Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимическая и молекулярно-биологическая характеристика штаммов микобактерий туберкулезного комплекса, распространенных в Санкт-Петербурге

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимическая и молекулярно-биологическая характеристика штаммов микобактерий туберкулезного комплекса, распространенных в Санкт-Петербурге"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

005015688

Черняева Екатерина Николаевна

БИОХИМИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО КОМПЛЕКСА, РАСПРОСТРАНЕННЫХ В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ

03.01.04 - Биохимия

1 М 2072

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2012

005015688

Работа выполнена в Частном научно-исследовательском учреждении «Биомедицинский центр» и Санкт-Петербургском государственном университете.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Козлов Андрей Петрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Перевозчиков Андрей Петрович, заведующий лабораторией, Институт экспериментальной медицины СЗО РАМН

доктор биологических наук, профессор Подгорная Ольга Игоревна, ведущий научный сотрудник, Институт цитологии РАН

Ведущая организация: ФГБУ НИИ гриппа Министерства здравоохранения

и социального развития Российской федерации

Защита диссертации состоится <<?<£» 2012 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д.212.232.09 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. A.M. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан « /6 »^^//¿¿¿J 2012 года

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук . ^ Л.С. Курилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Рост распространенности туберкулеза (ТБ) во многих странах мира является следствием социально-экономических потрясений, распространения ВИЧ-инфекции, а также результатом изменений самого возбудителя, а именно, появления штаммов микобактерий туберкулезного комплекса, устойчивых ко многим лекарственным препаратам.

Формирование лекарственной устойчивости микобактерий может быть обусловлено различными биохимическими механизмами: (і) снижением проницаемости клеточной стенки для препарата; (іі) усиленным выведение препарата из бактериальной клетки; (ііі) ферментативной инактивацией препарата; (¡V) модификацией мишени препарата; (у) инактивацией фермента, приводящего антибиотик в активную форму; (уі) повышенной экспрессией белка-мишени лекарственного препарата (\Vade еі аі., 2004). Данные механизмы резистентности к препаратам могут проявляться как в качестве природных свойств бактериальной клетки, так и возникать в результате селективного действия антибактериальных препаратов. Природная устойчивость бактерий к некоторым препаратам не является результатом возникших генетических изменений, в то время как приобретенная резистентность обусловлена генетически, а именно изменением нуклеотидной последовательности бактериальных генов или изменением уровня экспрессии собственных генов. Наиболее частой причиной возникновения устойчивости штаммов микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ) к противотуберкулезных препаратам, являются спонтанные мутации бактериальных генов. Однако частота мутаций, связанная с развитием лекарственной резистентности, может различаться в зависимости от географического региона. Для эффективного применения молекулярно-биологических методов ускоренной диагностики лекарственной устойчивости необходимо знать частоту мутаций, связанных с резистентностью к препаратам, в конкретном регионе в данный момент времени.

Помимо лекарственной устойчивости, серьезную угрозу возникновения эпидемии представляет рост заболеваемости ТБ среди ВИЧ-инфицированных индивидов, лиц, находящихся в местах лишения свободы, бездомных и мигрантов. В настоящее время существует достаточное количество работ, посвященных молекулярно-биологическим исследованиям штаммов микобактерий туберкулезного комплекса, распространенных в различных регионах России (Коуаіеу еі аі., 2005; 8игіко\а Л аі., 2005; ВгоЬпіе\¥5кі ег аі., 2005(а); Мокгоіиоу еі аі., 2008). В большинстве работ изучается генетическое разнообразие штаммов МБТ, циркулирующих среди общей популяции больных ТБ (Коуаіеу й а1., 2005; Загікоуа е( аі., 2005; Мокгоиэоу еі аі., 2008). Незначительное количество работ посвящено изучению особенностей генома штаммов МБТ, распространенных среди заключенных (Кітегііі^ еі аі., 1999; Тои^оиззоуа є! аі., 2003; ОгоЬпіе\у$кі « аі., 2005(а)). Вместе с тем, модекулярно-биологические особенности штаммов

МБТ, циркулирующих в группах риска, особенно среди таких как ВИЧ-инфицированные и лица БОМЖ, не изучены. Поэтому изучение генетического разнообразия штаммов МБТ, распространенных среди пациентов из групп риска, представляет большой интерес.

Цель и задачи исследования.

Целью исследования является изучение биохимических и молекулярно-биологических особенностей штаммов микобактерий туберкулезного комплекса, распространенных на территории Санкт-Петербурга. Задачи:

1. Сформировать коллекцию образцов геномной ДНК микробиологически охарактеризованных клинических штаммов M.tuberculosis, выявленных среди больных Санкт-Петербурга.

2. Определить частоту характерных аминокислотных замен, ассоциированных с устойчивостью штаммов микобактерий туберкулезного комплекса к изониазиду, рифампицину и офлоксацину.

3. Сравнить генетическое разнообразие изолятов микобактерий туберкулезного комплекса, чувствительных ко всем противотуберкулезным препаратам, а также обладающих множественной и широкой лекарственной устойчивостью.

4. Сравнить генетическое разнообразие изолятов микобактерий туберкулезного комплекса, выявленных у пациентов из различных групп риска. Научная новизна и практическая значимость работы.

Применены современные методы анализа ДНК, для молекулярного типирования штаммов микобактерий туберкулезного комплекса и обнаружения мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью. Сформирована коллекция образцов геномной ДНК клинических штаммов M.tuberculosis, выявленных среди больных туберкулезом жителей Санкт-Петербурга.

Проведена комплексная биохимическая и молекулярно-биологическая характеристика лекарственно-устойчивых и чувствительных к противотуберкулезным препаратам штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в Санкт-Петербурге.

Впервые проведено молекулярно-биологическое сравнение штаммов М. tuberculosis, выявленных среди пациентов из различных медико-социальных групп: бездомных, ВИЧ-инфицированных, заключенных и общей популяции жителей Санкт-Петербурга. Продемонстрировано доминирование штаммов М. tuberculosis Beijing во всех исследованных группах изолятов, а также значительное преобладание штаммов семейства Beijing среди пациентов, находящихся в местах лишения свободы.

Детекция мутаций в генах katG и гроВ позволяет с высокой вероятностью предсказывать наличие лекарственной устойчивости петербургских штаммов М tuberculosis к изониазиду и рифампицину, соответственно.

Результаты работы показали, что мутации в области QRDR гена gyrA обнаруживаются только у 57% офлоксацин-устойчивых изолятов, включенных в исследование. Этот факт демонстрирует относительно невысокую значимость мутаций в гене gyrA для определения лекарственной устойчивости штаммов М. tuberculosis к офлоксацину в Санкт-Петербурге по сравнению с другими регионами.

Результаты работы могут иметь значение для решения ряда прикладных задач современной клинической микробиологии и эпидемиологии туберкулезной инфекции, и являются достижением в области создания реагентной базы для разработки, производства и испытания кандидатной субъединичной вакцины против туберкулеза, а также диагностических тест-систем.

Форма выполнения диссертационной работы. Работа выполнена в рамках финансирования ЧНИУ «Биомедицинский центр» по гранту Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) «Исследование в области ВИЧ и туберкулеза» (№ RUB1-7000-ST-08).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на нескольких международных конференциях (4-й Международной конференции по инфекционным заболеваниям в Пекине (Китай) в 2010 г.; 16-й, 18-й и 19-й Международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург (Россия) в 2007, 2009 и 2010 гг., Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва (Россия) в 2009 г., Международной конференции молодых ученых «Ломоносов», Москва (Россия), 2009 г., Конференции по Иммунодиагностике туберкулеза, Вирджиния Бич (США), 2008 г.

Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в 11 публикациях (2 статьи в рецензируемых журналах, 1 заявка на изобретение, 8 тезисов и сообщений на конференциях).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 25 рисунков. Состоит из следующих глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы», который включает 274 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы. Материалами исследования послужили изоляты геномной ДНК, выделенной из чистых культур М. tuberculosis, выращенных на плотной селективной среде Левенштейна-Йенсена с применением метода абсолютных концентраций (Laszlo et al., 1997). Клинический материал и данные по устойчивости к противотуберкулезным препаратам были предоставлены бактериологической лабораторией Городского противотуберкулезного диспансера (ГПТД) Санкт-Петербурга в рамках совместного проекта. Также ГПТД г. Санкт-Петербурга были предоставлены социально-демографические данные о пациентах, от которых производился забор клинического материала для последующего генотипирования.

Для сравнительного генетического анализа штаммов МБТ, выявленных у больных ТБ лиц из разных групп риска, случайным образом отбирали культуры М. tuberculosis, полученные от пациентов БОМЖ; ВИЧ-инфицированных пациентов, проживающих в Санкт-Петербурге; заключенных из двух следственных изоляторов Санкт-Петербурга. В качестве контрольной группы анализировали штаммы МБТ, выявленные у ВИЧ-негативных больных ТБ, зарегистрированных на территории Санкт-Петербурга, не относящихся к перечисленным группам риска (далее - «общая популяция больных ТБ»).

Для сравнительного генетического анализа штаммов МБТ, обладающих лекарственной устойчивостью, случайным образом отбирали 30 культур М. tuberculosis устойчивых к офлоксацину, 41 культуру с МЛУ, а также 30 культур чувствительных ко всем противотуберкулезным препаратам.

Генетический материал 30 устойчивых к офлоксацину и 3 чувствительных к данному препарату штаммов МБТ анализировали на наличие мутаций в коротких областях генов gyrA и gyrB. Для определения частоты мутаций в гене katG, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду (INH), среди данной выборки образцов отбирали 45 устойчивых и 5 чувствительных к INH изолятов. Также было отобрано 42 образца устойчивых и 8 чувствительных к рифампицину (RIF) изолята МБТ, для анализа частоты мутаций в гене гроВ.

Генетический анализ штаммов M.tuberculosis. Очистка ДНК М. tuberculosis проводили методом фенольной экстракции. Для анализа нуклеотидных последовательностей генов katG, гроВ, gyrA и gyrB проводили амплификацию фрагментов названных генов методом ПЦР. Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК проводили методом терминирующих аналогов трифосфатов по Сэнджеру на автоматическом секвенаторе MegaBACE 500 с помощью набора "DYEnamic ЕТ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit" (Amersham Biosciences).

Сравнительный анализ геномов штаммов МБТ, выявленных в различных группах пациентов и штаммов с различными паттернами лекарственной устойчивости, проводили методом сполиготипирования. Аяализ данных сполиготипирования проводили с использованием программы Microsoft Excel. Для расчета индекса сходства Танимото - Kt-сравнивали результаты сполиготипирования изолятов МБТ, выраженных в бинарной системе исчисления. Построение филогенетических деревьев осуществляли с использованием метода невзвешенного попарного среднего (UPGMA) и программы Neighbor пакета программ Phylip 3.68. Филогенетические деревья представляли с помощью программы TreeView v. 1.6.0. Графически результат анализа представляли в виде горизонтальной древовидной диаграммы или дендрограммы. Принадлежность к семействам сполиготипов определяли с использованием онлайн сервиса SPOTCLUST (http://tbinsight.cs.rpi.edu/run_spotclust.html). Принадлежность сполиготипа к одному из кодов международной базы данных SpolDB4 определяли с использованием открытой базы данных Института Пастера Гваделупы, доступной по адресу http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVITDemo/.

Анализ «регионов различия» генома, описанный ранее (Parsons et al., 2002), использовали для дифференциации видов микобактерий туберкулезного комплекса, сполиготипы которых не были идентифицированы.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов сполиготипирования проводили на компьютере с применением статистического программного пакета R. Достоверность отличий оценивалась методом у2. Но (нулевая гипотеза) об отсутствии достоверных различий принималась при p-value>0,05; Hi (альтернативная гипотеза) о наличие достоверных различий принималась при р-value<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к

изониазиду.

Исследование нуклеотидных последовательностей фрагмента гена кшО позволило показать, что 93% исследованных нами ШН-устойчивых изолятов МБТ, выявленных в Санкт-Петербурге, имеют мутации в данном регионе. Все исследованные образцы имели единственную мутацию - БЗ15Т (рис.1). Чувствительные изоляты МБТ не имели мутаций, в исследованной области гена. Таким образом, показано, что мутация ЭЗ15Т является надежным маркером устойчивости штаммов МБТ к ШН, распространенных в Санкт-Петербурге. В нашей работе не было получено данных о других мутациях в гене кшй, которые могли бы коррелировать с резистентностью микобактерий к ПМН.

10 20 30 40 50 60 70

----I .... I .... | .... | .... | .... | .... |----I .... I----I----I .... I----| .... I .... | ... .

каЪб Н37Ку ССССй.ТСТООТСССССССОЛЛСССОЛ&ОСТ6СТССССТС&АЙСАОАТСС«СТТОООСТаОААСАйСТСОТАТаОСАССО каЪв -Б315Т ...............................................................................

90 100 110 120 130 140 150

----I .... I .... I .... I .... I .... I .... I----| .... I .... I----| .... I .... I----I----| .

katG H37Rv AACCGGTAAGGACGCGATCACCAGCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTC katG -S315T .......................С....................................................

10 20 30 40 50 -

.... I .... I .... | .... | .... | .... I .... I .... I .... I .... I . .

katG H37R.V ADLVGPEPE AAPLEQMGLGWKS SiGTGTGKDAITSGIE WWTHTPTKWDMSF -

katG -S315T ..................................T..................................ß

Рис.1. Сравнение нуклеотидных (А) и аминокислотных (Б) последовательностей фрагмента гена katG штамма М. tuberculosis H37Rv и мутантного штамма, несущего замену S315T, приводящую к возникновению устойчивости к INH. В строчке, соответствующей мутантной последовательности (katG-S315T) показана нуклеотидная замена G->C (А), присутствующая в устойчивых штаммах МБТ, приводящая к замене S315T (Б).

Описанная нами ассоциация мутации S315T в гене katG с возникновением лекарственной устойчивости МБТ к INH характерна как для России (Mokrousov et al., 2002 (b); Marttila et al., 1998), так и для других регионов земного шара. Однако частота встречаемости мутаций в данном регионе генома может быть ниже. Исследование изолятов МБТ, устойчивых к INH, проведенное в Бразилии выявило замену S315T в 60,4% случаев (Höfling et al., 2005). При этом, как было показано, частота мутаций в 315 кодоне гена katG может варьировать от 60% до 87,1% в различных городах Бразилии (Silva et al., 2003). Изучение мутаций в гене katG среди изолятов, распространенных в Китае показало, что мутация S315 может встречаться у 55 - 60% INH-резистентных изолятов(\¥и et al., 2006; Jiao et al., 2007).

Анализ мутаций, ассоциированных с устойчивостью микобактерий к рифампицину.

Для анализа частоты мутаций в гене гроВ, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к RIF было исследовано 42 изолята МБТ, устойчивых к RIF, и 8 изолятов чувствительных к данному препарату. В нашей работе была проанализирована нуклеотидная последовательность короткой области гроВ

размером 81 п.о. несущей большинство известных мутаций устойчивости к МБ. В случае если устойчивые к ЫР изоляты МБТ не имели мутаций в данном регионе, мы проводили анализ другого участка гена гроВ на наличие более редкой замены У176Р. Результаты секвенирования фрагмента гена гроВ показали, что 88% исследованных ЮТ-устойчивых изолятов имели мутации в исследованной области генома (рис.2). Большинство мутаций (64%) было обнаружено в кодоне 531, приводящих к замене серина на лейцин (8531Ь). Также в данной области гена были обнаружены мутации в кодонах 516, 522 и 526. Пять изолятов устойчивых к ЮТ, не имеющих названых мутаций, были проанализированы на наличие мутации в 176 кодоне гена гроВ, однако замены \n76F в нашем исследовании обнаружено не было. В проведенной работе, среди изолятов МБТ чувствительных к ЮТ не было обнаружено мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью.

10 20 30 40 50 60 70 80

----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----| .... | .... | .

гроБ Н37ВТ В|;СДССД1;ССАеСТСаСССДАТТСАТСгаССДСАДСАа,СССВСТВТСееБ1;1ТеАСССДСААВССССЕДС1е1СеВС|;СТВ

гроВ 35311 .........................................................................Т.......

гроВ Н526В .........................................................Б.......................

гроВ Н526Н .........................................................А.......................

гроВ Н526Т .........................................................Т.......................

гроВ В51СТ ............................Т....................................................

гроВ В516Г ...........................Т.....................................................

1-роВ 55221 ..............................................Т..................................

10 20

.... I----| .... | .... |----| . .

ГроВ H37Rv GTSQLSQFMDQHHPISGITHKRELSAL

гроВ S5311 ........................Ь . .

гроВ H526D ...................D.......

гроВ Н5261Т ...................Н.......

t-poB H526Y ...................Y.......

t-poB D516V .........V.................

гроВ D516Y .........Y.................

гроВ S522L ...............L...........

Рис.2. Сравнение нуклеотидных (А) и аминокислотных (Б) последовательностей фрагмента гена гроВ штамма М. tuberculosis H37Rv и мутантных штаммов, несущих нукпеотидные замены, приводящие к возникновению устойчивости к RIF. В строчках, соответствующих мутантным последовательностям гена гроВ (S531L, H526D, H526N, H526Y, D516V, D516Y, S522L) показаны замены нуклеотидов (А), приводящие к соответствующим заменам аминокислот (Б).

Мутации резистентности к RIF, выявленные в нашем исследовании, были описаны в аналогичных работах, проведенных ранее в России и за рубежом. Например, в исследовании, проведенном в России в 1998-2001 гг. мутации в гене гроВ были обнаружены у 92% изолятов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью. Большинство мутаций было обнаружено в кодонах 516, 526 и 531, но также были детектированы мутации в кодонах 511, 513, 522, 525 и 533 (Lipin et al, 2007).

Данные ряда исследований свидетельствуют о том, что детекция мутации V176F гена гроВ в некоторых популяциях МБТ может повысить специфичность молекулярно-генетических тестов по определению устойчивости к RIF (Неер et al, 2000; Rigouts et al, 2007; Pietzka et al., 2008). He смотря на то, что мутация V176F в нашем исследовании не была обнаружена, нельзя считать, что данная аминокислотная замена не встречается в популяции RIF-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза в Санкт-Петербурге. В нашем исследовании только пять

6

образцов не имело стандартных мутаций в гене гроВ, ассоциированных с резистентностью к RIF. Поэтому анализ области гена гроВ, кодирующей 176 кодон, был проведен только для этих пяти изолятов. Таким образом, исследование было ограничено маленькой выборкой.

Анализ мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к офлоксацину в генах gyrA и gyrB.

Исследование генов gyrA и gyrB офлоксацин-устойчивых штаммов М. tuberculosis, распространенных в Санкт-Петербурге, показало, что анализ небольшого региона гена gyrA позволяет обнаружить, по крайней мере, половину (56,6%) случаев устойчивости к офлоксацину (OFL). Исследованные офлоксацин-устойчивые изоляты имели точечные мутации в области QRDR гена gyrA в кодонах 90, 91 и 94 (рис.3). Самая распространенные мутации D94G и D94A, были обнаружены у 30% исследованных изолятов. Ген gyrA у трех изолятов МБТ из нашей выборки, устойчивых к OFL, нес мутацию A90V. В большинстве исследований была продемонстрирована корреляция между данной мутацией и устойчивостью в офлоксацину.

У 28 из 30 OFL-резистентных изолятов была обнаружена замена S95T, являющаяся естественным полиморфизмом М. tuberculosis, не связанная с устойчивостью к противотуберкулезным препаратам.

Мутации в кодонах 74 и 88, описанные ранее в литературе (Ginsburg et al., 2005; Duong et al., 2009; Mokrousov et al., 2008; Sun et al., 2008), в данном исследовании обнаружены не были. Все обнаруженные в исследовании мутации в гене gyrA были описаны для OFL-резистентных изолятов М. tuberculosis ранее (Mokrousov et al., 2008; Shi et al., 2006). Однако частота мутаций в участке QRDR среди исследованных изолятов отличается от полученных ранее данных, которые проводились на других выборках.

В аналогичных исследованиях мутации в области QRDR гена gyrA были обнаружены у 72-94% среди OFL-устойчивых изолятов МБТ (Mokrousov et al., 2008; Antonova et al., 2008; Alcaide, Telenti, 1997), тогда как в исследованной нами выборке только 56,6% OFL-устойчивых изолятов имели мутации в проанализированном регионе гена gyrA. Относительно низкая частота мутаций в гене gyrA (менее 50%) среди изолятов МБТ устойчивых к фторхинолонам была обнаружена в Индии (Siddiqi et al., 2002; Sulochana et al., 2007). При этом мутаций в гене gyrB в данных исследованиях обнаружено не было.

II <• >• » II II II

— I — I — I — I----1 —1 — I — 1 —1 — I — I — I — I — I — I

дуг» HSTRv СТСКСШГГС«ХС(ХСТСССТТ«ОТОССИШХЖааАС^

girt DMC .........................................................................G.

дуг» DM» .........................................................................C.

дуг» S»lí ...............................................................С...........

дуг» »90V .............................................................T.............

ст

9i ui ш ui m 1« is>

----1----1----i----1----1----1----i----i----1----i----i----i----1----i

дуг» H37RV GGTGCGCATGGCCCAGCCCTGGTCGCTGCGCTACCCGCTGGtGGACGGCCAGGGCTACTTCGGCTCGCCA

дуг» DMC ......................................................................

дуг» DM» ..................................................................

дуг» SMI ..................................................................

дуг» MW ..................................................................

И

II Í0 30 40 50

.... I .... I----I----I----I .... I----I .... I .... I .... I

дуг» H37Rv reKs^wmTifnramfroKrmsLvraaQFiisLRYPLVDGQiaiFGSP

дуг» D94G ........................GT........................

дуг» D94» ........................AT........................

дуг» S91Í .....................P...T........................

дуг» »90V ....................V____T........................

Рис.З.Сравнение нуклеотидных (А) и аминокислотных (Б) последовательностей области QRDR гена дугА штамма М. tuberculosis H37Rv и мутантных штаммов, несущих нукпеотидные замены, приводящие к возникновению устойчивости к OFL. В строчках, соответствующих мутантным последовательностям гена дугА (D94G, D94A, S91P, A90V) показаны замены нуклеотидов (А), приводящие к соответствующим заменам аминокислот (Б). На рисунке А прямоугольником обозначен естественный полиморфизм гена дугА, приводящий к замене S95T, не связанный с устойчивостью МБТ к фторхинолонам.

Возможно, исследуемая нами популяция офлоксацин-устойчивых изолятов М. tuberculosis обладает мутациями, расположенными в других областях гена gyrA, оказывающих влияние на конформацию хинолонового кармана. Кроме того на формирование устойчивости к препаратам хинолонового ряда могут влиять другие механизмы резистентности. В первую очередь, активное выведение препарата с помощью эффлюксного насоса (Singh et al., 2011).

В проведенном нами исследовании офлоксацин-устойчивых изолятов МБТ, выявленных в Санкт-Петербурге, не было обнаружено мутаций в коротком фрагменте гена gyrB, ассоциированных с лекарственной устойчивостью. Отсутствие мутаций в регионе gyrB в исследованной популяции штаммов МБТ снижает возможности молекулярно-биологического определения устойчивости к офлоксацину.

Анализ сполиготипов офлоксацин-устойчивых штаммов М. tuberculosis, штаммов обладающих множественной лекарственной устойчивостью и штаммов, чувствительных ко всем противотуберкулезным препаратам.

Геномная ДНК, выделенная из изолятов M.tuberculosis с различным спектром лекарственной чувствительности была использована для сравнения генотипов микобактериальных штаммов. Для генетического анализа мы применяли метод сполиготипирования изолятов МБТ, обладающих устойчивостью к офлоксацину, с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и чувствительностью ко всем противотуберкулезным препаратам.

В результате генетического анализа штаммов МБТ, обладающих устойчивостью к офлоксацину, была показана высокая однородность сполиготипов среди офлоксацин-устойчивых изолятов. В данной группе образцов было выявлено всего 7 различных сполиготипов (табл.1).

Таблица 1.

Сполиготипы М. tuberculosis с различным спектром лекарственной устойчивости.

Восьмеричный код Код сполиготипа Количество 0/ _Семейство_

сполиготипа в SpolDB4 изолятов SPOTCLUST SpolDB4

Чувствительные ко всем препаратам

000000000003371 ST265 1 3.33 Beiiinq Beiiinq

000000000003661 ST1651 2 6,67 Beijing Beijing

000000000003671 ST255 1 3,33 Beijing Beijing

000000000003771 ST1 10 33,33 Beijing Beijing

000002000003661 Нет 2 6,67 Beijing нет

000002000003771 ST1184 1 3,33 Beijing U

000002000103771 Нет 1 3,33 Beijing нет

177777657760771 ST1255 1 3,33 T1 T5

777777777760771 ST53 2 6,67 T1 T1

777777777700001 Нет 1 3,33 T2 нет

711041003760661 Нет 1 3,33 LAM9 NA

711041007740661 Нет 1 3,33 LAM9 NA

777741000160771 Нет 1 3,33 LAM9 NA

777777607760771 ST42 1 3,33 LAM9 LAM9

777777644020771 Нет 1 3,33 H1 нет

000000000503771 Нет 1 3,33 Beijing/36 нет

377737670000000 Нет 1 3,33 34 нет

777000000000371 ST560 1 3,33 35 и

Обладающие множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ)

000000000003661 ST1651 4 9.76 Beiiinq Beiiinq

000000000003671 ST255 1 2,44 Beijing Beijing

000000000003771 ST1 28 68,29 Beijing Beijing

000002000003671 нет 1 2,44 Beijing нет

000002000003771 ST1184 1 2,44 Beijing и

774002000760771 нет 1 2,44 T3 нет

777761007763771 нет 1 2,44 T4 нет

777574200376071 нет 1 2,44 33 нет

777777607763771 ST1247 1 2,44 33 MANU2

777477607700771 нет 1 2,44 LAM9 нет

000000007760771 ST4 1 2,44 36 LAM3 and

Устойчивые к офлоксацину

000000000003371 ST265 3 10 Beijing Beijing

000000000003771 ST1 22 73,33 Beijing Beijing

000000000003661 ST1651 1 3,33 Beijing Beijing

000000000000771 ST269 1 3,33 Beijing Beijing-like

775777777450771 нет 1 3,33 T1 нет

357777777760771 нет 1 3,33 T1 нет

775740003760771 ST266 1 3,33 T4 T1

К пекинскому семейству (Beijing family) относилось 90% исследованных изолятов. Этот факт, скорее всего, является следствием доминирования данного семейства на территории Санкт-Петербурга, описанного в литературе ранее (Surikova et al„ 2005; Kovalev et al., 2005).

Доминирование семейства Beijing было также показано среди исследованных нами изолятов МБТ с МЛУ и изолятов чувствительных ко всем препаратам. В результате сполиготипирования изолятов МБТ с МЛУ было выявлено 11 сполиготипов, при этом более 85% изолятов относились семейству Beijing (табл.1).

Сполиготипирование изолятов МБТ, чувствительных ко всем препаратам, позволило обнаружить 18 различных генетических паттернов в данной группе образцов. К семейству Beijing относилось 60% чувствительных к препаратам изолятов МБТ.

Штаммы микобактерий туберкулеза, принадлежащие генетическому семейству Beijing, обнаруживаются во многих странах мира и нередко являются причиной вспышек ТБ. В начале 1990-х годов штаммы с МЛУ, относящиеся к данному семейству, вызвали вспышки ТБ в США (Hewlett et al., 1991; Agerton et al., 1999; Bifani et al., 1996). В 1995 году большое число изолятов, геном которых имел сходный генетический паттерн, было обнаружено в Пекине. Изоляты семейства Beijing были выявлены и в других регионах (van Soolingen et al., 1995). Сполиготипирование данных штаммов показало, что семейство Beijing обладает характерным генетическим профилем: в области прямых повторов данная группа штаммов содержит только спейсеры с 35-го по 43-й. Сходным профилем сполиготипирования обладает генетическая группа М. tuberculosis, названная "Beijing-like" (Beijing-подобная).

Распространение штаммов М. tuberculosis семейства Beijing в России и других регионах бывшего СССР было обнаружено в предыдущие годы и обнаруживается до сих пор (Kruuner et al., 2001; Toungoussova et al., 2002; Toungoussova et al., 2003; Mokrousov et al. 2008; Kubica et al., 2005).

По сравнению с результатами более ранних исследований в Северозападном регионе России, в проведенном нами исследовании доля изолятов, относящихся к семейству сполиготипов Beijing, увеличилась как среди образцов, обладающих лекарственной устойчивостью (OFL и МЛУ), так и среди чувствительных к противотуберкулезным препаратам изолятов. При этом, чем шире был спектр лекарственной устойчивости микобактерий, тем чаще мы обнаруживали изоляты, относящиеся к семейству Beijing.

В проведенной нами работе мы показали достоверную ассоциированность штаммов семейства Beijing с лекарственной устойчивостью к OFL и МЛУ (тест на независимость). Обнаруженная нами закономерность о том, что для штаммов МБТ семейства Beijing характерна достоверная ассоциированность с лекарственной устойчивостью, особенно с МЛУ, хорошо согласуется с литературными данными, полученными по всему миру (Kubica et al., 2004; Kruuner et al., 2001; Kovalev et al., 2005; Toungoussova et al., 2002; Surikova et al., 2005; Caminero et al., 2001; Chan et al., 2001; Lavender et al., 2005; Drobniewski et al., 2005 (a); vanSoolingen et al, 2009).

Анализ сполиготипов М. tuberculosis, обнаруженных у пациентов, принадлежащих к различным группам риска.

В ходе работы был проведен генетический анализ 150 изолятов микобактерий туберкулезного комплекса, выявленных среди различных групп риска заболевания ТБ (бездомные, ВИЧ-инфицированные, заключенные) и общей популяции больных ТБ Санкт-Петербурга. Процентное соотношение сполиготипов семейства Beijing среди указанных групп составило56%, 77%, 83% и 60%, соответственно (табл. 2).

Как было отмечено ранее, доминирование семейства Beijing среди всех исследуемых групп согласуется с литературными данными. В более ранних исследованиях было показано, что доля семейства Beijing в России составляет более 50% (Kovalev et al., 2005; Surikova et al., 2005; Drobniewski et al., 2005 (a)).

Штаммы M.tuberculosis, принадлежащие семейству Beijing часто обнаруживаются в России, как среди общей популяции граждан России, так и среди заключенных. В исследовании штаммов МБТ, обнаруженных среди больных ТБ заключенных, проведенном в 2001 году в Архангельске, было показано, что 76% изолятов относились к семейству Beijing (Toungussova et al., 2003). В работе Шемякина и коллег, проведенной в 2001 году, было показано, что среди заключенных также преимущественно распространяются штаммы М. tuberculosis, принадлежащие семейству Beijing. В данном исследовании более 50% выявленных изолятов МБТ с МЛУ принадлежали пекинскому семейству, при этом сполиготип ST1 был обнаружен у 49% исследованных изолятов (Shemyakin et al., 2004). Стоит отметить, что в исследовании, проведенном в тюрьме Серпухова, 29% исследованных изолятов принадлежало группе семейств LAM, в то время как в нашем исследовании только 2 изолята можно отнести к данной группе сполиготипов.

Помимо семейства Beijing, среди образцов, включенных в наше исследование, обнаруженных у пациентов из социально дезадаптивных групп населения и общей популяции жителей Санкт-Петербурга, были обнаружены изоляты, принадлежащие семействам сполиготипов Beijing-like, LAM9, LAM3, TI, ТЗ, Т4, Т5, T5 RUS1, Haarlem (H)l, Н2, НЗ, MANU2, а также семействам 33, 34, 35, 36. Семейства Beijing, Beijing-like, LAM, Haarlem, T относятся к наиболее часто встречающимся семействам по всему миру (Brudey et al., 2006). Генетические семейства - Haarlem, LAM и Т - наиболее часто встречаются в Африке, Центральной Америке, Европе и Южной Африке. Изоляты МБТ, принадлежащие генетической линии Haarlem часто встречаются в Европе. За пределами Европы штаммы семейства Haarlem обнаруживают в Центральной Америке и в странах Карибского бассейна, что предположительно указывает на распространение данного штамма в эпоху колонизации Америки. Группа LAM является наиболее распространенной в Южной Америке, в странах Средиземноморья и Карибского бассейна. Генетическое семейство «Т» считают плохо определенным, тем не менее

данная группа штаммов широко распространена во многих странах (Brudey et al.,

И

2006). Генетическая группа "Manu" является относительно новой и состоит из трех семейств MANU1, MANU2 и MANU3. Принадлежность к семействам сполиготипов 33, 34, 35 и 36 нескольких исследованных изолятов были определены с помощью программы SPOTCLUST, данные семейства не включены в базу данных SpolDB4.

Таблица 2.

Сполиготипы М. tuberculosis, выявленные в различных группах пациентов.

Восьмеричныйкод Код сполиготипа Количество „. _Семейство_

сполиготипа в SpolDB4 изолятов SPOTCLUST SpolDB4

Изоляты, выявленные среди бездомных пациентов

000000000003371 ST265 1 2.94 Beijing Beijing ~

000000000003661_ST1651_1_2J4_Beijing_Beijing

000000000003771_ST1_16_47,06_Beijing_Beijing

000002000003671_нет_1_2Д34_Beijing_нет

515047607760661_нет_1_2^4_LAM9_нет

777477607700771_нет_1_2J)4_LAM9_нет

777741003760771_нет_1_2Д34_LAM9_нет

777761007760771_ST766_2_5JS8_LAM9_Т1

777777607760771_ST42_1_2;94_LAM9_LAM9

774777777423771_ST1481_1_Z94_33_MANU2

777777607763771_ST1247_1_2JS4_33_MANU2

777777777760771_ST53_1_2J54_Т1_Т1

177777657760771_ST1255_1_2J4_Т1_Т5

777777777770000_нет_1_2JM_нет_нет

777737677420731_нет_1_2J34_НЗ_нет

774002000760771_нет_1_2JM_нет_нет

777761007763771_нет_1_2JM_Т4_нет

777777774020771 ST47 1 2,94 Н1 Н1

_Изоляты, выявленные среди ВИЧ-инфицированных пациентов_

000000000003371 ST265 3 5.36 Beijing Beijing

000000000003661_ST1651_5_8ДО_Beijing_Beijing

000000000003671_ST255_4_7J4_Beijing_Beijing

000000000003771_ST1_30_53,57_Beijing_Beijing

000002000003661_нет_1_179_Beijing_нет

775741003760771_нет_1_179_LAM9_нет

711041003760661_нет_1_179_LAM9_нет

711041007740661_нет_1_179_LAM9_нет

777777607760771_ST42_1_179_LAM9_LAM9

777777777760771_ST53_1_179_Т1_Т1

711007676420621_нет_1_179_НЗ_нет

774777777420771_ST262_1_179_NA_Н4

775147677700000_нет_1_179_Т2_NA

777760007760771_ST254_1_179_Т4_T5_RUS1

777777644020771_нет_1_179_HI_нет

777777704020771_ST283_1_179_нет_Н1

777000000000371_ST560_1_179_35_U

377737670000000_нет 1_179_34 нет

Изоляты, выявленные среди пациентов из общей популяции жителей СПб 000000000003371 ST265 1 3.33 Beijing Beijing

000000000003661_ST1651_4_13,33_Beijing_Beijing

000000000003601_нет_1_адз_Beijing_NA

000000000003771_ST1_8_26,67_Beijing_Beijing

000002000003771_ST1184_3_10,00_Beijing_U

000000000000771_ST269_1_ЗДО_Beijing_Beijing-like

555047607760661_нет_1_3,33_LAM9_NA

777761007760651 нет 1 3,33 LAM9 NA

777477607760771 ST252 1 3,33 LAM9 LAM9

515047636760661 нет 1 3,33 T1 NA

515047236760661 нет 1 3,33 T1 NA

777777777760771 ST53 1 3,33 Т1 T1

757737777420771 нет 1 3,33 НЗ нет

570000636760601 нет 1 3,33 ТЗ нет

506044034000461 нет 1 3,33 Н1 NA

775743003763771 нет 1 3,33 33 NA

777777777723771 ST1634 1 3,33 33 MANU2

777402000000171 NA 1 3,33 35 NA

Изоляты, выявленные среди заключенных пациентов

000000000003671 ST255 2 6,67 Beijing Beijing

000000000003771 ST1 18 60,00 Beijing Beijing

000002000003771 ST11B4 2 6,67 Beijing и

000002000003671 Нет 3 10,00 Beijing NA

777777607760771 ST42 1 3,33 LAM9 LAM9

777677777720771 Нет 1 3,33 нет нет

774777737423731 Нет 1 3,33 33 нет

000000007760771 ST4 1 3,33 36 LAM3 and S /converqent

000000000503771 Нет 1 3,33 36 нет

В проведенном нами исследовании для нескольких образцов не было определено соответствие определенным семействам сполиготипов. Однако анализ областей различия генома показал, что все изоляты принадлежат виду М. tuberculosis (рис.4), т.к. области RDI, RD4, RD9, RD10 и RD12 были обнаружены у всех проанализированных изолятов. Мы предполагаем, что случаи выявления неидентифицированных сполиготипов МБТ, ранее не встречавшихся в международной базе данных SpolDB4, могут быть случаями двойной инфекции, когда индивид заражается штаммами МБТ, относящихся к различным семействам. Однако данная гипотеза требует изучения и подтверждения с помощью методов с более высокой дискриминирующей способностью.

Анализ генетического разнообразия штаммов M.tuberculosis, выявленных в различных группах риска показал, что наименьшее разнообразие обнаружено среди заключенных. В данной группе пациентов были обнаружены штаммы, представленные девятью различными сполиготипами. Среди исследованных изолятов М. tuberculosis, выявленных среди пациентов из групп «БОМЖ», «ВИЧ+» и «общей популяции» было обнаружено по 18 сполиготипов. Статистический анализ показал, что группы риска, состоящие из лиц БОМЖ, ВИЧ-инфицированных пациентов не отличаются от общей популяции больных ТБ города Санкт-Петербурга (пациентов, не относящихся ни к одной из групп риска) по доле представленности сполиготипов семейства Beijing.

Электрофореграмма результатов ПЦР области RDI

1 2 3 4 5 6 7

200 п.о. ■ 100 п.о,-

Размер продуктов ПЦР 150 п.о. свидетельствует о том, что все образцы содержат регион RDI

Электрофореграмма результатов ПЦР области RD9

1 2 3 4 5 6 7

Размер продуктов ПЦР 306 п.о. свидетельствует о том, что все образцы содержат регион Я09

Электрофореграмма результатов ПЦР области RD4

1 2 3 4 5 6 7

400 п.о. 300 п.о.

Размер продуктов ПЦР 343 п.о. свидетельствует о том, что все образцы содержат регион 1Ш4

Электрофореграмма результатов ПЦР области 0010

Размер продуктов ПЦР 308 п.о. свидетельствует о том, что все образцы содержат регион RD10

Электрофореграмма результатов ПЦР области RD12

1 23 4 5 6 7

Размер продуктов ПЦР 312 п.о. свидетельствует о том, что все образцы содержат регион 1Ш12

1. Маркер "GeneRuler lOObp DNA Ladder" (Fermentas).

2. Изолят № 25

3. Изолят № 34

4. Изолят № 141

5. Изолят № 248

6. Положительный контроль

7. Отрицательный контроль

Рис.4. Электрофореграммы результатов ПЦР областей различия микобактерий туберкулезного комплекса

Сравнение генетического разнообразия штаммов МБТ, выявленных в различных группах, показало, что наименьшее генетическое разнообразие наблюдалось в группе пациентов из мест лишения свободы. Данная группа риска достоверно отличается от общей популяции больных ТБ Санкт-Петербурга и от группы бездомных пациентов по доле представленности семейства Beijing. По сравнению со всеми исследуемыми группами риска, заключенные - наиболее замкнутая и обособленная группа, физически отделенная от остального населения. Заражение штаммами М. tuberculosis семейства Beijing может происходить внутри данной группы, независимо от общей популяции больных ТБ в Санкт-Петербурге. В связи с этим, не вызывает сомнений тот факт, что разнообразие представленности различных семейств сполиготипов МБТ среди заключенных минимальное.

Сходство генотипов штаммов МБТ, циркулирующих в общей популяции жителей Санкт-Петербурга, а также среди бездомных и ВИЧ-инфицированных, позволяет сделать вывод о большом влиянии пациентов из данных социально дезадаптивных групп на распространение ТБ среди граждан города. Этот факт, скорее всего, обусловлен недостаточностью профилактических противотуберкулезных мероприятий в группах риска, а также низкой приверженностью к лечению ТБ бездомных и ВИЧ-инфицированных пациентов, что приводит к высокой заболеваемости и активному распространению ТБ.

ВЫВОДЫ

1. Секвенирование фрагментов генома санкт-петербургских изолятов M.tuberculosis показало:

- точечные мутации, обнаруженные в генах katG и гроВ среди 93 и 88% INH- и RIF-устойчивых изолятов, соответственно, являются надежными маркерами устойчивости к данным препаратам;

- детекция мутаций в области QRDR гена gyrA позволяет обнаружить не менее 50% OFL-устойчивых изолятов;

- область QRDR гена gyrB не имела мутаций, ассоциированных с устойчивостью к OFL, в исследованной группе изолятов.

2. Генотипирование штаммов М. tuberculosis на основе полиморфизма области прямых повторов выявило доминирование генетического семейства Beijing во всех исследованных группах изолятов. Исследованные штаммы семейства Beijing достоверно чаще (р<0,05) обладали МЛУ, устойчивостью к OFL, а также значительно чаще преобладали среди пациентов, находящихся в местах лишения свободы, чем штаммы других генотипов.

3. Впервые показано распространение генетически сходных изолятов M.tuberculosis среди бездомных, ВИЧ-инфицированных и пациентов из общей популяции жителей Санкт-Петербурга. Сравнение сполиготипов исследованных штаммов МБТ обнаружило более низкое генетическое разнообразие бактериальных штаммов, выявленных среди заключенных, а также среди OFL-устойчивых изолятов.

4. Сформирована коллекция образцов геномной ДНК клинических штаммов M.tuberculosis, полученных от больных туберкулезом жителей Санкт-Петербурга, необходимая для создания кандидатного вакцинового препарата, направленного на профилактику и лечение туберкулезной инфекции. Данная коллекция образцов может быть использована для разработки тест-систем по обнаружению лекарственно-устойчивых штаммов МБТ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Chernyaeva Е., Dobrynin P., Pestova N., Matveeva N., Zhemkov V. and Kozlov A. / Molecular-genetic analysis of Mycobacterium tuberculosis strains spread in different patient groups in St.Petersburg (Russia) // Eur J Clin Microbiol Infect Dis, DOI: 10.1007/s 10096-011-1497-2.

2. Черняева E.H., Добрынин П.В., Пестова H.E., Матвеева Н.Г., Жемков В.Ф., Козлов А.П. / Обнаружение мутаций, ассоциированных с устойчивостью к офлоксацину в генах gyrA и gyrB, и молекулярно-генетический анализ офлоксацин-устойчивых изолятов М. tuberculosis, выявленных в Санкт-Петербурге в 2008 г. // Вестн. С-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2010. Вып. 4. С. 117-125.

3. Заявка на изобретение RU 2008149821 А, Июнь 2010. Вакцина для профилактики и лечения туберкулезной инфекции, рекомбинантный слитый белок FAE, рекомбинантная плазмидная ДНК pFAE для его получения. А.П. Козлов, Н.А. Климов, Б.В. Мурашев, И.В. Духовлинов, Р.И. Аль-Шехадат, Е.Н. Черняева.

4. Е. Chernyaeva, N. Pestova, P. Dobrynin, N. Matveeva, V. Zhemkov, A. Kozlov / Molecular-genetic analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains in St.Petersburg (Russia). // International Journal of Infectious Diseases, Volume 14, Supplement 2, July 2010, P. S23.

5. Черняева E., Пестова H., Матвеева Н., Жемков В., Козлов А. / Мутации в генах katG и гроВ и генетическое разнообразие штаммов М. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, распространенных в Санкт-Петербурге // Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье, Том 14, №1(29), 2010, С. 39.

6. Черняева Е., Пестова Н., Матвеева Н., Жемков В., Козлов А. / Изучение генетического разнообразия штаммов М. tuberculosis, обнаруженных в группах риска в Санкт-Петербурге в 2007-2008 гг. // Сборник тезисов III Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Октябрь 2009 г. Том 1, с. 19.

7. Dobrynin P., Chernaeva Е., Matveeva N.,,Zhemkov V. and Kozlov A. / Study of Point Mutations in gyrA and gyrB Genes, Asossiated with OfloxacinResisstance, in Cultures of M. tuberculosis Revealed in St.Petersburg ia 2008 II Rus J AIDS, Cancer and Public Health, V. 13 (2), May 2009, P. 58.

8. Pestova N., Chemaeva E., Matveeva N., .Zhemkov V. and Kozlov A / Study of M. tuberculosis spoligotypes among high-risk groups in St.Petersburg in 2007-2008 // Rus J AIDS, Cancer and Public Health, V. 13 (2), May 2009, P.72.

9. Добрынин П.В., Черняева Е.Н. / Изучение точечных мутаций в гене gyrA, связанных с устойчивостью к офлоксацину штаммов Mycobacterium tuberculosis, обнаруженных в Санкт-Петербурге в 2008 году // Материалы конференции «Ломоносов - 2009», Апрель 2009, секция «Биология», подсекция «Микробиология», с. 5.

10. Пестова Н.Е., Черняева Е.Н. / Молекулярно-эпидемиологическое исследование штаммов микобактерий туберкулезного комплекса в группах риска в Санкт-Петербурге в 2007-2008 гг. // Материалы конференции «Ломоносов - 2009», Апрель 2009, секция «Биология», подсекция «Микробиология», с. 16.

11. Mutations in katG, rpoB and embB genes in drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in St.Petersburg in 2007. Materials of Int Conference on TB Immunodiagnostics. September 2008, Virginia Beach, VA, USA.

Подписано в печать 09.02.2012г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,1. Тираж 100 экз. Заказ № 2499.

Отпечатано в ООО «Издательство "J1EMA"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. 24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черняева, Екатерина Николаевна, Санкт-Петербург

61 12-3/779

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОМЕДИЦИНСКИЙ ЦЕНТР

БИОХИМИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО КОМПЛЕКСА, РАСПРОСТРАНЕННЫХ

В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ

03.01.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

ЧЕРНЯЕВА

Екатерина Николаевна

Научный руководитель: доктор биологических наук

КОЗЛОВ А.П.

Санкт-Петербург 2012

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.........................................................................2

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................4

Цель и задачи исследования..........................................................................................................5

Научная новизна и практическая значимость работы................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................................7

1.1. Общая характеристика микобактерий туберкулезного комплекса....................................7

1.2. Геном микобактерий туберкулезного комплекса...............................................................13

1.3. Методы анализа генома микобактерий туберкулезного комплекса.................................15

1.4. Генетическое разнообразие штаммов микобактерий туберкулезного комплекса..........18

1.5. Семейства сполиготипов микобактерий туберкулезного комплекса. Распространенность различных сполиготипов микобактерий туберкулезного комплекса в разных регионах мира..................................................................................................................23

1.6. Молекулярные механизмы лекарственной устойчивости М. tuberculosis........................26

1.7. Проблема множественной и широкой лекарственной устойчивости..............................41

1.8. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в России и в мире..................................43

1.9. Распространенность туберкулеза в различных социальных группах..............................45

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................................................................51

2.1. Материалы..............................................................................................................................51

2.2. Методы...................................................................................................................................52

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.........................................................................................................................68

3.1. Анализ точечных мутаций, ассоциированных с устойчивостью М. tuberculosis к изониазиду, рифампицину и офлоксацину................................................................................68

3.2. Сравнение сполиготипов офлоксацин-устойчивых штаммов М. tuberculosis, штаммов обладающих МЛУ и штаммов чувствительных ко всем ПТП.................................................74

3.3. Результаты анализа сполиготипов М. tuberculosis, обнаруженных у пациентов, принадлежащих к различным группам риска............................................................................86

3.3. Анализ регионов различия генома МБТ...........................................................................101

3.4. Формирование коллекции геномной ДНК штаммов МБТ..............................................105

4. ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................................................................106

4.1. Анализ точечных мутаций в генах katG, rpoB, gyrA и gyrB, ассоциированных с устойчивостью штаммов М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам.................106

4.2. Анализ сполиготипов офлоксацин-устойчивых штаммов М. tuberculosis, штаммов обладающих МЛУ и штаммов чувствительных ко всем ПТП...............................................118

4.3. Анализ сполиготипов М. tuberculosis, обнаруженных у пациентов, принадлежащих к различным группам риска.........................................................................................................123

5. ВЫВОДЫ...............................................................................................................................130

Список литературы....................................................................................................................131

список

АМК

СРМ

СТАВ

ЕМВ

ЕТА

INH

КМ

OFL

PZA

RIF

SM

SNP

QRDR

АГ

БОМЖ

БЦЖ/BCG

ВИЧ

ВОЗ

ДНК

ЛАМ/ЬАМ

МАП/МАР

МБТ

МИК

МЛУ

МЛУ-ТБ

ПТП

СОКРАЩЕНИИ И ОБОЗНАЧЕНИИ

Амикацин Капреомицин

cetyltrimethylammonium bromide

Этамбутол

Этионамид

Изониазид

Канамицин

Офлоксацин

Пиразинамид

Рифампицин

Стрептомицин

Single nucleotide polymorphism quinolone resistance determining region Арабиногалактан Бездомные

Бацилла Кальметта-Герена/ВасШш Calmette—Guerin

Вирус иммунодефицита человека

Всемирная организация здравоохранения

Дезоксирибонуклеиновая кислота

Липоарабиноманнан

Микоил-АГ-пептидогликан

Микобактерии туберкулезного комплекса

Минимальная ингибирующая концентрация

Множественная лекарственная устойчивость

Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью

Противотуберкулезные препараты

РНК Рибонуклеиновая кислота

ТБ Туберкулез

ШЛУ Широкая лекарственная устойчивость

ШЛУ-ТБ Туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью

ПЦР полимеразная цепная реакция

п.о. пара оснований

УФ ультрафиолет

ЭДТА этилендиаминотетраацетат

Однобукеенные обозначения аминокислот:

А аланин С цистеин

В аспарагиновая кислота Е глутаминовая кислота

¥ фенилаланин О глицин

Н гистидин I изолейцин

К лизин Е лейцин

М метионин N аспарагин

Р пролин II аргинин

С> глутамин 8 серин

Т треонин V валин

триптофан У тирозин

IB IBEjE^EHI И E

Туберкулез является ведущей причиной смерти среди инфекционных заболеваний. Рост распространенности туберкулеза (ТБ) во многих странах мира стал естественным следствием не только социально-экономических потрясений, распространения ВИЧ-инфекции, но и результатом изменений самого возбудителя, а именно, появления штаммов микобактерий туберкулезного комплекса, устойчивых ко многим лекарственным препаратам. Согласно оценкам ВОЗ, в 2009 г. во всем мире насчитывалось около 14 миллионов случаев заболевания туберкулезом (ТБ) (WHO, 2010). Россия является одной из 22 стран с наибольшим бременем заболевания ТБ, а также входит в число стран с наибольшим числом случаев ТБ с множественной лекарственной устойчивостью (WHO, 2010). Наличие устойчивости к лекарственным препаратам значительно снижает вероятность успешного лечения ТБ, поэтому для назначения корректной терапии необходимо применять современные биохимические методы обнаружения устойчивости М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам, основанные на анализе мутаций, являющихся молекулярными маркерами резистентности. Известно, что частота аминокислотных замен, связанных с развитием лекарственной устойчивости у микобактерий, может различаться в различных географических регионах. Для эффективного применения молекулярно-биологических методов диагностики лекарственной устойчивости необходимо знать частоту мутаций, связанных с резистентностью к препаратам, в конкретном регионе в данный момент времени.

Помимо лекарственной устойчивости, серьезную угрозу возникновения эпидемии представляет рост заболеваемости ТБ среди ВИЧ-инфицированных индивидов, лиц, находящихся в местах лишения свободы, бездомных и

мигрантов. В настоящий момент существует достаточное количество работ, посвященных молекулярно-биологическим исследованиям штаммов микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ) в различных регионах России и (Kovalev et al., 2005; Surikova et al., 2005; Drobniewski et al., 2005(a); Mokrousov et al., 2008). В большинстве работ изучается генетическое разнообразие штаммов МБТ, циркулирующих среди общей популяции больных ТБ (Kovalev et al., 2005; Surikova et al., 2005; Mokrousov et al., 2008). Незначительное количество работ посвящено изучению особенностей штаммов МБТ среди заключенных (Kimerling et al., 1999; Toungoussova et al., 2003; Drobniewski et al., 2005(a)). Вместе с тем, молекулярно-эпидемиологические особенности штаммов МБТ, циркулирующих в группах риска, особенно среди таких как ВИЧ-инфицированные и лица БОМЖ, не изучены. Поэтому изучение генетического разнообразия штаммов МБТ среди групп риска, представляет большой интерес.

Цель и задачи исследования

Целью исследования является изучение биохимических и молекулярно-

биологических особенностей штаммов микобактерий туберкулезного комплекса, распространенных на территории Санкт-Петербурга. Задачи исследования:

1. Сформировать коллекцию образцов геномной ДНК микробиологически охарактеризованных клинических штаммов М. tuberculosis, выявленных

среди больных Санкт-Петербурга.

2. Определить частоту характерных аминокислотных замен,

ассоциированных с устойчивостью штаммов микобактерий туберкулезного комплекса к изониазиду, рифампицину и офлоксацину.

3. Сравнить генетическое разнообразие изолятов микобактерий туберкулезного комплекса, чувствительных ко всем

противотуберкулезным препаратам, а также обладающих множественной и широкой лекарственной устойчивостью.

4. Сравнить генетическое разнообразие изолятов микобактерий туберкулезного комплекса, выявленных у пациентов из различных групп риска.

Научная новизна и практическая значимость работы

Применены современные методы анализа ДНК для генотипирования

штаммов микобактерий туберкулезного комплекса

и обнаружения мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью. Сформирована коллекция образцов геномной ДНК клинических штаммов М. tuberculosis, выявленных среди больных туберкулезом жителей Санкт-Петербурга.

Проведена комплексная молекулярно-генетическая характеристика лекарственно-устойчивых и чувствительных к противотуберкулезным препаратам штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в Санкт-Петербурге.

Впервые проведено молекулярно-генетическое сравнение штаммов М. tuberculosis, выявленных среди пациентов из различных медико-социальных групп: бездомных, ВИЧ-инфицированных, заключенных и общей популяции жителей Санкт-Петербурга. Продемонстрировано доминирование штаммов М tuberculosis Beijing во всех исследованных группах изолятов, а также значительное преобладание штаммов семейства Beijing среди пациентов, находящихся в местах лишения свободы.

Результаты работы показали, что мутации в области QRDR гена gyrA обнаруживаются только у 57% офлоксацин-устойчивых изолятов, включенных в исследование. Этот факт демонстрирует относительно невысокую значимость мутаций в гене gyrA для определения лекарственной устойчивости штаммов М.

tuberculosis к офлоксацину в Санкт-Петербурге по сравнению с другими регионами.

Результаты работы могут быть применены для решения ряда прикладных задач современной клинической микробиологии и эпидемиологии туберкулезной инфекции, и являются достижением в области создания реагентной базы для разработки, производства и испытания кандидатной вакцины против ТБ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика микобактерий туберкулезного

комплекса

Туберкулез человека и животных вызывается несколькими близкородственными видами бактерий, относящихся к микобактериям туберкулезного комплекса (МБТ), принадлежащим роду Mycobacterium, семейству Mycobacteriacae, порядку Actinomycetalis. К роду Mycobacterium относится группа патогенных видов бактерий, включая микобактерии туберкулезного комплекса, М. leprae и ряд видов нетуберкулезных микобактерий, вызывающих различные микобактериальные заболевания.

1.1.1. Морфология и ультраструктура микобактерий

Микобактерии - тонкие, прямые или незначительно изогнутые палочки

длиной 1-10 (чаще 1-4) мкм, шириной 0,2-0,6 мкм, гомогенные или зернистые со слегка закругленными концами. Они неподвижны, не образуют эндоспор, конидий и капсул. Морфология и размеры бактериальных клеток значительно колеблются, что зависит от возраста клеток и, особенно от условий существования и состава питательной среды.

M. tuberculosis относится к немногочисленной группе микроорганизмов, способных выживать в фагоцитировавших их клетках животных, поэтому вполне обосновано положение о существовании в их клеточных оболочках специальных защитных механизмов. Большинство исследований структурных особенностей оболочки микобактерий проводились на моделях быстрорастущих нетуберкулезных микобактерий, которые легче культивируются и поддаются обработке, тем не менее, их структура не имеет видимых отличий от МБТ (Туберкулез. Патогенез, защита, контроль., 2002).

Клеточная мембрана микобактерий, в том числе МБТ, имеет классическую структуру из двух электронно-плотных слоев, разделяющихся прозрачной прослойкой (Silva et al. 1983). Отличительной чертой микобактериальной мембраны является содержание в ее составе большого количества липополисахаридов, липоарабиноманна (ЛАМ, LAM), липоманнана и фосфатидилинозитол маннозида. Долгое время считалось, что микобактерии не имеют внешней мембраны, подобно обнаруживаемой у грамотрицательных бактерий (Туберкулез. Патогенез, защита, контроль., 2002). Однако недавние исследования с использованием метода криоэлектронной томографии показали, что МБТ имеют внешнюю мембрану (Hoffman et al. 2008), которая, тем не менее, отличается от внешней мембраны грамположительных бактерий (Niederweis et al. 2010).

Клеточная стенка Mycobacterium состоит из пептидогликанов, соединенных с арабиногалактанами (AT), к которым присоединяются миколовые кислоты с помощью ковалентных связей (Brennan et al., 1995). Таким образом, формируется комплекс «микоил-АГ-пептидогликан» (МАП, MAP). Миколовые кислоты - это разветвленные 3-гидроксикислоты (R'-CHOH-CHR2-COOH), которые в положениях 2 и 3 замещены алифатическими цепями, имеющими различную длину. В миколовых кислотах микобактерий содержится

60-90 атомов углерода (Brennan et al., 1995). Миколовые кислоты и липиды, входящие в состав клеточной стенки, создают гидрофобный барьер проницаемости клетки. Каналы, напоминающие порины грамотрицательных бактерий, обнаруженные у M.chelonae (Trias et al., 1992) и M.smegmatis (Heinz et al., 2003; Niederweis, 2003; Trias et al., 1994), позволяют проникать гидрофильным молекулам сквозь гидрофобную клеточную стенку.

Поверхностные гликолипиды

Миколовые кислоты

û- <

арабиногалактан

пептидогликан Билипидный слой

Рис. 1. Схема строения клеточной стенки микобактерий. Комплексы МАП (МАР) формируют коровую структуру бактериальной оболочки.

Высокое содержание сложных жирных кислот в составе клеточной стенки микобактерий препятствует окрашиванию анилиновыми красителями. Несмотря на то, что микобактерии не окрашиваются по Граму, их принято считать грамположительными. После окрашивания бактерий феноловым фуксином они не обесцвечиваются раствором соляной кислоты или солянокислого спирта. Таким образом, их можно назвать «кислотоустойчивыми». Однако кислотоустойчивость может утрачиваться на определенных стадиях жизненного цикла микобактерий.

Микобактерии считаются аэробами, хотя имеются сведения, что некоторые их виды можно рассматривать как факультативные анаэробы. Существует естественное разделение видов микобактерий на две группы: «быстрорастущие» и «медленнорастущие». Медленнорастущие микобактерии способны формировать колонии на плотных средах не ранее, чем через 7 дней после посева клинического материала. Быстрорастущие микобактерии формируют видимые колонии ранее, чем через 7 дней после инокуляции, при культивации в идеальных условиях.

1.1.2. Виды микобактерий туберкулезного комплекса

Микобактерии, входящие в состав МБТ: Mycobacterium tuberculosis, М.

bovis, М. bovis BCG, М. africanum, М. caprae, М. microti, М. pinnipedii и М canetti, являются близкородственной группой медленнорастущих микобактерий. Несмотря на то, что виды МБТ генетически очень близки, они обнаруживаются у различных хозяев, различаются по ареалу обитания, фенотипу и патогенности (таблица 1) (Richter et al., 2004).

Штаммы Mycobacterium tuberculosis (sensu stricto), вызывающие туберкулез у людей чаще остальных видов микобактерий, были также обнаружены у приматов, собак, кошек, свиней, птиц и некоторых диких животных (Liu et al., 1980; Aranaz et al., 1996 (a); LoBue et al. 2010; Michalak et al., 1998).

Mycobacterium bovis является патогеном как для многих диких и домашних видов млекопитающих, так и для человека (LoBue et al., 2010; Collins., 2000).

M. bovis BCG - Бацилла Кальметта-Герена (Bacillus Calmette-Guerin) -является вакциной против туберкулеза, приготовленной из штамма ослабленной живой коровьей туберкулезной бациллы Mycobacterium bovis, которая утратила

вирулентность для человека, будучи специально выращенной в искусственной среде.

Вид Mycobacterium africanum, описанный Castets и коллегами в 1969 году, является гетерогенной группой штаммов, вызывающих ТБ у жителей Экваториальной Африки (Castets et al., 1969). Показано, что помимо людей штаммы М. africanum вызывают туберкулез у приматов, крупного рогатого скота и свиней (Thorel, 1980; Alfredsen et al., 1992).

Mycobacterium microti (Reed, 1957) были впервые выявлены у полевок в 1937 году. Штаммы этого вида чаще всего обнаруживаются у мелких грызунов, однако инфекция, вызываемая М. microti была обнаружена у кошек, свиней и лам (Huitema et al., 1967; Pattyn et al., 1970).

Изоляты Mycobacterium caprae впервые были выявлены в качестве возбудителя туберкулеза коз. Штаммы этого вида микобактерий также были обнаружены у больных туберкулезом людей.

Редко встречающиеся бактерии вида Mycobacterium canetti известны как возбудители ТБ у людей. Впервые М. canetti был изолированы и культивированы в институте Пастера в Париже в 1969 году Джорджем Канетти (Georges Canetti). В те годы их классифицировали как подвид М. tuberculosis, имеющий гладкие колонии при росте на плотных питательных средах. В 1997 году штаммы М.canetti были выделены в отдельный вид (Van Soolingen et al. 1997).

Mycobacterium pinnipedii были впервые обнаружены у тюленей. Ластоногие считаются естественными хозяевами для данного вида микобактерий, тем не менее,