Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимическая оценка роли антител к нейромедиаторам и психоактивным веществам для диагностики наркомании

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимическая оценка роли антител к нейромедиаторам и психоактивным веществам для диагностики наркомании"

РГ8 . ОД

- - --РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ ЩЩЖШ НАУК ГЕМАТОЛОГШЕСКИЯ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

| ШГЖШ Марина Александровна

БШШ11ЧЕСКАЯ ОЦЕНКА РОЛИ АНТИТЕЛ К НЕКРОМВДИАТОРАМ И ПСИХОАКМВШМ ВЗ^ЕСТВАМ ДЛЯ Д1'АГНОСТШ НАРШШЯИ

03.00.04 - биохимия

Диссертация в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора бислогических неук

Москва - 1993

Работа выполнена в Институте физиологии активных веществ РАН.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, пройЬессор, чл.-корр. АЕН Ю.к.Зарецная

Доктор медицинских наук, профессор А.А.Терентьев Доктор медицинекта наук А.Ц.Балашов •

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится "_"_199_г. в_ час.

на заседании специализированного совета Д 074.03.02 в Гематолог ческом научном центре РА1Ш (125167, Москва, Новозыковский прсез дом 4-а).

С диссертацией молко ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан "_"_^_192__г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В.Д.Реук

ОЩАК ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность пооблэмн. Для успешного решения проблемы, сеянной с диагностикой наркомания, необходимо проведете кошлек-фувдаментал£яыж к прикладные исследований в различных, областях • охиьаи, иммунологии, биотехнологии, каиравлекнкх на разработку сокочувствлтелъных методов анализа.

Е настоящее врехя за рубежом кзибслее шзреко используются им-кохмшческие кетокн определения интоксикации наркотиками. К ник ■яосят.ея разгеомауногнализ, гокогеннк? яькуноферкентный к иммуно-[уоресцентякЕ анализ. На их сенов» ряд зарубежных Фирм выпускает ивлерческлз наборы для определения наркотиков. Есе перечисленные гпе способы црздполагахт использование специального, дорогостоя-;го оборудования.

Дд.т выявления наркотиков в насей стране разработаны е прлме-готся ¡щзико-хиыическве методы (тонкослойная и газоаякостная зоматограгжя), которые трудоемка и длительна по времени исполне-4Я, требует предварительной обработки анализируемых образцов. В вяз к с этим, создание простых, -чувствительных к спешклчвых и.--дюхиг.этеоких метолов определения наркотических веществ является етуальной задачей.

Подход к диагностике наркомании, основанный на определении архотика или его метаболита имс-ет существенный недостаток, по-кольку позволяет диагностировать интоксикацию в течение несколь-суток с момента принятая препарата. чтот факт связав с метабо-взмоаг наркотических соединений и быстркм внведенпек их из орга-изма.

В литературе икегтея немногочисленное даннке о влиянии гоихо-ктиеннх наркотических веществ на иммунную систему животных и лк-ей, прежде ясего на гукоральнкз факторы дамуязтета. Так, при нутривекнсы взедзнш наркотиков часто отмечают повышение угоз-:я сывороточных иммуноглобулинов (!<} ). Эти факты можно обь-:сккть как результат хронической антигенной стимуляции. В зкепери-:енте на зевотных доказано, что длительное введение им даршина тщглър/ет в крозл образование агаудаглобулинод, связквапцих это оедчнение. Однако, сведения о характере изменения гуморального гдаундтета у людей, злоупотребляющих наркотиками и психотропны!.™ фепаратами весьма разрознены. Н= изучен вопрос о механизме гумо-илького ответа на введение этих веществ в формэ образования специфических антител.

Представленнке вше жалкие является основание.«.- для проведения

комплексного биохимического исследования по ветвлению к психоактивный препарата;«:, изучения их свойств при наркоманил у людей а разработке высокочувствительного ЕАщукохимического метода определения антител к наркотическим веществам. Результаты такого исследования открывают праншшзааьно новую возможность для диагностики интоксикации Еаркотакаш к другиья псшсоактввшшг препаратами.

Анализ современных литературных данных показывает, что механизм иммунологической защиты организма на введение каркоткхов .изучен недостаточно хорсыо .Наиболее широко известны -йакты о взаимосвязи нарушений имкунной и центральной нервной системы организма, происходящих при формирован!!!: зависимости.к психоактивным препаратам. Значительная роль а патогенезе данного заболевания отводится нейсомадзгаторам югсамановой а одиоашой природы. Эти соединения является теш гукоральныии факторами, которые осуществляют взаимосвязь двузс систеи и о пособия при повышении концентрации я избыточной активации привести к развитию икзднорегуляторного дисбаланса.

Б настоящее время вкетляеыы исследована.«;, свидетельствухдае о наличии в организме здорового человека 1о овязыветцих ряд эндогенных биологически активных соединений и называемых гстьствен-внми антителами - е~ЛТ. При патологических процессах урозсаь е-АТ может колебаться в коррелировать с тяжестью течения заболевания. Изменение нормального уровня е-АТ связано, как правило, с нарушением метаболизма того зли иного эндогенного биорегулятора, участвующего в патогенезе заболевания. Вот почему, большой интерес представляет обнаружение и изучение роли е-АТ к ряду нейромедиа-торов, изменение метаболизма которых имеет место при нар ко тки и у людей. К ним относятся, в первую очередь, соединения шноамшовой , и опиоидной природы. Детальное биохимическое доследование специфических реакций иммунной система, кгсащиеся выявления и изучения свойств е-АТ к данным медиаторам, открывает возможность к.создана® новых вадукозиммческих методов анализа для изучения механизма иммунопатологии га наркотика и диагностика зависимости к психотропным вещества!/..

Рать и задачи исследования. Цель работы состоит ^ определении роля антител к моноаклнак, опиоиднкк пептидам, психоактивнык препаратам при создании ноеого направления в диагностике наркомании, разработке эашективныз вариантов иммудашерменгяого анализа наркотиков и внедрении ях в практику.

3 соответствии с поставленной целью, определены следующие задач?, исследования:

- сазработать методы синтеза :.'озых коньюгсрсвакных антигенов, содержащих в сзоег.: составе психоактивные вещества к зндогей-ные нейрокедиагорк, используя в качестве какрокодекулярного носителя белковую- в поладеонуд каярацу;

- разработать различные варианта твердофазного 55А для определенна наркотически веществ (опиатов, какнабиноидоз, барбитуратов, зйедрина) в биологической ехдкостй челозеда;

- провести исследование по выямесив антител к оплата}.: в сн-восотке крови людей, разработать метод их выделения в изучить ик-кукохинЕческде свойства актвкорфЕНОЕкх антител;

- разработать нш-уноЁ-ерменткне кетодь" определения акте тел к певхоактивнни веществам и оценить есзкоеность их использования б диагностике наркоманив;

- на основе теоретических, экспериментальных ' биохимических доследований разработать ясные методы выявления антител к эндогенным биорегуляторам, участвующим в патогенезе заболевания наркоманией в сыворотке крови человека тзердейазныг. тазноФерментнык анализов (ША);

- исследовать имкукохамические свойства антител к одйоидяым пептида!: ( /-звдорщину, дер;;орэт.:?/), заявленных из сыворотки крови больных огийяоц нарко!.андей я доноров;

- провзстя сравнительный анализ содерканак специфических антител к психоактивным препаратам и энди ён:;:^: биорегуляторам е сыворотке крови допоров и больны?: наркоманией твердотазкш ША; оценить диагностическую значимость разработанных методов ИФА определения аятлтаг к наркотикам и кейромедиаторак для выявления заболевания наркоманией.

Научная новизна работы. Разработаны методы получения новых ксньЕгатов всихотрсднкх. веществ с белка!® и фериентака. Впервые синтезированы искусственные антигены на полимерной матрице, содержащие в качестве г&дтсна ошаты, опиоидяые пептиды, биогенные амины.

Разработаны оригинальные высокочувствительные твердофазные, ¡•ииунойерментяые методы количественного определения опиатов, препаратов эйедрина, каянабидоддов и барбитуратов.

Из сыворотка крови доноров е Сольных наркоманией с потацыо специально синтезированного иимунососбента выделены неизвестные ранее антитела к корзину и изучены их яммувоишческае езонотза.

- о -

Теоретически и экспериментально обоснованы яэеоэ направленна в диагностике- тркоь^тш, включапцзе создавав • методов определения антител к психоактивнш веществам. Ваервые разработан твердофазный Шк зняелзниг антител к опиатам я препаратам эЬздрина; определена диагностическая значимость предложенных методов для применения в медицинской практике.

В сыворотке крови доноров и больных наркоманией установлено наличие антител к эндогеннш нейроыедиаторги (биогенкнг<; ашшам и опеоядяым пептидам). У больных наркоманией, по сравнению с донорами, обнаружено изменение урон^ь антител к перечисленным визе эндогенным биорегуляторам, участвующим в патогенезе заболевания,

разработал новей метод получения иммуносорбентов для аффинной хроматографии; яа его основе впервые из сыворотки крови доноров и больных наркоманией выделены антитела к неЯргигедгаторам (^й-звдорфнау, дериордагу) и исследргаяк их йммунохльшческле свойства.

Получены новые факты, расширяющие представление о роля ж-¡лунной системы в механизме формирования зависимости к психоактивным препаратам у человека, свидетгльствуЕВДе о ток, что по мере развитая заболевания происходит образование антител как к экзогенным наркотикам, так и эндогеннш неЗромедааторам. Обнаруаена тесная взаакосвязь ыекду уровнем образования антител к юноаминам, опЕоадкам аептадач а длягельностъв употребления психоактивного соединения. Эти результаты позволила обосновать новое положение для разработки аетодов анализа, исподьзуздпх выявление уровня специфических антител к нейро^едпаторэи для диагностических цалей. Впервые га этой основе разработаны твердофазные вариант-н имцуно-шериенткого анализа для определения антител к опиоиднам пептиде.',! и бвогешм аминам.

Ерактаческая неннооть паботн. Полученные в работе результаты по созданза ногах кетодоз гожуноферментного анализа психотропных препаратов имевт ванное значение для практического использования в диагвестзке наркомании. На основе синтезированных новых искусственных антигенов (авторское свидетельство на способ получения искусственных антигенов 5 1614202) разработаны количественной: и качестззнннй (визуальный) варианта шмуношер^еятного анализа опиатов, препаратов эфедрина, барбитуратов и каннабконоидов, позволяющих с высокой чувствительнсстьа и достоверностью определять эти наркотика в биологической жидкости организма. Получены авторские свидетельства на способ выявления с лоиощье Й5А перечисленных выке

наркотиков J? 1544000, приоритетные справки tf 4B2255S, й 4824070, Л 49550392, Л 4950420 для опиатов, препаратов эйедркна, канна-биноидов и барбитуратов соответственно. Показана перспективность. , использования данных тест-систем для установления ¡Ьакта злоупотребления наркотиками. Ш выявления наркотиков апробирован в различных наркологических лабораториях страны. Разработана технология изготовления зи/унойеркептных тест-систем определения опиатов, барбитуратов какнабикоидов и йпрмоЁ "Синтез" начат ветуск опстно-прокшшейно* партии наборов реагеЕтсв для удовлетворения потребностей отечественного здравоохранения. (Н1Д приемочных испп-тани£ утзе.лтдена ГЕЯКНПС 33.02.SS г.).

Созданы гагнуноЬеркентные тест-скстекн для определения .антител к опиатаи и препаратам эфедрина, которке с 1982' г. используется в наркологических клиниках СССР. На способ диагностики опийной .и зшедроновоЕ наркомании пэлученк авторские свидетельства i' 1551087, приоритетные справки .К 4947040, Js 4B447S2.

Определена диагностическая значимость иа.уяоферментного анализа выявления антител к опиатам и препарата«; эфедрина в крови наркоманов, позволяющая объективно подтвердить Факт хронического употребления наркотических веществ спустя 2-4 г.есяаа с гсмента их последнего попадания з оргавизк.

С ISSS г. на базе Института физиологически активянх веществ РАН постоянно проводится методическая школа по обучении врачей из наркологических пентроз России новнк методам диагностики наркош-ИЕЯ.

Результаты по разработке синтеза имкуяосорбента (заявка на > авторское свидетельство, приоритетная справка № 434134). для выделения аятктел к опиатаи и отюидяньс пептида.1; являются перспективными для использования в практическом здравоохранении при создании аехнологпи получения селективных сорбентов в экстракорпоральных мзгодах лечения наркоманки. —

Основные полочная, внюсшаге на защиту.

Т. Создани ткунофермеятнне способы определения опиатов, препаратов эшедрина, каннабипоадоз и барбитуратов, являкщиеся чувствительными метода® анализа пригодный для использования в практическом здравоохранении.

2. Установлено, что длительное хроническое поступление психо-акглгяых соединений з организм человека, стимулирует у большинства людей синтез специфичных антител IoK и ïo5 класса, которке- могут быть выявлена е УМ.

• 3. Разработаны прикид дуально вовне методы диагностики нарекании, связанные с определением специфические антител к наркотикам и психотропным вещества}.!, которые можно использовать в качестве объективного теста на злоупотребление наркотическими препаратами.

4. Сбзаругено налачве в сыворотке кров;: человека антител к кейромедиагорам кокоаииношй и опиокдноё'природы. Выявлено увеличение уровня антител к данным биорегуляторам -по • мере шор;.ыроЕаяия зависимое?и к наркотика«, "оказана принципиальная возможность созданы нового направления ъ диагностике наркомании, основанного на разработке методов анализа определения антител к эндогенна», биорегуляторам, jчествующим в патогенезе заболевания.

5. Разработанные методы т&фтготермектного анализа определения антитез к. опноздкнм пептидам и биогенным аг.кна/.т могу? бнгз попользована в качестве дополнительных тестов как для диагностики наркомании. так и для установления сайсктивности проводимой тера-пчк«

Апробапия оаботк. Основные результаты исследования представлены на Всесоюзной конференции "Современные направлена,- создания медишвеких диагнсстикрш" (Москва, 1938 г.), 1-ом Всесоюзном иммунологическом съезде (Дагомыс, 1939 г.), Международной конференции "Лазеры и медицина" (Ташкент, ISS9 г.), 20 Съезде федерации европейского биохимического общества (Будапешт, I9S0 г.). УС Всесоюзно;^ сгезде "Инженерная знзимояогия" (Москва, T9ST г.), Мевду-народнэй конференции ''Ишушгеацпя и С1Щ" (Ленинград, TS3T г.), 15 Международном биохимическом конгрессе (Иерусалим, Т99Т г.), 3 Международном конгрессе общества нейроиммунологки (Иерусалим, ISSI г.), II Всесоюзном симпозиуме "Илкунобиотехналогия-ЭГ', Проблемы технологии производства зык/ноозерментных диагностккушв и их применение в здравоохранении (Дилер, Т99Т г.), I Российской* съезде иммунологов (Новосибирск, 1992 г.).

РЕЗУЗЬШЫ щшщрз&ш

I. Разоаботка различиях вариактоз твердофазного ША определения' психоактивных веществ в биологических жидкостях организма

Создание методов ISA обнаружения низкоюлекулярных психоактивных веществ включает решение ряда конкретных задач. В первую очередь, необходимо разработать способы получения иммунохимическвх реагентов: специфических антител и конксгироЬанных антигенов као-котика-гаптзна с r/акромолекуляркш носителем. Далее осуществляют

исследование оптимальных условий зз ар.» та действия иыкукоспецифи-ческих реагентоз на модельных варгантах ИА. определения данных веществ. Затем проводтт апробацию ®А выявления психоактивных препаратов в биологической емкости, устанавливают достоверность разработанного метода в сравнений с друга® вариантами анализа я дают саключэнке о его практическом'применении.

3 первой главе исследования излокевы ревенкя переделенных выше задач.

I.I. Получение реагентов ISA. определения ошатоз," каинабиноидов, производных эфедрина и барбитуратов

Для разработки твердофазных лмкуяофэрмеятких методов анализа наркотиков и получения специфических антител к низкодалекулярным наркотичзскич веществам б качестве реагентов синтезировала конъи-гяров?нвыб адтагены (КА) соответствуй!®: гаптенов с белками, а такге коякзгаты этих вацэств с ферментами. При получении ковъкга-тов морфина, эфедрина, каннабиноидов г. барбитуратов предварительно синтезировали производные этих гаиеясв, содерпалже карбоксильную группу. Ьто связано с там, что ня один из перечисленных выше паркотякоз ко содержит в своой структуре Функциональные груплн, пригодные да позалелтного связывания с белками в мягких УСЛОВИЯХ.

Исходныь гапгенн 6-О-гешсувцянат морфина (6-0-ГСМ) и З-О-ка-боксЕмэтдт ыорскн (?-0-Ш£) синтезированы из кор$?на и янтарного ангидрида ( В. и. dd. 1272) и ез шрфина з хкоруксусной кис-

лоты ( S. SpH'boz , 1972) соответственно. Гаптен, используемой двг конгюгатов с препдодда^г». эсёедрдна- С -Щедрин- идя э£ед-ров-//-3-дропионовую кислоту получали из производного эшедрдна is) ' 3.W. £¿.7/, T93I). Соединение 5-изоакал-5-(1-гидрокси-карбо?шп:еЕ?-5-шг) ОэрбЕтуровуккисдо?у подменяли в качестве гап-■тека (Б) дрп сдЕй-езс кс'гмзгатов. Гаптех^, на основе которого были слптззЕроданн кэнгеэгь'.ы, содарашцае в своем составе производное :сак.,яолнсютз, 6т пелуязн реаютден азосочетаяия ¿^-тетрагидпо-каннаолнола л дпез&яззеой ооли п-ашпобедзойной кислоты (л°-ТГК). Коньюгат? морфпаа, эфедрина, барбитуратов и каннабзноидов с белками (бычьим сигороточнЕг; альбуккяш-ЕСА,. овальбумивом-Ова, лизо-взмом-Яга) были синтезированы двумя способами: до методу смешанных алгибридов (г-егад СА} и с помощью водорастворимого карбодиимвза (метод ДЛИ). В реакциях козаледтного связывания исходя;« реагентов (модифицированного гаптена и белка) ксдользоваля кх различные го-

лярнне соотношения, в результате чего были получены КА, содерза-щие разное количество наркотика - гаптеяа на моль белка-носителя (Таблица I).

Таблица I

Характеристика полученных яонътированных антигенов

Ш: КА: Конысетрозан-ннй антиген : Соотношение гаптен-бэлок. : Метод * РМИФРЧР

.•вводимых в ре-:акцию соединэ--¡неё (моль/;.;оль) содгрзаяле гаптена в КА после синтеза Смоль/коль)

I. йoptffii-BDA 30:1 Г5 метод СА

2. Морфин-Лиз 14:1 П метод СА

3. й-С-ГГ,;ЮЕа 10:1 з метод КДИ

4. 14: Г п метод ?№

К \j . З-О-Ш-Оъа 7:1 2 иетод КДИ

6. З-О-КЙЕ-Ова Т0:Т 5 метод Klffi

7. 3-0-К155-0ва 14:1 ■II метод КИ-"

8. ЭФедрин-ЕСА 30:1 15 метод СА

9. ЭФедрин-Ова 3:1 2 метод КДИ

10. Эёедргн-Ова 6:1 5 метод ЮТ

II. Эфедрнн-Ова 14:1 II метод КЦИ

12. Эфедрик-Ова 3:1 2 метод ШШ

IS. д Э-ТГК-БСА 30:1 20 метод СА

14. д 9-ТаС-0ва 20:1 12 метод СА

Т5. л9-ТГК-Ова 5:Т з метод СА

16. Барбитал-БСА 30:1 20 метод СА

17. Барбитал-Ова 30:1 18 метод СА

18. Барбитал-Ова 15:1 ТО метод СА

IS. Барбитал-Ова 5:1 2 метод СА

Для разработки ингибиторного варианта ША морфина, препаратов эфедрина,барбитуратов, ^-тетрагидроканнабинола были получены комплексы, в которых гаптен ковалентно связан с ферментом-пе-роксидазоЗ хрена (Ш[). Комплексы гаптен-?-ермент получали по методу СА, используя е качестве исходных гаптенов 6-0-ГСМ, ^-зйед-рин - Л ''-3-про пионовую кислоту, 5-изоамил-5-(1-гидроксикарбоксил-пент-5-ил)-барбитуровув кислоту. Ковалентное связывание 9-тетра-гидроканнабинола с ферментом осуществляли с помощью Феррипианида калия. Б зависимости от соотношения вводимых в реакцию реагентов получены различные комплексы гаптен-Фермент, содержание 4 и П мо-

1е2 морфана или эфедрина не моль ПХ, а в случае барбитуратов и шшабиноидов в комплексе с феркептом было ковалеатно связано 5 1 15 талей гаптеяа на етлъ ГГС соответственно.

Вторым иммуноссешадическим реагентом в разрабатываемых вари- -актов Шк является антасыворэткн к наркотикам, которые получата иммунизацией кроликов синтезированным КА гаптеноз с БСА. В какдой полученной антиснворотне с помощью ИФА определяли титр антител (АТ) к гаптену, выделяли гамиа-глобулиновую фракцию я попользовали ее в качестве реагента в ЖА.

Для разработки ивгибнторного 1®А определения наркотических вешеств были получены комплексы АТ специфичных к соответствующим наркотикам с ферментом-ЕС. >

Таким образок, для разработки твердофазного КФА определения наркотических веществ быта получены все необходимые реагенты: кояъюгатн морссина, эгоедрина, бирбнтуратов и каннабиноидов с БСА для иммунизации яиеотных, АТ к данным наркотическим соединения!."., коньигаты перечисленных выше наркотиков с другими белками носителям - овальбушном и лизоппиом, различающиеся не только количеством молей гаптеяа, связанных с молем белковой матрицы, но и в случае КА с морфином местоположением связи гаптеяа с белком. Кроме того, были синтезирозаны комплексы исследуемых гаптеяоз-нарко-тиков с бэркэнтом, а также коныогаты АТ к наркотическим веществам с этим Ее Ферментом.

1.2, Конкурентный ША определения наркотических вэщесгз

Вариант твердофазного конкурентного ИФА определения низксмо-лекуляргых гаптенов вытачает следупдие стадии: сорбцию специфических к наркотику антител на ислветиролькый шаншет, конкурентное связывание свободного и меченного ферментом гаптена-каркотика с адсорбированными АТ и измерения Ферментативной активности иммунного комплекса. Концентрация Ферментной метки на твердой базе в этом случае обратно пропорциональна концентрации гаптена в анализируемом образце.

Не. первом этапе разработки конкурентного !15А определения наркотических веществ (морфина, эфедрина, барбитуратов и каннабивои-дов) подбирали оптимальные концентрации сорбируемых на тдзрдую Фазу АТ к этим наркотикам-гаптенам и разведения комплексов нарко-тик-Ш, содержащих различное количество молей гаптеяа, ковалентпо' связанных с молем фермента. С этой цальв предварительно исследовали в прямом Ш взаимодействие комплекса наркотик-Ш с гамма-гло-

буяиновой Фракцией кроличьей антиснвороткз к соответствующему наркотическому соединение (морфину, эфедрину, барбитурату, тетра-гидроканнобанолозому производному). По полученным в ИФА данным исследовала зависимость оптической плотности (OD ^gj) от концентрации сорбированных на твердой Фазе антит&л к ггптену при определенном раззгиедяи комплекса яаркотин-ЕХ, а таете зависимость QD 4д2 от раззедендя комплекса наркотик- IK при определенной концентрации Al к гаптену. На оспоЕашш анализа полученных результатов было установлено, что комплексы наркотик-IÍX с меньшим содержанием гашена лучше сзязнваются с соответствующими антителами. Кроме того, шя этлх za хоьшепсол характерен ¿oíее протяженней участок л1'ле£но* зависимости поглощения е ¡ffiA от концентрации сорбируемой гакма-глобулиновой фракции. Эти данные позволили сделать вывод о том, что в ИФА предпочтительнее использовать комплексы наркотик- EDC с меньшм содержанием гаптена, ковалентнс сел-занного с фешенюм.

Построение калибровочных кривнх (рис. 1-4) проводили при найденных соотношениях гсншдекса наркотж-ПХ и антител к веку, исследуя при stom сЕязызание кодексов гаптен-ПХ с соответствующий специфическими антителами зависимости от количества добавляемого в пробу свободного наркотического вещества.

Как показано на рис. 1-4, область ликейяой зависимости для определения перечисленных вше препаратов, лежи* в диапазоне от • 27 до SSO hi/Vji для морфина, 0<I Ю 20 ICO мхг/'кл - зри эфедрина, от S0 до 600 нг/мл - для каннабкноэдов и от 230 до 750 нг/кл -для барбитуратов.

Разработанные методы конкурентного К?А позволяет веяветь психоактивные зецества в биологических жидкостях, однако их собственными недостатками является длительное время проведения анализа (более трех часов) г неустойчивость кояъюгатов наркотиков с ЕХ при хранения. Это побудило нас к разработке другого варианта твердофазного Й5А - ингабиторного 13А.

1.3. Икгйбигорный Шл определения наркотикоз

йнгиситорнкЗ Шк для определения низкомолекулярных веществ, обычно, вклячает следующие основные стадии: иммобилизация анткге-на гапген-нооитель на твердую фазу, внгибированне свободным гапте-еом связывания специфических антигаптеяоЕых антител, меченных тер— ментов, с июобилизовашшм на твердой Фазе антигеном и измерение Ферментативной активности образовавшегося иммунного комплекса.

"о 10

03 06

04

- 13 -

в/в,

о 08

Оо

04

02

дасЛ. Калибровочная кривая определения могаина конкурентным й$А

ЦС 3 4 5 о

рис.2. Калибровочная кривая определения эфедрина конкуоеитным ИФА

жс.З. Калибровочная кривая * рис.4. Калибровочная кривая

определения каннаби- определения багйэтур&тов

ноидов конкурентным конкурентным ©А. ИФА'

На ряс. 1-8 по оси абсцисс - , где С - концентрация наркотика э иг/ил; по оси ординат - отношение оптических гдотнсстей В/Бо4 где В - измеряемая ОП^д?, В0 - ОВ ^ в отсутствии наркотика.

Таблица 2

Определение наркотических зещсетв ингибиторным ЙФА

Определяемое наркотическое вещество : Антиген, имюби-: лизованннй в : цлннаете гСоотнове-:ние гап-:тен-белок :з КА

морфин 6-О-ГСМ-Ова 3:Г

морфин б-О-ГСЬ'-Ова П:Г

морфин З-О-КШ-Ова 3:1

морфин 3-О-КМК-ОЕа 5:1

моршин 3-О-КШ-Ова 11:1

6,1 -эшедрин эФедрин-Ова 2: Г

:!, С -эфедргн эйезрия-Ова 5:1

J, i -зФедран ■ зФедрин-Ова 11:1

л 9-ТГК 9-ТГК-0ва 2:1

д9-ТГК --ТЕК-Ова 12:1

барбамил барбитал-Ова 2:1

барбамил барбитал-ОЕа 10:1

барбамил барбитал-Ова 18:1

:Диапазон измеоений :наркотика

50-1х104 нг/мл 310-2x10® пг/ля 22-200 нг/мл Т9-2,5х104 пг/мл 700-2х103 нг/мл Т,0-5& мкг/мл 25-IxIO2 шсг/мл 60-2x102 мкг/мл 20-3,5хЮ2 нг/мл Т50-5х102 нг/ьт 25-ТхГО3 нг/мл 1хЮ2-5хЕ03 нг/мл З,5х10~-Гх10^ нг/мл

С целью разработки высокочувствитатьного ингибиторного Й5А определения (морфина, эфедрина, даннабпноидов и барбитуратов на первом этапе были подобрали оптимальные концентрации сорблруемнх на твердую Фазу соответствующих антигенов наркотик-белок и комплексов антител к наркотику, меченных ферментом ИХ, при которых в системе антиген-АТ достигается равновесие. В качестве сорбируемых антигенов использовали конъюгаты лазрФин-Ова, в которых молекула гаптена присоединена по разным положениям (3 и 6-оцу) к белку,кроме того, эта конъюгаты содержали различное число молекул морфина ковалентно связанных с молекулой белка. При определении других наркотиков: эфедрина, барбитуратов и каннабиноидов на планшет сорбировали конъюгаты с различным содеркаяием гаптена.

Калибровочные кривые строили из найденных оптимальннх условий взаимодействия ювяэбилизозанного антигена и антител к нему, при этом исследовала связывание комплекса АТ-Ш к соответствующему наркотику с антигеном, сорбированным на твердой Фазе, в зависимости от количества добавленного з пробу свободного гаптена наркотика. Данные по определению ингибиторным 'Ш. диапазона измерений концентрации перечисленных выше препаратов, для всех используемых

По ос:: абсцисс не. рис. 4-Э - ЦдС , где С - концентрация в случае морфина пгД'л, и нг/мл для остальных наркотинов. В качестве антигенов исполоэобшы: 3-(МОМ-Ова (5:1), эфецрин-Ова ;2:1), Д. -ТГК-Ова 13:1), барбитал-Ова ,.2:1)

антигенов представлены в таблице 2, а ка рис. 5-8 приведены калибровочные кривые определения этих веществ, достроенные при обработке цифровых значений ША с использованием норрадяшонпого анализа (Шшцер б.ТГ. г др., 1232) с максимальной чувствительностью.

Таким образом, разработанные нами варианты ингвбиторного КФА позволяют выявлять корфая е концентрации-19 иг/т, збедркн -1,0 мкг/мл, каннабивоиды - 20 нг/мл, барбитураты - 25 нг/мл.

Т.З. Исследование специфичности лнгкбиторзого ША определенен психоактивных взществ

Далее нами, была изучена специфичность иигибиторного КФА оп-редепекия наркотических препаратов. Результаты исследования приведены в таблице 3.

Как видно из приведенных в таблице 3 данных, предложенные методы твердофазного икгзбиторкого УФА позволяют выявлять определенные классы наркотических вещести, относящихся либо н опиатам, либо к производным азедрдна, либо к каннабинокдам, либо к производным барбитуровой кислоты, поскольку антитела, используемые в качестве реагентов в 5ЮА, являются специфичными и не дают перекрестных реакций с наркотическим? и лекарственными препаратами другой" химической природы. Таким образом, разработанные варианты ИФА могут быть рекомендованы для определения данных груш наркотических веществ в диагностических пеяях.

Представленные методы Ш>к обладают енсокой степенью воспроизводимости и точности: коэффициенты вариации составляли 7-Ю%, а отклонение стандартной кривой не превышало 2-4$.

Следует особо подчеркнуть, что ингибиторный ША для выявления опиатов и производных зшедрина могло применять не только в количественном, но и в качественном варианте с визуальной оценкой результатов. Установлено, что морфия в концентрации 1,0 мкг/ш я зсведрпн в концентрации 10 мкг/мл практически полностью ингабируют взаимодействие меченных йерментом специфических антител к наркотику с соответствующим антигеном на твердой Фазе, что регистрируется в ША в виде сникеяня оптической плотности в 2,5-3 раза по сравнению с контролен, не содержащим ингибитора (морфина, эфедрина). Следовательно, этот метод дозволяет объективно оценивать наличие данных наркотических веществ в указанных выше концентрациях в образце при сравнения окраски раствора исследуемого образца со стандартными контрольный раствора:®.

Таблица 3

Специфичность ингибитошого ИФА определения наркотических вёщестз

Определяемый в ИОА класс наркотических веществ

Ингибитор

:% ингиби-'.' :сования : :б И5А

Ингибитор

:% ингн-:бироза-•лш в :ИФА

ИОА спрсдоле-еия наркотиков отьося-иихся к класса опиатов

морфин .100

кодеин 9

дегпдсюксико- 0,003 деия

диацетилмэроин 42

декстрометорйан 0,01

леворфенол 0,2

аминазин 0,3

эфедрин .0 ,007

галоперидол 0,007

Фенобарбитал 0,001

вгашжал натрия 0,00Т

6-0-ТС!,'

дегяяроксико-деизом

дегсдгакспко-деик

дионин

апскорфин

теСаин

кокаин

шгаольфен

барбамнл

димедрол

атдапин

30 0.,003

0,004

С ,05

0,4

0,003

0,13 •

0,007

0,001

0,17

0,35

]®А определения НАРКОТИКОВ, относящихся к ото-еззоднш зфед-пина

с1 -эфедрин 100

£ -эфедрин 100

адреналин 0,01

"Фенобарбитал О,ОТ

йоешШарогаламиЕ 27

кокаин 0,001

и, £■ -Эфедрин эфедрин

¿, С -амретаж^ мор£чн

прспнлгексндпЕ

/9-

•ПК

1®А определение наркотиков, относящихся к производим оар-битуоовой кислоте

<3сфба>.пл 100

эт~й».нал натрия 30

Фенобарбитал 30

мединал I

тиобарбггал 1,8

морфин

эфедрин

л9-тге

амнказш?

эфедрин

ТОО 100 4Т О,ОТ 45,2

о,оот

0,01 0,01 0,01 0,01 0,01

ИФА определения наркотиков, относящихся к классу каннаби-ноидов

й МГК 100 морфия О,ОТ

эфедрин 0701 эфегтрик 0,01

барбамзл 0,03 кокаин 0,05

фенобарбитал 0,5 ¿, ¿-зт.йетгмгл 0,01

й 8-ТГК 100 II ноМТК-ккс- 100

лота

Таким образом, в результате проведенных исследований разработаны количественный и качественный варианты твердофазного икги-биторяого ША определения опиатов, каянабаноидов, препаратов эфедрина и барбитуратов, отличавдихся высокой чувствительность!), воспроизводимостью и специфичностью.

1.4. Определение наркотических веществ в биологической жидкости организда ингибиторнда.ИФА и сравнение полученных результатов ША с другими методами анализа

Для опенки достоверности разработанных вариантов ®А. проводили выявление наркотических веществ в моче лиц, подозреваемых в злоупотреблении этими препаратами. Причем, в каждом анализируемом образце мочи проводили сравнительное определение наличия наркотика, как методом ISA, так и Физико-химическими методами, используя . тонкослойную и газжидкостную хроматографию (ТСХ и ГЕХ).

Определение наркотических веществ физико-химическими способами было проведено совместно с сотрудниками 17-Й наркологической больницы г.Москвн (Горбатова Т.И., Аколаев А.Н.).

При анализе 134 образцов мачи пациентов, подозревающихся в злоупотреблении ошантами, как с помощью разработаншмир вами инги-биторного ИБА, так и с использованием коммерческой тест-системы фирш " И оfisnwi -La-о-ка. " бшо получено полное совпадение результатов. Наличие опиатов при этом установлено в 79 пробах.

Далее провели определение содержания опиатов в этих же образцах мочи методом ТСХ.- При этом оказалось, что в данном случае морфин выявляется только в 65 тестируемых образцах. Следовательно, использование разработанного наш Шк позволяет выявлять большее количество образцов, содержащих юрфин, что связано с более высо- / кой чувствительностью этого метода.

Для выявления диагностической значимости разработанного ША определения каннабиноидов провели анализ ¿^-ТГК в 25 образцах мочи пациентов, подозреваема в злоупотреблении веществами этого шшсса. Эта ze образцы анализировали с использованием реагентов гомогенного ША Зарин " Syro.", метода анализа, принятого в мировой наркологической практике для определения лекарственных и наркотических препаратов. В результате было установлено наличие

в 80? исследуема образцов как с помощью разработанного И®А» ¿»к и методов Ш фирмы " и. ^та данные позволяют рекомендовал» разработанный метод ША в наркологической практике для масвовю скрвнинговнх обследований населения.

Аналогичные исследования были выполнена для оценки достоверности результатов, получаемых с помощью ингибиторного ИФА определения препаратов эфедрина, при этом сравнивали данные ША, ТСХ, Г1Х. Одновременное определение эфедрина и его производных прово- .• дили перечисленными выше методами в 95 образцах мочи лицей, подозреваемых в злоупотреблении этими наркотическими препаратами. На основами данных ТСХ, эфедрин и его структурные аналоги, представляющие, как правило, смесь первитина и эфедрина, были выявлены з 64 образцах (66%). Более высокочувствительный метод ГЕХ позволил установить наличие эфедрина и его производных уке в 94 анализируемых пробах. Проведение ША всех анализируемых образцов выявило присутствие эФедрина и его аналогов в 87 случаях. Как видно из этих результатов, разработанный ША позволяет определить эФедрин и его структурные производные в значительно большем количестве случаев (91/0 по сравнению с ТСХ, но несколько меньшем, чем ГГ. Яго обстоятельство связано с различной чувствительностью используеинх методов. Однако, учитывая простоту выполнения ИФА и небольшое время анализа, разработанный метод определения эфедрина моьет успешно использоваться в наркологической и судебно-медицинской практика.

Апробация разработанного ША определения барбитуратов проведена на 40 образцах мочи пациентов, подозреваемьх з злоупотреблении наркотическими веществами, при этом сравнивали данные ИФА и ТСХ. Б результате было установлено, что высокочувствительный КФА не только подтверждает наличие барбитуратов и их структурных производных в анализирусг:.нх пробах. вкязляемых г иомоцьэ ТСХ, но и позволяет дополнительно диагностировать присутствие этих наркотических Еещессз в 25-805? исследуемых образцов.

Полученные данные убедительно'свидетельствуют о достоверности результатов, получаемых с помощью разработанного ингибиторного " ЙФА определения наркотических веществ (опиатов, эФедрина, барбитуратов, какнабиноидов) в моче. Использование зтих результатов работы позволяет практически подойти к решению проблемы диагностика в наркологии: и судебной медицине в случае злоупотребления данными наркотическими веществами, либо при их передозировках и отравлениях психотропными лекарственными препаратами, имеющие з своем составе перечисленные выше соединения.

2. Разработка нового подхода к диагностике наркошшш, основанного на определении антител к психотропным веществам твердофазным Шк

Згот раздел диссертационной работы посвящен созданию новых методов выявления зависимости к психоактивным препаратам у человека. Наиболее широкое распространение в мировой практике получили методы диагностики наркомании, основанные на определении б биологической жидкости человека употребляемых наркотических ве-шеств и продуктов их метаболизма. Различные варианты таких методов анализа были разработаны нами и описаны в предыдущем разделе. Использовать эти способы анализа мокно лишь в течение первых 2448 часов после попадания наркотика в организм. Цель наших дальнейших исследований заключалась в разработке метода анализа, позволяющего диагностировать наркотическую зависимость в более отдаленные сроки госле последнего приема наркотика. Для решения этой задачи необходимо осуществить широкий спектр биохимических исследований, касалцихся механизма развития данного заболевания.

В литературе имеются единичные данные о наличии антител к психоактивным препаратам в сыворотке крови ивотных и людей. Так, показано, что длительное хроническое введение в организм животного дизкомолекулярных веществ, стимулирует у них образование иммуноглобулинов, связывающих данные соединения. Такие иммуноглобулины мояно обнаружить в сыворотке крови животного в течение некоторого времени после прекращения поступления наркотика в организм. Кроме того, существуют данные с том, что в организме лед ей, злоупотребляющих опиатами или страдающих гашишизмом, присутствуют иммуноглобулины, связываание эти наркотические вещсстза, однако их выявление не было достоверным.

Все перечисленные выше сведения побудили нас провести систе-г,этическое биохимическое исследование, направленное, в первую очередь, на установление фактов существования таких антител в сы-зоротке крови больных наркоманией и доноров. Далее, на разработку методоЕ выделения и изучения свойств данных антител, и, самое главное, на создание новых методов анализа, используемых в дальнейшем в диагностике наркомании и зависимости к психотропным препаратам.

2.1. Выделение антител к опиатам афинной хоомато-графиеЗ и исследование их свойств

Для проведения аффинной хроматографии,был получен иммуносор-бент на основе реакции смешанного ангидрида 6-0-ГСМ с аминопропи-

дарованным макропористым стеклом. Выделение антител проводили из сыворотки крови 12 доноров и 12 больных опийной наркоманией. При этом концентрация белка, выделенного из сыворотки крови больных опийной наркоманией находилась з интерзале 0,036-0,05 кг/мл, а в • сыворотке доноров была равна 0,01 ¿¿0,003 иг/мл.

Далее с помощью ингибиторного'ИЬА были исследованы иммуяохи-мическке свойства (афгинность и специфичность) выделенных из сыворотки крози лэде2 1о.. 3 случае аналлзьруемых образцов сыворотки крови доноров константу аффинности (Ка) удалось установить только для одного образца и ее численное значение составило лишь ТО4},Г1", что свидетельствует о низкой аффинности Т^, близкой к значениям, разделяющим специфические и неспецифические взаимодействия в системе гаатен

В противоположность этому Ка бяти опредачены для 10 из Т2 образцов антител, выделенных из сыворотки крови больных опийной наокоманией, причем их значения лезат в шкрокок диапазоне -ГО^-ТО1-'-^1 для ТоН и Ю7-Т0ГТ1Г1 для 1о& антител.

<] с!

Исследование специфичности аятиопиатных антител, выделенных из сызоротки кров?, наркоманов проводили 1®А с использованием з качестве ингибиторов ыорфина и соединений структурно родственных ему, но отлпчащпхея от морфлза характером заместителей з 3-м и Б-м положениях молекулн или отсутствием эпоксидного мостика (кодеин, героин, апсьирфиз, дигидрокеккодеияон, дионин, табаия). В результате обнаружено, что антитела к мэссбяну, образухлдаеся у различна; -лгедея при хрони~ес;:ом употреблении пизког«олекулярнкх опиатов, йндизадугдьпы по своей специфичности. Но тем не мекзе, среди них можно выдалш'ь группу людей, обладаниях ввсоноспедаФячЕиш антителами только к корфару, кодеину или героину, либо антитела, рэагиружцие в различной степени.как с морфином, так и с его производными. Однако, антио мятные антитела, выделанные из сыворотки крови наркоманов, на взач.\;одэ&ствовалз ни с одним из соединений родственных морфину, но не являющимся его метаболитом.

Таким образом; проведенные итлмунохимические исследования антител к опиатам, убедительно свидетельствуют о тем, что длительное введение низкомолекулярных опиатов индуцирует у большинства людей синтез специфических антшпиатных антител. Полученные результаты являются основанием для разработки методов ан?.тиза антител к наркотикам, используемым в диагностике наркомании.

2.2. Разработка Й5А выявления антител к наркотикам

Проведенное вше исследование явилось первым этапом в разработке способов анализа для создания нового направления в диагностике зависимости к психоактивным препаратам. Обнаруженную индукцию синтеза антител к опиатам и существование различий в специфичности можно объяснить образованием в организме человека естественных конъюгироваиных антигенов. Механизм получения таких конъюгатов основан на том, что под действием ферментативных систем низкомолекулярные гадтенн трансформируются в реакцаонноста-собные метаболиты, которые реагируют с эндогенными бедками, образуя разнообразные коЕЪюгаты, обуславливая синтез специфических антител. При этом, как показывает наш исследования, у большинства людей могут синтезироваться естественные ко ¡¡котированные антигены, отличающиеся по структуре, что-и подтверждается в конечном итоге разнообразием индуцированных антител. •

Дальнейшая задача исследования заключалась в разработке методов выявления антител у больных наркоманией и доноров с помощью твердофазного ИФА. Для ее выполнения требуется осуществить синтез необходимых реагентов и на их основе выбрать оптимальные условия проведения Шк обнаружения антител к наркотикам и психоактивным препаратам.

2.2.1. Получение реагентов для выявления антител к наркотика.: и психоактивным веществам

В качестве объекта исследования налет были выбраны больные опийной ж эсЬедроновой наркоманией, поэтому для выявления антител к опиатам и препаратам эйедрина у этой категории больных наркоманией мы провели синтез серии конъюгированных антигенов, имеющих в своем составе в качестве гаптеяов различные структурные производные морфина и эФедрива. Это связано с тем, что низкомолекулярные гаптены-индукторы синтеза специфических антител после ковалентного связывания в мягких йизиологических условиях с эндогенными бедками образуют большое количество естественных конъюгированных антигенов. Во той же причине для выявления всего спектра антител, образующихся в организме больного, необходимо осуществить синтез конъюгатов разнообразных по химической структуре, отличающихся как количеством гаптена, ковалентно связанного с белком, так и местоположением связи гаптена с белковой матрицей.

Так, для определения антител против эсбедрнна у болвных э«ед-

роновой наркоманией получены КА путем конденсации в присутствии карбодиимида с/-,1 -эФедрин или с1,£■ -эФедрон-пропионовой кислоты с овальбумином, вмещие различное молярное соотношение гаптена и белка-носителя (1:3 и 1:Т2). Синтез конъюгатов такой структуры : обусловлен тем, что больные эфедроновой наркоманией употребляют главным образом препарат, приготовленный окислением эфедрина и содеркащий в своем составе определенную доли как исходного соединения, так и различные продукты его окисления - эфедрон, первктин. Все эти соединения являются структурно родственники и содержат в своем составе остатки бензольного кольца и замещенные аминогруппы, превращающиеся в организме з реакционносгособные метаболиты, содержащие Феноксильные, гидроксидяые, эпоксидные и другие радикалы, способные вступать в реакцию с эндогенными белками, стимулируя синтез разнообразных по специфичности антител.

Для выявления антител к морфину у больных опийной наркоманией бклк такте синтезированы различные по химической структуре КА, на основе использования в реакции конденсации с бедками производных морфина: б-О-ГС" и 3-0-КММ в соотношении гаптен-белок (1:4 и 1:14). Полученные конъюгаты позволяют зняелять антитела, индуцированные в организме естественными коньюгированнвми антигена;,я, образующимися за счет бвотрансформадии морфина в различные реак-цлопноспособные ингермедиаты (азиридиновые, феноксильные, эпоксидные) .

При получении КА, используемые для выявления аятител в скво-ротке крови больных наркоманией, необходимо учитывать Факторы влияния структуры белка-носителя на результаты анализа. В связи с этим нага* разработан впсокозсйекпвнкй новый способ получения искусственных антигенов на основе полимерной матрицы, использование которых в иммукоанализе позволяет определять антитела, саязы-заыс:еся непосредственно с гаптеном, исключая белок-носитель. Метод создания новых антигенов основан на реакции конденсации поли(4-интрофенпл) акрзлага, т.е. полностью активированной полиакриловой клслоты о амлногрушагя, либо присутствупцими, либо последовательно введенными в молекулу гаптена. Данный способ синтеза является универсальным и позволяет обеспечить заданную молекулярную массу КА и варьировать состав и соотноиекие лигандоз-гал-тенов, включаемых в искусственный антиген.

Наиболее детальна целесообразность получения и использования новых искусственных КА экспериментально исследована нами по;: разработке ®А определения опиатной зависимости у человека.

Синтез конвоированных антигенов на основе полимерной матрицы осуществляли с предварительной модификации гаптена. Для это- . го использовали морфин карбоксилированный по шестому или третьему положение (6-0-1СМ или 3-0-КШ). Далее зтерифицировали карбоксильные группы производных морфина и полученные эФяря вводили во взаимодействие с гексамегилевдламинок. Затем производили конденсацию полученных соединений с доли-(4-нитротенил)-акрилатом, осуществляя контроль за количеством присоединившихся молекул морфина. Получаемые антигены содержали 1556-20$ замещения полимерной матрицы молекулами гаптена через спейсер по третьему-3-оксикарбо-нилметил-морФин-полимер (3-М-Т!) или шестому-б-гемисухшнатморфин-полимер ^ 6—положению молекулы.

2.2.2. йммуноферментннй анализ определения антител к наркотическим и психоактивным веществам

Разработка твердофазного иммуноФерментного метода выявления антител к опиатам я препаратам эфедрина в сыворотке крови людей проведена на основе синтезированных КА. Анализ выполняли по следующей схеме: I стадия - сорбция антигена на полистирольный планшет, И стадия - инкубация иммобилизованного антигена с образцом сыворотки крови и Ш стадия - выявление связавшихся АТ с помощью конъюгата антавидовых антител против человека различных классов с Ферментом и регистрация ферментативной активности.

На первом этапе исследования осуществляли оптимизацию условий проведения ША яа каздой отдельной стадии при использовании пула сывороток наркоманов и доноров. Во-первых, изучали" влияние структуры и концентрации раствора антигена, используемого для ' сорбция на планшете на выявление антител. Во-вторых, провели оптимизации условий, при которых происходит связывание иммуноглобулинов из сыворотки крови человека с антигеном иммобилизованном на планшете. В-третьих, выбрали условия выявления иммунных комплексов иммобилизованных на длашете: антиген-1^. человека. Цель этих исследований состояла в подборе таких параметров ИФА, которые обеспечивали бы наибольшее превышение уровня ОС 493 ё для пула сыворотки крови наркоманов над уровнем оптической плотности, регистрируемой в ИФА, для нормальной сыворотки. Данные по подбору условий проведения ША, представлены в таблице 4.

Далее с помощью разработанного ША провели установление факта наличия антител в сыворотке крови наркоманов.

Способ выявления антител против производных эФедрина' и морфи-

Таблица 4

Условия проведения ЙФА выявления антител к опиатам и препаратам эфедрина в сыворотке крови людей

Выявление антител к опиатам и препаратам эфедрина

Выявление антител к опиатам

сорбируемые

(гаптен-белок)

:к^нпентра-:^веде-_

:вора КА .ОТ :для сорб- : :пии мкг/мл:

сорбируемый

(гаптен-беяок)

:ко.=шент- :разве-

:рапия раствора :КА для :сосбшш

гдение : сыворотке

т X « Эшедрин-БСА 12:1 5 1:100 5. 6-0-ГСМ- Ова 1:4 2 1:100

2. Эфедрин- Ова 12:1 5 1:200 6. 3-0-КШ- Ова 1:4 2 1:100

3. ЭФедрин- 5 1:200 7. 6-М-П I 1:400

Ова 3:1 8. з-м-п I 1:400

4. Маршин-Лиз 1:14 10 1:100

на апробирован на сыворотках крови 75 больных эфедроновой наркоманией и 953 больных опиатной наркоманией, в качестве контроля использовали сыворотки 320 практически здоровых людей. Все полученные данные обрабатывали, используя методы вариационной статистики. Для того, чтобы установить количество больных с достоверно повышенным уровнем иммуноглобулинов, связавшихся на планшете с исследуемыми антигенами, по сравнению с донорами, за велдчину порогового уровня, разделяющего нормальные и аномальные сыворотки, принимали полученные в серии .тестов среднее значение оптической плотности (ОС 492 в мя нормальных сывороток длюс трехкратное " значение стандартного отклонения.

При использовании в ИФА коньюгатов № I и 2 (табл. 4) в обследованной группе больных эфедроновой наркоманией достоверное увеличение уровня антител наблюдалось как для так и для типа и' составляло 8% и 54^ соответственно. Наилучшие результаты получены в случае применения в 1йА конъюгата № 3 (табл. 4). Достоверное увеличение антител в группе наркоманов, по сравнению- с контрольной группой, составляет 40% для 1^6- и 72$ для Г^Ч соответственно.

В разработанном варианте ИФА определения антител к морфину у больных опийной наркоманией в случае использования з анализе КА, в которых морфин ковалентно связан с белками-носителями, процент

выявления достоверно повышенного уровня соответствующих специфических 1о колебался от 55% до 74$. Полученные нами ранее резуль-с

татн, свидетельствующие о том, что специфичность антиморфиновых антител индивидуальна для каждого больного и направлена к разным участкам молекулы гаптена, явились побудительным стимулом для использования в №А выявления таких антител, не одного, а двух антигенов, отллчапцпхся тем, что молекула гаптена присоединена к молекуле макроколекулярного носителя по разным участкам и через разные связующие "мостикн"-цепочки атомов углерода: 6-ОГС1.'-ОЕа и З-О-КМК-Ова (табл. 4). Это позволяет увеличить выявление достоверно повышенного уровня антител е сыворотке крови наркоманов по сравнению с донорами до 80^. При проведении сравнительного эксперимента по определение Го против морфина 5 сыворотке крови опийных наркоманов и доноров"на оснозе использования в №А КА, различавшихся как природой мгкромолекулярного носителя, так к местоположением гаптеновой сеязи (зто - морфин-Лиз, Б-К-П и З-М-П) получены следующие результаты. Применение КА 6-й-П по сравнению с первоначально использованным в ИФА белковым антигеном морфин-Лиз -позволяет ешзить повышенны.! урозень г. морфину у большого (на 10^) количества больных опийной наркоманией. Использование КА З-Ы-П распирает возможности йФА, так как повышение уровня антиогш-атнкх антител обнаруживается дополнительно еще в 5-8% случаев, причем в тех образцах сыворотки крови больных наркоманией, в которых не установлено увеличение уровня антител при использовании в анализе конкзгатов морфин-Лиз и б-М-П. Таким образом, совместное использование в ИФА антигенов 6-К-П и З-К-П для определения анти-опиатных антител в сыворотке крови человека, позволяет выявить повышение уровня к морфину у 90% больных опийной наркоман* ей, что кокет слуяить основанием для применения данного метода в диагностике заболевания наркоманией.

2.2.3. Определение диагностической значимости разоабо-танкого 1®А определения антител к наркотикам

Ус ..'овлекле диагностической значимости разработанного твер-дофазног; ГОА выявления антител к наркотикам в клинике различных типов на! ;*эдшшё проводили совместно с Институтом клинической наркологии Государственного наркологического центра 1й РФ (чл.-корр.

Анохина К.П., Бркн Е.А., Копоров С.Г.). Для выполнения работы обследовали несколько групп больных наркоманией и группы здоровых доноров (200 чел.), не имевших контакта с наркотиками. Первую наиболее обширную группу (более 500 человек) составили липа с досто-

верно установленным Фактом злоупотребления опиатами, но без детальных анамнестических и клинических данных, т.е. это была случайная выборка опийных наркоманов. Сыворотки крови этих людей были представлены нам из различных наркологических диспансеров страны.

Вторую группу составили больные опийной наркоманией (27 человек), поступивших в клинику добровольно, т.е. в этом случае высока объективность анамнестических данных. Бее больные этой группы утверждали, что употребляют опиаты.

С помощью разработанного ША установила, что в первой группе опийных наркоманов более 80$ Срс 0,001) больных имеют достоверное превышение порогового уровня антиопиатных антител.

Такой высокий процент выявления больных с повышенным уровнем антител даже при отсутствии точных клинических данных о стаже наркотизации свидетельствует о высокой диагностической значимости разработанного ША, как дополнительного теста для подтверждения Факта злоупотребления опиатов. '

Для второй группы больных был проведен анализ уровней антител как к морфину, так и к эфедрину (таблица 5).

Анализ клинических показателей течения заболевания и полученных данных иммуяохимического анализа позволил установить, что больные, имеющие повышенный уровень антител к соответствующим наркотическим веществам, находились в состоянии абстинентного синдрома. Важно отметить, что больные опиатной группы, давшие положительную реакцию не только опиаты, но на опиаты и зФедрин, а з двух случаях только на эфедрин отрицали потребление наркотических производных эфедрина и эфедрин содержащих лекарств. Однако, выявление у таких больных специфических антител к эфедрину, вероятно, свидетельствует о том, что они употребляли смесь наркотических веществ. Более того, эти Факты лодтверддены и клиникой протекания абстинентного периода у этих больных. Следовательно, можно предположить, что торговцы наркотиками разбавляют опийенй раствор более дешевым в производстве перветином шш эфедрином, что приводит к Формированию нового типа оптйно-эфедриновой полинаркомании.

Необходимо отметить, что у ряда наркоманов обследованной группы содержание антител к наркотикам было в пределах нормы. Анализ клинических данных показал, что большинство больных этой группы скрыто наркотизировались и факт отсутствия антител к наркотическим препаратам объясняется тем, что в кровотоке свободно циркулирующие антитела связываются з иммунный комплекс с поступающим в организм

Таблица 5

Содеожание Го. , связывающих конъпгаты морфинг (А) и этедрина (Б) во второй группе больных наркоманией и доноров

пп 'Значения СЭ^ в КФА для * антггеноз Н; Значения 0Г432 в ЯЩ антигенов

А : Б А ; Б

1.

2.

е.

7.

ТО.

11.

12. ТЗ. 74. 15.

Больше 0,973 -0,815 -1,090 -0,910 -1,107 -0,855 -0,827 + 0,918 ^ 0,521 0,496 1,049 + 0,655 -г • 0,805 -0,760 -0,973 -

0,710

0,540

0,651

0,471

0,552

0,570

0,629

0,6Т2

0,923 +

0,951 -

0,942 +

0,826 +

0,875 -

0,915

1,02? -

= 5'

17.

18. Т9. 20. 21. 22.

23.

24.

25.

26. 27.

0,918 -0 5Т2 0,493 0,577 0,500 0,435 0,456 0,535 0,463 0,411 0,923 -41,008 +

Доноры

Хс р±Я1 0,523 Л,030 X ЗГ 0,732 .

0,374 0 520 0,634 0,^39 0,654 0,532 0,645 0,654 0,562 0,551 0,653 0,519

0,623^0,0^1. 0,810

Яоижечание

отмечены 0.оЛС5.? в ©А для снвоооткл коовь наскома-

ков, кмешэк достоверно пов^енное содеожание Го. к

•данному антигену, т.е. бсльые 7„ -=• Зет'*.

ср

наркотиком и не шяз^лэтся йыА.

Таким образом, исследование уровне!: антител к наркотическим препаратам отгожвает новые возможности для диагностики наркомании."" Во-первых. определение содержания таких атжал способствует выявление Факта хронического злоупотребления наркотиками в отдаленный п* 7<иод после последнего приема наркотика. Этот метод может быть огм нно необходим, когда нет четких клинических признаков заболевав я, к имеется сомнения в диагностике наркомании. Во-вторых, выявление антител к наркотикам дает возможность уточнить состав употребляемых препаратов. В-третьшс, этот метод может быть дополнительны}.': тестом для выявления приема наркотика в клинике и объективизации клинической оценки эффективности проводимой терапии.

Для полно! оценки диагностической значимости разработанного КФА определено число возможных ложноголожи*ельных результатов у 195 больных различными заболеваниями (аутоиммунными расстройства-

ми, психическим? и инфекционными заболеваниями, алкоголизмом). Пит этом было устаЕовлеяо, что частота ложнополокительных результатов в этих группах составляла не более 6$.

.Б связи с зим методы ИФА, разработанные на основе нового ; подхода к диагностике зависимости к психоактивным веществам могут быть рекомендованы при массовых обследованиях населения для выявления скрытой формы наркомании, а также для решения сложных вопросов диагностики, связанных к определением профессиональной пригодности. Ваклое преимущество разработанного способа заключается з возможности выявлять.АГ в сроки, достаточно отдаленные от момента последнего поступления наркотика в организм (до двух месяцев и более), что расширяет возможности диагностики.

3. Разработка-козых методов ИФА выявления антител к эндогенным биорегуляторам, участвующим в патогенезе заболевания

Создание новых методов ИФА проводили на основе детального биохимического исследования естественных антител (е -АТ) к эндогенным биорегуляторам.

Имеющиеся в литературе данные, свидетельствовали о том, что важной составной частью иммуноглобулинов, циркулирующих в кровотоке практически всех здоровых людей являются е -АТ. Оки обладают полиспецифичностью и способны связываться с целым рядом собственных молекул организма. Основная Физиологическая Функция е -АТ заключается в выведении из организма потенциально патогенных субстанций, продуктов клеточной деградации. Проведений; широкий круг предварительных исследований позволил получить более ясные представления о роли е -АГ, связызанцзхся в организме как с низкомолекулярными эндогенными соединениями, в частности с простагладди-нага и моноаминами, так л с молекулами белков - регуляторов гемостаза (тромбин, антитромбян-Ш, о^-макроглобулкн).

Первоначально нами была обследована группа больных стенокардией Ш и 1У функционального класса. 7 этой категории больных обнаружены неизвестные ранее е-АТ к широкому кругу биологически активных соединений, принимающих участие в патогенезе 'Молевандя (таблица 6).

Показано, что у части больных наблюдаются существенные изменения уровня е-АТ по сравнению со здоровыми людьми. При этом у наибольшего процента больных отмечаются изменения нормального содержания е-АТ к тромбину, антитромбину Ш, норадрензлину и адреналину. Далее на основании клинических данных было установлено, что

Таблица 6

Уровень е-АТ к биологически!.! соединениям у больных стенокардией

Группы : Уровень -АТ, | в % Количество больных, в * а р

е-АТ к тромбину I ' 136,7 ±7,4х 43,5

П 104,В ± 1,87 5о,5

е- АТ к <Аг>.: Г 67,8 ; 7,3" ТТ,3

п ТОО,9 ± 7,55 83,7

е -АТ к АТ 11 I 13£,0 +.3,7* 44,0

п ТОЗ ± 7,8 56,0

е-АТ к дофамину I 136,Т ± 3,7й 35,0

п ТС6,2 ± 1,8 - - 65,0

е-АТ к норадгеналину I 155,0 ± "4,8Н 70,0

тт ' 106,0 ¿2,2 30,0

е-АТ к адреналину I 147,6 ± 5,2К 70,0

п 102,2 ± 2,Т 30,0

е-АТ к простатландину I 139,0 ; 4,0 25,0

п 61,1

ш 74,3 + 3,28* __ 73,9

е-АТ к простаглавдину г^д I Т39,7 ± 4,Г 25,0

тт ТОО,2 * 3,4 61,1

ш 72.6 ± 2,5Х Т3,9

е-АТ к гистаьЕну т 139,3 ¿4,3 27,8

и 99,0"! 2,2 58,3

и 70,8 ¿ 3,4х 13,9

е-АТ к сэротонзву I 140,6 * 3,5х 19,4

п 96,3 + 3,5 52,8

ш 75,9 + 2,2е 27,8

Т группа больные с юзышеннш уровнем -АТ; П группа - вольные с нормальным уровнем -АТ; Ш группа - 1ольаые с гоникеннык уровнем -АТ;

~ - достоверность различий по критерию Стькдента по сравнению с контрольной группой.

-ЗТ -

у большее стенокардией при повышении уровня е-АТ к тромбину и катеходаминам наблюдается достоверное увеличение тяжести течения заболевания, а для е-АТ к тромбину также и достоверное увеличение свертывающей системы крови. Исследована динамика изменения •' содержания е-АТ при проведении терапии. Отмечен избирательный характер влияния экстракорпоральных методов на уровень е-АТ к различным соединениям, зависящий от исходной величины отклонения от нормального уровня.

Как видно из приведенных выше Фактов, содержание е-АТ .к перечисленным вше соединениям, изменяется в кровотоке человека при патологиях, обусловленных нарушением обмена соответствующих ключевых биорегуляторов и в некоторые случаях коррелирует с активностью заболевания и эффективностью проводимой терапии. Таким образом было установлено, что изменение нормального содержания е-АТ к биологически активным соединения.: является уникальным маркером нарушения метаболизма соответствующего -антигена. .

З.т. Выявление е-АТ к яейромедиатооам твердофазны.!

УМ в сыворотке крови больных наркс:.анией

Результаты, полученные при установлении роли е -АТ к ряду биорегуляторов у больных стенокардией явились побудительным стимулом к разработке методов, позволящих исследовать у больных наркоманией уровень е-АТ к широкому кругу соединений, изменение метаболизма которше имеет место при данном заболевании. Ведущая роль в механизме формирования психофизической зависимости к наркотикам у человека принадлежит нейромедиаторам коноэшноесй и опиоидной природы. По этой причине наш исследования направлены на разработку методов определения антител к двум классам перечисленных выше эндогенных биорегуляторов.

3.1.1. Шлучение реагентов и выбор услоьий проведения ЙФА

Выявление 1д, связывавших биогенные амины и опиоидные пептиды проводили твердофазным ИФА, в котором на голистирольный планшет иммобилизовали коньигироваяннй антиген'соогветствущего нейромеди-атора. Далее проводили инкубации с анализируемым образцом сыворотки крови и определяй количество связавшихся с помощыз конъюга-тов против и человека.

Для сиггеэа НА кы применили разработанный нами ранее принцип получения искусственных антигенов на полимерной матрице. КА нейро-медцаторов синтезировали путем конденсации биогенных аминов (серо-

тонина, гистаына, нэрадреналина, адреналина, дофамина) и ряда опноидных пептлдоз (деркорфина и его аналогов, а также t-ги и tlet -энкефалЕНов) с 4-полднитроФеш!лакрилотом. Использование полимерной матрицы, содержащей. предварительно активированные карбс-ксильные групдк в зпде п-яЕтрофенклогого эфира, позволило в мягких условиях получить синтетические антигены моноаминов и пептидов, сохраняя практически без изменения структуру исходных гап-тенов. Получено три вида конызгатоЕ, содержащих полностью ззме-щенную гаптени: матрицу, ZC% присоединенных молекул гаптена к ней, либо IO-15/i отзывание молекул лиганда с лолимрпом. Такое разнообразие сянть.-яруемЕХ КА обусловлено теь:, что при выявлении антител к любслгу г: перечисленных выше нсйрс^едиаторов на первом этапе мы исследовали влияние структура искусственного антигена на полноту связывания в ИМ с гетерогенной популяцией 1о, присутст-вупдих б сыворотке крогв больных и доноров. В результате обнаружено, что конытатк с 10-155! гггешениеч поликерной матрицы -нейромедиатором является ирктодныш для определения популяции специфических 1о, различающихся- как силой связывания с антпгспом, так и концентрацией в каждой индивидуальной сыворотке человека.

Знбор условий проведения Шк для выявления 1о к биогенным аминам п опиогдныи пе^ядам, а такхе оценку получаемах результатов, проводил?- на основании критериев, выбранных нами ранее з разработанных вариантах ®А выявления антител к наркотикам.

3.1.2. Определение с шкотью M<d.s е-АТ к ионоакакам з сыворотке крови наркоманез и доноров

При обследовании сыворотки кргзи здоровых доноров с помощью твердофазного ISA, нами впервые была обнарукены 1о класса 6- ; Д,\ связывающиеся с конъюгатамг. эндогенных назкомолевулярчых биогенных аминов. Для группы Сольных гапкаяой и опийной наркоманией з ИёА установлено, что содержание в сыворотке крови , связывающих "исследуемые моноаманы, практически не отличается от нормы.

Результаты сравнительного анализа но определению 1оМ, связывающих бк гендче аминь:, в группе больных с наркотической ваЕиеи-костьз г. шэров представлены > таблице 7.

Как щзо из представленных результатов, у больных опийной наркомании it в среднем по группе по сравнению с донорами, наблюдается увелйченге уровня 1оЕ, связывающих дофамин и серотонш. В группе больныг с гашишной зависимостью выявляется достоверное повышение уровня Iolti, специфичных только для дофамина, содержание

Таблица 7

Иммуноферментянй анализ содерзания 1оЫ, связывающих биогенные амины, в группе доноров и Зольных о зависимостью к наркотикам

Биогенные амины

Значения оптической плотности ?' ИФА (ОР 403)

доноры

больные опийной:больные гашиш-наркоманией :ной наркома-:нией

Цойагяая

Норадреналин

Адреналин

Сесютондн

Гисташн

0,486 + 0,024

0,783 + 0,021 0,605 +0,011 0,354 + 0,015

0,77Г ± 0,019 р < 0,01 0,807 + 0,027 0,532 + 0,014 0,795 + 0,025 р< 0,01

0,780 +0",020 р< 0,01 0,794-¿0,030 0,559 + 0,117 0,660 + 0,021

0,422 + 0,012 0,802 + 0,002 0,792 + 0,04

1ой, связывающих адреналин и норадреналин не отличалось от нормы.

Полученные результаты по .увеличению уровня Г^ подтверзщают данные об участии дофаминергяческой и серотоннкергической систем в развитии наркотической зависимости. З.ти системы,, как известно, участвуют в регуляции, физиологических процессов, направленных на сохранение гомеостаза в изменявшихся условиях внешней и внутренней среди. Прием наркотика ведет к повышенному выбросу биогенных амидов, которые в свою очередь сказывают влияние на синтез спегга-фичесдих.Г^ способных выполнять, по нашему мнению, компенсаторную функцию и регулировать концентрацию данных моноаманоэ.

3.1.3, Определение с покощьв ИФА. г-АГ протдв опиоидных дептидов в сыворотке крови наркоманов я доноров

С помощью разработанного варианта ЙЭА проведено выявление , связывающихся с целым рядом низкомрлекулярных опиоидных. пзд-тздов, являющихся селэкатиЕныет тгзш$ж 'а^Гопиатных рецепторов.Так, впервые было установлено в сыворотке крови доноров наличш 1<2. , связнваюгцихся с из комол едулярндми-опиоидными пептидами. Полученные. факты позволили расширить .спектр, известных естественных антител к низкомолекулярннм гндогеяянл соединениям. Проведенный сравнительны! аналаз'. содеркания ± апиоидам з группах доноров и больных опийной наркоманией показал, что уровень 1о остается практически одинаковым у всех обследованных лиц. Результаты по

выявлению 1оМ, связывающие ошаоидные дедтидн у доноров и больных наркоманов, представлены в таблице 8.

'Таблица 8

Данные ОД содержания 1оМ к ошюидннм пептидаы у доноров и больныХ наркоманией

ОпЕОидные пептида

Значения оптической плотности в ИИ. при 492 на

■ппнппи : бОЛЬЕНе опийной

доноры . шркошнне2

—ЭНДОрфИН Ма -энкефалкЕ энкеФалин дерморфин

С ,588 + 0,021 0,670 £ 0,026 0,505 £ 0,025 0,757. + 0,017 0,519 + 0,015

0,673,+0,024 0,810 + 0,044 0,603 +.0,068 0,941 £0,032 0,606 + 0,021

Как следует из полученных данных, у больных опийной наркома-, нией,в средаек по группе, наблюдается специфическое увеличение уровня связывают* дериоршан. Содержание ГоМ к ¡2» -эндорфину и эккёфайнам не отличалось от норчы.

4, Исследование иммунохюяческпх свойств азтител т. А-эндорфину, дерморйкну, Еэделенных из сыворотки крова доноров и больных наркоманией

Выделение антител к опиоиднш пептидам впервые проводили из сыворотки крова наркоманов и доноров с помощью синтезированного икмуносорбента. Для его получения к суспензии акйЕОирошишроЕак-ного макропористого отекла, активированного предварительно поли-нитрофенилакрглатоы, добавляли в одном случае соответствующие количества /5-эннорфша, в другом дерморфина. После ковалентного связывания ошсзднях пептидов с макропористым носителем определяли емкость полученных иммуЕосорбентов (0,-5 иг/т) и использовали их для афлинноЁ хроматографы.

В 1и.'"естз= объекта исследования каш была выбраны сквородта крови доноров 2 наркоманов.

В число последних вошли больные опийной наркоманией "в сыворотке крови которых содержались антитела к морфину и больныз полв-каркоманией, шепцие в сыворотке крови антитела, как к морфину, так к к эфедрину. После проведения.хроматографии наш 6ыле выделены из сыворотз крови больных и здоровых лиц антитела к (2 -зЕдор-

Фину и дерморфину О л M класса.

Причем 70% доноров имели антитела к fi -эндорфину Г^класса, а остальные, как , тая и IgM. 3 случае антител против деркор-Фина в сыворотке крови присутствовали в основной le? é , а в единичных • случаях I^f г Ipl антитела. При исследовании' изотипичес-кого состава антител против опиоидных пептидов, присутствующих в сыворотке крови опийных наркоманов было обнаружено, что у 30% обследованных опийных больных выделены Г^М антитела, а у остальных, как 1оМ, так и Го (г антитела против р -зядорфика.

»U каздой сыворотки крови ошайнкх наркоманов хроматографзро-ваны антждерморфиноЕые антитела, относящиеся к Ы классу. Для больных полинаркоманией также в равной степени характерно наличие Го <г и Ioj,t антител к опиоидным пептидам.

<1 а

Далее для всех исследуемых образцов антител против опиоидных пептидов определили константу аффинности. В результате было установлено, что у 50$ до но оо в' Rk для антител к Р -эндорфину составляет величину I08-I0S!.rI для ГоМ и 109-ЮГ0Г.Гг дг_~ Го'5- . Для оставшейся половины доноров Ка не удалось рас читать. Для всех анти-дермэрфиновых антител, выделенных из сыворотки крови донороз Ка также не была рас читана, что, вероятно,'связано с наличием, в сыворотке здоровых доноров популяции низкоаффиннвх антител к данным антигенам. Для больных наркоманией величина Ка колебалась в широком диапазоне и составляла Ю7-!©^'-^ и IQ^-IO-1}!-^ для IgM л Го 5- антител, к ¿-зндорфину; 'в случае дермоФина зта величина составила 105-10%ГГ, для ГоМ и Ю9-Ю101ГГдля lof.

с "

Далее для всех исследуемых образцов антител :-: опиоидам была

изучена специфичность связывания с некоторыми лигаддамя опиатяых рецепторов, имевдих сходную с /3-экдорфином Физиологическую активность ( Lno , //¿¿-энкефалины, дерморфин, / -эвдорфпк, морфин). В результате установлено, что все сыворотки крова индивидуальны по своей специфичности, но тем не менее в каждой сыворотке крови донора присутствует популяция антител {рюш M класса, обладающая перекрестным связыванием (Г0-35#) хотя бы с одним лигавдом^-оди-атного рецептора.■Этот факт, по Еашему мнении, связан с наличием общих детерминант, участвующих в связывании с ^-статным рецептором и узнаваемых антителами к опиоидным пептидам.

Для группы обследованных наркоманов характерно увеличение специфичности антител к /3-эндорфину и дерморфину и отсутствие перекрестных реакций с другими лигандами/'-опиатных рецепторов.

Обобщение результатов по имкунохимическоыу исследовании антител к опиоиднш пептидам свидетельствует.о.тесной связи систем гуморального иммунитета г. опяоидннх пептидов. По мере развития . наркотической зависимости с появлением антител к экзогенному наркотику (эфедрину, морфину) изменяется ш сравнению с донорами и изотипический состав соотношения 1о ¿- и 1о" антител к эндогенному /о -эндорЗдну и дерморфину, происходит увеличение количества ' больных, содернаших 1о" антитела. Кроме того, по мере развития заболевания, увеличения в сыворотке крови эндогенных опаоидов, увеличивается специфичность антител к £ -эндорфину и дерморфину, способных избирательно связываться с ошоидннми пептидами, предохраняя организм от их патогенного воздействия.

Таим образом, проведенное сравнительное исследование икЕ-гу-нохимических свойств антител к & -эндорфину и дерморфину показало, что при возникновении наркотической зависимости изменяется -аффинность и специфичность антител. Зги изменения являются отра-гениек течения заболевания.

5. Диагностическая значимость выявления антител к Еаокотикам, биогенным аминам, олиоидным пептидам у больных наркоманией

На основании результатов, полученных в назем исследовании ранее установлено, что у больных наркоманией наблюдается повышение уровня 1с|, связывающих наркотики, в то не время у них происходит повышение уровня 1ом к некоторым эндогенным соединениям, таким как ошоидные пептиды, биогенные амины. На следующем этапе работы необходимо установить диагностическую значимость метода ИМ выявления уровня 1о к перечисленным вше наркотикам и биорегулятора?.:.

Для группы больных опийной наркоманией провела иссчедоБание по установлению взаимосвязи мецду уровнем антител к морфину а исследуемым кейроыедиатором. С этой целью были построены ланей-ные корреляционные зависимости между значениями ОЙ^ в И9А определения к опиатам и 1дМ, связывающих серотопин, дофамин ,

•дерморф: а. Коэффициент лзнгЕной корреляции мекду уровняш аити-морфиновых в 1оУ к дофамину, серотонииу, дерморфину составляет 0,64 , 0,58 , 0,72 (р< 0,01) соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о сикбатном изменении содержания антител к опиатам и данным, нейрокедлаторам у больных опийной наркоманией.

Таким образом, при развитии некоторых видов наркомании пропс-

ходит изменение специфического гуморального мкукитета, выражающееся в увеличении уровня З^М, .связывавших как экзогенный наркотик, так и эндогенные нейромедпаторы.

Анализ результатов ИЗА определения антител нейромедиато-рам в сыборотке крови наркоманов показал, что достоверное повышение уровня аятитэл х морфину; сопровождается в первую очередь повышением уровня антител к опиоидам, в частности к дерморфину.

При исследовании уровня , сЕязыващих биогенные ашнн, обнаружено, что в группе больных с повышенным уроинем , к морфину, увеличение уровня 1о к моноаыинаы зависит от длительности заболевания. Так, в таблице 10 представлены' данные, показывающие, что при стаже наркотизации до 6 лет (в наблюдении 9 человек) повышение уровня 1о к одному из антигенов отмечено у 6 человек, при стаже наркотизации от 3 до 17 лет (в наблюдении.8 человек) увеличения уровня 1о к одному антигену отмечено только у одного человека, .-а у 7 пациентоз наблюдалось повышение уров&ч 1о уже к двум и более антигенам.

Таблица 10

Результаты ША содержания 1о. к биогенным аминам з группе больных наркоманией с различным стажем наркотизации

..Гоуппа больных со стажем . нгрЕОтизают от I до £ .лет

Группа -больных со .стажем нар-котдзации от 8 до 17 лет

Время : Исследуемые антигены : Время :Исследуемке антигены

наркота-:-;нарготд-=-

запии :серо:гис-:норад-:дос:- :зздин :сеоо-:гис- : норад- :дсс-(год) :то- :та- :зена- :ам£н : (.год) :то~ :та- : оена- :амйн

:кип :;лш :лан

га-

ЛИН

13 10 17 8 10 13 10 о

+

+

+ +

+ +

+

+

Знаком "+" отмечены больные в снЕоротке ксоеи которых отмечено достоверное повышение уровня к данному антигену.

Зга факты свидетельствуют о том. что система биогенным аш-еоз и огшойдеш: пептидов' по-разкому участвуют в патогенезе наркомании. Опиопдная система в первую очередь реагирует на развитие заболевания и только спустя некоторое время могло обнаружить изменения в систеке биогенных аминов. Обе эти системы, за счет изменения содержания нейрокедааторов, осушествляют регуляцию физиологических процессов, направленных на адаптацию организма к изменяющимся условиям внутреннего и внешнего окружения. Увеличение уровня 1о к нейромедиаторам на определенном этапе развития наркомании оказывает защитное компенсаторное действие и регулирует функцию этих спсте::..

Выявление уровней этих 1о твердофазным ®А может быть использовано в клинике наркомании: во-первых, для подтзержд&ния Факта злоупотребления наркотиками во-вторых, для установления длительности употребления наркотических препаратов.

ВЫВОДЕ

1. Разработано теоретическое и экспериментальное обоснование нового направления в диагностике наркотической зависимости, включающее создание методов определения антител к экзогенным психо-тротсшм препаратам и эндогенным нейромедиатораы, участвующим в патогенезе заболевания (авторское свидетельство № 1551С87).

2. Из сыворотки крови доноров и больных наркоманией с помощью специально синтезированного ич«,!уносорбентг впервые выделены антитела к морфину. Установлено, что хроническое введение наркотика в организм стимулирует образование рнгител к опиатам у большинства (9($) додай, (авторское свидетельство !'- 4371034).

3. Разработан твердофазный-иммунофермектпкй метод выявления антител к психоактивны*; препаратам (опиатам, препаратам эфедрина) в сыворотке крови людей. Доказано диагностическое и прогностическое значение выявления антител к наркотикам для определения зависимости к данным веществам (патент № 4947040).

4.0бнар;,гзена в сыворотке крови людей естественные антитела к непременнагорам (опиоадным пептидам, катехояаминам, биогегпжм аминам). Установлено повышение уровня естественных анпггел к данным биорегуляторам у больных наркоманией по сравнению с донорами. Показана эффективность анализа таких антител для решения задач диагностики наркомании.

5. Из екзэроткк кроет доноров и больных наркоманией аффинной хроматографией выделены антитала к огиокдннм пептидам: /з-энцор-

фину и дермрофину. Установлено, что по мэре рас вития наркотической зависимости у больных наркоманией происходит изменение свойств антител к опиоидным пептидам: возрастает их специфичность и узе- : личивается содержание в кровотоке высокоаффинкых антител класса.

6. Показано, что определение антител к опиоидным пептидам, катехозаминам и биогенным минам з сыворотке крови больных с помощью разработанных методов нмыунофермьнтного анализа является на-дехккм критерием диагностики заболевания наркоманией, как на первом этапе обследования, так и з динамике, позволяя выявлять сроки начала употребления наркотических веществ.

7. Разработаны методы получения кокьагирозанкых антигенов на основе психоактивных веществ и эндогеггных нейромедиаторов. Впервые с;::гйлировакы искусственные антигены на лолиыэряой матрице, содержащие з качестве гаптснов:-' опиаты, отаоидные пептиды, катехолами-ны, биогенные амины. Доказана универсальность разработанной схемы синтеза для получения коньюгатоз чизкомолекулярных соединений (авторское свидетельство ]1614202).

3. Получены иммунохимические реагента для разработки твердофазных методов шму но ферм енгного анализа определения наркотических веществ и их специфических антител: конъкгяроганные антигены морФина, эфедрина, каннабкноидов и барбитуратов с бычьим сывороточным альбумином, кроличьи антитела к данным наркотическим соединениям, коньюгаты перечисленных зыпе наркотиков с лизсциыом, овальбумином, пероксидазоГ: хрена, а также конзагаты антител к наркотикам с пероксидазой хрена.

9. Разработаны высокочувствительные конкурентов и дагибитор-ные твердофазные методы для им.чуноферментного анализа наркотических веществ: опиатов, барбитуратов, каннабиноидов и эфедрина з биологических жидкостях организма. Показана эффективность приме-кения разработанных методов иммуноферментиого анализа для диагностики в наркологической и медицинской практике (авторские свидетельства £ 1544000, 1745042).

Список работ по тема диссертации

I. Бовин Н.З., Зотиков В.А., Иванов А.Е., Корчагина Е.Ю., Мягкова М.А. Спосоо' получения иммуносорбентов для связывания груп-поспецифических антител// Заявка на авторское свидетельство № 4371034. - 9.02.1988.Положительное решение 23.12.1989.

2. Бовин Н.В., Байрашва Н.Э., Зешкнухина Т.В., Корчагина Е.Ю., Мягкова К.А. Способ получения искусственных антигенов// Авторское свидетельство J.- I6I4202. - 1990.

3. Гаврилов O.K., Фомичев З.И., Федосеев A.Ü., Мягкова U.L., Полевая О.Ю., Новозиенова Т.В. Влияние .плазмосор?ции на содержание естественных антител к тромбину ¿¿,-макроглобулдау у больных стенокардией// Тер.архив. - 1991. - 4. - с. 71-73.

4. Гаврилов O.K., Ковигаенова Т.В., Мягкова ¡а.А. к др. Естественные антитела к некоторым компонентам свертывания крови и изменения их уровня под влиянием плазмафереза// Тез. Всесоюзной конференции "Физиология и наркология гемостаза". - Полтава. -1991. - с. 15-16.

5. Гаврилов O.K., Лекохыахер С.С., Добашна А.Н., Мягкова U.A.

и др. Прогностическая значимость измерений уровня естественных ^антител к тромбину у больных стенокардией// Кяинич.мед. - 1992. -PI.- с. 23-26.

6. Зефиров К.С., Полевая O.Ü., Мягкова М.А., Лушнккоза .¿.В. Способ клчуноферменгного определения опиатов в моче// Заявка на авторское свидетельство № 4622555, пололлтелънсе решение о-т 03.05.90 г. •

7. Зефиров Н.С., Полевая GJ)., Мягкова ¿i.A., Лушшкоза М.В. Способ имцунофериентного определения, эфедрина в моче// Заявка на аЕтоггдоа свидетельство № 4824070, полокчтельное решение от 10.05.90 г!

8. Зефиров Н.С., Полегая О.Ю., Иягкобд М.А., Лушникова М.В. Им-муноферментный способ определения сфэдрияа в сьтьорогке крови

. - больных эфедроновой наркоманией// Заявка на авторское свидетельство fr-- 48447922, положительное решение от 05.07.90 р.

9. Зефиров Н.С., Полагая О.Ю., Иягкова H.A. Способ шмунофермент-нсго определения барбитуратов в моче// Заявка на авторское свидетельство М> 49550392, положительное решение от 22.04.92.

10. Зефире^ R.C., Полевая О.Ю., Мягкоеа И.А., Запольская Е,Б. Антигены ,.ля иммунологического определения канлабиноидов в моче// Заявка .-.а авторское свидетельство № 4950420, положительное решение от 22.04.92.

11. Зефиров Н.С., Полевая О.В.. Мягкова М.А.: Лушникова М.В. Способ определения опиатов в моче// Ангорское свидетельство

Jr I745G49 сг 03.05.1990 г.

12. Зефяроз Н.С., Полевая О .В., Мягкова К.А., Панченко О.Н. Антигены для определения антиопкатных антите.т// Заявка на авторское СЕВДетельсузо Г- 4947040, положительное решение от 22.04.92 г. "

13. Кяимозич Л.Г., Новсгтанов Т.В., Гаврилов O.K., Мягкова U.A.

и др.Механизмы притивоачгиноэного эффекта гелий-неонового облучения кров и// Гезиси Мездународной конференции "Лазеры и медицина". - Ташкент. - 1939. - с. I3I-I32.

14. Корочкин ü.M., Вербицкая A.A., Полевая G..J., йягкова М.А. и др. Динамика урогня тромбина и антител к нему у больных

ИУ // Кардиология. - 199о. - " I. - с. 45-4d.

15. ¿¡ягкова ii.h.., Лупкккова .У.В., Губерниэва Л.М. и др. ТвердоФазный иммунофгравиткый метод количественного определения морфина в биологических жидкостях// Вопросы наркологии -1988. - Р*3. - с. 14-18.

16. шягкова U.A., Луинкхова ii.3;, Губерниева Л.Ц. и др. Твердо-'зазны'Л шшуноферуенгный метод количественного определения морфина в биологических жидкостях// Современные направления создания медицинских диагностикумоз: Таз. Зсессазн.кскфэренци::.-Москва. - 1988. - с. 57.

17. Мягкова Ж.к., Лушникоза М.В., Полевая С.Ю. йммуноферментный способ определения опиатов в моче/У Авторское свидетельство £ I544ÜCG. - 1988.

Iö. Лягкова М.А., Яушиксва М.В., Полевая О.Ю. Акунохимическич свойства естественных >; индуцированных антител человека против морфина// Вопросы наркологии. - 1989, - 4.-е. 7—II.

19, .Мягкова U.A., ДушихоЕа М.В. Имкуиэферментный метод.определения опиатов в биологических жидкостях// Тез. I Зсгсоюзн.съезда иммунологов. - Дагомыс. - 1989. - с. 73.

2и. иягкова м.А., пдешкин В.д., Полевая О.Ю. Выявление иммунофер-мчнтныл методом естественных антител протлв тромбина макроглобулина в плазме и сыворотке крови человека// лабораторное дело. - I99C. - !г- IÜ. - с. 11-15.

21. Мягкова М.А., Полевая О.Ю., Новожженова Т.В. и др. Анализ содержания естественных антител к тромбину и а. ¡_-макроглобудину в плазме денеров и больных ИБС// Сов.Медицжа. - 1990. -

!г 4. - с. 12-14.

22, Мягкова U.A., Лушникоза М,.В. Иммунохимлческие метода анализа наркотических. вецесгв//Х!ш.-фарм.журнал.-1990.-Г' 6.-с.76-82.

23. Мягкова М.А., Полевая С.ь)., Аледкин В.А. Выявление ISA методом естественных антител против антитромбина iil// Гематология и трансгузнология. - I99J. - I? 9. - с. 3u-3I.

24. Мягкова U.A., Лушникова Ы.В., Полегая С.Ю. Твердофазный Aik метод количественного определения эфедрина// Суд.-мед.экспертиза. - I99ü. - J.s 3. - с. 3v-32.

25. Мягкова ¿i.A., Лупникоза Ы.В., Полевая 0.L-., Горбатова , Акглаев А.Н. Выявление эфедрина методами твердофазного Л^к и YYJJ Суд.мед.экспертиза. - 1991. Е 2с. - с. 43-45.

26. Мягкова , Луаыикова ¡¿.В., долевая 0.L1., Гамслея Н.Б. Антитела к эфедрину у больных эфедроновой наркоманией// Вопросы наркологии. - 1931. - J> 2.-е. IU-I3.

27. Мягкова ii..1.., Луиникова Ü.B., Полевая G.ij., Еремин С.К. ¡: др. Сравнительный анализ определения опьетов в моче ТСХ и üä> методом// Волр.нарк. - 1991. - Г 4. - с. 23-27.

23. Мягков? id.А., Лузгникова ¡.¡.В., Полевая O.D., Власова Е.З.

ИЗА определения наркотиков в биологических еидкостях организма// Тез.докл. УП Всесоюзный съезд "Инженерная инэимология".

- 1991. - =. 2Id.

29. Мягкова ¡I.A., Полевая О.Г., Лужкова ¡¿.Б. Иммуноглобулины, связывающие нейропептиды у больных наркоманией// Тез.докл. УП Всесоюзный съезд "Инженерная знзкмология". - 1991.- с. 79.

30. Мягкова М.А., Лушнякоза il.B. > Полевая 0.3. ¿шуноглобулкны, связывающие биогенные амины у больных с наркотической . зависимостью// Иммунология. - 1992, - 1" 3. - с. 18-23.

31. Мягкове H.A., Даньков Ю.В., Полевал O.D. Твгрдофазкый И5А количественного определения барбитуратов б моче// Суд.мод.экспертиза. - lüÄi. - it, - с. ¡¿¿-¡so.

32. Мягкова М.А., ЛушлкоЕа ¡¿.В., Полевая O.iü., Запольская Е.Б. Твердофазный иммуноферментный метод количественного определения каннабшокдов// Хим.-фар:/..курная. - 1992. - 6. -

с. 69-71.

33. Мягкоза М.А., Лушникова Ы.З., Запольская Е.Б., Полевая О.Ь. Ноьы>; подход в диагностике наркомании// I Российский съезд иммунологов. - Новосибирск. - Tos .докл. - 1992. - с. 105. Мягкова М.А., Покезая O.D., Панченио О.Н, Имкунофермечтный метод выявления иммуноглобулинов у больных с наркотической зависимостью// I Российский съезд иммунологов. - Новосибирск.

- Тез.док«. - 1992. - с. BI.

35. Мягкова U.A., Панченко G.H. ¡-Ьмунохинэтеские свойства антител .к ß -эндсрфину у больных с наркотической зависимостью// Иммунология. - 1993. - )? о. - с. 19-23.

36. Полевая О.Ю., Мягкова М.А., Лушникова М.З., Губерниева Л.М. Способ диагностики опийной наркомании// Авторское свидетельство Г' I55I0S7. - 1ЭБ8.

3'7. Полевая О.Ю., ¿¡ягкова Ii.А., Вербицкая И.А., Кярочкин ii.M. и др. Сравнительный анализ содержания тромбина и антител' к нему у доноров и больных Ж// Гематология и трансфузиология. - 1990. - Й. - с. Ö-IC.

38. Полевая О.Ю., Лудаикова U.E., МягкоЕа U.A., Ярова Е.А. Сравнительная'характеристика специфичности антител к опиатам,индуцированных свободным ковалентко связанным с белком морфином// Иммунология. - 1990. - ;Г 3. - с. 19-22.

39. Полевая С.й., Самссков З.А., Мягкова H.A. и др. &муноглобу-лины, езлзываящие спиоиццые пептиды у больных дерматитом и опийной наркоманией// Иммунология. - I9SI. - £ 2.-е. 42-44.

40. Полевая О.Ю., Брш S.A., Мягкоза il.А., Панченко Ù.H., Споров С.Г. Выявление диагностической значимости твердофазного ИМ уровней антител я опиатам и препаратам эфедрина в клинике наркомании// Е^пр.наркол. - ГЗЭЗ. - 1с.- с. 13-21.

41. Полеваэ O.D., Брзн Е.А., Мягкова U.A., Панченко О.Н., Копа-ров С.Г. Иммуноглобулин, сБязываищие огоювдые пептзды, биогенные глины и опиаты у больных наркоманией// Воггр.наркол,-1993. - Г? 2.-е. 20-23.

42. MjagJcava H.A., Lushniiiova M.Y., Folevaja O.Y\i., Aljeahkin V.A. Natural antibodies to ihronbirs.an-titiiroafcino III and ts-o-0®" croglooulin; Abstr. PEB3 20th Meeting Paâeration oi European Blochen. Soc.,1930,Budapest, p.282.

43- Pole va ja O.Yu., Hjagicova ¡.I.A., busaniJcova S.V., Lerraontovs. K.E.. Xiraevu 3.C-., Bachurin 3.0. МРГР influence on human immunity: antibodies against dopatnin» in nice. Atstr. 3-rd Int. Cong. Int, Soc. of Kauroiranun., 1991, Jerusalem, p.3.

44. Tolsvajs. O.Yu., Mjagkova M.A., Lushnikova M.V., Sansonov V.A., lashaeva I. The natural antibodies against neuropeptides under neuroiKr.une disorders. АЪзхг. 15th Int. Biochem. Cong., 1991, Jerusalem, p.210.

45. Mjagfcova H.A., Lushnikova U.V., Polevaja O.Tu., Viasova E.V.

. Inraunoass&T of drug abuse in the biological fluids. Russian Biochem. Biotech., 19$1, v.1,K 2/3, p.62.

46. Mjagkova U.A., Lushnilrovc. K.V., Polsvaja O.Ku. The deterain&t-ioa of natural neuropeptides binding Immunoglobulins by using ELISA., Russian Biocbera. Biotech., 199"!, v.1, K.2/3, p.83.

47. UjagiovQ K.A., Lushzu-kova M.Y., Polevaja Q.Yu. Tne ¿Biermm-ai-ioii oi Eaiural caiecnoiarr.mes binding insnunoglooulinas by using ELISA. A'cstr. Int. Conference. Immunisation on AIDS,1991, Leningrad, p.1S,