть обусловлено нарушениями в зритропоэзе или гемолизом. Гемолиз считается неспецифическим показателем ухудшения состояния рыбы. Однако гемолиз может происходить в результате нарушения структуры мембран эритроцитов продуктами перекисного окисления липидов (Мерзляк, Соболев, 1975), которое инициируется перекисью водорода и другими активными формами кислорода (Фридович, 1979).

Целостность мембран лейкоцитов тоже может нарушаться в результате

перекисного окисления, приводя к снижению их количества, поэтому в набор определяемых гематологических показателей было включено содержание лейкоцитов в крови рыб.

Пероксидазная активность крови представляет интерес, поскольку она является одним из показателей активности антиокислительных ферментных систем крови (Фридович, 1979; Голиков и др., 1986). Механизм адаптации к нелетальным дозам перекиси водорода может быть связан с повышением активности антиокислительных ферментов (Lee et a!, 1993).

Как видно из табл.1, содержание метгемоглобина, гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, степень гемолиза и пероксидазная активность в крови рыб не различались в контрольных и опытных вариантах при концентрациях перекиси водорода до 10 3 М и экспозициях до 30 суток.

Таблица 1.

Гематологические показатели карпов при действии перекиси водорода.

Показатели. М±ст

Время [Н20:], MctHb,% НЬ, г% Эрц, Лкц, Гемолиз, ПА. мЕ

моль/л млм/мкл тыс/мкл %

3 К* 3,0±0,8 7,3iO,4 l,6i0,2 18,7±9.6 <0,1 15S±17

CVTOK 105 М 2,7-tl ,0 7,64.0,5 1,6±0,2 19,0±8,1 <0,1 152±18

Ю4М 3,2±1,8 8,3±0,8 1,8*0,4 19,4±4,7 < 0.1 159±=20

5-104М 2,1 ±0,9 8,0±0,6 1,9±0,7 19,! ±6,5 < 0.1 154±25

10'1 М 1,9±0,8 9,S±0,9 1,6±0,7 17,919,8 < 0.1 162±35

10 К* 2,3±0,7 8,2±0,6 2,1 ±0,2 19,4±1,5 0,84-0,3 200±36

суток 10*М 2,241,2 8,0-Ю.б 2,3±0,2 21,3±4,7 0,7±0,2 1S0±35

! 0° М 3,7±1,б 7,Ш,2 2,3 ±0,5 19,44:1,5 0,6±0,4 192±12

!0JM 5,2±2,4 8,04=0,6 2,1 ±0,1 18,6±3,9 0.64=0,1 206±25

5-10"1 М 3,3±0,6 7,640,8 2,0±0,7 19,2±4,3 0,7±0,3 204±47

10"' М 3.040,8 7,5±1,1 2,0=Ю,8 19,0±5,4 0,9±0.3 205±29

30 К* 4,В±0,8 8,1±1,0 2,0±0,4 22,7±6,6 1,24=0.3 175±41

суток 10* м 2,4±1,1 7,8±0,6 2,1 ±0,3 20,0±4,2 1,24=0,3 181±33

Ю'М 4,3±2,1 7,54=1,2 2,2±0,5 20,6±7,4 1,4±0,6 182-4=38

Ю"4М 2,7±1,1 7,940,6 2,040,2 20,8±4,7 1,1 ±0,3 173±24

5-10-'М 2.840,6 8,0445,6 1,94-0,9 21,2±5,8 1,2±0,3 178±53

10'1 м 3.6±L0 7,8±1,0 1,94.0,2 22,3±4,1 1,5±1,0 163±23

20 к* 0,3±0,2 9,94=1,8 <0,1

минут 10'2М 1,5±1,1 11,0+2,6 <0,1

2-Ю"2 М 0,9±0,8 9,1±1,6 <0,1

60 К* 0,843,4 10,4*3,3 <0,1

минут 10-м 2,3±1,0 10,4.4.0,7 <0.1

2-10":М 4,6±2,6 9,7±1,7 <0,1

Примечания: К* - контроль; МеЖЬ - метгемоглобин в % от общего гемоглобина; НЬ-гемоглобин, г%; Эрц-эритроциты; Лкц-лейкоциты; Гемолиз - содержание НЬ в сыворотке в % от НЬ в цельной крови; ПА, мЕ - пероксидазная активность, Ю-3 международной единицы.

При концентрациях перекиси водорода 102 и 210 3 М и экспозиции 60 минут наблюдается небольшое, но достоверное увеличение содержания метгемоглобина в крови рыб по сравнению с контролем. Видимо, эти концентрации перекиси водорода превышают возможности защитных антиокислительных механизмов в эритроцитах рыб на ранней стадии воздействия окислителя. Содержание гемоглобина и степень гемолиза не отличались от контроля; следовательно, структура мембран эритроцитов не нарушалась попавшей в кровь перекисью водорода. Полученные результаты показывают, что перекись водорода быстро, менее чем за 1 час, проникает в кровь и в неразрушенные эритроциты. Это совпадает с представлением о хорошей проницаемости для перекиси водорода всех биологических мембран, кроме митохондриальных (Лукьянова и др., 1982).

Т.о., наименьшая действующая на гематологические показатели карпов концентрация перекиси водорода находится на уровне 102М.

В таблице 2 представлены данные о влиянии перекиси водорода в концентрациях от 10'6 до 10 э М при экспозициях от 3 до 30 суток на уровень перекисного окисления липидов в жабрах, мышцах и гепатопанкреасе и содержание цитохрома Р-450 в гепатопанкреасе рыб. Уровень перекисного окисления липидов оценивался по содержанию в тканях малонового диальдегида, конечного устойчивого продукта перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот.

Таблица 2.

Содержание мапонового диальдегида (МДА) и цитохрома Р-450 в тканях карпа при действии перекиси водорода.

Показатели, М±о

Жабры | Мышцы | Гепатоланкреас

Время, сутки [Н2Ог1, моль/л МДА, нмоль/г ткани | цхР-450*

Контроль 45,9*8,7 11,3*2,8 38,3*12,3 5,8*0,6

10~5 М 43,8*6,8 12,0*3,1 40,3*11,7 6,3*1,3

10"4 М 29,6*6,3 11,6*1,2 34,6*12,9 5,2*2,9

10"3 М 43,2*5,1 11,8*1,0 38,9* 6,3 5,4*1,8

Контроль 10'® М 17,9*3,9 14,1±1,5 6,1*1,4 6,0*0,9 21,1*2,8 21,7*3,1 4,6*0,3 4,8*1,1

10 10"6М 12,7*1,6 4,8*1,2 13,5*0,6 5,1*0,1

10"4 М 1б,5±1,1 6,7*0,8 20,8*4,9 4,3*0,3

5-Ю"4 М 16,8*2,8 7,0*1,5 22,3*3,3 4,5*0,7

10'3 М 20,9*4,5 7,8*2,0 28,1*4,8 4,3*0,9

Контроль 9,3*0,6 7,4*2,0 24,1*5,4 7,5*0,2

10"®М 10,3*6,2 7,5*1,3 25,6*2,2 9,0*3,3

30 Ю"5 м 9,7±1,8 7,4*2,9 24,2*2,4 7,6*0,1

10 4 М 10,1*1,9 8,0*2,1 18,2*0,4 7,3*1,1

5-Ю"4 М 10,0*2,6 8,0*3,1 25,3*0,3 6,7*0,7

10~3 М 11,6*1,1 13,9*0,7 25,3*3,8 5,95*1,1

* Цитохром Р-450,10 2 нмоль/мг белка

Очевидно, что перекись водорода в концентрациях до 510"* М включительно при экспозиции до 30 суток не влияет на содержание МДА в тканях рыб и на содержание цитохрома Р-450 в гепатопанкреасе. Действие перекиси водорода на эти показатели проявлялось при концентрации окислителя 103 М. В вариантах с концентрацией перекиси водорода 103 М при экспозиции 30 суток у рыб достоверно повышалось содержание МДА в жабрах и мышцах, при экспозиции 10 суток - в гепатопанкреасе; при экспозиции 30 суток достоверно снижалось содержание цитохрома Р-450 в гепатопанкреасе. В жабрах и мышцах при действии перекиси водорода в концентрации 10*3 М и экспозиции 10 суток наблюдалась тенденция к повышению содержания МДА.

На основании полученных результатов можно сделать заключение, что наименьшая концентрация перекиси водорода, действующая на самые чувствительные к влиянию окислителей физиолсго-биохимические показатели карпов, находится на уровне 10 3 М. Ее действие на биохимические показатели карпов проявлялось при экспозиции не менее 10 суток.

Глава IV. ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ ОТ НИТРИТОВ И ЕГО ПОСЛЕДСТВИЯ.

Существующие в настоящее время методы очистки воды от нитритов и методы лечения и профилактики отравления рыб нитритами имеют свои ограничения. Инъекции аскорбиновой кислоты и метиленового синего рыбам (Руссо, 1981) очень трудоемки и вряд ли могут использоваться в условиях производства. Внесение в воду метиленового синего (Руссо,1981), марганцевокислого калия или цеолитов (Шахмурзов, Призенко, 1991), хлоридов кальция и натрия (\А/есЗетеуег, УавсЛаке, 1978;Тота55о е1 а1., 1980) связано с введением в систему соединений, которые не могут быть удалены без специальных мероприятий и могут накапливаться в воде или в почве.

Наиболее подходящим методом очистки среды обитания рыб от нитритов представляется использование восстановительной каталитической системы, которая состоит из перекиси водорода и аскорбиновой кислоты в соотношении 1/4 и микромолей ионов железа (Верещагин, 1988). При очистке сточных вод от нитритов перекисью водорода для эффективного окисления рекомендуется поддерживать рН воды в диапазоне от 2 до 5, предпочтительно от 3 до 4 (Селюков, Тринко, 1988). Такие значения рН токсичны для рыб, особенно для карпов (Метелевидр., 1971). Неободимоустановить концентрации перекиси водорода, окисляющие нитриты при нейтральных и слабощелочных значениях рН водной среды.

Для создания нужных концентраций нитритов и нитратов в воде при экспериментах использовались концентрированные растворы нитрита натрия и нитрата натрия, поскольку соли натрия менее токсичны, чем соли калия (Метелев и др., 1971).

Эффективность окисления нитритов перекисью водорода была исследована в диапазоне концентраций нитритов от 0,1 до 4,0 MrN/л и перекиси водорода от 10 5 до 103 М. Опыты проводились как в емкостях с отстоявшейся водопроводной водой, так и в аквариумах с рыбой. Полученные результаты были обработаны методом множественной линейной регрессии по стандартной программе. Зависимость между конечной и исходной концентрациями нитритов и применяемой концентрацией перекиси водорода описывалется следующим линейным уравнением {множественный коэффициент корреляции 0,969):

[NOJ, = 0,023 + 0,79[N02]„ - 170,9{Н202].

Высокое значение коэффициента корреляции свидетельствует о том, что уравнение с высокой точностью описывает связь между исследованными показателями.

Концентрацию перекиси водорода (в мг/л), необходимую для снижения содержания нитритов до нужного уровня, можно вычислить по формуле: [Н202] = (0,023 + 0,79[N02]b - [NOjJ / 0,005; где [Н,02] - необходимая концентрация перекиси водорода, мг/л; [|\Ю2]и - исходная концентрация нитритов, MrN/л; [N02]k - желательная конечная концентрация нитритов, MrN/л.

Скорость окисления нитритов перекисью водорода наиболее высока в течение 1-2 часов после добавления окислителя. Эффективность окисления повышается при концентрациях нитритов более 0,3 MrN/л. Для того чтобы содержание нитритов снижалось до 50% от исходного уровня за 1-2 часа, нужен большой избыток перекиси водорода - от 65 до 110 мг перекиси водорода на 1 мг нитритного азота. При использовании ВКС такое же снижение уровня нитритов в первые часы после добавления ВКС происходит при меньшей в 10 раз концентрации перекиси водорода в составе ВКС, что соогласуется с результатами Верещагина (1988).

Нитриты в крови рыб окисляют гемоглобин в метгемоглобин (Руссо, 1981).При высоких концентрациях нитритов снижается уровень гемоглобина, гематокрита, белка в крови, числа эритроцитов (Yamagata, Niwa, 1979). Чтобы проверить, будет ли суммироваться аналогичное влияние двух окислителей, гематологические показатели карпов были исследованы при действии растворенных нитритов в концентрациях 0,25, 0,3 и 0,5 мгЫ/л и нитритов в сочетании с перекисью водорода в концентрациях от 10 5 до 103 М. Для сравнения было также изучено влияние на гематологические показатели карпов нитритов в сочетании с восстановительной каталитической системой (ВКС) при соотношении концентраций перекиси водорода и аскорбиновой кислоты 1:4 и концентрациях перекиси водорода в составе ВКС 105 и 10" М. Ни в одном из исследованных вариантов не наблюдалось достоверных различий в содержании гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, степени гемолиза и пероксидазной активности в крови рыб по сравнению с контролем.

Нитриты в относительно низкой концентрации, всего на 25% превышающей верхний допустимый предел для карповых прудов, значительно увеличивали содержание метгемоглобина в крови рыб. В то же время перекись водорода и ВКС препятствовали образованию метгемоглобина в крови рыб под действием нитритов, причем содержание метгемоглобина было более низким в вариантах с более высокими концентрациями перекиси водорода (рис. 1 и 2). При концентрации перекиси водорода 10 5М содержание метгемоглобина в крови рыб было более низким, чем в варианте с нитритами без перекиси водорода, однако в данном случае можно скорее говорить о тенденции. В дальнейших опытах эта концентрация перекиси водорода не использовалась из-за низкой эффективности.

3 дня

Е 50

0 2

£

1 40 £

30 20 10 О

ЕЙЗЗ

Контроль N0?"

1 ЕЙ

• 10'5М -ИО^М И0"3М Контроль N0;' Н;Ог НгО? НЛ:

0.2

+ВКС1 +ВКС2

вманы

01М0;

1.25 мг«/л N01' ♦ НгОг или ВКС

Рис. 1 .Влияние перекиси водорода и ВКС на уровень метгемоглобина в крови кар-пов и содержание растворенных в воде нитритов (исходный уровень ЫОг 0,25 мгЫ/л).

МеЖЬ - метгемоглобин в % от суммарного гемоглобина, планками

обозначено среднее квадратичное отклонение; ВКС1 - перекись водорода (105 М)/аскорбиновая кислота; ВКС2 - перекись водорода (Ю-4 М)/аскорбиновая кислота.

7 дней

0,3

50

0.25

40

0,2 | 2

0,15 |

с

3"

X I

20

10

о

Контроль N0, »10-М Контроль N0;' «ВКС1 +ВКС2

НА Н2Ог

ММНЬ □ N0.

0,25 мг№ МО/ + НгОг или ВКС

Рис. 2. Влияние перекиси водорода и ВКС на уровень метгемоглобина в крови карпов и содержание растворенных в воде нитритов {исходный уровень 1\102 0,25 мгЫ/л).

Ме1НЬ - метгемоглобин в % от суммарного гемоглобина, планками обозначено среднее квадратичное отклонение;

ВКС1 - перекись водорода (105 М)/аскорбиновая кислота;

ВКС2 - перекись водорода (10ч М)/аскорбиновая кислота.

Перекись водорода в концентрации 10 3М оказывала влияние на уровень перекисного окисления липидов в тканях карпов при экспозиции не менее 10 суток и не влияла на гематологические показатели рыб при экспозиции до 30 суток. Поэтому она использовалась в опытах длительностью не более 7 суток. Концентрация перекиси водорода 10"3 М наиболее эффективно снижала как содержание нитритов в воде, так и содержание метгемоглобина в крови рыб; однако, хотя на 3 и на 7 сутки опыта оба показателя в этих вариантах не отличались от контрольных, у рыб появлялись точечные гематомы на жабрах и происходил отход до 10% рыбы при отборе крови. Такой эффект может быть обусловлен повышением концентрации перекиси водорода за пределы 10'3 М в результате последовательных добавлений окислителя и низкой скорости его распада при концентрациях более 5104 М. Видимо, перекись водорода в концентрации 10~3 М можно применять для

снижения содержания нитритов в воде однократно, последующее добавление перекиси водорода в воду не следует производить в течение ближайших 48 часов.

0.35 0,3

о,»

2

О? а X

0.'5 I

-5 Ю М

ИЛ

N0," » Н,02 или ВКС

Рис. 3. Динамика содержания метгемсглобина в крови карпов при профилактическом применении перекиси водорода и ВКС (исходный уровень №02 0,3 мгМ/л).

Ы02' - нитриты, 0,3 мгЫ/л;

+ВКС2 - нитриты и ВКС2 ([Н2Су в составе ВКС2 10" М); +Н202 - нитриты и перекись водорода.

8 2»

Г*1

пм

ад + 6КС1 .'-(/л N01' .НЛ, N0, -ВКС2 N0, *В<С1 ->ЬО;

аМе1НВ О "О. .

N0, Н,0,ил» ВКС

Рис. 4. Динамика снижения содержания метгемотобина в крови карпов при лечебном применении перекиси водорода и ВКС (исходный уровень Ы02 0,3 мгЫ/л).

Ы02 - нитриты 0,3 мгЫ/л;

+ВКС2 - нитриты и ВКС2 ([Н202] в составе ВКС2 10" М); +Н202 - нитриты и Н202,10" М.

0 4X0«

На рис. 3 представлена динамика содержания метгемоглобина в крови рыб в вариантах с нитритами (0,3 мгЫ/л), с нитритами и ВКС2 ([Н2Ог] в составе ВКС2 10"М), с нитритами и перекисью водорода ([Н202] 104 М и 510 4 М) при одновременном добавлении всех веществ в воду. На рис. 4 представлена динамика содержания метгемоглобина в крови рыб при добавлении перекиси водорода (10^ М) и ВКС2 ([Н202] в составе ВКС10" М) в воду после проявления токсического эффекта нитритов. Рыбу выдерживали в аквариумах с концентрациями растворенных нитритов 0,3 мгМл до значительного повышения содержания метгемоглобина в крови (более 30%), затем добавляли в воду перекись водорода или ВКС2. Результаты показывают, что перекись водорода и ВКС при равных концентрациях окислителя одинаково эффективно препятствуют образованию метгемоглобина (рис. 3) или снижают его содержание (рис. 4) в крови рыб.

ВКС в первый час после добавления в воду гораздо эффективнее снижает содержание нитритов, чем перекись водорода в такой же концентрации, как в составе ВКС. Это не соотносится с одинаковой эффективностью предотвращения образования метгемоглобина в крови рыб перекисью водорода и ВКС (рис. 1-4). Одинаковое снижения содержание нитритов достигается при концентрации перекиси водорода в составе ВКС в 10 раз более низкой, чем при действии одной перекиси водорода.

Была прослежена динамика изменения содержания нитритов в воде при добавлении перекиси водорода и ВКС при разных исходных концентрациях нитритов (от 0,1 до 0,5 мгЫ/л) и разных соотношениях концентраций перекиси водорода и нитритов. Результаты представлены на рис. 5.

с: 2 г

' сч

о 2

-НгОг 10'4М

-Н2025-10"'М

-ВКС2

Рис. 5. Динамика изменения содержания нитритов при действии перекиси водорода и ВКС.

При разных исходных концентрациях нитритов прослеживается следующая одинаковая закономерность. Концентрация нитритов резко снижается в первые 2 часа после добавления ВКС и (в меньшей степени) перекиси водорода. Затем в варианте с ВКС концентрация нитритов начинает повышаться и достигает величины 80-90% от исходного уровня в течение суток, а в вариантах с перекисью водорода концентрация нитритов медленно снижается или остается на одном уровне. При следующем добавлении перекиси водорода и ВКС в исследуемые растворы наблюдается такая же закономерность. В результате через сутки после добавления ВКС или перекиси водорода при равных концентрациях перекиси водорода в этих каталитических системах содержание нитритов снижается до одинакового уровня. При данной схеме опыта ВКС не вызывала устойчивого снижения содержания нитритов в воде.

Перекись водорода окисляет нитриты до нитратов. В литературе иногда встречаются утверждения, что клинические признаки отравления нитратами и нитритами одинаковы: происходит лизис эритроцитов, снижение содержания гемоглобина, увеличение содержания метгемоглобина в крови рыб; последний из перечисленных признаков даже предлагается в качестве основного показателя для диагностики нитратного отравления (Шахмурзов, 1994). Поэтому было изучено влияние нитратов в концентрациях от 3 до 300 мгЫ/л при экспозиции 96 часов на гематологические показатели рыб. Полученные результаты показали, что в исследованных концентрациях, самая высокая из которых в 100 раз превышает допустимый верхний предел для карповых прудов, растворенные в воде нитраты не влияют на содержание метгемоглобина, гемоглобина и гемолиз в крови рыб. В вариантах с концентрациями нитратов 200 и 300 мгЫ/л при 96-часовой экспозиции зафиксирован отход 20-30% рыбы.

Влияние нитратов в концентрациях от 3 до 30000 мгЫ/л на гемоглобин было исследовано также непосредственно в гемолизатах крови карпов. Даже при самой высокой из исследованных концентраций нитратов содержание метгемоглобина в гемолизате существенно не повышалось:

Контроль МеШЬ - 2,0% НЬ - 8,1 г%

1М03-, 30000 мг1М/л МеШЬ - 2,2% НЬ - 8,1 г%

Полученные результаты позволяют утверждать, что нитрат-ионы сами по себе не способны окислять гемоглобин, а в крови рыб нитраты ферментативно не могут восстанавливаться до нитритов. Следовательно, метгемоглобинемия не является механизмом токсичности растворенных в воде нитратов для рыб, и повышенное содержание метгемоглобина не может служить диагностическим признаком отравления рыб растворенными нитратами. Можно сделать вывод, что продукт окисления нитритов перекисью водорода - нитраты - не лимитируют применение перекиси водорода для окисления нитритов.

Глава V. ВЛИЯНИЕ СУЛЬФИДОВ НА КАРПОВ И СПОСОБ ЕГО УСТРАНЕНИЯ.

Действие на карпов растворенных в воде сульфидов исследовалось в диапа-зоне концентраций от 0,04 до 20,5 мгБ2/л при времени действия от 1-3 до 96 часов в слабощелочной и слабокислой среде: при рН 8,0-8,3 (содержание сероводорода составляет 4-9% от суммарного количества сульфидов) и при рН 5,9 (содержание сероводорода составляет 90% от суммарного количества сульфидов). До проявле-ния неблагоприятного эффекта сульфидов воды не аэрировалась (3 часа при рН 8,0 и 1 час при рН 5,9). При рН 8,0-8,3 и концентрациях сульфидов 8,2,12,3,16,4 и 20,5 мгБ^/л рыба заглатывала воздух и опрокидывалась через 2,5-3 часа. После включения аэрации рыба приходила в норму через 20-60 минут. Как выяснилось, при этих концентрациях сульфидов содержание растворенного в воде кислорода снижалось до 0-0,4 мгО/л за 2,5-3,5 часа, при концентрациях 2,0 и 4,1 мг82 /л - за 4,5 и 6,5 часов, соответственно. Следовательно, в данном случае неблагоприятное влияние сульфидов на рыб вызвано быстрым удалением растворенного кислорода, который может расходоваться на взаимодействие с сульфидами.

При рН 5,9 и концентрациях сульфидов 2,0, 4,1 и 8,2 мгЭ27л признаки отравления рыб (снижение частоты дыхания, потеря рефлекса равновесия) проявлялись через 1 час. Содержание растворенного кислорода в воде в это время было не менее 6 мг/л. Как известно, в живую клетку при рН меньше 6,0 легко проникает недиссоциированный сероводород (Метелев и др., 1971), который является ядовитой формой сульфидов (Смит мл., 1979), так что а данном случае наблюдается именно отравление сероводородом.

Сероводород способен блокировать гемоглобин (Хочачка, Сомеро, 1988), однако его действие на гемоглобин в крови рыб не изучено, механизм этого процесса и степень его обратимости у рыб неизвестны. Влияние сульфидов на образование дериватов гемоглобина - сульфгемоглобина и метгемогло-бина - в крови рыб исследовалось как при остротоксичных концентрациях, так и при концентрациях, не оказывающих выраженного неблагоприятного действия на рыб за время опытов. Влияние сульфидов изучалось как в слабощелочной (рН 8,0-8,3), так и в слабокислой среде (рН 5,9), в которой они присутствуют в основном в недиссоциированной форме - в виде сероводорода.

Во всем диапазоне исследованных концентраций сульфидов при экспозиции до 96 часов содержание дериватов гемоглобина и общего гемоглобина в крови рыб в контрольных и опытных вариантах достоверно не различалось. Содержание сульфгемоглобина в крови карпов было очень низким, на уровне десятых долей процента от общего содержания гемоглобина.

Влиние сульфидов на гемоглобин рыб исследовалось также в гемолизатах

крови карпов в диапазоне концентраций от 8,2 до 2050 мг527л. При минимальной действующей концентрации сульфидоэ 2050 мг82/л в гемолизатах увеличивалось содержание метгемоглобина (от 2,0 до 38,8%), содержание сульфгемоглобина изменялось незначительно. Сероводород, являющийся восстановителем, не может окислять гемоглобин до метгемоглобина, возможно, он нарушает конформацию белковой части молекулы гемоглобина. При изменении структуры гемоглобина меняется положение тема, что может способствовать его окислению другими веществами.

Скорость проявления токсического эффекта сульфидов и их влияние на гемоглобин в гемолизатах крови рыб позволяют предположить, что они могут изменять структуру белков жаберного эпителия, в результате может нарушаться проницаемость клеточных мембран жаберного эпителия для кислорода и ионов.

Высокая токсичность сульфидов для рыб обуславливает необходимость снижения содержания сульфидов до аналитического нуля за короткое время. В рыбоводные хозяйства возможно поступление сульфидов с артезианской водой, а а зимний период - с водой из покрытых льдом водоемов. Аэрация не обеспечивает надлежащей очистки воды, в ней остается много гидросульфидов, в сети водоподачи происходит отложение сульфида железа (Вехотко и др., 1974). Исследовано время полного удаления растворенных сульфидов из воды при 4 разных концентрациях (0,2; 0,41; 2,0 и 8,2 мг32/л), при рН 5,8-6,0 и рН 8,3 и при разных концентрациях перекиси водорода.

Рис. 6.Зависимость времени полного окисления сульфидов от соотношения концентраций перекиси водорода и сульфидов.

Результаты представлены на рис. 6. Время полного удаления сульфидов из воды практически не зависело от исходной концентрации сульфидов, а зависело от соотношения концентраций перекись водорода/сульфиды (мг/мг). При соотношении Н20/Э2' от 1,7 до 2,1 сульфиды окислялись за 80-90 минут, при 4,2 - за 50-60 минут, при 8,5 - за 30 минут, при 17 -за 5-10 минут.

Такая высокая скорость очистки воды от сульфидов перекисью водорода наводит на мысль о возможности применения этого окислителя для обеспечения обратимости токсического действия сульфидов на рыб.

Исследована возможность восстановления нормальной жизнедеятельности рыб при использовании перекиси водорода на ранних стадиях отравления сульфидами. Перекись водорода добавлялась на стадии нарушения рефлекса равновесия у 100% рыбы в аквариумы с 3 разными концентрациями сульфидов (2,0; 4,1; 8,2 мгБ27л) при рН 5,9. Полученные результаты представлены на рис. 7. Восстановление рефлекса равновесия у рыб после отравления сульфидами в концентрации 2 мг827л при соотношении Н^СХ/Б2' =17 происходило за 7-12 минут, при 8,5 - за 30 минут, при 8,5 в случае добавления перекиси водорода в воду через 30 минут после нарушения рефлекса равновесия у 100% рыб - за 50-65 минут, при 8,5 (при исходной концентрации сульфидов 4,1 мг5г7л) - за 40-60 минут. В течение 4 следующих суток состояние рыбы не ухудшалось. При исходной концентрации сульфидов 8,2 мгБ27л и соотношении Н20./52 4,2 добавление перекиси водорода приводило к восстановлению рефлекса равновесия у карпов за весьма растянутый промежуток времени от 90 до 120 минут. Состояние рыбы на следующие сутки все еще оставалось несколько неустойчивым (кратковременные нарушения равновесия при плавании, неравномерное дыхание) и нормализовалось только на вторые сутки после применения окислителя.

100

80 60

X *

г

| 40

а а. ш

20 0

Рис. 7. Зависимость времени восстановления рефлекса равновесия у карпов от соотношения концентраций перекиси водорода и сульфидов. В скобках указана исходная концентрация сульфидов, мгБг7л; * - перекись водорода добавлена через 30 минут после нарушения рефлекса равновесия у 100% рыб.

I т

17(2,0) 8,5(2.0) 8,5(2,0 )• 8,5(4,1) 4,2(8,2) Соотношение НгОг/Б2"

Очевидно, что скорость восстановления рефлекса равновесия у отравленных рыб после добавления перекиси водорода в значительной степени зависит от скорости окисления сульфидов перекисью водорода (сравн. рис. 6 и 7). Время восстановления рефлекса равновесия при одинаковом соотношении Н.О^З2 увеличивается при увеличении времени воздействия сульфидов на рыб и повышении исходной концентрации сульфидов (рис. 7). Следовательно, для успешного применения перекиси водорода при отравлении сульфидами следует учитывать исходную концентрацию сульфидов, скорость их окисления при разных концентрациях перекиси водорода для выбора наиболее эффективного соотношения Н^^ Б2 , а также следует добавлять перекись водорода своевременно, при первых признаках отравления. При высоких концентрациях сульфидов, для эффективного окисления которых необходимы концентрации перекиси водорода, превышающие диапазон безопасных для рыб концентраций окислителя, приходится довольствоваться использованием менее эффективных соотношений Ир^Б2' и, соответственно, меньшими скоростями окисления сульфидов.

ВЫВОДЫ

1. Перекись водорода в концентрациях до 103 М включительно при времени воздействия до 30 суток не оказывала влияния на гематологические показатели рыб: содержание метгемоглобина, гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов, гемолиз, пероксидазную активность в крови рыб.

2. Перекись водорода в концентрацияхдо 5-10" М и экспозициях до 30 суток не влияет на уровень перекисного окисления липидов в жабрах, мышцах и гепатопанкреасе карпов и на содержание цитохрома Р-450 в микросомах гепатопанкреаса.

3. Присутствие перекиси водорода в воде препятствует образованию метгемоглобина в крови рыб под действием растворенных нитритов.

4. Перекись водорода и восстановительная каталитическая система с равной концентрацией окислителя одинаково эффективно препятствуют образованию метгемоглобина в крови рыб под действием растворенных нитритов.

5. Растворенные в водной среде нитраты (в концентрациях до 300 мгЫ/л) не являются причиной окисления гемоглобина до метгемоглобина в крови рыб.

6. Растворенные в водной среде сульфиды в токсичных для рыб концентрациях (от 0,4 до 20,5 мг/л) не влияют на содержание дериватов гемоглобина и общего гемоглобина в крови рыб.

7. При соотношении концентраций перекиси водорода и сульфидов от 1,7 до 17 содержание сульфидов в воде снижается до аналитического нуля в интервале времени от 5 до 90 минут.

8. Устойчивое восстановление рефлекса равновесия у карпов происходит при добавлении в воду перекиси водорода на ранних стадиях отравления рыб сульфидами, время восстановления зависит от соотношения концентраций перекиси водорода и сульфидов и своевременности добавления окислителя.

9. Перекись водорода в безвредных для рыб концентрациях до 5-10Л М эффективно очищает воду от токсичных концентраций нитритов и сульфидов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для снижения содержания нитритов и окисления сульфидов можно применять перекись водорода в концентрации до 510"' М. Необходимо следить, чтобы при последовательных добавлениях перекиси водорода ее суммарная концентрация не превышала 10 3 М.

2. Перекись водорода следует добавлять в емкости с рыбой в виде раствора с концентрацией не более 1 М, предпочтительно не более 0,1 М. Необходимо обеспечить хорошее перемешивание применямого раствора перекиси водорода с водой.

3. Поскольку перекись водорода постепенно разлагается даже при правильном хранении, ее концентрацию периодически необходимо проверять. Оптическая плотность раствора перекиси водорода с концентрацией 1 М при длине волны 313 нм равна 0,4. Если эта величина уменьшилась, следует ввести поправку и увеличить количество добавляемого окислителя.

4. Для снижения содержания нитритов в воде необходим избыток перекиси водорода. Концентрацию перекиси водорода, необходимую для снижения содержания нитритов до нужного уровня, можно вычислить по формуле:

[Н202] = (0,023 + 0,79[N02]m - [NCy,) / 0,005; где [Н202] - необходимая концентрация перекиси водорода, мг/л; [N0.,]^ - исходная концентрация нитритов, MrN/л; [NO.,j(- желательная конечная концентрация нитритов, мгЫ/л.

5. Для очистки воды от нитритов рациональнее применять перекись водорода, поскольку ВКС (восстановительная каталитическая система) не обеспечивает устойчивое снижение количества нитритов в воде, а при одинаковой эффективности предотвращения токсического действия нитритов ВКС в несколько раз дороже перекиси водорода.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванеха Е.В., Андронников С.Б., Лукина Т.М. Изучение продуктов разложения органических веществ в прудах // Всесоюзная конференция молодых ученых "Методы интенсификации прудового рыбоводства" : Тез. докл. - М., 1984.-С, 142-143.

2. Иванеха Е.В., Шестерин И.С. Перекисное окисление органических веществ в прудах // Республиканская научно-техническая конференция "Интенсификация товарного рыбоводства Молдавии" : Тез. докл., Кишинев, 7-8 августа 1986 г. - Кишинев, 1986. - С. 37-38.

3. Иванеха Е.В. Влияние перекиси водорода на перекисное окисление в тканях рыб в норме и при воздействии хлорофоса // Сб. науч. тр. Болезни рыб и водная токсикология. - М.: ВНИИПРХ, 1987. - Вып. 50. - С. 187-192.

4. Иванеха Е.В. Влияние перекиси водорода и хлорофоса на содержание гемоглобина в крови рыб // I Всесоюзная конференция по рыбохозяйственной токсикологии : Тез. докл., ч. I, Юрмала, декабрь 1988. -Рига, 1988.-С. 158-159.

5. Ибрагимов И.И., Иванеха Е.В., Лиманский В.В. Изучение влияния аскорбиновой кислоты и хлорофоса на гематологические показатели рыб // II Симпозиум по экологической биохимии рыб : Тез. докл., Ростов Великий, декабрь 1990. - Ярославль, 1990. - С. 97-98,

6. Иванеха Е.В. Образование метгемоглобина при действии нитритов и перекиси водорода на рыб // Там же. - С. 98-100.

7. Иванеха Е.В. Содержание эритроцитов и лейкоцитов в крови карпа в присутствии нитритов и перекиси водорода II II Всесоюзная конференция по рыбохозяйственной токсикологии : Тез. докл., T. I. - С.-Петербург, 1991. - С. 228-229.

8. Иванов Э.В., Горюнова C.B., Иванеха Е.В., Фомин O.K. Влияние фотодыхания планктонных водорослей на накопление перекиси водорода в окружающей среде // Вестник РУДН. - Сер. Экология и безопасность жизнедеятельности. - 1997. - № 2. - С. 129-131.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванеха, Елена Викторовна, Москва

На правах рукописи

ИВАНЁХА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЛИЯНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РЫБ.

03.00.10 - ихтиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

доктор химических наук Скурлатов Ю.И.

Москва 1998

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................3

Глава 1. ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ

ВОДНОЙ СРЕДЫ И ИХ РОЛЬ В ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ

(обзор литературы)......................................................................6

Глава II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА.........................................................38

Глава III. ВЛИЯНИЕ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА НА ФИЗИОЛОГО-

БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ РЫБ...................................40

1. Влияние перекиси водорода на гематологические показатели карпов..................................................................40

2. Влияние перекиси водорода на уровень перекисного окисления липидов в тканях карпов и содержание цитохрома Р-450 в гепатопанкреасе.....................................45

Глава IV. ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА ДЛЯ ОЧИСТКИ

ВОДЫ ОТ НИТРИТОВ И ЕГО ПОСЛЕДСТВИЯ.......................48

1. Эффективность окисления нитритов перекисью водорода................................................................................48

2. Влияние нитритов и перекиси водорода на гематологические показатели рыб......................................50

3. Влияние нитратов на гематологические показатели

рыб.........................................................................................63

Глава V. ВЛИЯНИЕ СУЛЬФИДОВ НА КАРПОВ И СПОСОБ ЕГО

УСТРАНЕНИЯ............................................................................66

1. Влияние сульфидов на поведение и гематологические показатели карпов..................................................................66

2. Эффективность окисления сульфидов перекисью водорода.................................................................................72

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................................76

ВЫВОДЫ...................................................................................................79

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ........................................................80

ЛИТЕРАТУРА............................................................................................81

ВВЕДЕНИЕ

Наиболее безопасные для окружающей среды методы очистки воды связаны с применением экологически "чистых" окислителей -перекиси водорода и озона, которые являются природными соединениями и не загрязняют воду побочными высокотоксичными продуктами восстановления. В рыбоводстве эти окислители можно применять не только для очистки и дезинфекции воды, но и для лечебно-профилактической обработки рыб, обеззараживания рыбоводного оборудования и инвентаря (Colberg, Lingg, 1978; Сапожников, 1991; Мирзоева, 1995; Mitchell, Collins, 1997). Перекись водорода обладает рядом технологических преимуществ по сравнению с озоном (Бе-ренблит, 1984; Селюков, Тринко, 1988), а также на 3 порядка меньшей токсичностью для рыб, чем озон (Метелев и др., 1971).

Перекись водорода не является чужеродным соединением для гидробионтов. Перекись водорода образуется в клетках живых организмов; физиологические концентрации перекиси водорода нетоксичны и необходимы для некоторых биохимических процессов (Лукьянова и др., 1982). Содержание перекиси водорода в водоемах достигает 200 мкг/л, в основном не превышая 3-Ю"6 М, или 102 мкг/л (Синельников, 1980; Штамм, 1988).

Однако вопрос о возможности применения перекиси водорода в рыбоводстве остается открытым. С одной стороны, именно высокая окисляющая способность перекиси водорода позволяет использовать ее в зарубежной практике очистки сточных вод от большого числа загрязняющих веществ (Селюков, Тринко, 1988). Начатые в начале 90-х гг. исследования американских ученых к настоящему времени доказали, что этот окислитель очень перспективен как эффективный фунгицид, бактерицид и паразитоцид для применения при содержании рыбы в емкостях и при транспортировке (Mitchell, Collins, 1997). С дру-

гой стороны, высокая эффективность перекиси водорода как окислителя при высоких концентрациях может оказаться неблагоприятной для рыб. Есть данные, что перекись водорода вызывает лизис эритроцитов, конверсию гемоглобина в метгемоглобин (Лукьянова и др., 1982; Мецлер, 1980), окислительную деградацию гемоглобина (Mills, 1957; Пак и др., 1986), а также окисление сульфгидрильных соединений и метионильных групп белков, ингибирование некоторых ферментов, инициацию свободнорадикальных процессов перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот и разрушение цитохрома Р-450 (Владимиров, Арчаков, 1972; Фридович, 1979). Эти результаты получены в основном на изолированных клетках или органах теплокровных животных.

Влиянию перекиси водорода на гидробионтов, в том числе и на рыб, посвящены единичные работы. Так, при лечебно-профилактическом применении перекиси водорода учитывалась только выживаемость рыб (Mitchell, Collins, 1997). В двух отечественных работах установлены концентрации перекиси водорода, при которых появляются изменения в эритропоэзе сеголетков карпа, гематомы на жабрах у личинок вьюна, повышается уровень свободнорадикальных процессов в тканях личинок (Верещагин, 1988), снижается электрическая активность обонятельной луковицы рыб (Каплан и др., 1986).

Для комплексной оценки методов детоксикации и дезинфекции воды с помощью перекиси водорода этого недостаточно. Отсутствуют данные о влиянии перекиси водорода на наиболее чувствительные к действию окислителей физиолого-биохимические показатели рыб.

Кроме того, недостаточно исследованы возможности использования перекиси водорода для очистки воды от токсичных для рыб нитритов и сульфидов. Нитриты являются одним из основных токсич-

ных факторов в установках индустриального рыбоводства с рециркуляцией воды. Суммарное содержание сульфидов в артезианской воде достигает 10 мг/л в пересчете на Н28 (Вехотко и др., 1974), тогда как безопасные для рыб концентрации сероводорода находятся на уровне мкг/л (Смит мл., 1979). Нитриты могут окислять гемоглобин в крови рыб до метгемоглобина (Руссо, 1981). Иногда встречается также мнение об аналогичном действии на рыб нитратов (Шахмурзов, 1991), являющихся продуктом окисления нитритов перекисью водорода. Сероводород способен блокировать гемоглобин (Хочачка, Со-меро, 1988), однако его действие на гемоглобин в крови рыб не изучено. Одновременное присутствие в воде нескольких соединений, оказывающих отрицательный эффект на одни и те же гематологические показатели, может оказаться критическим для рыб.

Цель и задачи исследований. Цель работы заключалась в определении диапазона безвредных для рыб и наиболее эффективных для очистки воды от нитритов и сульфидов концентраций перекиси водорода. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- изучить влияние перекиси водорода в диапазоне концентраций от физиологических до лечебно-профилактических при разной длительности воздействия

- - на содержание метгемоглобина, гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, гемолиз и пероксидазную активность в крови рыб;

- - на уровень перекисного окисления липидов в тканях рыб и содержание цитохрома Р-450 в гепатопанкреасе;

- установить эффективные для очистки воды от нитритов концентрации перекиси водорода и изучить суммарное влияние нитритов и перекиси водорода на гематологические показатели рыб;

- изучить влияние нитратов на содержание метгемоглобина, гемоглобина и гемолиз в крови рыб;

- изучить влияние сульфидов на содержание дериватов гемоглобина в крови рыб;

- установить эффективные для очистки воды от сульфидов концентрации перекиси водорода.

Экспериментальные материалы получены в ходе исследований, выполненных за период с 1984 по 1991 гг. При обобщении результатов использованы литературные источники.

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Пользуясь случаем, хочу поблагодарить бывшего старшего лаборанта лаборатории токсикологии Евгению Александровну Житову и бывшего научного сотрудника НТЦ "Аквакорм" Павла Виленовича Лысенко за помощь в получении и обработке научного материала.

Глава 1. ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ ВОДНОЙ СРЕДЫ И ИХ РОЛЬ В ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ

(обзор литературы).

Окислительно-восстановительные процессы имеют большое значение при взаимодействии между водными организмами и средой их обитания (Сычев и др., 1983). Окислительно-восстановительный потенциал воды характеризует направленность окислительно-восстановительных превращений в среде и определяется содержанием как неорганических, так и органических соединений. Вклад отдельных окислительно-восстановительных систем в окислительно-восстановительное состояние природных вод неодинаков. Главные окислительно-восстановительные системы, которые вносят наиболее важный вклад в общий окислительно-восстановительный потенциал среды, образуются за счет кислорода, соединений железа, серы раз-

ной валентности, некоторых органических соединений. Величина окислительно-восстановительного потенциала отражает общее окислительно-восстановительное состояние многокомпонентной системы, но не может характеризовать относительную роль отдельных компонентов в образовании данного потенциала (Мхитарян и др., 1988). Показана возможность идентифицировать метаболические изменения активности в процессе ферментации бактериальной культуры в аэробных условиях по расхождению в профилях окислительно-восстановительного потенциала культуральной среды и растворенного кислорода (Kwong et al., 1992). Доказано значение положительного окислительно-восстановительного потенциала среды (от +400 до +440 мВ) для экспрессии ферментов анаэробного дыхания в клетках E.coli в отсутствие кислорода (Unden et al., 1990).

Вещества с выраженными окислительными или восстановительными свойствами попадают в водоемы разными путями. Так, некоторые окислители используются для очистки и дезинфекции питьевой воды, например, перманганат калия, соединения хлора, озон, перекись водорода (Пак, Лобачева, 1986). В практике небиологической очистки сточных вод в качестве окислителей чаще всего используют хлор, озон, перекись водорода. Микроколичества этих веществ могут оставаться в обработанной воде и оказывать действие на гидробио-нтов. Хлор в природной воде взаимодействует с гумусовыми веществами с образованием хлороформа, с аммиаком образует токсичный для рыб хлорамин (Дука, 1988), поэтому для применения хлора в рыбоводстве существуют серьезные ограничения.

Озон. Применение экологически "чистых" окислителей - перекиси водорода и озона - в рыбоводстве весьма перспективно, т.к. они являются природными соединениями и не загрязняют воду устойчивыми побочными токсичными продуктами. Озон является самым эф-

фективным из окислителей, используемых для очистки воды (Скворцов, 1978). В рыбоводстве озон можно применять для очистки воды от органических и минеральных соединений, улучшения физико-химических свойств воды и обогащения ее кислородом, детоксикации ядохимикатов и растительных токсинов, уничтожения патогенных вирусов, бактерий, грибов, дезинфекции и дезинвазии рыбоводного оборудования и инвентаря (Colberg, Lingg, 1978; Сапожников, 1991). Показано, что озонирование воды ведет к гибели многих эктопаразитов, свободноживущих в воде личинок гельминтов и веслоногих рачков, служащих промежуточными хозяевами гельминтов; следовательно, озон можно применять как средство профилактики многих инвазионных болезней рыб (Сапожников, 1991). В проточной озонированной воде (0,1 или 1 мг/л) более 99% патогенных бактерий в смеси с про-тозоем погибало через 60 секунд. Споры протозоя Bacillus polymixa были устойчивы в течение 10 минут. Окисляющая способность озона максимальна при повышенных значениях pH (Colberg, Lingg, 1978). Озон токсичен и для рыб, в концентрации 90 мкг/л озон вызывает макроскопическое поражение жабр ушастого окуня, при этом его действие часто сопровождается распространением смертельной грибковой инфекции, что указывает на повреждение эпителия кожи (Palier, Heidinger, 1980). СК50 озона для ушастого окуня при 24-часовой экспозиции - 50 мкг/л; при концентрации озона 10 мкг/л и четырехнедельной экспозиции погибало более 50% рыб (Palier, Heidinger, 1979). Некроз жаберного эпителия у мальков форели появлялся при концентрациях озона в воде более 2 мкг/л; следовательно, при очистке воды от загрязнений остаточная концентрация озона в воде не должна превышать 2 мкг/л (Wedemeyer et al., 1979), поэтому озонированную воду подают в емкости с рыбой только после распада в ней остаточного озона (Colberg, Lingg, 1978; Сапожников, 1991). Озон токсичнее

хлора, но быстрее удаляется из обработанной воды и не дает высокотоксичных продуктов. Токсичность озона определяется его свойствами сильного окислителя. Наиболее чувствительны к его действию клеточные мембраны. Первичный механизм повреждающего действия озона - окислительное расщепление полиненасыщенных жирных кислот. Озон может также вызывать окисление тиоловых групп белков, потерю цитохрома Р-450, оказывать мутагенное действие (возможно, в результате образования поперечных сшивок между ДНК и гистонами) (Goldstein, 1979). Витамин Е оказывает сильное защитное действие на чувствительность животных к озону (Мензель, 1979).

Перекись водорода обладает рядом технологических преимуществ по сравнению с озоном: хорошей растворимостью в воде, меньшей зависимостью эффективности окисления от температуры и рН воды, высокой селективностью окисления различных примесей, химической инертностью по отношению к аммонийным соединениям, относительно высокой стабильностью и простотой применения (Бе-ренблит, 1984; Селюков, Тринко, 1988). Токсичность перекиси водорода для рыб на 3 порядка ниже, чем токсичность озона (Метелев и др., 1971). Перекись водорода широко применяется в зарубежной практике очистки сточных вод. Перекись водорода позволяет эффективно очищать воду от соединений азота и серы, металлов, хлора, фенолов, ПАВ, красителей и др. (Максин и др., 1986; Селюков, Тринко, 1988), в сочетании с ферри-ионами и УФ-светом используется для разложения полихлорированных бифенилов (Pignatello, Chapa, 1994). В нашей стране перекись водорода для очистки сточных вод почти не применяется из-за сравнительно высокой стоимости и дефицитности. Однако освоение новых технологических процессов получения перекиси водорода и расширение ее производства приводят к уменьшению дефицита и стоимости этого окислителя. Уже создан относи-

тельно дешевый метод электросинтеза перекиси водорода на основе процесса катодного восстановления кислорода на графитовых электродах (Селюков и др., 1985). Перспективным направлением представляется создание пришитых фотосенсибилизаторов, генерирующих перекись водорода под действием солнечного излучения. Перспективно также налаживание производства малогабаритных электрохимических генераторов перекиси водорода на базе катодного восстановления кислорода. Могут быть полезны водопогружные источники жесткого УФ-излучения, под действием которого в сточных водах образуется перекись водорода, инициируются радикальные процессы окисления (Штамм и др., 1991).

Перекись водорода - более сильный окислитель, чем кислород (хотя по валентному состоянию должно быть наоборот), и более сильный восстановитель, чем вода. Перекись водорода как окислитель имеет более высокий окислительно-восстановительный потенциал, чем как восстановитель, поэтому молекула перекиси водорода, восстанавливаясь до воды, легко может окислить другую молекулу перекиси до кислорода (Шамб, 1958; Бабко и др., 1966).

Перекись водорода не является чужеродным соединением для среды обитания гидробионтов. Содержание перекиси водорода в естественных водоемах достигает 200 мкг/л, но обычно не превышает 3-Ю"6 М (102 мкг/л) (Синельников, 1980; Штамм, 1988). В рыбоводных прудах среднее содержание перекиси водорода достигает 300-800 мкг/л (Ким, 1976). Содержание перекиси водорода в воде определяется динамикой фотохимических и биохимических процессов ее образования и разрушения. Перекись водорода эффективно образуется в фотохимических реакциях за счет фотосенсибилизированных превращений растворенных в воде органических соединений (Cooper et al., 1983, 1986). Перекись водорода, непрерывно образующаяся в

природных водах под действием солнечного света, обеспечивает деструкцию соединений биологического происхождения, таких как триптофан, тирозин, гуминовые вещества и др.; присутствием перекиси водорода объясняют механизм возможного разложения в воде загрязняющих веществ искусственного происхождения (Draper, Crosby, 1983). Большой вклад в образование перекиси водорода вносят зеленые и диатомовые микроводоросли при действии на них солнечного света, а также некоторые виды бактерий (Pat Patterson, Myers, 1973; Сычев и др., 1983; Palenic, Morel, 1985; Скурлатов, 1988; Штамм, 1988; Штамм, Батовская, 1988; Батовская и др., 1988; Штамм и др., 1991; Иванов и др., 1997). Перекись водорода попадает в воду также из атмосферы, выпадая с атмосферными осадками (Kok, 1980; Zika et al., 1982; Tompson, Zafiriou, 1983; Cooper et al., 1987). В культурах водорослей максимальное количество перекиси водорода образуется в логарифмической фазе роста; концентрация пер�