Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биодеградация компонентов нефтяного загрязнения с участием микроводорослей и цианобактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биодеградация компонентов нефтяного загрязнения с участием микроводорослей и цианобактерий"

САНКТ - ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

САФОНОВА Елена Федоровна

БИОДЕГРАДАЦИЯ КОМПОНЕНТОВ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ С УЧАСТИЕМ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ И ЦИАНОБАКТЕРИЙ

Специальность: 03.00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в отделе Микробиологии Биологического НИИ Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Квитко Константин Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Никитина Валентина Николаевна

доктор биологических наук Юрлова Надежда Александровна

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский центр Экологической Безопасности РАН

Защита состоится "¡в" С^О.^&^'р-Ф 2004 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 212.232.07 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Биолого-почвенный факультет СПбГУ, аудитория 133.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке имени А. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е. И. Шарова

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Антропогенное загрязнение окружающей среды нефтепродуктами, и в частности ароматическими углеводородами является важной экологической проблемой. Некоторые ароматические загрязнители обладают токсическими, мутагенными или канцерогенными свойствами. Поэтому способы удаления этих веществ из окружающей среды являются предметом изучения многих отраслей науки, и в первую очередь биологии

При биоремедиации техногенных экосистем используют, как правило, биопрепараты на основе бактерий, мицелиальных грибов и дрожжей, а также высшие растения Водоросли и цианобактерии в очистке вод от ксенобиотиков, таких как нефть и ароматические углеводороды до настоящего времени не нашли применения. Такая недооценка их использования связана с тем, что разрушение ароматических соединений этими организмами практически не изучено и лишь ограничено отдельными исследованиями (Narro et al, 1992; Semple et al, 1994).

Известно, что системы, включающие несколько организмов, являются более предпочтительными в биоремедиационных процессах (Alexander, 1994) Изучению нефтеразрушающих микробных консорциумов бактерий и цианобактерий (Abed et al, 2002; Cohen, 2002; Al-Awadhi et al, 2003) в последнее время начали уделять большее внимание, в то время как консорциумы бактерий и водорослей остаются до сих пор почти не исследованными.

Биоремедиация загрязненных нефтью экосистем ассоциациями микроорганизмов -нефтедеструкторов и устойчивых к загрязнению водорослей и цианобактерии позволит интенсифицировать процесс очистки. Кроме того, если эти организмы будут сами способны к разрушению ксенобиотиков, то внесут дополнительный вклад п биоремедиацию техногенных экосистем

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было нзучение разрушения компонентов нефтяного загрязнения с участием водорослей и цианобактерии Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи: -создание коллекции водорослей из обитателей нефтеразрушающнх ценозов, -испытание устойчивости штаммов водорослей к ароматическим к поверхностно-активным веществам,

«испытание устойчивости штаммом по доросло íi к нсфтн (лшуту) п аксешгш?.1\ культурах и в смесях с бактериями;

-изучение биодеградации фенола и фспантрсна алмо-Оак-г^рцАп^щ" згллшшшами

„(fö^AMff^W -

УВ%¡D&

-практическое применение селективно-отобранных альго-бактернальных консорциумов для очищения воды из озера-коллектора сточных вод.

Научная новизна работы. Впервые создана коллекция водорослей и цианобактерий, штаммы которой являются не только резистентными к ароматическим веществам, но и способными к их разрушению.

Разработан новый метод определения концентрации фенантрена на основе его флуоресценции в четыреххлористом углероде.

Впервые установлено, что водоросли Chlorococcum vacuolatum, Klebsormidium flaccidum, Tetracystis fissurata, Stichococctus sp. способны к разрушению фенола.

Впервые определены продукты разрушения фенантрена зеленой водорослью Scenedemus obliquus ES-55.

Показано, что фотосиитетические партнеры, такие как зеленые водоросли и цианобактерий способствуют ускорению осуществляемых бактериями деградационных процессов.

Впервые применены в биоремедиационной работе по очистке высокотоксичных индустриальных стоков штаммы водорослей рода Stichococcus, формирующие микробный консорциум на поверхности капроновых волокон.

Практическая значимость. Штаммы водорослей из созданной коллекции могут быть использованы в консорциумах с бактериями-деструкторами для очистки вод и почв, загрязненных ароматическими веществами и нефтью

Проведенные пилотные испытания показали высокую эффективность нового подхода в ремедиации нефтезагрязненных систем

Апробация работы. Результаты исследований представлялись на Международной конференции "Fundamental and applied problems of environmental protection" (Томск, 1995), конференции "Business Methods for Russian Biotechnology" (С-Петербург, 1995); 2-ой практической конференции «Sustainable development: system analysis in ecology» на Украине (Севастополь, 1996); VI молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (С.-Петербург, 1997); научной конференции студентов и молодых ученых биологического факультета БГУ (Уфа, 1997); конференции «Микробиология почв и земледелие» (С.-Петербург, 1998); симпозиуме "Microbiology of Polluted Aquatic Ecosystems" (Leipzig, 1998); 4 Международном симпозиуме королевского университета в Северной Ирландии (Belfast, 1998); Всероссийском научно - практическом молодежном симпозиуме "Экология Байкала и Прибайкалья" (Иркутск, 1998); III Международном конгрессе "Окружающая среда для нас и будущих поколений: экология, бизнес и экологическое образование" (Самара-Астрахань, 1998); седьмой ежегодной научной конференции «XXI век: ♦ молодежь, образование, экология, ноосфера» (С.-Петербург, 1999); Всероссийском научно-практическом молодежном симпозиуме "Экология Байкала

и Прибайкалья" (Иркутск, 1999); Международной конференции «Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность» (С.-Петербург, 2000); VII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (С.-Петербург, 2000), 4 European Workshop "Biotechnology of microalgae" (Bergholz-Rehbrucke, 2000); конференции "Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды" (Пущино, 2001); конференции ISEB (Лейпциг, 2001), 7 Путинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003); Международной научно-практической конференции «Проблемы и перспективы реабилитации техногенных экосистем» (Астрахань, 2004).

Публикация. По материалам диссертации опубликовано 24 работы.

Структур а и объем ди ссе рта ци и. Диссертация состоит из введения; обзора литературы; материалов и методов; изложения и обсуждения результатов; заключения; выводов; приложений. Список литературы содержит 165 названия, в том числе 139 на английском языке. Текст диссертации изложен на 143 страницах, содержит 37 таблиц и 40 рисунков, в том числе 4 таблицы и 12 рисунков вынесены в приложение.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ: АВ - ароматические вещества, ГХ/МС - газовая хроматография / масс-спектрометрия, ДМСО - диметилсульфоксид, КОЕ - колониеобразующие единицы, ОП - оптическая плотность, ПАВ - поверхностно-активные вещества, DAD - Diode Array Detection, HPLC -High Performance Liquid Chromatography, ФЛ - фенол, ö-MH - ö-метилнафталин, 1,6-ДМН -1,6 -диметилнафталин, ФН - фенантрен, ЕСзо- 50% эффективная концентрация.

П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили штаммы водорослей, цианобактерий, бактерий, выделенные из нефтезагрязненных вод и почв (Safonova et al., 1998), а также штаммы водорослей и бактерий из различных коллекций России и Европы.

Культивирование штаммов проводилось на средах: № 6 (Громов и Титова, 1991), ВВМ (Bischoffand Bold, 1963), Kuhl (Kuhl, 1962), СПА (Махачкала, Россия), BBL (Becton Dickinson, США), NB (Sifin, Германия) и FES (Schlosser, 1994)

Водоросли выращивали при 25°С при постоянном освещении 25^mol photons x m'2 X s*' или при 20°С в режиме свет-темнота (16:8) при освещении 45^mol photons x in'* X S"'.

Выделение и отбор штаммов водорослей и цианобактерий для создания коллекции ES (Ecological strains) проводили на основании характеристик температурного оптимума, иммобилизации на капроновых волокнах, устойчивости к тяжелым металлам, нефти, АВ и ПАВ (Сафонова, 1997, Safonova et al, 1998).

Для выяснения устойчивости к АВ, проводили определение концентрации хлорофилла а и b методом, описанным Hiscox и Israelstam (1979). Эффективные концентрации АВ, вызывающие 50% снижение уровня хлорофилла (EC50) были рассчитаны методом регрессионного анализа.

Концентрацию фенола определяли колориметрическим анализом (Singleton et al., 1999) • и HPLC анализом на хроматографе Beckman System Gold (Германия) с System Gold DAD Module 168 на капиллярной колонке Ultra sphere ODS RP-18 (15 м 4,6 мм, 5 цм).

Концентрацию фенантрена определяли в экстрактах CCI4 люминесцентным методом (Каменцев и др., 2001) на анализаторе Флюорат-02 (Люмекс, С.-Петербург) и HPLC анализом на хроматографе Beckman System Gold, System Gold DAT) Module 168, капиллярная колонка LiChroSpher PAH (250 x 4 мм, 5 jum). Идентификацию продуктов деградации фенантрена проводили методом ГХ/МС. Пробы экстрагировали СС^ и анализировали в хромато-масоспектрометре HP-6890-MSD (Hewlett Packard, Германия) с капиллярной колонкой HP5-MS (30 м х 0,25 мм; 0,25 дМ)

Для изучения роста штаммов водорослей и искусственных ассоциаций под пленкой 1 % мазута использовали измерение ОП, подсчет клеток в камере Горяева и подсчет КОЕ (Safonova et al, 1999). Разрушения нефти определялось флуоримстрически на анализаторе Флюорат-02 (Люмекс, С.-Петербург).

Для пилотного эксперимента по биоремедиация воды озера-коллектора был проведен скрининг водорослей и бактерий, а также иммобилизация клеток на различных носителях (Safonova et al., 2004). БПК и ХПК определяли по методу Лурье и Рыбниковой (1974). Атомный адсорбционный спектрометр MGA-915 (Люмекс, С.-Петербург) использовали для определения Си, Ni, Zn, Mn, Fe. Концентрацию фенола, анионные ПАВ и нефти определяли флуориметрически на анализаторе Флюорат-02 (Люмекс, С.-Петербург)

Проверка аксеничности водорослей проводилась путем светового и фачово-контрастного микроскопирования и пысевом проб на твердые органические среды

HL РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Создание, коллекции ES, В течение 1993 - 1999 годов из ценозов почп и водоемов, загрязненных разливами нефти, фенолов и ионами i-яжслых металлов, были изолированы культуры эукариотических водорослей и цианобактернй. На основании характеристик (табл. I), важных для использования водорослей в составе биофильтров, была создана коллекция водорослей ES (Ecological strains). Коллекция пополняется по мере изучения новых изолятов из загрязненных вод и почв. Часть штаммов передано в коллекцию САШ.

Таблица 1.

Характеристика таксонов водорослей, включенных в коллекцию ES к 1997 году

Штамм ЭКОТОП t опт Иммобилизация Резистентность

ФЛ аМН 1,6 ДМН ФН ПАВ

Chlamydomonas sp. ES-16 почва 15 И - - - + -

Chlamydomonas sp. ES-47 почва 15 И - - - + -

Chlorella sp **(ES-1, ES-3, ES-4) вода IS И + + -

Chlorella sp.*(ES-3m, ESA ES-13) вода 25, 15 , ни - + + + +

Chlorella sp. ES-27 почва 15 И - - - + -

Chlorella sp. ES-30 почва 15 И + + + + +

Chlorococcum vacuolalum ES-15 почва 15 И + - - - -

Kirchneriella obesa ES-60 почва 15 НИ + - - + -/+

Klebsormidhm flacadum ES-29 вода 15 НТ + + + + -

Nostoc sp. ES-79-2 почва 25 И + + + + НТ

Scenedesmus obliqma ES-55 почва 25 И + + - + +

Scenedesmus quadricauda ES-59 почва 15 НИ - + - + +

Scenedesmus quadricauda ES-79 почва 15 НИ - - • + +

Scenedesmus quadricauda ES-80 почва 15 НИ - + - + +

Scenedesmus sp. ES-44 почва 15 И + + - + +

Stichococcus minor ES-19 почва 15 И + + + + +

Tetracystisfissurau ES-67 почва 15 и - - - -

Tetracystis ftssurala ES-77 почва 15 и - - - - -

( + ): устойчивые штаммы; (+/-): среднеустойчивые штаммы; (-): чувствительные штаммы; *: устойчивые к тяжелым металлам, миксотрофы; **: среднеустойчивые к тяжелым металлам, фототрофы; НТ: не тестированы; И: способны к иммобилизации на капроновых волокнах; НИ - не иммобилизуются на капроновых волокнах.

Разнообразие проявления устойчивости штаммов водорослей к загрязнению ароматическими веществами. Устойчивость штаммов водорослей из нашей коллекции ES, САШ, SAG, ASIB, Института Ботаники Лейпцигского университета к АВ (ФЛ, й-МН, 1,6 ДМН, ФН) была определена методом измерения хлорофилла в суспензиях.

Среди исследованных нами представителей рода Chlorella (6 штаммов) устойчивостью к ФН обладало 5 штаммов, к ФЛ - 1 штамм, к а-МН - 3 штамма, к 1,6 ДМН - 3 штамма Представители рода Scenedesmis (4 штамма) показали устойчивость к ФЛ (3 штамма), аМН (2 штамма) и ФН (3 штамма), но к 1,6 ДМН все штаммы были чувствительны. Из 15 рассмотренных нами штаммов рода Stichococcus 14 штаммов были устойчивы к а-МН и 6 штаммов обладали устойчивостью к ФЛ. Тестирование двух представителей рода

Kkbsormidium выявило устойчивость ко всем четырем АВ штамма из нашей коллекции (ES-29). Штамм из коллекции SAG (335-1 а) проявил резистентность к а-МН и ФН. Тестирование 2-х штаммов рода Kirchneriella показало, что штамм из нашей коллекции (ES-60) был устойчивым к ФЛ и ФН, тогда как, штамм из коллекции Лейпцигского Университета (А.20) был устойчив к а-МН и 1,6 ДМН. Два исследованных штамма рода CMamydomonas оказались устойчивы только к ФН. Представители Tetracystis fissurata (2 штамма) были чувствительны ко всем АВ. Из культур рода СЫоюсоссчт протестирован 1 штамм, который был устойчив только к ФЛ.

Увеличение концентрации хлорофилла (по отношению к контролю) наблюдалось для штаммов: Kkbsormidiumflaccidum ES-29 при добавлении всех исследуемых АВ (в 1,5-6 раз), Kkbsormidium miens SAG 335-la при воздействии а-МН (в 1,5 раза) и ФН (в 2 раза), CMamydomonas sp. ES-47 (в 3 раза) при воздействии ФН.

Наиболее высокие уровни устойчивости к АВ по критерию БСзо (50% снижение содержания хлорофилла) показали следующие штаммы: Chhrella sp. ES-13 (0,19% а-МН и 0,33% 1.6ДМН), Chhrella sp. ES-13m (0,23% 1.6ДМН), Chtamydomonas sp. ES-47 (0,63% ФН), Stichococcus minor ES-19 (0,24% а-МН), Stlchococcus sp. ES-85 (0,24% а-МН), SHchococcus sp. ES-88 (0,19% а-МН), Klebsormidium flaccidum ES-29 (0,13% ФЛ и ФН, 0,25% 1,6ДМН),Klebsormidium nitens SAG 335-la (0,15% ФН).

Изучение разрушения фенола искусственными альго-бактериальными ассоциациями. Разрушение АВ в природе происходит за счет работы всего ценоза. Поэтому представляется. важным моделирование и изучение искусственных ассоциаций, составленных из водорослей, устойчивых к токсикантам, и бактерий, разрушающих эти вещества.

В результате скрининга 24 штаммов бактерий на способность разрушать фенол (400 мг/л) были отобраны фенолразрушающие. штаммы. При тестировании этих штаммов в ассоциациях со штаммом водоросли Chloretla sp. ES-30 было показано, что разрушение фенола в ассоциациях происходит быстрее (табл. 2). Исключением была смесь Ph-1 и Chlorella sp. ES-30.

Таблица 2.

Сравнение длительности процесса полного разрушения фенола (400 мг/л) бактериями и их ассоциациями со штаммом водоросли СННгеИа sp. ES-30 (колориметрический анализ)

Штамм Время полной деструкции фенола, часы

монокультура В ассоциации с Chlorella sp. ES-30

Bacillus sp. D-68 144 120

Pseudomonas putida E-2 120 48

Acinetobacter deovorum 712 144 72

Rhodococctts erythropolls AC-184 144 72

Ph-1 48 144

Биодеградация фенола штаммами водорослей. Скрининг на способность к разрушению ФЛ в концентрации 5 мг/л был проведен колориметрическим анализом для 19-ти штаммов водорослей, растущих фототрофно (рис. 1) Через 29 дней разрушение ФЛ происходило в культурах: Chlorella vulgaris CALU-157 (на 93%), Stichococcus sp. ES-86 (на 21%), Chlorococcum vacuolatum ES-18 (на 100%), TetracystisJissurataES-22 (на 100%), Tfissurata ES-67 (на 56%), Tfissurata ES-77 (на 72%), T.fissurata ES-84 (на 97%), Nostoc sp. ES-79-2 (на 28%). HPLC анализ подтвердил разрушение фенола штаммами водорослей.

Способность к разрушению фенола в концентрации 10 мг/л исследовалась для 7 штаммов. Штамм Chlorococcum vacuolatum ES-18 разрушал ФЛ на 67% за 45 дней, Chlorococcum vacuolatum ES-15 на 97% за 29 дней, Chlorella vulgaris CALU-157 на 64% за 43 дня, Klebsormidittm flaccidum ES-29 на 95% за 50 дней, Tetracystis fissurata ES-84 на 42% за 45 дней. Разрушения не наблюдали в течение 1 месяца для S. obliqutn ES-55 и К. obesa ES-60. Разрушение фенола на свету не происходило в контрольной среде (в отсутствии водорослей) HPLC анализ подтвердил данные, полученные колориметрическим анализом. Неиденгифициропанный метаболит со временем удержания 3,29 был выявлен на хромато грамм ах при HPLC анализе проб супернатанта культуры Ch. vulgaris CALU-157, выращенной в присутствии ФЛ на свету.

Опыты показали, что все исследованные штаммы рода Tetracystis разрушали фенол. Но из протестированных б штаммов рода Chlorella и 5 штаммов Stichococcus только по одному представителю (Ch. vulgaris CALU-157 и Slichococcus sp. ES-86) были способны к разрушению фенола. Поэтому, способность водорослей к разрушению фенола, скорее всего, является индивидуальной характеристикой штаммов.

Разрушение фенантрена искусственными ассоциациями. Разработанным нами флуоресцентным методом определения фенантрена, были протестированы ассоциации бактерий и водорослей. В большинстве случаев вариант искусственной ассоциации близок

к ожидаемому при аддитивном взаимодействии. Наиболее сильный совместный эффект наблюдался в ассоциациях с Rhodococcus sp. Ac-1267 и с Р!5. puUda E2 (табл.3), отрицательный эффект наблюдался в ассоциации cRh, erythropolis AC-184.

Таблица 3.

Сравнение разрушения ФН (2 0 иг/л) бактериями и их ассоциациями со штаммом водоросли Chlorelta sp. ES-30 на 30 день (определено флуоресцентным методом).

Штаммы Разрушение фенантрена (в % от контроля)

монокультура ассоциации эффект смеси

СЫогеПа яр. Ев-ЗО 14,1 . -

ВасШш ер. 1)-68 12,3 27,0 +0,6

Рзешктюпаз риМа Е-2 27,6 55.2 +13,5

Юкхккоссиз ягуЛгороПз АС-184 25,2 19,6 -19,7

Аапек&ас/ег октогит 712 17,8 36,2 +4,3

РЬ-1 44,2 50.3 -8,0

ЮШохрогапцтт аШит 754 5.5 21.5 +1.9

Шюсккоссиз «р. Ас-1267 8.6 45,4 +22,7

Разрушение фенантрена водорослями. 13 штаммов водорослей было подвергнуто воздействию ФН (20 мг/л) (рис. 2). Разрушение ФН клетками двух штаммов Scenedesmш на 40-й день (Scenedesmus sp. ES-44 - 60%, Scenedesmus obtiquus ES-S5 - 65%) было наиболее эффективно, в то время как третий из исследуемых штаммов этого рода Scenedesmus sp. ES-111 не обладал способностью к разрушению. Так же как и в случае с разрушением ФЛ, это указывает на то, что способность к разрушению ФН является индивидуальным признаком каждой культуры.

Рисунок 2. Разрушение ФН (20 мг/л) на 40-й день (в % от контроля), определенное флуоресцентным методом.

Биодеградация фенантрена штаммом водоросли Scenedesmus obliquus ES-55. Культура S. obliquus ES-55 не росла в темноте, как в присутствии ФН (14 мг/л), так и в его отсутствии. На свету ФН угнетал деление клеток (рис. 3) и образование 4-х клеточных ценобиев. Однако метаболизм клетки осуществляется, о чем свидетельствует увеличение количества хлорофилла на клетку.

ИРЬС анализом определено, что разрушение ФН культурой Е8-55 (рис. 4А) происходит только на свету. Новый пик (метаболит 1) со временем удержания 4,5-4,6 был выявлен на хроматограммах для Е8-58 растущей на свету в присутствии ФН.

ГХ/МС выявлено 5 продуктов деградации ФН штаммом S. obliquus ES-55. Один метаболит был идентифицирован как дигидрокси-дигидрофенантрен (рис 4В). Для выяснения стереохимической структуры дигидрокси-дигидрофенангрена и идентификации других метаболитов необходимо провести дополнительные анализы.

Изучение устойчивости клеток водорослей к загрязнению среды мазутом. 21 штамм водорослей и 16 штаммов цианобактерий, как в чистой культуре, так и в смеси с алканотрофкыми бактериями, были подвергнуты воздействию 1% мазута. Представители родов Stichococcus, Anabaena, Nostoc, Microcystis, Phormidium показали устойчивость к мазуту. В смеси с бактериями устойчивость штаммов водорослей и цианобактерий к мазуту усиливается. Присутствие алканотрофных бактерий восстанавливает размножение

чувствительных к мазуту штаммов и стимулирует клеточный рост чувствительных и толерантных штаммов водорослей.

Таблица 4.

Сравнение резистентности к мазуту штаммов водорослей и цианобактерий и их смесей с алканотрофными бактериями.

Тести- Резистентность Тести- Резистентность

Таксоны ровано без бак с бак-ми таксоны ровано без бак с бак-ми

количество штаммов количество штаммов

Chlorella 8 0 7 Tetracystis 2 0 1

Chlamydomonas 2 0 2 Anabaena 1 1 1

Chlorococcum ] 0 1 Lyngbya 2 0 2

Klrchnenella 1 0 1 Nosloc 7 2 5

Klebsormidhan 1 0 0 Osciilatoria 1 0 0

Scenedesmus 5 0 5 Phormidium 4 4 4

Stichococcus 1 1 1 Microcyslis 1 1 0

Природные ассоциации водорослей и штаммы водорослей с добавлением алканотрофных бактерий были более эффективны в разрушении мазута по сравнению с самими алканотрофными бактериями. Разрушение мазута штаммом Rhodococus sp. Ac-1267 составило 35,5%, при смешивании его с ассоциацией AS-45 (доминирующий род Scenedesmus) - 56,23%, в смеси с ассоциацией AS-47 (доминирующие формы Scenedesmus и Phormidium) - 60,8%.

Феномен стимуляции роста водорослей в присутствии алканотрофных бактерий и усиления деструкционной способности алканотрофных бактерий в присутствии водорослей, открывает новые перспективы в использовании искусственных ассоциаций водорослей и алканотрофных бактерий в биоочистке загрязненных экосистем.

Биоремедиапия воды озера-коллектора селектированным альго-бактериальным консорциумом. Модельным объектом для апробации ремедиации ассоциациями водорослей и бактерий сточной воды послужило озеро-коллектор в Самаре. Водоем использовался как коллектор стоков индустриальной промышленности более 50 лет.

В результате скрининга водорослей и бактерий на резистентность к сточной воде были отобраны следующие штаммы: водоросли СМогеПа sp. ES-13, Chlorella sp. ES-30, S. obliquus ES-55, штаммы Slichococus (ES-19, ES-85, ES-86, ES-87, ES-88), цианобактерпя Phormidium sp. ES-90 и бактерии Rhodococcus sp. Ac-1267, Kibdelosporangium aridum 754, два неидентифицированных штамма (St-1, St-2), изолированные из озера. Водоросли и бактерии были иммобилизованы на носителях (водоросли и цианобактерии на капроновых волокнах и сетках, бактерии на керамических, капроновых и древесных носителях) и введены в пилотную установку. Также использовались растения (Lemnasp. и Salvinia sp.).

Пилотная установка включала три этапа очистки: механическую фильтрацию песком, деградацию бактериями и биодеградацию водорослево-бактериальными консорциумами.

Удаление токсикантов на стадии песчаного фильтра происходило за счет прикрепления нефтяной эмульсии к частичкам песка и за счет того, что песок мог работать как биофильтр. Затем вода проходила в резервуар с иммобилизованными бактериями, аэрируемый воздухом. В этом резервуаре бактерии, разрушая загрязнители, снижали токсичность воды. В последующих 4 резервуарах были иммобилизованные водоросли и бактерии. Здесь проходило формирование водорослево-бактериальных ассоциаций. Клетки Stichococcus посредством выделяемой ими слизи прикреплялись к капроновым волокнам, формируя «конверты», к которым в свою очередь прикреплялись клетки других водорослей и бактерий. Таким образом, формировались ассоциации способные к деградации загрязнений. Клетки Chlorella и Scenedesmus отсоединялись от волокон в сточную воду и позже волокна обрастали клетками Stichococcus. Клетки Chlorella sp. и Scenedesmus sp. были определены микроскопированием в таких «конвертах». Также биопленки микробных консорциумов с доминирующей цианобактерией Phormidium были сформированы на капроновых сетках. Salvima sp. была чувствительна к сточной воде и гибла в течении первых дней, тогда как Lemma sp. была толерантна.

Химический анализ показал, что фенолы были удалены на 85%, анионные ПАВ на 73%, нефть на 96%, металлы от 62% до 90% (табл. 5). Снижение ХПК составляло 51% (от 1200+66,5 мг/л до 59О±48,9), снижение BOD25 было 97% (от 664±33,3 мг/л до 18,1±6,6).

Таблица 5.

Ремедиационные процессы в пилотной установке на различных ее этапах. Стандартное отклонение от среднего для металлов не превышало 10 %. N0 - не определено.

токсиканты Концентрация на различных этапах очищения, [мг/л] % удаления

Вход После фильтра с песком ■ После ремед нации бактериями После ремедиации консорциумами

фенолы 0,48±0,12 0,34±0,03 0,12±0,06 0,07±0,04 85

анионные ПАВ 22,25±2,35 21,8±0,45 14,15±2,24 6,07±1,6 73

нефть 7,5±1,03 3,3±0,69 2,15±0,55 0,3±0,07 %

медь 0,04 0,04 0,045 0,015 62

никель 0,21 0,14 0,14 0,08 62

цинк 0,10 ND ND 0,01 90

марганец 0,20 0,49 0,17 0,06 70

железо 6,43 4,22 2,88 2,31 64

Консорциум был более эффективен в удалении нефти. Концентрация нефти снизилась в семь раз после резервуара с бактериями. Концентрации фенолов и анионных ПАВ были в 2 раза ниже. Концентрации Си и N1 не изменилась после песочного фильтра и после резервуара с бактериями, тогда как после резервуаров содержащих водоросли и растения концентрации значительно снизились, возможно, вследствие аккумуляции их водорослями и растениями.

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция водорослей и цианобактерий (ES), штаммы которой являются резистентными к ароматическим веществам (компонентам нефти), а также к ряду ПАВ. Некоторые штаммы коллекции ES способны к разрушению фенола и фенантрена при инкубации на свету. Данные свойства штаммов водорослей и цианобактерий дают основания рекомендовать их в качестве компонентов искусственных ценозов (биофильтры) для ремедиации загрязненных нефтью экосистем.

2. Установлено, что аксеничные культуры водорослей Chlorella vulgans (CALU-157), Chlorococcum vacuolatum (ES-15, ES-18), Klebsormidium flaccidum (ES-29), Slichococcus sp (ES-86), Tetracystisftssurata (ES-22, ES-67, ES-77, ES-84) и цианобактерия Nostoc sp. (ES-79-2) способны к разрушению фенола (5-10 мг/л) на свету. Наиболее эффективным в разрушении фенола (10 мг/л) является штамм Chlorococcum vacuolatum ES-15 (97% за 29 дней).

3. Установлено, что аксеничные штаммы Scenedesmus sp. ES-44 и Scenedesmus obliquus ES-SS способны к разрушению фенантрена (20 мг/л) на свету (на 60 и 65% за 40 дней). Одним из продуктов деградации фенантрена штаммом Scenedesmus obliquus ES-SS является дигидрокси-дигидрофенантрен

4. Искусственные альго-бактериальные ассоциации более эффективны в разрушении фенола, фенантрена и мазута, чем монокультуры бактерий-деструкторов и водорослей. Наиболее эффективно разрушающей фенол (400 мг/л) и фенантрен (20 мг/л) ассоциацией являлась Pseudomomsputida E-2 и Chlorella sp. ES-30.

5. Практическое применение селективно-отобранных альго-бактериальных консорциумов с доминирующими водорослями рода Stichococus (служат как матрикс в ассоциациях) для очищения воды коллектора сточных вод с нефтепродуктами показало эффективность нового подхода для ремедиационных процессов в высоко-загрязненной окружающей среде. Фенолы были удалены на 85%, анионные ПАВ на 73%, нефть на 96%, металлы от 62% до 90%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРГАЦИИ

1. Квитко К. В, Янкевич М И, Дмитриева И А, Сафонова Е.Ф, Ляпунов Я. // Консорциумы водорослей и алканотрофных бактерий, их активность в разрушении пленок сырой нефти // «Экологически чистые технологические процессы в решении проблем охраны окружающей среды». Материалы конференции Иркутск, 1996 Вып 1 С. 37-38.

2. Kvitko K.V., Safonova E.Th., Dmitrieva 1Л, Iankevitch M 1, Hadeeva V.V., Lyzunov Л В. Functions or the associations of phototrophic and hcterolrophic microorganisms in processes of soil and water remediation after oil spills // «Sustainable development: system analysis in ecology». Abstracts of 2 practical conference Sevastopol, 1996. P. 112.

3. Сафонова Е.Ф. Подбор природных форм и мутантов водорослей Chlorella spp., фотосинтезирующих в загрязненых водоемах // Тезисы VI молодежном конференции ботаников в Санкт-Петербурге. С-Пб, 1997. С. 33-34

4. Сафонова Е.Ф. Изменчивость резистентности к токсикантам среди штаммов Chljrelta spp, выделенных из загрязненых вод // Тезисы Докладов на Научной конференции студентов и молодых ученых биологического факультета БГУ. Уфа, 1997. С. 65-66.

5. Сафонова ЕФ , Квитко К.В., Дмитриева ИА., Хадеева В.В. Фототрофные микроорганизмы в нефтезагрязненных грунтах // «Микробиология почп и земледелие» Тезисы докладов конференции. С.-Пб., 1998. С. 92.

6 Safonova E.Th., Kvitko К. V., Potapova M G. The collection of algae from polluted waters and soils // "Proceedings of the Workshop Microbiology of Polluted Aquatic Ecosystems, 1997". P.M. Becker (ed.), Leipzig, 1998, P. 188-196.

7. Safonova E.Th., Dmitrieva I A., Kvitko К V. The interaction of algae with alcanotrophic bacteria in black oil decomposition // "The International Society for Environmental Biotechnology". Abstracts of 4 International Symposium at The Queen's University of Belfast. Belfast, 1998. P. 18.

8. Сафонова Е.Ф. Состав ценоза как характеристика загрязнения вод Байкала и Ладоги // "Экология Байкала и Прибайкалья". Сборник тезисов Всероссийского научно-практического молодежного симпозиума. Иркутск, 1998 С. 11-42.

9. Safonova E.Th., Kvitko K.V., Dmitrieva I A, Potapova M G. The resistance of algae to black oil toxic effects in pure cultures and in association with alcanotrophic bacteria // "The Environment for us and the future generation Ecology, Business and Fxological Education". Abstracts of3 International Congress. Samara-Astrakhan, 1998. P. 30-31.

10. Сафонова Е.Ф. Создание банка культур микроводорослей для использования их в искусственных нефтеразрушающих ассоциациях // Труды победителей конкурса грантов 1998 года для студентоп, аспирантов н молодых ученых Санкт-Петербурга Направление «БИОЛОГИЯ». С-Пб, 1998 С 198-199.

11. Safonova E.Th., Dmitrieva I. A., Kvitko K.V. The interaction of algae with alcanotrophic bacteria in black oil decomposition // Resources. Conservation and Recycling, 1999 V. 27. P. 193-201.

12. Сафонова Е.Ф., Дмитриева И.А, Кпнтко К.В. Микроорганизмы нефтезагрязненных вод и почв - источник форм, участвующих в биорсмедиации // «XXI век молодежь.

образование, экология, ноосфера». Сборник тезисов 7 ежегодной научной конференции. С-Пб., 1999. С. 102-103.

13. Сафонова Е.Ф., Кольченко А.А. Поиск искусственных ассоциаций водорослей и бактерий, наиболее эффективно разрушающих фенол // "Экология Байкала и Прибайкалья". Сборник тезисов Всероссийского научно-практического молодежного симпозиума. Иркутск, 1999. С. 60-62.

14. Сафонова Е.Ф., Квитко К.В. ES-коллекиия водорослей и цианобактерий, устойчивык к токсическим веществам // «Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность». Труды Международной конференции. С-Пб., 2000. С. 461-463.

15. Кольченко АА., Сафонова Е.Ф. Отбор устойчивык к ароматическим веществам штаммов водорослей по признаку «выцветание хлорофилла» в массовык тестах // Сборник тезисов VII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге. С-Пб, 2000. С. 65.

16. Safonova E.Th., Kvitko K.V., Iankevitch M.I. Comparative study of artificial associations as agents of phytoremediation // "Biotechnology of microalgae". Abstracts of 4 European Workshop. Bergholz-Rehbrucke, 2000. P. 1.

17. Квитко К.В., Янкевич М.И., Сафонова Е.Ф. Научные основы технологии фиторемедиации нефтезагрязненных природных и сточных вод // "Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды". Сборник тезисов конференции. Пущино, 2001. С. 81-82.

18. Сафонова Е.Ф., Квитко К.В. Разрушение фенола и фенантрена чистыми культурами бактерий, водорослей и их смесями // "Экобиотехиология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды". Сборник тезисов конференции Пущино, 2001 С. 83-85.

19. Янкевич М.И., Суржко Л Ф., Дмитриева И.А., Авсюкевич А П., Сафонова Е.Ф., Квитко К.В. Фиторемедиация токсичных вод // "Экобиотсхнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды". Сборник тезисов конференции Пущино, 2001. С. 87-89.

20.Каменцев Я.С., Сафонова Е.Ф., Квитко КВ. Способ оценки доз фенантрена в культурах микроорганизмов // "Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды". Сборник тезисов конференции. Пущино, 2001. С. 89-90.

21. Iankevitch M.I., Surgko L.F., Afti IA, Avsukevitch AP., Safonova E.F., Kvitko K.V. Bioremediational technology of toxic water // „Phytoremediation". Abstracts of the ISEB Meeting. Leipzig, 2001. P. 82.

22. Safonova E.Th., Kvitko K.V., Iankevitch MI, Surgko L F, Afti lA Formation of microbial associations which perform phytoremediation of water // „Phytoremediation". Abstracts of the ISEB Meeting. Leipzig, 2001. P. 116.

23. Захарова Н.В. Сафонова Е.Ф. Канаванин-устойчнвые мутанты штамма SceneJesmus obliquus ES-5S, исследование их устойчивости к токсическим веществам // «Биология -наука XXI века». Сборник тезисов 7 Путинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 2003. С. 102.

24. Safonova E., Kvitko K.V., Iankevitch M.I, Surgko LF, Afti 1А, Reisser W. Biotreatnient of industrial wastewater by selected algal-bacterial consortia // Engineering in Life Sciences, 2004. V. 4. P. 347-353.

Подписано в печать 01.11.04. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 0,93. Тираж 100 экз. Заказ № 51.

ЦОП типографии Издательства СП6ТУ. 199061, С.-Петербург, Средний пр., 41.

- - 5 5 9 в

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сафонова, Елена Федоровна

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1. Альгофлора загрязненных экосистем

1.2. Воздействие токсических веществ и нефти на водоросли

1.3. Разрушение водорослями токсических веществ

1.4. Воздействие фенола на водоросли

1.5. Биодеградация фенола

1.5.1. Биодеградация фенола бактериями

1.5.2. Биодеградация фенола микроводорослями

1.6. Биодеградация фенантрена

1.6.1. Биодеградация фенантрена бактериями

1.6.2. Биодеградация фенантрена грибами

1.6.3. Биодеградация фенантрена водорослями

1.7. Фитобиоремедиация

Глава Q. Материал и методы исследования 41 П. 1. Среды и условия культивирования водорослей и бактерий 41 II.2. Штаммы водорослей и бактерий, растения 42 П.З. Методы очистки и клонирования 43 II.4. Регистрация роста культур водорослей и бактерий 44 II. 5. Тестирование устойчивости водорослей и ассоциаций к токсическим веществам

II. 5.1. Устойчивость к тяжелым металлам

II. 5.2. Устойчивость к ароматическим углеводородам

П.5.3. Устойчивость к поверхностно-активным веществам

II.5.4. Устойчивость водорослей и искусственных ассоциаций к мазуту

II.6. Тестирование разрушения фенола

П.6.1. Разрушения фенола бактериями

П.6.2. Разрушения фенола искусственными ассоциациями

II. 6.3. Разрушения фенола штаммами водорослей 47 II.6.3 .1. Скрининг водорослей на способность разрушать фенол (5 мг/л) в среде 47 Kuhl

П.6.3.2. Разрушение фенола (10 мг/л) водорослей в среде ВВМ или Kuhl

П. 7. Тестирование разрушения фенантрена

П.7.1. Скрининг на разрушение фенантрена природными ассоциациями, бактериями и водорослями

П.7.2. Разрушение фенантрена искусственными ассоциациями

II.7.3. Биотрансформация фенантрена штаммом водоросли Scenedesmus 48 obliquus ES

II. 8. Регистрация изменения пигментации

11.9. Метод реплик

11.10. Аналитические методы 51 II. 10.1. Колориметрический анализ 51 П. 10.2. Новый метод определения снижения концентраций фенантрена 52 П. 10.3. HPLC анализ 53 П. 10.4. Метод газовой хроматографии / масс-спектрометрии (ГХ/МС) 53 II. 11. Моделирование искусственных ассоциаций и их апробация в пилотном эксперименте

П. 11.1. Пробы воды

II. 11.2. Определение бактериальной микрофлоры из озера

II. 11.3. Селекция штаммов водорослей и бактерий

II. 11.4. Иммобилизация на носителях 5 5 П.11.5. Пилотная установка

Глава Ш. Результаты исследований и обсуждение

III. 1. Происхождение культур водорослей и цианобактерий, первый этап отбора

III. 2. Скрининг штаммов водорослей по признаку «выцветание хлорофилла» при воздействии токсикантов

III. 3. Создание коллекции ES

Ш.4. Разнообразие проявления устойчивости штаммов водорослей к загрязнению ароматическими веществами

III. 4.1. Устойчивость к ароматическим веществам штаммов рода Chlorella

Ш.4.2. Устойчивость к ароматическим веществам водорослей рода 65 Scenedesmus

Ш.4.3. Устойчивость к ароматическим веществам штаммов рода Stichococcus

111.4.4. Устойчивость к ароматическим веществам штаммов рода 69 Klebsormidium

111.4.5. Устойчивость к ароматическим веществам штаммов рода 70 Chlamydomonas

П1.4.6. Устойчивость к ароматическим веществам штаммов рода Kirchneriella

III.4.7. Устойчивость к ароматическим веществам штаммов СЫогососсит vacuolatum и Tetracystis fissurata

III. 5. Разрушение фенола

III.5.1. Изучение разрушения фенола искусственными альго-бактериальными 74 ассоциациями

П1.5.2. Биодеградация фенола штаммами водорослей

III. 5.2.1. Скрининг водорослей на способность к разрушению фенола

IH.5.2.2. Способность штамма Chlorella vulgaris CALU-157 к разрушению 77 фенола

111.5.2.3. Способность штамма Scenedesmus obliquus ES-55 к разрушению фенола

111.5.2.4. Способность штамма Chlorococcum vacuolatum ES-15 к разрушению 80 фенола

111.5.2.5. Способность штамма СЫогососсит vacuolatum ES-18 к разрушению 82 фенола

1П.5.2.6. Способность штамма Kirchneriella obessa ES-60 к разрушению фенола

111.5.2.7. Способность тгъмълг. Klebsormidium flaccidum ES-29 к разрушению 84 фенола

111.5.2.8. Способность штамма Tetracystis fissurata ES-84 к разрушению фенола 84 III.6. Разрушение фенанггрена 86 III.6.1. Скрининг природных ассоциаций, бактерий и водорослей на способность к разрушению фенантрена

Ш.6.2. Разрушение фенантрена искусственными ассоциациями

Ш.6.3. Динамика снижения концентрации фенантрена штаммами зеленых 88 водорослей

Ш.6.4. Биодеградация фенантрена штаммом водоросли Scenedesmus obliquus 90 ES

1П.6.4.1. Разрушение фенантрена в среде ВВМ

Ш.6.4.2. Разрушение фенантрена в среде Kuhl

Ш.6.4.3. Идентификация метаболитов

Ш.7. Изучение устойчивости клеток водорослей к загрязнению среды 96 мазутом

Ш.8. Биоремедиация воды озера-коллекгора селектированным альгобактериальным консорциумом

HI. 8.1. Анализ бактериального ценоза озера

III. 8.2. Резистентность водорослей к сточной воде, селекция штаммов 101 водорослей

III.8.3. Селекция бактериальных штаммов

Ш.8.4. Ремедиация сточной воды озера в пилотной установке иммобилизованными водорослями и алканотрофными бактериями

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биодеградация компонентов нефтяного загрязнения с участием микроводорослей и цианобактерий"

Антропогенное загрязнение окружающей среды нефтепродуктами, и, в частности, ароматическими углеводородами является важной экологической проблемой. Некоторые ароматические загрязнители обладают токсическими, мутагенными или канцерогенными свойствами. Поэтому способы удаления этих веществ из окружающей среды являются предметом изучения многих отраслей науки, и в первую очередь микробиологии.

Классические методы очистки вод и почв, такие как экстракция, растворителями, адсорбция и химическое окисление являются очень дорогими и при этом могут образоваться опасные продукты (Altow et al., 1984). Биологические методы очистки (биоремедиация) в этом отношении более предпочтительны (Lop and Tar, 2000; Alexander, 1994)

При биоремедиации техногенных экосистем используют, как правило, биопрепараты на основе бактерий, мицелиальных грибов и дрожжей, а также высшие растения. Водоросли и цианобактерии в очистке вод от ксенобиотиков, таких как нефть и ароматические углеводороды до настоящего времени не нашли применения. Такая недооценка их использования связана с тем, что разрушение ароматических соединений этими организмами практически не изучено и лишь ограничено отдельными исследованиями (Narro et al., 1992; Semple et al., 1994).

Известно, что системы, включающие несколько организмов, являются более предпочтительными в биоремедиационных процессах (Alexander, 1994). Изучению нефтеразрушающих микробных консорциумов бактерий и цианобактерии (Abed et al., 2002; Cohen, 2002; Al-Awadhi et al., 2003) в последнее время начали уделять большее внимание, в то время как консорциумы бактерий и водорослей остаются до сих пор почти не исследованными.

Биоремедиация загрязненных нефтью экосистем ассоциациями микроорганизмов - нефтедеструкторов и устойчивых к загрязнению водорослей и цианобактерии позволит интенсифицировать процесс очистки. Кроме того, если эти организмы будут сами способны к разрушению ксенобиотиков, то внесут дополнительный вклад в биоремедиацию техногенных экосистем.

Целью настоящей работы было изучение разрушения компонентов нефтяного загрязнения с участием водорослей и цианобактерий из созданной нами коллекции.

Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) создание коллекции водорослей из обитателей нефтеразрушающих ценозов;

2) испытание устойчивости штаммов водорослей к ароматическим и поверхностно-активным веществам;

3) испытание устойчивости штаммов водорослей к нефти (мазуту) в аксеничных культурах и в смесях с бактериями;

4) изучение биодеградации фенола и фенантрена альго-бактериальными ассоциациями;

5) изучение биодеградации фенола и фенантрена штаммами водорослей и цианобактерий;

6) практическое применение селективно-отобранных альго-бактериальных консорциумов для очищения воды из озера-коллектора сточных вод.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Сафонова, Елена Федоровна

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция водорослей и цианобактерий (ES), штаммы которой являются резистентными к ароматическим веществам (компонентам нефти), а также к ряду ПАВ. Некоторые штаммы коллекции ES способны к разрушению фенола и фенантрена при инкубации на свету. Данные свойства штаммов водорослей и цианобактерий дают основания рекомендовать их в качестве компонентов искусственных ценозов (биофильтры) для ремедиации загрязненных нефтью экосистем.

2. Установлено, что аксеничные культуры водорослей Chlorella vulgaris (CALU-157), Chlorococcum vacuolatum (ES-15, ES-18), Klebsormidium flaccidum (ES-29), Stichococcus sp. (ES-86), Tetracystis fissurata (ES-22, ES-67, ES-77, ES-84) и цианобактерия Nostoc sp. (ES-79-2) способны к разрушению фенола (5-10 мг/л) на свету. Наиболее эффективным в разрушении фенола (10 мг/л) является штамм Chlorococcum vacuolatum ES-15 (97% за 29 дней).

3. Установлено, что аксеничные штаммы Scenedesmus sp. ES-44 и Scenedesmus obliquus ES-55 способны к разрушению фенантрена (20 мг/л) на свету (на 60 и 65% за 40 дней). Одним из продуктов деградации фенантрена штаммом Scenedesmus obliquus ES-55 является дигидрокси-дигидрофенантрен.

4. Искусственные альго-бактериальные ассоциации более эффективны в разрушении фенола, фенантрена и мазута, чем монокультуры бактерий-деструкторов и водорослей. Наиболее эффективно разрушающей фенол (400 мг/л) и фенантрен (20 мг/л) ассоциацией являлась Pseudomonas putida Е-2 и Chlorella sp. ES-30.

5. Практическое применение селективно-отобранных альго-бактериальных консорциумов с доминирующими водорослями рода Stichococcus (служат как матрикс в ассоциациях) для очищения воды коллектора сточных вод с нефтепродуктами показало эффективность нового подхода для ремедиационных процессов в высоко-загрязненной окружающей среде. Фенолы были удалены на 85%, анионные ПАВ на 73%, нефть на 96%, металлы от 62% до 90%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В период с 1993 по 1999 годы были обследованы ценозы почв и водоемов, загрязненных разливами нефти, фенолов и ионами тяжелых металлов. Из этих экотопов были изолированы культуры эукариотических водорослей и цианобактерий. На основании характеристик, важных для использования водорослей в составе биофильтров, была создана коллекция водорослей ES (Ecological strains). Такими характеристиками являлись: температурный оптимум (15° С), иммобилизация на капроновых волокнах, устойчивость к АВ (фенолу, фенантрену, а-метилнафталину, 1,6 диметилнафталину) и ПАВ.

Разнообразие проявления устойчивости штаммов водорослей к загрязнению АВ изучалось для штаммов из нашей коллекции ES, а также из коллекций CALU, SAG, ASIB и коллекции Института Ботаники Лейпцигского Университета. Среди 15 рассмотренных штаммов рода Stichococcus 14 были устойчивы к а-метилнафталину. Но в большинстве случаев устойчивость к АВ варьировала среди представителей одного и того же рода, что указывает на штаммоспецифичность признака устойчивости к АВ.

Таким образом, были получены чистые культуры штаммы водорослей, устойчивых к компонентам нефтяного загрязнения. Но разрушение АВ в природе происходит за счет работы всего ценоза. Поэтому представляется важным моделирование и изучение искусственных ассоциаций, составленных из водорослей, устойчивых к токсикантам, и бактерий, разрушающих эти вещества. При тестировании фенолразрушающих штаммов бактерий в ассоциациях со штаммом водоросли Chlorella sp. ES-30 было показано, что разрушение фенола в ассоциациях происходит быстрее.

Колориметрическим анализом с использованием реагента Фолин-Чокальтеу было установлено, что аксеничные штаммы водорослей из нашей коллекции способны к разрушению фенола (5 мг/л). В течение 29 дней фенол разрушали следующие культуры, растущие на свету: Chlorella vulgaris CALU-157 (на 93%), Stichococcus sp. ES-86 (на 21%), Chlorococcum vacuolatum ES-18 (на 100%), четыре культуры Tetracystis fissurata, шт. ES-22 (на 100%), шт. ES-67 (на 56%), шт. ES-77 (на 72%), шт. ES-84 (на 97%), Nostoc sp. ES-79-2 (на 28%).

Способность водорослей к разрушению более высоких концентраций фенола (10 мг/л) исследовалась для 7 штаммов. Штамм Chlorococcum vacuolatum ES-18 разрушал фенол на 67% за 45 дней, Chlorococcum vacuolatum ES-15 на 97% за 29 дней, Chlorella vulgaris CALU-157 на 64% за 43 дня, Klebsormidium flaccidum ES-29 на 95% за 50 дней, Tetracystis fissurata ES-84 на 42% за 45 дней.

Неидентифицированный метаболит со временем удержания 3,29 был выявлен на хроматограммах при HPLC анализе метаболитов в среде культуры Chlorella vulgaris CALU-157, выращенной в присутствии фенола на свету.

Опыты показали, что все исследованные штаммы рода Tetracystis разрушали фенол. Но из протестированных 6 штаммов рода Chlorella и 5 штаммов Stichococcus только по одному представителю (Chlorella vulgaris CALU-157 и Stichococcus sp. ES-86) были способны к разрушению фенола. Поэтому, способность водорослей к разрушению фенола, скорее всего, является индивидуальной характеристикой штаммов. Таким образом, впервые установлено, что аксеничные штаммы водорослей Chlorococcum vacuolatum, Klebsormidium flaccidum, Tetracystis fissurata, Stichococcus sp. способны к разрушению фенола.

Разработанным нами флуоресцентным методом определения фенантрена бьши протестированы ассоциации бактерий и водорослей. В большинстве случаев вариант искусственной ассоциации близок к ожидаемому при аддитивном взаимодействии. Наиболее сильный совместный эффект наблюдался в ассоциациях с Rhodococcus sp. Ac-1267 и с Ps. putida Е2.

Из 13 исследованных штаммов водорослей разрушение фенантрена (20 мг/л) клетками двух штаммов Scenedesmus на 40-й день (Scenedesmus sp. ES-44 - 60%, S. obliquus ES-55 -65%) было наиболее эффективно, в то время как третий из исследуемых штаммов этого рода Scenedesmus sp. ES-111 не обладал способностью к разрушению. Так же как и в случае с разрушением фенола, это указывает на то, что способность к разрушению фенантрена является индивидуальным признаком каждой культуры, то есть штаммоспецифично.

Более подробно изучалась биодеградация фенантрена штаммом водоросли Scenedesmus obliquus ES-55. Культура S. obliquus ES-55 не росла в темноте, как в присутствии фенантрена (14 мг/л), так и в его отсутствии. На свету фенантрен угнетал деление клеток и образование 4-х клеточных, ценобиев. HPLC анализом определено, что культура S. obliquus ES-55 разрушает фенантрен только на свету. Новый пик (метаболит 1) со временем удержания 4,5-4,6 был выявлен только на хроматограммах для ES-55 растущей на свету в присутствии фенантрена. Метаболит обнаруживается в культуре с 7-го дня инкубации, и его концентрация возрастает до 28 дня.

ГХ/МС выявлено 5 продуктов деградации фенантрена штаммом S. obliquus ES-55. Один метаболит был идентифицирован как дигидрокси-дигидрофенантрен. Для выяснения стереохимической структуры дигидрокси-дигидрофенантрена и идентификации других метаболитов необходимо провести дополнительные анализы. Разрушение фенантрена и продукты деградации аксеничными эукариотическими водорослями в этой работе описаны впервые.

21 штамм водорослей и 16 штаммов цианобактерий, как в чистой культуре, так и в смеси с алканотрофными бактериями, были подвергнуты воздействие 1% мазута. Представители родов Stichococcus, Anabaena, Nostoc, Microcystis, Phormidium показали устойчивость к мазуту. В смеси с бактериями устойчивость штаммов водорослей и цианобактерий к мазуту усиливается. Присутствие алканотрофных бактерий восстанавливает размножение чувствительных к мазуту штаммов и стимулирует клеточный рост чувствительных и толерантных штаммов водорослей.

Природные ассоциации водорослей и штаммы водорослей с добавлением алканотрофных бактерий были более эффективны в разрушении мазута по сравнению с самими алканотрофными бактериями. Разрушение мазута штаммом Rhodococcus sp. Ас-1267 составило 35,5%, при смешивании его с ассоциацией AS-45 (доминирующий род Scenedesmus) - 56,23%, в смеси с ассоциацией AS-47 (доминирующие формы Scenedesmus и Phormidium) - 60,8%.

Феномен стимуляции роста водорослей в присутствии алканотрофных бактерий и усиления деструкционной способности алканотрофных бактерий в присутствии водорослей открывает новые перспективы в использовании искусственных ассоциаций водорослей и алканотрофных бактерий в биоочистке загрязненных экосистем.

Апробация ремедиации ассоциациями водорослей и бактерий сточной воды коллектора нефтепродуктов в г. Самаре была проведена совместно с ЗАО «Экопром». Впервые применены в биоремедиационной работе по очистке высоко-токсичных индустриальных стоков штаммы водорослей рода Stichococcus, формирующие микробный консорциум на поверхности капроновых волокон. Клетки Stichococcus посредством выделяемой ими слизи прикреплялись к капроновым волокнам, формируя «конверты», к которым в свою очередь прикреплялись клетки других водорослей и бактерий. Таким образом, формировались ассоциации, способные к деградации загрязнений. Также биопленки микробных консорциумов с доминирующей цианобактерией Phormidium были сформированы на капроновых сетках.

Проведенные пилотные испытания показали высокую эффективность нового подхода в ремедиации нефтезагрязненных систем. Фенолы были удалены на 85%, анионные ПАВ на 73%, нефть на 96%, металлы от 62% до 90%. Снижение ХПК составляло 51% (от 1200±66,5 мг/л до 590±48,9), снижение BOD25 было 97% (от 664±33,3 мг/л до 18,1±6,6).

Таким образом, впервые создана коллекция водорослей и цианобактерий, штаммы которой являются не только резистентными к ароматическим веществам, но и способными к их разрушению. Штаммы водорослей из созданной коллекции могут быть использованы в консорциумах с бактериями-деструкторами для очистки вод и почв, загрязненных ароматическими веществами и нефтью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сафонова, Елена Федоровна, Санкт-Петербург

1. Аксенова Е.И., Труфанова З.А. О влиянии хлорофоса и нефтепродуктов на протококковые и сине-зеленые водоросли // Гидробиологический журнал. 1971. Вып. 7. N6. С. 86-90.

2. Багнюк В. М., Олейник Т.Л., Ксендзюк И.П., Миронюк В.И. Анализ фенолутилизирующей функций у аксенической и альгобактериальной культур хлореллы // Гидробиологический журнал. 1987. Вып. 23. N1. С. 56-60.

3. Воропаева О.Г., Рублева И.М., Тюленева С.В. Изучение влияния фенола и метанола на развитие зеленых водорослей // Деп. В ВИНИТИ 12.02.86, Ярославль. 1986. N1009-86. С. 3-27.

4. Громов Б.В. Бактерии рода Caulobacter, сопутствующие водорослям // Микробиология. 1964. Сер. 33. Вып. 2. С. 298-305.

5. Громов Б.В. Микрофлора массовых культур протококковых водорослей в открытых установках // Вопросы микробиологии: Тр.Петергофского биол. Ин-та ЛГУ. 1965. С. 149-154.

6. Гусева К. А. . Влияние нефтепродуктов на развитие планктонных водорослей в пресноводных водоемах. // В кн. Антропогенные факторы в жизни водоемов, АН СССР, ин-тбиол. внутр.вод, труды. "Наука", Л. 1975. Вып.ЗО.С. 127-130.

7. Догадина Т.В., Чухлебова Н.А. Водоросли биологической пленки биофильтров и их роль в процессах самоочищения // Гидробиологический журнал. 1971. Вып. 7. N6. С. 56-60.

8. Дубовик И.Е. Влияние нефтепродуктов на почвенные водоросли // «Актуальные проблемы современной альгологии». Тезисы докладов I Всесоюзной конференции. Киев, 1987. С. 163.

9. Козицкая В.Н. Влияние фенольных соединений на жизнедеятельность Microcystis aeruginosa // Гидробиологический журнал. Киев: Наукова думка, 1987. Т. 23, N1. С. 51-56.

10. Костяев В.Я. Биологические факторы разрушения фенола // В сб.: Антропогенные факторы в жизни водоемов. Тр. Ин-та биологии внутр. вод. 1975. Вып.30. N. 33. С. 85-88.

11. Кравченко М.Е., Гапочко Л.Д Влияние нефти и нефтепродуктов на некоторые сине-зеленые водоросли//Изв. АН ТССР. Сер. Биол. Наук. 1977. N2. С. 52-56.

12. Ленова Л.И., Борисова ЕВ. Бактерии, сопутствующие некоторым галофильным одноклеточным водорослям // Микробиологический журнал. 1983. Вып. 4. №45. С. 39-44.

13. Ленова Л.И., Ратушная М.Я., Белецкая Н.М. О возможности утилизации фенола бактериально чистым штаммом Chlorella vulgaris Beijer // Укр.бот. журн.1976. №2 С. 137-139

14. Лукина Г А. Действие фенола на фотосинтез и дыхание хлореллы // Тр. ин-та биологии внутренних вод. 1970. Вып 19. № 22. С. 87-89.

15. Лукина. Г.А. Действие фенола на различные штаммы хлореллы // Тр. ин-та биологии внутренних вод, инф. Бюллютень №15, изд. «Наука». 1972. Лен. отд., С. 10-13.

16. Лурье Ю.Ю., Рыбникова А.И. Химический анализ производственных сточных вод//М. "Химия". 1974.

17. Миронов О.Г., Ланская Л.А. Развитие некоторых диатомовых водорослей в морской воде, загрязненной нефтепродуктами. Биология и распределение планктона южных морей // М. Наука. 1967. С. 31-34.

18. Миронов О.Г. Взаимодействие морских организмов с нефтяными углеводородами//Л.Гидрометеоиздат. 1985. С. 128

19. Назарова Г.Д., Мыльникова Э.В. Оценка токсичности метилмеркаптановых соединений для водорослей. Круговорот вещества и энергии в водоемах // Тезисы Докладов 5 Всесоюз. Лимнолог. Совещ., Листвиничное на Байкале. 1981. Иркутск. С. 101-102.

20. Неганова Л.Б., Шилова И.И., Штина Э.А. Альгофлора техногенных песков нефтегазодобывающих районов Среднего Приобья и влияние на нее нефтяного загрязнения // Экология. 1978. №3. С. 29-35.

21. Сафонова Е.Ф. Изменчивость резистентности к токсикантам среди штаммов Chlorella spp., выделенных из загрязненных вод // Сборник Научной конференции студентов и молодых ученых биологического факультета БГУ. Тезисы докладов. Уфа. 1997. С. 65-66.

22. Ступина В.В., Багнюк В.М. Водоросли и очистка сточных вод. Об утилизации некоторых компонентов промышленных стоков протококковыми водорослями совместно с бактериями// Тез. докл.Усъезда Всесоюз. Бот. Об-ва. Киев, 1976 С.321-322

23. Ткаченко Н.В., Айвазова Л.Е. Влияние растворенных нефтепродуктов на морские и пресноводные одноклеточные водоросли // Труды ВНИИ морского рыбного хозяйства и океанографии. 1974. Вып. 100. С.68-73.

24. Шлегель Г. Общая микробиология // пер. с нем. Мир 1987. 567 с.

25. Шлыгин И.А. Нефтяные углеводороды в морских донных отложениях: химические и биологические процессы // Гидрометеорология. 1986. Вып.4. С. 1-45.

26. Abd-El-Haleem Moawad H., Zaki E.A., Zaki S. Molecular characterization of phenol-degrading bacteria isolated from Egyptian Ecosystems. Microb Ecol. 2002. V. 43. P. 217-224.

27. Adams D., Ribbons D.W.The metabolism of aromatic ring fission products by Bacillusstearothermophilus strain 1С //Journal Gen. Microbiology.l988.V.134. P.3179-3185.

28. Al-Awadhi H., Al-Hasan RH, Sorkhoh N.A, Salamah S., Radwan S.S. Establishing oil-degrading biofilms on gravel particles and glass plates // Internal. Biodeterior. Biodegrad. 2003. V. 51. P. 181-185.

29. Alexander M. Biodegradation and Bioremediation // San Diego, С A: Academic Press. 1994.

30. Al-Hasan RH., Sorkhoh N.A., Al Bader D., Radwan S.S. Utilization of hydrocarbons by cyanobacteria from microbial mats on oily coasts of the Gulf // Appl. Microbiol Biotechnol. 1994. V. 41. P. 615-619.

31. Al-Hasan R.H., Al Bader D., Sorkhoh N.A., Radwan S.S. Evidence for n-alkane consumption and oxidation by filamentous cyanobacteria from oil-contaminated coasts of the Arabian Gulf//Marine Biology. 1998. V. 138. P. 521-527.

32. Altow S, Bonadonna-Aaparo L, Klibanov A.M. Dephenolization of industrial waste waters catalyzed by polyphenol oxydase. Biotechnol Bioeng. 1984. V.26. P. 599-603.

33. Anderson J.J., Dagley S. Catabolism of aromatic acids in Trichosporon cutaneum // Journal Bacteriology. 1980. V.141. P. 534-543.

34. Azov Y., Shelef G., Narkis N. Effect of hard detergents on algae in a high-rateoxidation pound // Appl. and Environ. Microbiology. 1982. V. 43. N2. P. 491-492.

35. Bakst J.S. Impact of Present and Future Regulations on Bioremediation // Journal Ind. Microbiology. 1991.V. 8 N 1. P. 13-22.

36. Balani S.K., Bladeren P.J.V., Shirai N., Jerina DM. Resolution and absolute configuration of K-region trans-dihydrodiols from polycyclic hydrocarbons // Journal Org.Chemestry. 1986. V. 51. P. 1773-1778.

37. Balfany J., Rehm H. Biodegradation of 4-chlorophrnol bz adsorptive immobiliyed Alcaligenes sp. A 7-2 in soil // Appl Microbiol Biotechnol. 199l.V. 35. P. 662-668.

38. Barbas J.T., Sigman M.E., Dabestani R. Photochemical oxidation of phenanthrene sorbed on silica gel // Environmental Science and Technology, 1996. V. 30. P. 1776-1780

39. Bayly R.C., Wigmore G.J. Metabolism of phenol and cresols by mutants of Pseudomonas putida И Journal Bacteriology. 1973. V. 113. P. 1112-1120.

40. Bezalel L., Hadar Y., Fu P.P., Freeman J.P., Cemiglia C.E. Metabolism of phenanthrene by white rot fungus Pleurotus ostreatus II Appl.Envir. Microbiol. 1966. V.62. N7. P. 2547-2553.

41. Bischoff H.& Bold H.C. Phycological Studies. IV.Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species // University of Texas Publication. 1963. No. 6318. P 95

42. Borde X., Guieysse В., Delgado O., Munoz R., Hatti-Kaul R., Nugier-Chauvin C., Patin H., Mattiasson B. Synergistic relationships in algal-bacterial microcosms for the treatment of aromatic pollutants, Biores. Technol. 2003. V.86. P. 293-300.

43. Bucker M., Glatt H.R., Piatt K.L., Avnir D., Ittah Y., Blum J., and Oesch F. Mutagenicity of phenanthrene and phenanthrene K-region derivatives. Mutat. Res. 1979. V. 66. P. 337-348.

44. Cerniglia C., Baalen C.and Gibson D. Oxidation of biphenyl by the cyanobacterium, Oscillatoria sp., strain JCM // Arch. Microbiology. 1980a. V.125. P. 203-207.

45. Cerniglia C.E., Baalen C.V., Gibson D.T. Metabolism of naphthalene by the cyanobacterium Oscillatoria sp., strain JCM I I Journal Gen. Microbiology. 1980b. V.116. P. 485-494.

46. Cerniglia C.E., Gibson D.T., Baalen C.V. Oxidation of naphthalene by the cyanobacteria and microalgae. // Journal Gen. Microbiology. 1980c. V. 116.P. 495-500.

47. Cerniglia C.E. Aromatic hydrocarbons: metabolism by bacteria, fungi and algae, in: E.Hodgson, J.R.Bend and R.M. Philpot (Eds.) // Reviews in Biochemical Toxicology. Elsevier/North-Holland, NY, 1981. V.3. P. 321-361.

48. Cerniglia C.E., Gibson D.T., Baalen C.V. Naphthalene metabolism by diatoms isolated from the Kachemak Bay region of Alaska // Journal Gen. Microbiol. 1982. V.128. P. 987-990.

49. Cerniglia C.E. and Yang S.K. Stereoselective metabolism of anthracene and phenanthrene by fungus Cunninghamella elegans // Appl.Environ.Microbiol. 1984. V. 47. P. 119-124.

50. Cerniglia C.E., Campbell W.L., Freeman J.P., and Evans F.E. Identification of a novel metabolite in phenanthrene metabolism by fungus Cunninghamella elegans II Appl.Environ.Microbiol. 1989. V. 55. P. 2275-2279.

51. Cerniglia C.E. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Biodegradation. 1992. V. 3. P. 351-368.

52. Cerniglia C.E., Sutherland J.B., Crow S.A. Fungal metabolism of aromatic hydrocarbons // In G. Winkelmann (ed), Microbial degradation of natural products. VCH Press, Weinheim.1992. P. 193-217.

53. Chan Kwong-yu and Chiu S.Y. The effects of diesel oil and oil dispersants on growth, photosynthesis, and respiration of Chlorella salina II Arch. Environ Contain. Toxicol. 1985. V.14.N3.P. 325-331

54. Chaturapit S. and Holder C M. Studies on the hepatic microsomal metabolism of 14C-phenanthrene//Biochem. Pharmacol. 1978. V. 27. P. 1865-1871.

55. Cohen Y. Bioremediation of oil by marine microbial mats, Int Microbiol. 2002. V. 5. P. 189-193.

56. Coulibaly L., Gourene G., Agathos N.S. Utilization of fungi for biotreatment of raw wastewaters // Afr. Jounal Biotechnology. 2003. V. 2. N. 12. P. 620-630.

57. Craigie J.S., McLachlan J., Towers G.H.N. A note on the fission of an aromatic ring by algae // Can.Journal Bot. 1965. V. 43. P. 1589-1590.

58. Dagley S. and Gibson D.T. The bacterial degradation of catechol // Biochem. Journal. 1965. V.95. P. 466-474.

59. Dagley S. Microbial catabolism, the carbon cycle and environmental pollution // Naturwissenschaften. 1978. V. 65. N. 2. P. 85-95.

60. Dagley S. Biochemistry of aromatic hydrocarbon degradation in Pseudomonas // The Bacteria. The Biology of Pseudomonas. J.RSokatch (ed.), London. Academic Press. 1986. V. 10. P. 527-556.

61. Dean-Ross D, Rahimi M. Toxicyty of phenolic compounds to sediment bacteria // Bull Envirom Toxicol. 1995. V. 55. P. 245-250.

62. Dean-Ross D. Bacterial abundance and activity in hazardous waster-contaminated soil // Bull Environ Contain Toxicol. 1989. V.43. P. 511-517.

63. Ellis B.E. Degradation of phenolic compounds by fresh-waters algae // Plant Sci. Lett. 1977. V. 8. P. 213-216.

64. Evans W.C., Fernley H.N., Griffiths E. Oxidative metabolism of phenanthrene and anthracene by soil Pseudomonads; the ring fission mechanism. // Biochem Journal. 1965. V.95. P. 819-821.

65. Ghisalba O. Chemical wastes and their biodegradation an overiew // Experientia. 1983. V. 39. P. 1247-1257.

66. Gibson D.T. Microbial degradation of hydrocarbons // Toxicol. Environ. Chem. 1982. V. 5. P. 237-250.

67. Gibson D.T., Subramanian V. Microbial degradation of aromatic hydrocarbons // Gibson D.T. (ed ). Microbial degradation of organic compounds. Marcel Dekker, Inc., New York. 1984. P. 181-252

68. Guieesse В., Viklund G., Toes A., Mattiasson B. Comdined UV-biological degradation of PAHs // Chemosphere, 2004. V. 55. P. 1493-1499

69. Gurujeyalakshmi G. and Oriel P. A termophilic process for catechol production from phenol // Biotechnology Letters. 1989. V. 11. N. 10. P. 689-694.

70. Hammel K.E., Gay W.Z., Green В., Moen M.A. Oxidative Degradation of Phenanthrene by the Ligninolytic Fungus Phanerochaete chrysosporium // Appl. Env. Microb. 1992. V.58. N.6. P. 1832-1838.

71. Hiscox J D and Israelstam G F. A method for the extraction of chlorophyll from leaf tissue without maceration // Can. Journal Bot. 1979. V. 57. P. 1332-1334.

72. Hopper D.J. and Taylor D.G. Pathway for the degradation of m-cresol and p-cresol by Pseudomonas putida II Journal of Bacteriology. 1975. V.122. P. 1-6.

73. Houghton J.E., Shanley M.S. Catabolic potential of Pseudomonads: a regulatory perspective // Rasul Chaudhry G. (ed). Biological degradation and bioremediation of toxic chemicals. Chapman and Hall. London. 1994. P. 11-32.

74. Jacobson S.N and Alexander M. Enhancement of the microbial dehalogenation of a model chlorinated compound // Appl. Environ. Microbiol. 1981. V.42. P. 1062-1066.

75. Jamison V.W., Raymond, RL., Hudson J.O. Biodegradation of high-octane gasoline in ground water//Dev. Ind. Microbiol. 1975. V.16. P. 305-312.

76. Jerina D M., Selander H., Yagi H., Wells M.C , Davey J.F., Mahadevan V., and Gibson D.T. Dihydrodiols from anthracene and phenanthrene // Journal. Am.Chem.Soc. 1976. V. 98. P. 5988-5996.

77. Jones K.H., Trudgill P.W., Hopper D.J. Metabolism of p-cresol by the fungus Aspergillus Jumigatus II Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 1125-1130.

78. Joseph V., Joseph A., Acclimation of algal species following exposure to phenol // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1999. V. 62. P. 87-92.

79. Kemp MB., G. D. Hegeman G.D. Genetic Control of the ^-Ketoadipate Pathway in Pseudomonas aeruginosa II Journal Bacteriology. 1968. V. 96. N. 5. P. 1488-1499.

80. Kiyohara H., Nagao K., and Nomi R. Degradation of phenanthrene through o-phthalate by Aeromonas sp // Agric. Biol. Chem. 1976. V. 40. P. 1075-1082.

81. Kiyohara H., Nagao K. The catabolism of phenanthrene and naphthalene by bacteria //Journal. Gen. Microbiology. 1978. V.105. P. 69-75.

82. Klekner V. and Kosaric N. Degradation of phenols by algae // Environmental Technology. 1992. V. 13. P. 493-501.

83. Kobayashi H. and Rittman B.E. Microbial removal of hazardous organic compounds //Environ. Sci. Technol. 1982. V.16. P. 170-183.

84. Kuhl A. Zur Physiologie der Speicherung kondensierter anorganischer Phosphate in Chlorella II Beitrage zur Physiologie und Morphologie der Algen. Deutsche Botanische Gesellschaft. Fischer (ed ), Stuttgart. 1962. P. 157-166.

85. Lenke H, Pieper D.H, Bruhn C, Knackmuss H.J. Degradation of 2,4-dinitrophrnol by two Rhodococcus erythropolis strains, HL 24-1 and 24-2 // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V.58. P. 2928-2932.

86. Liebe В., Fock H.P. Growth and adaptation of the green alga Chlamydomonas reinhardtii on diesel exhaust particle extracts // J.Gen. Microbiol. 1992. V.138. P. 973-978.

87. Lindquist В., Warshawsky D. Stereospecificity in algal oxidation of the carcinogen benzoa.pyrene // Experientia. 1985a. V.41. P. 767-769.

88. Lindquist В., Warshawsky D. Identification of the ll,12-dihydro-ll,12-dihydroxybenzoa.pyrene as a major metabolite produced by the green algae Selenastrum capricornutum //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985b. V.130. P. 71-75.

89. Lop КС., Tar C.P. Effect of additional carbon souces on biodegradation of phenol // Bull Environ Contam Toxicol. 2000. V. 64. P. 756-763.

90. Machate T, Noll H, Behrens H., A. Kettrup A. Degradation of phenanthrene and hydraulic characteristics in a constructed wetland // Wat. Res. 1997. V. 31. N. 3. P. 554-560.

91. Martin-Sikkema F.D, de Bont J.M Degradation of nitroaromatic compaunds by microorganisms // Appl. Microbiol Biotechnol. 1994. V. 42. P. 499-507.

92. Mastrangela G., Fadda E., Marzia V. Polycyclic aromatic hydrocarbons and cancer in man. // Environ. Health Perspect. 1997. V. 104. P. 1166-1170.

93. Meagher R.B. and Ornston L.N. Relationships among enzymes of the (3-ketoadipate pathway. I. Properties of cis,cis-muconate-lactonizing enzyme and muconolactone isomerase from Pseudomonas putida II Biochemistry. 1973. V.12. N.18. P. 3523-3530.

94. Megharaj M, Pearson H.W., Venkaterswarlu K. Toxicity of phenol and three nitrophenols towards growth and metabolic activities of Nostoc linckia, isolated from soil // Arch. Environ Contam Toxicol. 1991. V.21. P.578-584.

95. Middelhoven W.J. Catabolism of benzene compounds by ascomycetous and basidiomycetous yeasts and yeast-like fungi // Antonie van Leeuwenhoek (ed.). 1993. V. 63. P. 125-144.

96. Miura R.S., Honmaru S., Nakazaki M. The absolute configuration of the metabolites of naphthalene and phenanthrene in mammalian systems // Tetrahedron. Lett. 1968. V. 50. P. 5271-5274.

97. Moody J.D., Freeman J.P., Doerge D.R., Cerniglia C.E. Degradation of phenanthrene and anthracene by cell suspensions of Micobacterium sp. Strain PYR-1 // Appl. Environm. Microbiol. 2001. V. 67. N.4. P. 1476-1483.

98. Mouchet P. Review of the reactions of algae to inorganic and organic micropollutants // Ecological consequences and possibilities for industrial-scale application. Soc. Degremont, Rueil Malmaison, Fr. Water Research. 1986. V.20. N.4. P. 399-412.

99. Narro ML., Cerniglia C.E., Van Baalen C., Gibson D.T. Metabolism of phenanthrene by the marine cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum PR-6 // Appl. Environ. Microbiol. 1992a. V.58. N.4. P. 1351-1359.

100. Narro M.L., Cerniglia C.E., Van Baalen C., Gibson D.T. Evidence for an NIF shift in oxidation of naphthalene by the marine cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum PR-6 //Appl. Environ. Microbiol. 1992b. V. 58. N.4. P. 1360-1363.

101. O'Niell W.L, Nzengung V.A, Noakes J.E, Bender J., Phillips P C. Biosorption and biodegradation of tetrachloroethylene and trichloroethylene using mixed-species microbial mats // J Hazard. Subst. Res. 2000. V. 2. P. 1-16.

102. Ornston L.N. and Stanier R.Y. The conversion of catechol and pyrocatechuate to P-ketoadipate by Pseudomonasputida II Journal Biol.Chem. 1966. V. 241. N. 16. P. 3776-3786.

103. Oswald W.J. Micro-algae and waste-water treatment, in Micro-algal biotechnology II M.A. Borowitzka, C.J. Borowitzka (eds.). Cambridge University Press, New York 1988. P. 305-328.

104. Perez S., Dachs J., Barcelo D. Sea-breeze modulated volatilization of polycyclic aromatic hydrocarbons from the Masnou harbor (NW Mediterranean Sea) // Environmental Science and Technology, 2003. V. 37. P. 3794-3802

105. Powlowski J.B., Ingebrand J., Dagley S. Enzymology of the beta-ketoadipate pathway in Trichosporon cutaneum II Journal, of Bacteriology. 1985. V. 163. N.3. P 11361141.

106. Piatt J.J., Backhus D.A., Capel P.D., Eisenreich SJ. Temperature-dependent sorption of naphthalene, phenanthrene, and pyrene to low organic carbon aquifer sediments // Environmental Science and Technology. 1996, V. 30. P. 751-760

107. Pieper D.H, Engesser K.H, Knackmuss H.J. Regulation of catabolic pathways of phenoxyacetic acids and phenol in Alcaligenes//Arch Microbiol. 1989. V 151. N.4. P.365-371.

108. Pinto G., Pollio A., Previtera L, Temussi F. Biodegradation of phenols by microalgae // Biotechnology Letters. 2002. V. 24. N.24. P. 2047-2051.

109. Philips P., Bender J., Word J., Niyogi D., Denovan B. Mineralization of naphthalene, phenanthrene, chrysene, and hexadecane with a constructed silage microbial mat //Appl.Biotechnol.Site Rem. 1993. V.2. P. 305-309.

110. Potapova, M.G., Kvitko K.V., Dmitrieva. I. A. Algal components of the oil-pollutedwater ecosystems // "Proceedings of the Workshop Microbiology of Polluted Aquatic Ecosystems". P.M. Becker (ed). Leipzig, 1998. P. 182-187.

111. Prasad S, Ellis B.E. In vivo characterization of catechol ring cleavage in cell culture of Glycine max //Phytochemistry. 1978. V. 17. P. 187-190.

112. Raghukumar C., Vipparty V., David J.J. Degradation of crude oil by marine cyanobacteria. // Appl. Microbiology and Biotechnology. 2001. V.57. N.3. P. 433-436.

113. Rittmann B.E. In Situ Bioremediation. When Does It Work? // Washington DC, National Academy Press. 1993.

114. Sack U., Heinze T.M., Deck J., Cerniglia C.E., Cazau M.C., Fritsche W. Novel Metabolites in Phenanthrene and Pyrene Transformation by Aspergillus rriger // Appl.Env.Microbiol. 1997. V.63. N.7. P. 2906-2909.

115. Safonova E.Th., Kvitko K.V., Potapova M.G. The collection of algae from polluted waters and soils // "Proceedings of the Workshop Microbiology of Polluted Aquatic Ecosystems". P.M. Becker (ed.). Leipzig, 1998. P. 188-196.

116. Safonova E.Th., Kvitko K.V., Iankevitch M.I., Surgko L.F., Afti I.A. Formation of microbial associations which perform phytoremediation of water // Abstracts ISEB. 2001. P. 116.

117. Safonova E.Th., Dmitrieva I.A. and Kvitko K.V. The interaction of algae with alcanotrophic bacteria in black oil decomposition // Resources, Conservation and Recycling. 1999. V. 27. P. 193-201.

118. Sala-Trepat J.M. and Evans W.C. The meta cleavage of catechol by Azotobacter species // European Journal of Biochemistry. 1971. V. 20. P. 400-413.

119. Salonen M, Middeldorp P, Briglia M, Valo R, Haggblom M, Mc Bain A. Cleanup of old industrial sites // Biology and Biodegradation. Porrtfolio Publishing Company, The Woodlands. D. Kamelz, A Chakrabartz, and G.S.Omenn (eds.). 1989. P. 347-365.

120. Samanta S.K., Chakraborti A.K., Jain R.K. Degradation of phenanthrene by different bacteria: evidence for novel transformation sequences involving the formation of 1-naphthol //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V.53. P. 98-107.

121. Savino J.F., and Tanabe L.L. Sublethal effects of phenanthrene, nicotine, and pinane on Daphnia pulex // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1989. V. 42. P. 778-784.

122. Semple K.T. and Cain R.B. Biodegradation of phenolics by Ochromonas danica И Appl.Environ.Microbiol.1996. V.62. P. 1265-1273.

123. Semple K.T. Biodegradation of phenols by a eucariotic alga I I Res. Microbiol. 1997.1. V. 148. P. 365-367.

124. Semple K.T., Cain R.B., Schmidt S. Biodegradation of aromatic compounds by microalgae//FEMS Microbiol. Letters. 1999. V.170. P. 291-300.

125. Schoeny R., Cody Т., Warshawsky D., Radike M. Metabolism of mutagenic polycyclic aromatic hydrocarbons by photosynthetic algal species // Mutat. Res. 1988. V.197. P. 289-302.

126. Schldsser U.G. SAG Sammlung von Algenkulturen at the University of Gdttingen -catalogue of strains//Bot. Acta. 1994. V. 107. P. 113-186.

127. Shashirekha S., Uma L., Subramanian G. Phenol degradation by the marine cyanobacterium Phormidium valderianum BDU 30501 // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 1997. V.19. N.2. P. 130-133.

128. Shingler V., Franklin C., Tsuda M., Holroyd D. and Bagdasarian M. Molecular analysis of a plasmid-encoded phenol hydroxylase from Pseudomonas CF600 // Journal of General Microbiology. 1989. V.135. P. 1083-1092.

129. Singleton, V. L.; Orthofer, R.; Lamuela-Raventos, R. M. Analysis of total phenols and other oxidation substartes and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent Methods Enzymol. 1999. V. 299. P. 152-178.

130. Smets B.F. and Rittmann B.E. Sorption equilibria for trichlorethene on algae // Water Research. 1989. V. 24. P. 355-360.

131. Solbakken J.E., and Palmork K.H. Metabolism of phenanthrene in various marine animals // Сотр. Biochem. Physiol. 1981. 70C. P. 21-26.

132. Sorkhoh N., Al-Hasan R., Radwan S. Self-cleaning of the Gulf. Nature. 1992.• V.359. P. 109.

133. Sorkhoh N.A., Al-Hasan R.H., Khanafer M., Radwan S.S. Establishment of oil-degrading bacteria associated with cyanobacteria in oil-polluted soil // J. Appl. Bacterid 1995. V. 78. P. 194-199.

134. Soto C., Hellebust J.A., Hutchinson T.C and Sawa T. Effect of naphthalene and aqueous crude oil extracts on green flagellate Chlamydomonas angulosa II I. Growth. Can.J.Bot. 1975a.V. 5. N2. P. 109-117.

135. Soto C., Hellebust J. A. and Hutchinson T.C. Effect of naphthalene and aqueous crude oil extracts on the green flagellate Chlamydomonas angulosa //II. Photosynthesis and the uptake and release of naphthalene. CanJ.Bot. 1975b. V. 53. N.2. P. 118-126.

136. Stephen J.R., Macnaughton S.J. Developments in terrestrial bacterial remediation of metals // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. V.10. N. 3. P. 230-233.

137. Subramanian G., Uma L. Role of cyanobacteria in pollution abatent // Recentadvances in ecobiological research. Sinha M.P. (ed). New Delhi. 1997. V.l. P. 435-443.

138. Sutherland J.B., Freeman J.P., Selby A.L., Fu P.P., Miller D.W., Cerniglia C.E. Stereoselective formation of a K-region dihydrodiol from phenanthrene by Streptomyces flavovirens//Arch. Microbiol. 1990. V.I54. P. 260-266.

139. Sutherland J. В., Selby A.L., Freeman J. P., Evans F. E., Cerniglia C.E. Metabolism of phenanthrene by Phanerochaete chrysosponum II Appl. Environ. Microbiol. 1991. V.57. P. 3310-3316.

140. Sutherland J. В., Fu P.P.,Yang S.K., Tungeln L.S. V., Casillas R.P., Crow S.A., Cerniglia C.E. Enantiomeric composition of the trans-dihydrodiols produced from phenanthrene by fungi // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V.59. P. 2145-2149.

141. Tadros M.G., Philips J., Patel H., Pandiripally V. Differential response of green algal species to solvents // Bull Environ Contam Toxicol. 1994. V.52. P. 333-337.

142. Tausson W.O. Die Oxidation des Phenanthrens durch Bacterien // Planta. 1928. V. 5. P. 239-273.

143. Tikoo V., Scragg A.H. and Shales S.W. Degradation of pentachlorphenol by microalgae // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1997. V. 68 P. 425-431.

144. Tolgyessy P. The ecotoxicology of water pollutants // Chemistry and biology of water, air and soil, environmental aspects. Studies in environmental science. Tolgyessy J. (ed.). Elsevier Science, Amsterdam. 1993. V. 53. P.742-756.

145. Vose J.R., Cheng J.Y., Antia N.J., Towers G.H.N. The catabolic fission of the aromatic ring of phenilalanine by marine planktonic algae // Can.J.Bot.l971.V.49. P.259-261.

146. Wang Q., Cui Y., Dong Y. Phytoremediation of polluted waters. Potential and prospects of wetland plants // Acta Biotechnol. 2002. V.l. N.2. P. 199-208.

147. Wang T.C, Weissman J.C., Ramesh G., Varadarajan R., Benemann J.R. Heavy metal binding and removal by Phormidium II Bull. Environ. Contain. Toxicol. 1998. V.60. p. 739-744.

148. Wardas W., Wardas M., Hamankiewicz D. The effect of 3,4 benzopyrene on the growth of Chlorella, strain 366 // Occanologia (PRL). 1983. V.17. P. 51-57.

149. Walker J.D., Colwell R.R, Petrakis L. Degradation of petroleum by an alga, Prototeca zopfii И Appl. Microbiol. 1975. V.30. P. 79-81.

150. Warshawsky D., Radike M., Jayasimhulu K. and Cody T. Metabolism of benzoa.pyrene by dioxygenase enzyme system of the freshwater green alga Selenastrumcapricorrmtum II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. V.l52. P. 540-544.

151. Warshawsky D., Kennan Т.Н., Reilman R, Cody Т.Е. and Radike M.J. Conjugation of benzoa.pyrene metabolites by freshwater green alga Selenastrum capricornutum // Chem.-Biol. Interact. 1990. V.74. P 93-105.

152. Wheelis M L. and Ornston L.N. //J.Bacteriol. 1972. V.109, 790c.

153. Williams P. A., Murray K: Metabolism of benzoate and the methylbenzoates by Pseudomonas putida (Arvilla) mt-2: evidence for the existence of a TOL plasmid // Journal Bacteriol. 1974. V. 120. P. 416-^23.

154. Winters K., ODonnell R, Batterton J. C., Van Baalen C. Water soluble components of four fuel oils: chemical characterization and effects on growth of microalgae // Marine Biology. 1976. V.36. N. 3. P. 269-276.

155. Wurster M., Mundt S., Hammer E., Schauer F., Lindequist U. Extracellular degradation of phenol by the cyanobacterium Synechococcus PCC 7002 // Journal of Applied Phycology. 2003. V. 15. P. 171-176.

156. Zachleder V., Abarzua S., Wittenburg E. Effect of 3,4-benzopyrene on the chlorococcal alga Scenedesmus quadricauda // Planta. 1983. V. 157. N.5. P. 432-440.

157. Происхождение культур водорослей и цианобактерий из коллекции ES.

158. N штамм Место сбора и характер проб Время сбора проб Отсев клона таксономическая принадлежность

159. ES-1 Ил, Красный Бор IX-93 Х-93 Chlorella sp.

160. ES-3 Ил, Красный Бор IX-93 Х-93 Chlorella sp.

161. ES-4 Ил, Красный Бор IX-93 Х-93 Chlorella sp.

162. ES-6 Ил, Красный Бор IX-93 Х-93 Chlorella sp.

163. ES-13 Ил, Красный Бор IX-93 Х-93 Chlorella sp.

164. ES-Зш Ил, Красный Бор IX-93 Х-93 Chlorella sp.

165. ES-150 Почва, Череповец Х-94 ХИ-94 Chlorococcum vacuolatum

166. ES-16 Почва, Череповец Х-94 ХИ-94 Chlamydomonas sp.

167. ES-182) Почва, Череповец Х-94 VIII-95 Chlorococcum vacuolatum

168. ES-19 Почва, Череповец Х-94 XII-94 Stichococcus minor

169. ES-222) Почва, Череповец Х-94 VIII-95 Tetracystis fissurata

170. ES-47 Почва, Череповец Х-94 VIII-95 Chlamydomonas sp.

171. ES-673) Почва, Череповец Х-94 VIII-95 Tetracystis fissurata

172. ES-773) Почва, Череповец Х-94 VIII-95 Tetracystis fissurata

173. ES-843) Почва,Череповец Х-94 VIII-95 Tetracystis fissurata

174. ES-55 Почва, Ростов IX-94 VIII-95 Scenedesmus obliquus

175. ES-59 Почва, Ростов IX-94 VIII-95 Scenedesmus quadricauda

176. ES-60 Почва, Ростов IX-94 VIII-95 Kirchneriella obesa

177. ES-79 Почва, Ростов IX-94 VIII-95 Scenedesmus quadricauda

178. ES-79-2 Почва, Ростов IX-94 VIII-95 Nostoc sp.

179. ES-803) Почва, Ростов IX-94 VIII-95 Tetracystis fissurata

180. ES-27 Вода, 5ТЭЦ, СПб VII-95 VIII-95 Chlorella sp.

181. ES-28 Вода, 5ТЭЦ, СПб VII-95 VIII-95 Chlorella sp.

182. ES-30 Вода, 5ТЭЦ, СПб VII-95 VIII-95 Chlorella sp.

183. ES-29 Вода, 5ТЭЦ, СПб VII-95 VIII-95 Klebsormidium flaccidum

184. ES-31 Вода, Печора VII-95 Х-95 Chlorella sp.

185. ES-33 Вода, Печора VII-95 Х-95 Chlorella sp.

186. ES-34 Вода, Печора VII-95 Х-95 Chlorella sp.

187. ES-3 7 Вода, Печора VII-95 Х-95 Chlorella sp.

188. ES-41 Вода, Уфа IX-95 V-96 Chlorella sp.

189. ES-42 Вода, Уфа IX-95 V-96 Chlorella sp.