Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Атипичные участки связывания липопротендов в гладкомышечных клетках: кинетические свойства и возможное участие в активации систем вторичных посредников

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Атипичные участки связывания липопротендов в гладкомышечных клетках: кинетические свойства и возможное участие в активации систем вторичных посредников"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

______РГБ ОД _______________________________

"1 7 ОПТ да

На правах рукописи

КУЗЬМЕНКО ЕЛЕНА СТЕПАНОВНА

АТИПИЧНЫЕ УЧАСТКИ СВЯЗЫВАНИЯ ЛИПОПРОТЕИДОВ В ГЛАДКОМЫЖЕЧНЫХ КЛЕТКАХ: КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ВОЗМОЖНОЕ УЧАСТИЕ В АКТИВАЦИИ СИСТЕМ ВТОРИЧНЫХ ПОСРЕДНИКОВ

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Института экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра Российской Академии Медицинских наук.

Научный руководитель ■ кандидат биологических наук В. Н. Бочков^

Научный консультант член-корреспондент РАМН В. А. Ткачук

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, проф. Б. И. Ходоров кандидат медицинских наук В. А. Косых

Ведущая организация профилактической медицины

Российский научный центр

1994 в

Зашита диссертации состоится - . . " чх- " часов на заседании специализированного ученого совета в Кардиологическом научном центре Российской Академии медицинских наук по адресу: 125252, Москва, 3-я Черепковская ул. , д. 15а.

С диссертацией можно ознакомиться Кардиологического научного центра РАМН.

в библиотеке

Автореферат разослан

1994 г.

Учений секретарь

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. . Наиболее изученной функцией шпопротеидов плазмы крови является их способность переносить юлестерин и другие липиды [Goldstein et а 1 ., 1983]. Помимо 1ерераспределения холестерина в органах и тканях, липопротеиды и IX апобелки способны влиять -на активность некоторых ферментов Brewer et al., 1992], а также выступать в качестве регуляторов функциональной активности клеток иммунной системы [Hui et al., 1980], тромбоцитов [Andrews et al ., 1987], макрофагов [Kelley et il., 1988], и альвеолярных клеток II типа [ Voyno-Yasenetskaya et il., 1993]. Кроме того, в экспериментах in vitro была показана способность липопротеидов регулировать сосудистый тонус по эндотелий-зависимому механизму и путем прямого воздействия на гладкомышечные клетки сосудов [Galle et al., 1990; Simon et al., 1990; Toraita et al., 1990]. Так как эндотелиальные и гладкомышечные клетки, а также макрофаги и тромбоциты являются регуляторами тонуса- сосудов -и активными участниками тромбоза и атерогенеза .[Ross, 1993], изучение данного типа клеточных эффектов липопротеидов представляет потенциальный интерес не только для клеточной биологии, но и для медицины.

Появившиеся в последнее время данные позволяют предположить, что регуляторные эффекты липопротеидов являются результатом активации внутриклеточных сигнальных систем. Показано, что в первые же секунды после добавления липопротеидов происходит активация фосфоинозитидного обмена и повышение уровня кальция в цитоплазме .клеток [.Dunn et al . , 1988; Block et al.., 1988]. Липопротеиды способны изменять уровень цАМФ и цГМФ в клетках

v

[Bruckdorfer et al., 1984; Schmidt et al., 1990], регулировать pH цитоплазмы [Cashinidis et al., 1991] и стимулировать фосфорилирование ряда внутриклеточных белков [Andrews et al., 1987]. Все эти данные указывают' на сходство в действии липопротеидов и гормонов и позволяют предположить, что действие

липопротеидов на системы вторичных посредников опосредуется

! • v мембранными рецепторами.

Природа предполагаемых "сигнальных" липопротеидных рецепторов не ясна. Метаболические эффекты липопротеидов низкой плотности (ЛЯП) опосредуются их связыванием с "классическим" апо В,Е-рецептором. По-видимому, этот рецептор не связан с системами внутриклеточной передачи сигналов. Об этом говорит- то, что структура апо В,Е-рецептора значительно отличается от строения гормональных рецепторов, связанныых с системами вторичных посредников. На основании этих данных можно предположить существование дополнительных ЛНП-связывающих участков, отличавшихся от апо В,Е-рецептора и сопряженных с . внутриклеточи-^к -.истемами передачи информации.

Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение механизмов активирующего действия липопротеидов на системы вторичных посредников клетки и поиск участков связывания липопротеидов, опосредующих этОт эффект в гладкомышечных клетках сосудов человека.

Для достижения этой цели ставились следующие задачи:

1. Изучить кинетику активирующего" действия липопротеидов на системы обмена кальция и фосфоинозитидов в гладкомышечных клетках сосудов человека.

•■ 2. Охарактеризовать кинетику связывания • липопротеидов с культивируемыми гладкомышечными клетками сосудов

человека.

3. Выявить и изучить липопротеид-связываюшие бглки в мембранах гладкомышечных клеток сосудов человека. ;учная новизна и практическая ценность работы:

В настоящей работе детально изучено влияние ЛНП на системы ¡мена кальция и фосфоинозитидов в ГМК человека. При этом (лучены данные, свидетельствующие об участии ГТФ-связываюиих :лков в липопротеид-индуцированной активации систем вторичных »средников, а также об ингибируюшем действии ряда клеточных ютеинкиназ на эффекты ЛНП. На гладкомышечных клетках сосудов :ловека впервые обнаружен и охарактеризован атипичный участок ¡язывания ЛНП. Получены свидетельства в пользу того, что эти ¡астки сопряжены с системами вторичных посредников. Кроме того, работе обнаружен ранее не описанный белок с молекулярной массой !)5 кЛа, избирательно связывающий липопротеиды низкой плотности г №е$1егп-блотах белков мембран ГМК сосудов человека, и, эзможно, представляющий собой предполагаемый "сигнальный" гцептор ЛНП.. -

пробация работы. Диссертация апробирована на. межлабораторном еминаре Института экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН Москва, 1994).

убликации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, труктура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", Результаты", "Обсуждение результатов", "Выводы" и "Список итературы". Работа изложена на стр. машинописного текста,

одержит 31 рисункСЬ. Список литературы включает аименований.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение липопротеидов проводили с помошью препаративного ультраиентрифугирования "посредством последовательной флотации [Havel et al. , 1955].

Иодирование липопротеидов низкой плотности проводили с использованием ICI по ранее описанному методу [Goldstein et al,, 1983]. Удельная радиоактивность ЛНП составляла 150-500 имп. х мин~^/нг белка ЛНП. 95% радиоактивности осаждалось ТХУ, менее 2% экстрагировалось смесью хлороформ/метанол.

Получение модифицированных липопротеидов низкой плотности.

Ацетилированные ЛНП получали, инкубируя ЛНП с уксусным ангидридом

[Basu et а]., ¡976]. Карбамоилирование ЛНП проводили по ранее

описанному методу [Weisgraber et al.,1978] с использованием

цианата калия. Обработку ЛНП циклогександионом проводили как

описано ранее [Mahley et al., 1977]. Процесс модификации ЛНП

контролировали с помощью нативного электрофореза [Basu et al.,

1976], а также по способности модифицированных липопротеидов 125

конкурировать с I-ЛНП за связывание с высокоаффинным

рецептором фибробластов.

Культивирование клеток. Гладкомышечные клетки микроартериол сальника человека и фибробласты кожи человека были выделены, охарактеризованы и культивировались согласно ранее описанным методам [Scott-Burden et al., 1989; Fuki et al., 1991]. Среда культивирования MEM содержала 20 мМ HEPES, 4мМ бикарбонат натрия, 10% эмбриональной сыворотки теленка. Клетки (10-18 пассаж) выращивали до монослоя и инкубировали в бессывороточной среде, содержащей'0, 1% БСА в течение 48 часов'.

Измерение концентрации ионов кальция в цитоплазме

А

гладкомышечных клеток проводили по описанному ранее методу [Bochkov et al . , 1992]. Клетки, выращенные на покровных стеклах, инкубировали 15 минут при в растворе, содержащем 140 мМ

NaCl, 10 мМ KCl', 1 мМ NaH2P04,' 1 мМ MgC 12, 1,8 мМ СаС12, 5 мН D-глюкозу, 25 мМ HEPES-NaOH, рН 7,4, 0,1 мг/мл БСА и 1 мкМ fura-2/АМ. Затем клетки промывали тем же раствором без кальциевого зонда. Флуоресценцию, возбуждаемую попеременно (с частотой 6,25 Гц) светом с длиной волны 340 и 380 нм, регистрировали при длине волны 500 нм. Калибровку сигнала и расчет [Ca^+]j осуществляли как описано ранее [Ambler et al., 1988; Grynkiewicz et al., 1985].

Изучение активации фосфоинозитидного обмена. Гладкомышечные клетки в 24-луночных плашках инкубировали в течение 48 часов в бессывороточной среде, содержащей 0,1% БСА и 1 мкКи/мл мио-[^Н]инозитола. Перед экспериментом клетки отмывали от метки средой с 0,1% БСА и инкубировали 20 минут при

37 °С в среде,

содержащей 15 мМ LiCI. Далее добавляли агонисты и останавливали инкубацию трихлоруксусной кислотой (конечная концентрация 4,6 %). Через 30 минут ТХУ разбавляли водой до 1 % и наносили на анионообменные колонки, содержашие 0,5 мл Dowex-AG 1-Х8 . Моно-, бис- и трисфосфаты инозитола разделяли ступенчатой элюцией с использованием возрастающих концентраций формиата аммония в 0,1 М муравьиной кислоте [Berridge et al . , 1983]. Радиоактивность во фракциях определяли методом жидкостной сцинтилляции. Анализ инозитолфосфатов ВЭЖХ был проведен согласно ранее описанному

методу [Bochkov et al., 1992].

125

Связывание [ 1]ЛНП с фибробластами и ГМК. Инкубацию клеток с [ 1251 ]ЛНП (0,5-100 мкг/мл) проводили' при' 4°С' в ср'еде культивирования MEM,, содержащей 0,1% БСА. В экспериментах с ГМК

после 4 часов инкубации клетки промывали (6x3 мл) раствором Хенкса (0-4°С). содержащим 0,1% БСА, солюбилизировали клетки в 0,1 М NaOH и определяли связанную с клетками радиоактивность. Инкубацию [ ~ I ]ЛНП с фибробластами проводили в тех же условиях, после чего клетки промывали и инкубировали в среде МРИ, содержащей 10 мг/мл гепарина в течение 1 часа при 4°С [Goldstein et al., 1983]. Среду инкубации просчитывали в гамма-счетчике для определения вытесняемой гепарином радиоактивности. Специфическое связывание определяли как разность между величиной общего связывания неспецифического связывания, измеренного в

присутствии 1 мг/мл немеченых ЛНП. Данные по связыванию липопротеидов анализировали с помощью компьютерной программы "Ligand" [Munson et al., 1980].

Выделение мембран медии аорты человека. Мембраны гладкомышечных клеток медии аорты человека выделяли по ранее описанному методу [Matlib et al., 1984]. Предварительно удалив адвентицию и эндотелий, медию аорты измельчали в буфере, содержащем 250 мМ сахарозу, 20 мМ M0PS, 0,05% БСА, 1мМ PMSF (рН 7,4 при 4°С), гомогенизировали и центрифугировали в течение 10 мин при 1 000 х g. Супернатант последовательно центрифугировали 10 мин при 10 000 х g и 30 мин при 112 000 х g. Осадок ресуспендировали в том же буфере. Концентрацию белка определяли методом Петерсона [Peterson, 1977].

Препарат частично очищенного апо В,Е-рецептора из коры надпочечников быка и моноклональные антитела против апо В,Е-рецептора Fjj были любезно предоставлены В.П. Цибульским, ведущим научным сотрудником отдела молекулярной и клеточной кардиологии ИЭК КНЦ РАИН. '

Электрофорез в полиакриламидиом геле в присуствии ДДС-Na и

лигандный блоттинг. Белки разделяли в 7% ПААГ в присутствии

ДДС-Na в невосстанавливаюших условиях (без неркаптоэтанола).

Перенос белков с ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли

по [Towbin et al., 1979]. Белки, связывающие липопротеиды

определяли последовательно инкубируя Western-блоты в присутствии

125

ЛНП, антител против ano В и вторых антител меченных [ I]. (удельная активность 2000-5000 имп х мин-* на 1 нг белка). Мечение антител проводили с помощью иодогена [Fraker and Speck, 1978]. Все инкубации проводили при комнатной температуре в буфере А (50 тМ Трис-НС1, 150 mM NaCl, рН-7,4), содержащем 5%-ное обезжиренное молоко или 2%-ный бычий сывороточный альбумин. Липдпротеид- связывающие белки выявляли методом радиоавтографии. Величину радиоактивности, связанной с белком 105 кДа, определяли вырезая связывающий участок и просчитывая на гамма-счетчике.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние липопротеидов плазмы крови на системы вторичных посредников.

С помощью флуоресцентного Са^+-чувствительного зонда fura- 2

удалось зарегистрировать быстрое и обратимое повышение уровня 2+

Са в цитоплазме культивируемых гладкомышечных клеток аорты человека под действием липопротеидов низкой (ЛНП) и высокой (ЛВП^ плотности (Рис. 1, а). Липопротеиды способны также активировать фосфоинозитидный обмен в данных типах клеток. При этом происходит образование moho-, бис- и трисфосфатов инозитола, а также накопление диацилглицерина (Рис. 1, б, в, г). Анализ изомерного состава образующихся фосфатов инозитола с помощью ВЭЖХ показал, что ЛНП и ЛВП, активируют, полифосфоинозитидспецифичную

[Са"]„нМ 250-

0 -

-wvA 1

лнп

1 мин

Sg'»0

tt4 5 я

4 и

1000 ÍI '

5 7

2? 850

ТОО

. лнп

О 5 10 15 20 время (ше)

2500

3 *

S g 2000

-2- в 1500.

г7«

3 ? 1000.

я 3

¿•з

500.

(ЛИП)

2500

3

2 4 6 8 время (кив)

. (ЛВПз)

2 4 6 8 10 время (mía)

2+

культуре ГМК

Са^+-чувствигельного зонда fura-2.

Рис.1 а) Повышение уровня цитоплазматического С'а ' в

2+

гладкомышечных клетках под действием ЛНП и ЛВП^. [Са ]j в аорта человека определяли по флуоресценции На рисунке представлены репрезентативные кривые, полученные после стимуляции клеток ЛНП или ЛВП^ (каждый по 50 мкг/мл).

Кинетика липолротеид-индуцированной активации фосфоинозитидного

обмена, б) - Кинетика образования диацилглицерина под .действием

ЛНП и ЛВП,. в) - Кинетика накопления moho- (1), бис- (2), и 3

трисфосфатов (3) [ Н]инозитола под действием ЛНП. г) Кинетика

накопления ыоно- (1), бис- (2), и трисфосфатов (3) [^Н]инозитола

под действием ЛВП,. .-Анализ • фосфатов■ ( ^Н]инозитола, . а также

3

экстракцию липидов и измерение [ Н]диацилглицерина проводили как описано в разделе "Методы".

0

2500

2000

¡- >>

а * ?! 1500

В £ 2 «• 5 «

1000

500

300-, й б

0 ---100 -

Липопротеид (мкг/кл)

¿2 £

+ 2

N н

а а

О о

щ Л

а з

Л Ч а а о п

С хо

200-

100

0-1

200

100

Липопротеид (мкг/мл)

200

Рис.2. Концентрационная зависимость липопротеид-индуцированного повышения [Са ^ и фосфатов инозитола в культивируемых

гладкомышечкых клетках аорты человека. а) Культивируемые клетки аорты человека, нагруженные

гладкомышечные 2+

чувствительным

Са

зондом ):ига2, обработали указанными концентрациями ЛНП (1) или ЛВП, (2). Результаты представлены как разность между максимально достигнутым уровнем Са ■ и исходным (базальным) уровнем« б) гладкомышечные клетки, меченные

[ Н]инозитолом, обрабатывали указанными концентрациями ЛНП (1) или ЛВПд (2) в течение 5 мин при 37°С, после чего останавливали инкубацию и определяли содержание [ ^Н]инозитолфосфатов ' как описано в разделе "Методы".

фосфолипазу С. Эффекты ЛНП и ЛВП^ на уровень [Ca ]j и

фосфоинозитидный обмен были дозозависимыми и достигали насыщения

при физиологических концентрациях липопротеидов (Рис. 2). Эти

данные показывают, что липопротеиды, подобно вазоактивным

гормонам, активируют системы вторичных посредников в

гладкомышечных клетках. Мы обнаружили, что вещества, активирующие

протеинкиназу С, а также сАМР- и cGMP-зависимые протеинкиназы,

ингибируют гормоноподобное действие липопротеидов в данных типах

клеток. Обработка гладкомышечных клеток токсином Bordetella

pertussis, ингибитором Gj и О0-белков, также приводила к

существенному снижению ЛНП- и ЛВЛ^-индуцированного повышения 2+

[Ca и фосфоинозитидного обмена.

Полученные результаты свидетельствуют о сходстве механизмов

активации фосфоинозитидного обмена гормонами и липопротеидами, а

также о возможном участии в этом процессе G-белков..

Для определения роли "классического" рецептора ЛНП (апо В,Е-

рецептора) в активации обмена фосфоинозитидов и повышении уровня

цитоплазматическог.. кальция, мы изучили эффекты ЛНП в условиях,

препятствующих связыванию с ,апо В,Е-рецептором. ЛНП-

2+

индуцированное повышение [Ca и уровня инозитолфосфатов в ГМК сосудов не ингибировалось под действием ЭДТА (Рис. 3), блокирующего связывание ЛНП с апо В,Е-рецептором. Гепарин, предотвращающий связывание ЛНП с апо В,Е-рецептором фибробластов, не влиял на вызванное ЛНП накопление инозитолфосфатов в гладкомышечных клетках. Ацетилирование или карбамоилирование лизилов апо В, устраняющие взаимодействие липопротеидов с апо В,Е-рецептором, практически не изменяли активирующее действие ЛНП на фосфоинозитидный обмен в ГМК (Рис. 4). Представленные данные свидетельствуют о том, что "классический" рецептор ЛНП не

1Г

[Са2+1„нМ Са2+0=1.8 «М 300 -

150 -0 -

Са2+=0

4 6

ЭДТА (иМ)

Рис.3. Влияние хелаторов Са^+ на ЛКП-инауцированнув активацию сигнальных систем в гладкомышечных клетках сосудов человека, а) -гладкомышечные клетки аорты человека, нагруженные ' Гига-2, инкубировали в буфере, содержащем 1 мМ и 1,8 мМ СаС^ или 1

мМ ЭГТА. В. указанные стрелками . момменты в среду инкубации добавляли ЛНП (50 мкг/мл). б) - Клетки, меченные [ 3Н]ино зитолом," инкубировали в течение 5 минут с 50 мкг/мл ЛНП в среде МЕМ, содержащей указанные концентрации ЭДТА. По окончании инкубации к клеткам добавляли ТХУ, после чего [ ]инозитолфосфаты определяли с помощью анионообменной хроматографии на Оотвех. Результаты-представлены в виде % от содержания [ 3Н]инозитолфосфатов в клетках, инкубированных без добавления ЛНП.

Лнпопротеид (мкг/мл)

О 4-i-i-i-1-1

О 50 100 150 200 250

Липопротеид (мкг/мл)

Рис.4. Влияние химических модификаций ano В на способность ЛНП стимулировать накопление инозитолмонофосфата в культивируемых -гладкомышечных клетках сосудов человека. Гладкомышечные клетки сосудов человека, преинкубированные с [ Н]инозитолом, обрабатывали в течение 5 минут указанными концентрациями нативных или модифицированных ЛНП, после чего добавляли ТХУ и анализировали содержание [ Н¡инозитолмонофосфата как описано в разделе "Методы". а) Модификация лизиновых аминокислотных остатков ano В: ( 1 )-нативк^е ЛНП, {2 )-аиетилированные .ЛНП, (3 )-карбамоилированные ЛНП. б) Модификация аргининовых аминокислотных остатков ano В: (1 )-нативные ЛНП, (2)-ЛНП, обработанные циклогег :phjm21'ом.

участвует в активирующем действии этих липопротеидов на сигнальные системы в гладкомышечных клетках.

Связывание липопротеидов низкой плотности с гладкомышечными клетками сосудов человека.

■ При изучении специфических участков связывания липопротеидов. на гладкомышечных клетках микроартериол сальника человека обнаружено два участка связывания для липопротеидов низкой плотности (Рис. 5 а, б). Константа диссоциации K^j

высокоаффинного участка связывания ЛНП равна 0,88 + 0,67 мкг/мл

—9

(2x10 М): величина.максимального связывния ЛНП В , составляет 4 ' maxl

13 + 6,2 нг/мг клеточного белка (п=4). Участки связывания ЛНП второго типа имеют более низкую аффинность = 53,2 ± 19,9

мкг/мл (1x10 М) при более высокой величине максимального связывания ®max2 = ± 16,5 нг/мг клеточного белка (п=9).

Константа диссоциации высокоаффинного участка связывания рецептора близка к К^ "классического" апо В,Е- рецептора (1 - 1,5 мкг/мл, [Brown and Goldstein, 1986]), а также к величине, полученной нами в экспериментах на фибробластах (рис. 5, в, г), где Kd = 2 ± 1,2 мкг/'мл~( n=3) (4х10-9 М) и Вщах = 203 ± 122 нг/мг клеточного белка. Эти эксперименты показали, что на гладкомышечных клетках, в отличие от фибробластов, основная часть специфического связывания ЛНП отражает взаимодействие липопротеида с низкоаффинным участком связывания, отличающимся от апо В,Е- рецептора.

125

Изь-грение кинетики связывания [ I ]ЛНП с культивируемыми гладкомышечными клетками показало, что это связывание зависит от времени и является обратимьм. Константы скорости ассоциации и диссоциации [ ]ЛНП составили, соответственно, V^.8 ± 1,2) х 103 М-1сек-1 (п=2) и (2,8 ± 0,7) х Ю-4 сек-1 (п=2). Эти величины

а

б

— ч

100

У i 0 fe

О 20 40 60 SO 100

|1251|ЛНП (мкг/мл)

J2Q

« Е

- о

д 1 160

С v

s

1 N

80

U в

i От-

В

Фиироиласты

3

0 10 20 И 40 (1251)ЛНП (мкг/мл)

5 '1 Kji- 1 мкг/мл I Rm;ixl = 13 nr/мг

03

0.2

0.1

Kj2= 5° мкг/мл Вшах2= 86 иг/мг

SO 100

В (нг/мг)

ISO

Г

K,j— 2 мкг/мл Вщах'= 200 нг/мг

100 200 в (нг/мг)

зоо

125

Рис.5. Связывание липопротеидов низкой плотности, меченных I, с культивируемыми гладкомышечными клетками сосудов человека (а, б) и фибробластами кожи человека (в, г), а) и в) - Изотерма связывания [1251]ЛНП с клетками. Инкубацию клеток с [ 1251 ]ЛНП (1-100 мкг/мл) проводили в течение 4' часов при 4°С в среде культивирования MEM, содержащей 0,1% БСА. Неспецифическое связывание определяли в присутствии избытка (1 мг/мл) немеченых ЛНП. Специфическое связывание (2) рассчитывали, вычитая из величин общего связывания (1) значения неспецифического связывания (3). б) и г) - Обработка данных связывания в

координатах Скэтчарда. По оси абсцисс отложены количества специфически связанных ЛНП (В)', по' оси' ординат - отношения количества специфически связанных ЛНП к количеству свободных ЛНП, умноженные на 1000.

существенно отличаются от кинетических констант ano В,Е-

4

рецептора, для которого они составляют соответственно 5,5x10 М-1сек-1 и 6,3х10-5 сек-1 [Pitas et al., 1979]. Константа

j - J25 " 1

диссоциации [ 1]ЛНП, вычисленная из 2 экспериментов как

—8

отношение K_j и составила (3,75 ± 1,24) х 10 М (п=2), что

незначительно отличается от оценки, полученной в экспериментах по

равновесному связыванию.

В экспериментах по вытеснению связывания меченых ЛНП

нерадиоактивными липопротеидами мы обнаружили, что нативные ЛНП

полностью подавляют специфическое связывание [ I ]ЛНП (рис. 8,

а). К^ и Втах, рассчитанные из данных по вытеснению с помощью

программы "Ligand", составили, соответственно, 50,2 + 1,0 мкг/мл

(1x10 М) и 102 + 25,5 нг/мг (п=5), что хорошо согласуется с

данными экспериментов по равновесному связыванию и кинетических

измерений. В отличие от немеченых ЛНП, ЛВП^ менее эффективно 125

вытесняли [ I]ЛНП (рис. 8, а). Константа ингибирования для ЛВП, составила 300. ± 140 мкг/мл .(ЗхЮ-6 М) (п=3)..

Участок специфического связывания ЛНП с гладкомышечными клетками, имеющий более низкую аффинность, обладает рядом характеристик, считающихся типичными для липопротеидного рецептора. Во-первых, концентрационная зависимость специфического связывания ЛНП характеризуется насыщением. Концентрации ЛНП, необходимые для насыщения данного участка связывания, находятся в физиологическом диапазоне (в медии сосудов концентрация ЛНП около 100 мкг/мл [Sloop et al., 1978]). Во- вторых, связывание ЛНП с гладкомышечными клетками при 4°С (то есть в условиях, препятствующих эндоцитозу) является обратимым. В-третьих, данные экспериментов ■ по конкурентному связыванию липопротеидов с гладкомышечными клетками говорят о селективности данного участка

б

К 5

я Ю

5.2 го

О

Ю м

г-1

аЗ % 3 ч

я -« £

л 2 К

а

и С-

10

Я О

2 4 6 8 Гепарин (мг/мл)

5 10 15 Гепарин (мг/мл)

125

Рис.6..Влияние гепарина на специфическое связывание.[ Г]ЛНП с ,гладконышечныии клетками (а) и фибробластами (б). Клетки инкубировали в среде МЕМ, содержащей [ I)ЛНП (5 мкг/мл) в присутствии гепарина (в указанных концентрациях).

150

120--

£ а

6 9

ЭДТА.(мМ)

Рис.7. Зависимость специфического связывания

гладкомышечными клетками и фибробластами от

катионов. Связывание с гладкомышечными.. клетками (1) .и

125

фибробластами (2) измеряли при концентрациях [ I ]ЛНП соответственно 30 мкг/мл и 5 мкг/мл в присутствии ЭДТА в указанных концентрациях.

[1251]ЛНП с двухвалентных

для липопротеидов определенного типа. В отличие от ano В, Н— рецептора, взаимодействие ЛИП с низкоаффинным участком связывания гладкомышечных клеток нечувствительно к гепарину (Рис. 6) и не требует присутствия двухвалентных катионов (Рис. 7). Ацетилирование и карбамоилирование лизиновых аминокислотных остатков ano В практически не изменяют взаимодействие ЛНП с низкоаффинным участком связывания гладкомышечных клеток (Рис. 8, а), тогда как данные химические модификации полностью предотвращают связывание ЛНП с ano В,Е- рецептором фибробластов (рис. 8,6). ................"

Из приведенных выше данных следует, что кинетические характеристики взаимодействия ЛНП с низкоаффинным участкой связывания гладкомышечных клеток находятся в хорошем соответствии с параметрами активации систем вторичных посредников. Величина

связывания ЛНП совпадает с концентрацией ЛНП, вызывающей полумаксимальное повышение уровня инозитолфосфатов и .цит^плазматического Са^+. Ацетилирование или карбамоилирование ano В не влияет на способность ЛНП активировать сигнальные системы клетки или связываться с низкоаффинным участком. Кроме того, активация фосфоинозитидного обмена под действием ЛНП, так же как и связывание этих липопротеидов с ГМК, не чувствительны к гепарину и не ингибируются ЭДТА. Приведенные данные позволяют предположить, что низкоаффинньщ ЛНП-связывающий участок может опосредовать активацию липопротеидами систем вторичных посредников в гладкомышечных клетках человека.

Связывание липопротеидов с белками мембран аорты человека на Western-блотах.

Большинство известных рецепторов липопротеидов .сохраняют способность связывать лиганды после электрофоретического

200

400

800

Липопротеид (мкг/мл)

50 .100

Липопротеид (мкг/мл)

150

125

Рис.8. Связывание [ I]ЛНП с гладкомышечными клетками и

фибробластаии в присутствии ЛВП^ и модифицированных липопротеидов

низкой плотности. Гладкомышечные клетки сосудов человека (а)

125

инкубировали в среде MEM, содержащей 30 мкг/мл [ I]ЛНП в.

отсутствие или в присутствии немеченых ЛНП (1), ^ВП^ (2),

ацетилированных ЛНП (3) и карбамоилированных ЛНП (4) в указанных

концентрациях. Фибробласты кожи человека (б) инкубировали в среде

125

MEM, содержащей 5 мкг/мл [ 1.]ЛНП в отсутствие или в присутствии

немечены* ЛНП (1), (2), ацетилированных ЛНП (3) и

карбамоилированных ЛНП (4), в указанных концентрациях. Количество 125

связанных [ I]ЛНП определяли как описано в разделе "Методы исследования".

разделения и переноса на нитроцеллюлозу. Мы применили этот методический подход для поиска белков, опосредующих низкоаффинное связывание ЛНП с гладкомышечными клетками.

На рис. 9 (а) показано, что ЛНП избирательно взаимодействуют с мембранным белком с молекулярной массой 105 кДа. Специфическое связывание ЛНП с этим белком зависит от концентрации липопротеидов и хорошо совпадает с концентрационной зависимостью атипичного участка связывания ЛНП на ГМК (рис. 9, б). Обработка мембранных белков р-меркаптоэтанолом, восстанавливающим дисульфидные связи, значительно снижала ЛНП-связывающую активность 105 кДа белка. Таким образом, нативные дисульфидные связи 105 кДа белка необходимы для проявления его ЛНП-связывающей активности. Сходными свойствами обладает "классический" ano В,Е- рецептор [Daniel et al., 1983]. Однако моноклональные антитела (С^, ^13)' связывающиеся с ano 3, Е— рецептором мембран печени человека и надпочечников быка, не узнавали 105 кДа белок мембран медии аорты человека.

Для того, чтобы оценить липопротеидную специфичность 105 кДа-белка, инкубацию Western-блотов с ЛНП проводили в присутствии возрастающих- концентраций ЛВП^. Мы обнаружили, что -^П^ ингибировали связывание ЛНП с белком 105 кДа, однако, для этого требовались высокие концентрации ЛВП^. Снижение связывания ЛНП на 50% наблюдалось при 100-кратном молярном избытке ЛВП-j. Эти данные указывают на значительную избирательность- 105 кДа липопротеид-связывающего белка для ЛНП по сравнению с ЛВП-j.

Ацетилирование и карбамоилирование лизиновых остатков ano В

х—

не предотвращало связывания ЛНП с 105 кДа белком, тогда как данные химические' модификации ano В полностью блокировали взаимодействие ЛНП с ano В,E-рецептором фибробластов [Basu et

а

kDa 205 — j

116 — 97 — £3 — 105

66 —

45 —

1 2

б

5 I

в я U

20 40 60 80

ЛНП (мкг/мг)

Рис.9. Связывание ЛНП с белками мембран медии аорты человека на

Sestern-блоте.. Белки .разделяли в 7%.ПААГ .в присутствии ДДС-Na в<

невосстанавливаюших условиях. Перенос белков с ПААГ на

нитроцеллюлозную мембрану осуществляли no [Towbin et al., 1979].

Белки, связывающие липопротеиды определяли последовательно

инкубируя Western-блоты в отсутствие (1) или в присутствии (2)

125

ЛНП, антител против ano В и вторых антител меченных [ I]. б) - Концентрационная зависимость связывания ЛНП с 105 КДа белком мембран иедии аорты человека на Western—блоте.

а!.', 1976; ЧЫзЕгаЬет ег а1.., 1978].

Сравнение свойств связывания липопротеидов с 105 кДа-белком с известными характеристиками других липопротеид-связывающих белков показало, что описанный в данной работе белок отличается от апо В,Е-рецептора, скевинджер-рецептора, 1ЛР, ЛВП-рецептора и

нуклеолина [ Semenkovich, 1990]. Некоторые из описанных выше свойств липопротеид-связывающего 105 кДа-белка совпадают со свойствами атипичного участка связывания ЛНП, обнаруженного на ГМК методом радиолигандного анализа. Сходство выражается в близкой концентрационной зависимости связывания, селективности связывания для ЛНП по сравнению с ЛВП^, способности атипичного участка и 105 кДа белка связывать химически модифицированные ЛНП. На основании этих данных можно предположить, что 105 кДа белок опосредует низкоаффинное связывание ЛНП с глаякомышечными клетками.

. ВЫВОДЫ

1. Кинетика -активирующего действия липопротеидов плазмы

крови на системы вторичных посредников ГМК подобна кинетике 2+

действия Ca -мобилизующих .гормонов. Влияние липопротеидов на фосфоинозитидный обмен и уровень иитоплазматического Са^+ блокируется после преинкубации клеток с ингибитором GTP-связываюших белков, токсином Bordetella pertussis, а также под действием активаторов протеинкиназы С и сАМР- зависимой протеинкиназы.

2. На культивируемых ГМК сосудов обнаружен и охарактеризован ранее не описанный участок специфического .связывания ЛНП. Кинетические характеристики этого связывания и чувствительность к ингибиторам совпадают с соответствующими параметрами активации фосфоинозитидного обмена."

3. Методом лигандного блоттинга в мембранах гладкомышечных клеток сосудов человека обнаружен белок с молекулярной массой 105 кДа, избирательно связывающий ЛНП, но отличающийся от апо В,Е-рецептора, участвующего в транспорте холестерина.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бочков В.Н., Кузьменко Е.С., Резинк Т., Ткачук В.А. Гормоноподобное действие липопротеидов плазмы крови на тромбоциты и гладкомышечные клетки сосудов человека. -Биохимия. ■1994. Т.' 59. С. 960-968.

2. Бочков В.Н., Кузьменко Е.С., Резинк Т., Ткачук В.А. "Классический"' апо В,Е-рецептор не участвует в активирующем влиянии липопротеидов низкой плотности на системы вторичных посредников в тромбоцитах и гладкомышечных клетках сосудов человека. Биохимия. 1994. Т. 59. С. 1330-1339.

3. Кузьменко Е.С., Бочков В.Н., Стамбольский Д.В., Ткачук В.А. Атипичные участки связывания липопротеидов низкой плотности в гладкомышечных•клетках сосудов человека. Биохимия. 1994. Т. 59. N. 9. С. 1340-1348.

4. Bochkov V.N., Tkachuk V.A., Kuzmenko Ye.S., Borisova Yu.L., Buhler F.R., Resink T. J. Characteristics of low and' high density lipoprotein binding and 1ipoprotein-induced signaling in quiescent human vascular smooth muscle cells. Molec. Pharmacol. 1994. V. 45 P. 262-270.

5. Kuzmenko Ye.S., Bochkov V.N., Fi1ippova M.P., Tkachuk V.A., Resink T.J. Characterization of an atypical 1ipoprotein-binding polypeptide in human aortic media membranes by ligand blotting. Biochem. J. 1994 (принято к печати).

6. Tkachuk V.A., Kuzmenko Ye.S., Resink T.J., Stambolsky D.V., Bochkov V.N. An atypical low density 1ipoprotein-binding site wich may mediate 1ipoprotein-induced activation of second messenger systems. Molec. Pharmacol. 1994 (принято к печати).