Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антительные тест-системы на основе полимерных суспензий для мониторинга биополлютантов и биологически важных соединений

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Антительные тест-системы на основе полимерных суспензий для мониторинга биополлютантов и биологически важных соединений"

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВСКАЯ ИРИНА ИВАНОВНА

АНТИТЕЛЬНЫЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРНЫХ СУСПЕНЗИЙ ДЛЯ МОНИТОРИНГА БИОПОЛЛЮТАНТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Специальность: 03.00.16 экология

02.00.06 высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Учебно-научном институте физико-химических и информационных технологий Российского университета дружбы народов.

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор

Сидоренко Сергей Николаевич

кандидат химических наук Левачев Сергей Михайлович

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор

Сакварелидзе Майя Александровна

доктор биологических наук, профессор

Орлова Валентина Сергеевна

Ведущая организация:

Федеральное Государственное Унитарное предприятие Государственный Научный Центр Российской Федерации Научно-исследовательский физико-химический институт им. Л.Я. Карпова - «НИФХИ им. Л.Я. Карпова».

Защита диссертации состоится "24" марта 2005г. в часов на заседании диссертационного совета Д212.203.17 в Российском университете дружбы народов по адресу: 115093 г. Москва, Подольское шоссе, д.8/5, экологический факультет РУДН.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6

Автореферат разослан

февраля 2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Н.А. Черных

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Проблема индикации загрязнения внешней среды продуктами биологического происхождения возникла на этапах открытия возбудителей инфекционных болезней. Экологический аспект ее в начале не выходил за рамки эпидемиологии и эпизоотологии. Методологически она решалась путем выделения из объектов внешней среды самого возбудителя и последующей его идентификации.

Угроза загрязнения среды биополлютантами с развитием общества возрастала. Необходимы были специфические методы их индикации. Было показано, что серологические реакции, визуализация которых основана на эффекте агглютинации, являются наиболее удобными для проведения мониторинга окружающей среды на присутствие определенного биологического компонента в ней. Распространение получили тест-системы, работающие по принципу реакции агглютинации, в которых в качестве носителей биолигандов использовали эритроциты. Однако при их использовании трудно было выполнить основное условие: носитель должен быть инертным в серологической реакции. Такое условие не всегда может быть соблюдено, поскольку на эритроцитах имеются антигенные детерминанты, к которым в иммунных сыворотках могут присутствовать антитела.

Это обстоятельство побудило исследователей перейти на синтетические носители, где иммунологический феномен неспецифической агглютинации полностью исключается. Кроме того, использование функциональных полимерных носителей позволило расширить варианты иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер за счет ковалентного связывания функциональных групп полимера и биолиганда.

До настоящего времени не было проведено достаточно глубоких исследований фундаментального характера, позволяющих представить физико-химические процессы, протекающие на поверхности носителя, на всех этапах приготовления диагностикума и при выполнении непосредственно серологической реакции. Это в свою очередь не позволяет выдвигать четкие требования к параметрам полимерных микросфер, пригодных для создания диагностикума. В связи с этим подбор таких полимерных суспензий до настоящего времени осуществляется эмпирически.

В настоящей работе сделана попытка подойти к проблеме конструирования антительных диагностикумов, предназначенных для решения различных экологических задач, с позиций изучения состояния межфазного слоя полимерных микросфер на всех стадиях получения тест-систем, начиная с исходной суспензии.

Цель работы. Создание антительных тест-систем для мониторинга биополлютантов и Tamm-HorsfaИ протеина.

Основные задачи исследования.

1.Выбрать способ иммобилизации антител различной специфичности на поверхность полимерных микросфер.

2.0ценить изменение коллоидно-химических свойств исходных полимерных суспензий и тест-систем в процессе их создания.

3.Изучить влияние состава биолигандов на чувствительность и специфичность реакции латексной агглютинации.

Научная новизна.

• В целях решения проблемы охраны безопасности жизнедеятельности человека созданы новые тест-системы для обнаружения столбнячного и дифтерийного токсина, являющихся причиной тяжелых заболеваний, и высокочувствительная тест-система для определения Tamm-HorsfaИ протеина, позволяющая выявлять механизмы формирования уропатогенной популяции микробов из кишечного биоценоза.

Впервые прослежено изменение коллоидно-химических свойств полимерных суспензий в процессе получения тест-систем -потенциал, диаметр, распределение частиц по размерам, параметры изотерм двумерного давления 2D пленок) и показано, что качество полученных тест-систем существенно зависит от времени хранения полимерной суспензии и от чистоты биолиганда.

• Сопоставительный анализ различных способов иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер показал, что чувствительность антительных тест-систем, полученных при связывании биолигандов с полимерными микросферами через спейсор, протеин А, выше, чем при непосредственном связывании функциональных групп полимера и биолиганда.

• Установлено, что при создании тест-систем на стадии иммобилизации биолиганда необходимо использовать иммунореагенты, не содержащие примесей поверхностно- активных веществ.

• Впервые было проведено методом Ленгмюра систематическое исследование поверхностных свойств полимерных микросфер (исходных и на различных стадиях производства тест-систем), и показана их зависимость от времени хранения полимерных микросфер и чистоты биолиганда.

Практическая значимость.

1 .Составлен лабораторный регламент получения тест-систем.

2.Показано, что антительные тест-системы для определения столбнячного и дифтерийного токсинов и Tamm-Horsfall протеина обладают высокой диагностической эффективностью.

3.Сформулированы требования к полимерным суспензиям и сывороткам биолигандов для получения эффективных тест-систем.

Положения, выносимые на защиту.

1.Результат исследования коллоидно-химических свойств полимерных суспензий, полученных затравочной полимеризацией стирола,

4

стиролсульфоната натрия и акролеина, и их изменение на всех стадиях получения тест-систем и в процессе хранения.

2.Влияние способа иммобилизации на чувствительность тест-систем.

3.Зависимость чувствительности тест-систем от чистоты биопрепарата.

4.Лабораторный регламент получения тест-систем для определения Tamm-Horsfall протеина, столбнячного и дифтерийного токсина.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Научно-технической конференции "Наука и образование" (Мурманск 2002, 2004), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002" (Москва-2002), Научно-практической конференции НПО "Биомедицинские технологии" (Москва 2003), Всероссийской научной конференции по проблемам математики, информатики, физики, химии и методики преподавания естественных дисциплин (Химическая секция) (Москва, РУДН, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы. Материалы изложены на 162 страницах машинописного текста, включая 20 таблиц, 35 рисунков. Список литературы содержит 154 работы.

Материалы и методы исследования.

Объекты исследования. Мономеры - стирол, акролеин, стиролсульфонат натрия были очищены от примесей по описанным в литературе методам. ПАВ а-(карбоксиэтил)-со-

(триметилсилокси)полидиметилсилоксан - (ПДС), -НООС-СН2СН2-Si(CH3)20-[Si(CH3)20]7-Si(CH3)3 синтезирован в ИНЭОС РАН.

Додецилсульфат натрия марки «чда». Поливинилпирролидон применяли с молекулярной массой 40000. Динитрил азоизомасляной кислоты (ДАК) очищали перекристаллизацией из метанола. Персульфат калия (ПК) марки «хч». Карбодиимид фирмы "Merck". Sudan Blue 11, краситель, C.I. 61554, содержание основного вещества 98%.Sudan III, С. I. 26100, ВТУ ТСНХ 54-8661. Человеческий сывороточный альбумин (лиофилизированный), 89041631 фирмы Reanal (молекулярная масса 67 кДа, содержание активного вещества не менее 95%). Протеин А - рекомбенантный белок А, секретируемый штаммом B.Subtilis. Гидрофосфат калия марки «хч». Дигидрофосфат натрия марки «хч». Сульфат аммония марки «хч». Вода — бидистиллат. D,L-a-аланин, марки «чда». D,L-триптофан марки «чда». Глицин марки «хч». Твин-80 фирмы «Ferak Berlin». Столбнячный анатоксин-С.886. Дифтерийный анатоксин 0,1 ЛФ. Бруцеллезная сыворотка (1:12800). Сальмонеллезная сыворотка (1:6400). Лептоспирозная сыворотка (титр в РМА 1:100000). Лошадиные противостолбнячные сыворотки: С704К4197 3000МЕ; С150К3544 3000МЕ; С818К163 3000МЕ; С482К2590 3000МЕ; С718К375 ЗОООМЕ; С698К4075 ЗОООМЕ Лошадиная противодифтерийная сыворотка 3000ME. Аффинноочищенные антитела противодифтерийной сыворотки

500МЕ. Противостолбнячный иммуноглобулин человека 250МЕ. Сыворотка, содержащая антитела к Tamm-Horstfall протеину, полученная по методу, предложенному Кравцовым Э.Г. Tamm-Horstfall протеин.

Полимерные суспензии синтезировали в реакторе при 70°С. Полимеризацию проводили до полной конверсии полимера.

Размер и ^-потенциал частиц полимерной суспензии определяли фотон-корреляционной спектроскопией на приборе «Malvern» (Англия).

Устойчивость частиц в различных средах и их индивидуальность определяли с помощью светового микроскопа, либо по осаждению в специальных планшетах (как это принято при работе с диагностическими наборами).

Реакция латексной агглютинации (РЛА). Для постановки РЛА использовали 96-луночные микропланшеты. Во все лунки планшета вносили 0,1% раствор альбумина в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (рН=7,2). Антиген титровали в микропланшете с шагом 2 по 25 мкл, оставляя последнюю лунку ряда только с раствором альбумина как контроль. Далее во все лунки добавляли по 25 мкл 0,1%-ной полимерной суспензии (частицы которой иммобилизированы антителами). Планшет встряхивали и оставляли при комнатной температуре. Реакцию учитывали через 12 часов. При положительной реакции на дне лунки формировался окрашенный агглютинат в виде перевернутого зонтика, при отрицательной - частицы оседали, собираясь в плотный осадок в виде точки.

Иммобилизация протеина А на поверхность полимерных микросфер.

Раствор протеина A S. Aureus (штамма cowan 1) различной концентрации готовили в ФСБ. Полимерную суспензию разводили ФСБ до концентрации 0,5%. Смешивали равные объемы 0,5% полимерной суспензии и раствора белка А. Полученную суспензию инкубировали в течение 12 часов при температуре 37,2°С. От избытка белка полимерные микросферы отмывали ФСБ, трижды центрифугируя суспензию при 4000об/мин по 15 мин. Полимерную суспензию разводили ФСБ до 0,1% по сухому остатку.

Иммобилизация антител на поверхность полимерных микросфер через спсйсор- протеин А. Сенсибилизирующую дозу иммунной сыворотки определяли по предельному ее разведению, при котором не происходит спонтанной агрегации частиц (субагглютинационная единица). К определенному объему 0,1% полимерной суспензии, частицы которой предварительно были модифицированы протеином А, добавляли равный объем сыворотки в субагглютинационном титре и систему выдерживали в течении 2 часов при 37°С. Через два часа модифицированные полимерные микросферы отмывали от неприсоединившихся к ним сывороточным антителам, центрифугируя раствор дважды по 15 мин при 4000 об/мин, и полимерную суспензию разводили ФСБ до концентрации - 0,1% по сухому веществу.

Метод весов Ленгмюра. Для формирования и исследования 2D пленок в работе использовали ванну Ленгмюра кругового типа. Прибор позволяет регистрировать изменение поверхностного натяжения в процессе изменения площади пленки вещества, нанесенного на поверхность раздела фаз жидкость/воздух.

Измерение двумерного давления осуществляли методом Вильгельми с помощью рифленой пластинки из вольфрама периметром 10 см, связанной с механотроном. Скорость движения барьера составляла 0,0143 рад/с. Чувствительность прибора при комнатной температуре - 0,01 мН/м. В экспериментальной работе получали изотермы двумерного давления 2Б пленок дважды в независимых опытах. Исследуемые системы отличались высокой степенью воспроизведения результатов эксперимента.

Результаты исследований и их обсуждение.

Была синтезирована полимерная суспензия затравочной полимеризацией стирола стиролсульфоната натрия (StSNa) и акролеина (Акт.) на

полистирольных затравочных частицах, в присутствии поливинилпирролидона (ПВП) в качестве стерического стабилизатора, система 1.

В качестве биолигандов были выбраны лептоспирозная, сальмонеллезная и бруцеллезная кроличьи сыворотки и противостолбнячный у-глобулин человека. Так как все иммунопрепараты были получены иной серии, чем в ранее использованных работах, то на всех этапах создания тест-систем возникла необходимость находить оптимальные концентрации белков, иммобилизируемых на поверхность полимерных микросфер. Иммобилизацию проводили за счет ковалентного связывания функциональных групп полимера и биолиганда, а также через предварительно ковалентно иммобилизованный протеин А, специфически взаимодействующий с Fc-фрагментом IgG определенного строения. Рассмотрим свойства каждой полученной тест-системы.

Тест-систему для определения лептоспироза, полученную из полимерных микросфер, в которых биолиганд был иммобилизован через протеин А проверяли в реакции латексной агглютинации с лептоспирозным антигеном. В качестве контроля была реакция латексной агглютинации со средой, в которой был выращен микроб. В обоих случаях титр реакции оказался одинаковым, т. е. неспецифические IgG, содержащиеся в среде, реагировали с протеином А, а спонтанная агрегация частиц происходила из-за избытка у-глобулина на поверхности протеина А.

При определении сальмонеллезного и бруцеллезного антигенов и столбнячного анатоксина не удавалось добиться высокой чувствительности созданного диагностикума при удовлетворительном контроле реакции. Если для иммобилизации была взята разбавленная сыворотка, то чувствительность получаемой тест-системы была низкой, и реакция латексной агглютинации не

наблюдалась. При увеличении концентрации сыворотки частицы агглютинировали, т. е. невозможно было получить контрольную точку.

Совокупность полученных результатов потребовала постановки систематических исследований по изучению влияния способа проведения полимеризации (природа красителя, введение ПАВ и красителя в реакционную систему, концентрация акролеина) и времени хранения полимерных суспензий, их коллоидно-химических свойств, которые играют определяющую роль в устойчивости полимерных микросфер при создании тест-систем. Были синтезированы вновь по этому же рецепту полимерные суспензии, отличающиеся друг от друга способом добавления красителя в реакционную систему (1, 1.1), природой красителя (1, 1.3, 1.4), концентрацией акролеина (1, 1.4, 1.7), временем хранения (1, 1.1, 1.3, 1,5) и природой ПАВ (1, 1.8) (табл.1).

Таблица 1

Характеристики полимерных суспензий.

Шифр образца Состав Краситель Время хранения, сут. d,MKM

1 ПВШм.ч.Акг.Зм.ч. StSNa3M.4. Sudan Blue II,окрашен после введения Акт. 15 0,999 -20,1

1.1 ПВШм.ч.Акг.Зм.ч. StSNa3M.4. Sudan Blue II,окрашен до введения Акт. 15 0,876 -22,6

1.2 ПВШм.ч.Акг.Зм.ч. StSNa3M.4. Sudan Blue II,окрашен после введения Акт. 40 0,963 -17,1

1.3 ПВШм.ч.Акг.Зм.ч. StSNa3M.4. Sudan III розовый,окрашен после введения Акт. 60 0,884 -23,2

1.4 ПВШм.ч.Акг.бм.ч. StSNa3M.4. окрашен после введения Акт. флюоресцентным красителем 10 0,898 -19,9

1.5 ПВШм.ч.Акг.Зм.ч. StSNa3M.4. Sudan Blue II, окрашен после введения Акт. Более 180 1,275 -16,8

1.6 ПВШм.ч.Акг.Зм.ч. StSNa3M.4. Не окрашен 10 0,885 -27,4

1.7 ПВШм.ч. Акт. 12м.ч. StSNa З.м.ч. Sudan Blue II, окрашен после введения Акт 10 0,971 -24,2

1.8 St Полидиметил-силоксан (ПДС) Sudan Blue II, окрашен после введения ПДС 10 0,769 -27,7

ПВП- поливинилпирролидон, Акт. - акролеин, StSNa- стиролсульфонат натрия, St-стирол.

Кроме того, для оценки влияния концентрации специфического лиганда на чувствительность реакции латексной агглютинации, были взяты различные серии производственных сывороток. Частицы всех полимерных суспензий были использованы в качестве носителей биолигандов. Для разных серий сыворотки были получены тест-системы для определения соответствующего антигена.

Рассмотрим особенности получения и поведения в реакции латексной агглютинации каждой полученной тест-системы.

При создании тест-системы к столбнячному анатоксину использовали производственные сыворотки, очищенные методом «диаферм», суть которого состоит в том, что нативная сыворотка подвергается частичному протеализу пепсином и последующему выделению спиртовым методом активного компонента в виде Fab-фрагментов IgG. Такой способ очистки сыворотки исключает возможность иммобилизации антител через белок А, но оставляет возможность прямой иммобилизации биолиганда к полимерному носителю через активные группы, содержащиеся в межфазном слое полимерных частиц.

Таблица 2

Чувствительность тест-систем при определении столбнячного анатоксина в реакции латексной агглютинации.

\ Противо-\ столбняч-\ нал \ сьгоо- Шифр\ образца \ С 718 К375 (350М Е) С 818 К163 (350МЕ) С 482 К2590 (350МЕ) С 698 К4075 (350МЕ) С 704 К4197 (350МЕ) С 150 КЗ 544 (350МЕ)

1 0 578нг\мл 36нг\мл 36нг\мл 1156нг\мл 289нг\мл

1.2 0 144.5нг\мл 578нг\мл 0 0 0

1.3 0 0 18нг\мл 72нг\мл 2312нг\мл 36нг\мл

1.4 0 0 289нг\мл 578нг\мл 2312нг\мл 18нг\мл

1.5 0 0 2312нг\мл 0 0 0

1.6 0 144.5нг\мл 18нг\мл 144.5нг\мл 578яг\мл 289нг\мл

Как следует из данных, приведенных в табл. 2, тест-системы, полученные с использованием полимерных микросфер, содержащих альдегидные группы на поверхности, и иммунологического препарата серии 482 определяли столбнячный анатоксин. При этом чувствительность полученных систем позволяла во всех случаях определять искомый белок (столбнячный анатоксин) в пределах 18-2312нг/мл. Тест-системы, полученные с использованием сывороток серий 818, 698, 704 и 150 определяли столбнячный анатоксин только в некоторых случаях, а тест-система, полученная из тех же полимерных микросфер с использованием иммунологического препарата серии 718, вообще не работала. Было сделано

предположение о том, что в иммунной сыворотке содержатся примеси неспецифических белков.

В связи с этим были поставлены опыты по иммобилизации аффинно-очищенного Fab-фрагмента антител к дифтерийному анатоксину.

Результаты реакции латексной агглютинации с тест-системами, полученными с использованием двух биолигандов (аффинно-очищенных Fab-фрагментов и дифтерийной сыворотки, очищенной методом «диаферм») показали, что в случае иммобилизации очищенных Fab-фрагментов на полимерные микросферы, тест-системы оказываются более чувствительными, чем тест-системы, полученные при иммобилизации белков из сыворотки, очищенной методом «диаферм».

Эта закономерность подтверждается при использовании всех используемых полимерных микросфер (1.7, 1.8).

Далее необходимо было убедиться в том, что агглютинация полимерных частиц происходит за счет взаимодействия иммобилизированных на их поверхности антител с антигеном. Для этого была использована следующая схема опыта: в двух рядах планшета раститровывали анатоксин; в первый контрольный ряд во все лунки добавляли равное количество буфера, во второй - такой же объем сыворотки, разведенной до 3 ME, после чего во все лунки вносили соответствующий диагностикум. Специфические антитела, содержащиеся в сыворотке, взаимодействовали с анатоксином, и если агглютинация была обусловлена специфическим взаимодействием тест-системы с антигеном, то в опытном ряду она должна отсутствовать или идти до меньшего титра, чем в контрольном. Было показано, что столбнячный анатоксин полностью связывается со специфическими антителами, активность которых составляла ЗМЕ. Ни один из полученных диагностикумов после специфического связывания антигена с антителом не агглютинировал. Это свидетельствовало о том, что реакция латексной агглютинации с тест-системами является специфической.

Аналогичные результаты были получены при контролировании тест-систем на дифтерийный токсин.

Для подтверждения того, что иммобилизация биолиганда происходит за счет ковалентного связывания его функциональных групп с функциональными группами полимера на поверхности носителя, в суспензию полимерных микросфер добавляли растворы аминокислот: аланина, триптофана и глицина. В этом случае альдегидные группы полимерных цепей взаимодействовали с аминокислотами, и последующая ковалентная иммобилизация белка была невозможной. Действительно, добавление любой из указанных аминокислот в полимерные суспензии делала их инертными в отношении иммобилизации антител.

Кроме ковалентного связывания белка, возможна и его физическая адсорбция на поверхность полимерных микросфер. В какой степени этот процесс влияет на активность диагностической системы, можно было решить, если десорбировать несвязанные ковалентно антитела в среду. С этой целью было использовано поверхностно-активное вещество- твин 80. Получали тест-

системы из частиц полимерной суспензии (1.3) и противостолбнячной сыворотки серии 482 разной активности (от 750 до 187,5МЕ). Тест-системы определяли столбнячный анатоксин в концентрациях от 144,5 до 18нг/мл. Наиболее активным оказался диагностикум, при получении которого использовалась противостолбнячная сыворотка с активностью 350МЕ, в сыворотке с активностью 750МЕ, по-видимому, концентрация специфического белка была избыточной, а в сыворотке с активностью- 187,5МЕ -недостаточной. После добавления твин-80 к тест-системам, для получения которых применяли сыворотку с активностью, отличной от оптимальной (350МЕ), чувствительность тест-систем возрастала (~в 4раза). В то же время тест-система, полученная с использованием иммунной сыворотки с оптимальной (350МЕ) активностью, после добавления твин-80 не изменила свою чувствительность.

Таким образом, получена специфичная тест-система на столбнячный и дифтерийный анатоксин, которая характеризуется высоким титром реакции латексной агглютинации. Она состоит из полимерных микросфер с альдегидными или карбоксильными группами на их поверхности, ковалентно связанными с амино группами биолиганда, очищенного методом «диаферм».

По той же схеме была получена тест-система для определения Татт-Ног$1Ы1 протеина. Отличие состояло лишь в том, что нативные антитела к Татт-Ноге1аИ протеину не выделяли из сыворотки. Сыворотка представляла собой сложную систему белков, среди которых альбумин составляет 52-55%, мукопротеиды-5%, (3-липопротеиды 5%, металлопротеиды-3%, а глобулины-13- 17%.

Полученные диагностикумы при хранении в присутствии азида натрия не изменяли активность в течение трех месяцев (срок наблюдения). Они были высокоспецифичны, однако не могли быть использованы для индикации тех количеств Татт-Ноге1Ы1 протеина, которые реально могут присутствовать в образцах мочи. Это может быть обусловлено низкой концентрацией биолиганда на поверхности полимерных микросфер, по-видимому, из-за иммобилизации на поверхность полимерных микросфер и неспецифических белков. Если принять, что суточная секреция этого белка составляет 100-200мкг, а физиологическое выделение мочи колеблется в пределах 1,5- 2л, то вероятная концентрация Татт-Ноге1Ы1 протеина в мл мочи составляет 70-140нг/мл. Эта величина и определяет предел чувствительности индикаторной системы. Для сравнения чувствительность описанных систем составила 3250нг/мл.

Согласно литературным данным более чувствительные тест-системы можно получить при иммобилизации антител через спейсор, в качестве которого рекомендуют использовать протеин А, аффинно взаимодействующий с Бс-фрагментом иммуноглобулина в.

Аффинное связывание иммуноглобулина в со спейсором позволяло исключить операцию выделения у-глобулиновой фракции из нативной сыворотки. Однако усложнение конструкции было чревато потерей агрегативной устойчивости частиц. Действительно, было не ясно, как

изменится межфазный слой полимерных микросфер после иммобилизации протеина А, и в какой степени повлияет на него включение дополнительного иммуноглобулина, т. е. решалась задача со многими неизвестными.

Приступая к реализации создания такого типа антительного диагностикума, вначале необходимо было на поверхность полимерных микросфер ковалентно иммобилизировать протеин А. Использовали полимерные микросферы, содержащие на поверхности альдегидные группы (1.7) и карбоксильные группы (1.8). Было установлено, что при иммобилизации спейсора (протеина А) агрегативная устойчивость суспензии несколько снижается. Если до иммобилизации частицы не агрегировались в буфере, то после ковалентной иммобилизации биолиганда в растворе буфера они теряли агрегативную устойчивость. Для стабилизации коньюгата «полимерная микросфера- протеин А» был добавлен альбумин, концентрация которого составила 0,78мг/мл. Полученный коньюгат агглютинировал сыворотку кролика, плазму крови человека и афинноочищенный у-глобулин человека (табл. 3 ).

Таблица 3

Титр различных сывороток в реакции латексной агглютинации.

Концентрация раствора протеина А, мг/мл Титр реакции

С плазмой человеческой крови С кроличьей противо-лептоспирозной сывороткой С у-глобулиновой фракцией человеческой сыворотки

1 1:1024 1 512 I 409600

0,5 1:256 1 512 1 204800

0,25 1:256 1 256 1 204800

0,125 1:1024 1 128 1 409600

0,06 1:128 1 128 1 102400

0,03 1:128 1 128 1 102400

0(контроль) 0 0 0

Из данных табл. 3 следует, что предельное разведение указанных биолигандов, при котором происходила агглютинация частиц «полимерная микросфера- протеин А» зависит от количества протеина А, иммобилизованного на поверхности частиц. Так, при использовании в качестве биолиганда белков из плазмы крови человека оптимальная концентрация протеина А составляла 0,125мг/мл в разведении 1:1024, из фракции у-глобулина человека- 1:409600, а белков из сыворотки кролика-1:512 при оптимальной концентрации протеина А 0,5мг/мл. Таким образом, для иммобилизации антител человека и кролика необходимо было использовать коньюгат «полимерная микросфера- протеин А» с различной концентрацией протеина А. При этом, необходимо было выбрать такое разведение биолиганда, при котором коньюгат прекращал с ним

агглютинировать (субагглютинационная доза). Выбор оптимальных условий иммобилизации антител, специфичных к Tamm-HorsfaИ протеину, был сделан на основании данных, приведенных в табл. 4.

Оптимальная концентрация протеина А при получении коньюгата «полимерная микросфера- протеин А» при использовании полимерных микросфер, содержащих на поверхности альдегидные группы, составила 0,05мг/мл, а для полимерных микросфер, содержащих на поверхности карбоксильные группы- 0,025мг/мл, т. е. активность коньюгата «полимерная микросфера - протеин А» определяется как концентрацией протеина А, так и природой функциональных групп на поверхности полимерных микросфер.

Таблица 4.

Зависимость агрегативной устойчивости конъюгатов «полимерная микросфера-протеин А» от концентрации протеина А при введении сыворотки, содержащей антитела к Tamm-Horsfall протеину

Концентрация раствора протеина А, мг/мл Титр сыворотки в реакции

Конъюгат, полученный из полимерных микросфер с альдегидными группами на поверхности Конъюгат, полученный из полимерных микросфер с карбоксильными группами на поверхности

0,1 1:65536 1:32768

0,05 1:131072 1:8192

0,025 1:4096 1:65536

0,001 1:2048 1:16384

0,00075 1:512 1:8192

0,0005 1:512 1:8

0,00035 1:512 1:16

0,00025 1:1024 1:16

0,000175 1:512 1:8

0,000125 1:1024 1:8

В работе было найдено предельное разведение используемой сыворотки, при котором получаемый диагностикум агрегативно устойчив и характеризуется высокой чувствительностью в реакции латексной агглютинации (определяет 7-35нг/мл специфического белка).

Таким образом, получена тест-система для определения Tamm-Horsfall протеина. Она состоит из полимерных микросфер, содержащих на поверхности альдегидные или карбоксильные групп, к которым через ковалентно присоединенный спейсор - протеин А иммобилизированы биолиганды. В качестве биолиганда должны быть использованы сыворотки с высокой концентрацией специфических антител.

Свойства полученной системы были многократно воспроизводимы и через 6 месяцев хранения при температуре 5°С в присутствии азида натрия не изменились. Так как полученная система была проверена в реальных

условиях, она может быть рекомендована к применению для определения Ташт-НогеМ протеина в биологических жидкостях.

Сроки хранения тест-систем и примеси, присутствующие в исследуемых биопрепаратах, существенно влияют на чувствительность реакции латексной агглютинации.

Коллоидно-химические свойства полимерных суспензий на всех стадиях получения тест-систем изучали для выявления причин, приводящих к спонтанной агрегации частиц, и влияния состава биолигандов на чувствительность реакции латексной агглютинации.

Для выявления различных факторов, влияющих на гидрофильно-гидрофобные свойства поверхности полимерных микросфер, таких как введение поверхностных групп (лигандов), время хранения, влияние красителей и др., наиболее информативным является метод Ленгмюра. Анализ значений параметров изотерм двумерного давления 2Б пленок, полученных из полимерных суспензий, позволяет получить численные значения двумерной поверхностной активности полимерных микросфер, эффективного модуля упругости тонкой пленки. Другие традиционные методы, позволяющие оценить свойства поверхности полимерных микросфер, мало пригодны для решения задачи поиска связи между свойствами поверхности раздела фаз в полимерной суспензии и качеством получаемой тест- системы.

2Б пленки получают путем нанесения на энергетически однородную поверхность раздела воздух/вода или водный раствор какого-либо компонента/воздух определенного количества вещества в виде суспензии или раствора, способного распространяться по всей имеющейся площади ванны Ленгмюра. После образования стабильной 2Б пленки измеряют изменение двумерного давления, ж [мН/м], при сжатии 2Б пленки движущимся барьером с постоянной скоростью как разность поверхностных натяжений субстрата (воды или раствора) и нанесенной 2Б пленки, полученной из полимерной суспензии. Таким образом, получают изотермы двумерного давления в координатах я - А, где А - площадь 2Б пленки.

Природа агрегативной устойчивости и особенности протекания коагуляции полимерных микросфер главным образом зависят от молекулярного строения и физико-химических свойств поверхности частиц суспензий. Безусловно, что в рассматриваемых системах определяющими вкладами в устойчивость являются собственный поверхностный заряд частиц полимерных суспензий и структурно-механический барьер по Ребиндеру.

В табл.5 приведены величины максимальной площади поверхности, Ао, приходящейся на одну частицу, при которой происходит регистрация изменения двумерного давления, для частиц исходных полимерных суспензий.

Эффективность снижения поверхностного натяжения определяется как поверхностно-активными свойствами индивидуальных полимерных частиц, так и свойствами структуры образующейся 2Б пленки.

Сравнивая полученные результаты с величиной максимального поперечного сечения сферы полимерной частицы, равной в среднем 4.5 мкм2,

можно отметить, что рост двумерного давления начинается при высокой степени заполненности поверхности вода/воздух полимерными частицами.

Значения Ао для систем 1.1, 1.4 имеют близкие значения и отличаются для систем 1, 1.2, 1.3, 1.6. Такое изменение параметра Д в зависимости от предыстории образца может быть объяснено изменением степени агрегации частиц в разреженной 2Б пленке. При увеличении степени агрегации происходит уменьшение относительного числа поверхностно-активных объектов на единицу площади. Значительное снижение значения параметра Д наблюдается для системы 1.5, анализируемой после хранения полимерной суспензии более шести месяцев, оно составило 4.0+0.1 мкм2/част. Следовательно, во избежание дополнительной агрегации частиц необходимо использовать полимерные суспензии со сроком хранения не более шести месяцев после проведения их синтеза.

Таблица 5

Значение параметров изотерм двумерного давления 2Б пленок, полученных из исходных полимерных суспензий

Шифр образца Ао, мкм2 част мкм2 част ^кол, мН/м у Ю-12 мДж/част е, мН/м Н'10_у, мДж/част.

1 5,8 0,57 31,79 102,50 21,50 3,42

1.1 5,0 0,57 31,79 113,80 20,00 2,56

1.2 8,4 0,57 31,79 71,43 18,88 2,97

1.3 5,5 0,57 31,79 51,65 11,99 2,84

1.4 4,9 0,57 28,20 74,25 18,84 2,89

1.5 4,0 0,57 25,13 51,6 15,5 0,00

1.6 5,85 0,57 33,08 94,67 21,56 2,38

Значения Ао для неокрашенных частиц, образец 1.6, и полученных в присутствии красителей различной природы (1, 1.3, 1.4), изменяются незначительно. Изменение последовательности введения мономера, красителя в реакционную смесь при затравочной полимеризации также не приводит к значительным изменениям величины Д„ система 1.1.

Величина двумерного давления в точке коллапса (тскол) характеризует компенсацию межмолекулярных взаимодействий полимерных частиц на границе вода/воздух, обеспечиваемую наличием 2Б пленки. Для систем 1, 1.1, 1.2, 1.3 значение л коллапса равно 31.79+0.2 мН/м. Различия в свойствах

индивидуальных частиц, по-видимому, в этих системах нивелируются при формировании соответствующих структур 2Б пленок.

Наибольшее отличие в величине % коллапса и в этом случае имеет система, 1.5, которая хранилась длительное время. Снижение значения я коллапса до 28.20+0.2 мН/м для пленки, полученной из полимерных микросфер, содержащих флуоресцентный краситель, объясняется его химическим строением, система 1.4. Увеличение числа гидрофобных групп на поверхности полимерной частицы уменьшает эффективность снижения поверхностного натяжения. Аналогичная картина наблюдается для неокрашенной полимерной суспензии (1.6). Отсутствие в поверхностном слое частиц красителя, имеющего гидрофобную структуру, приводит к росту значений параметра коллапса, следовательно, повышается роль частиц в качестве поверхностно- активных веществ на границе раздела фаз вода/воздух.

Значение величины энергии взаимодействия частиц (Н) в коллапсированной 2Б пленке, образованной исследуемыми суспензиями, для системы 1.5 не определено, что, по-видимому, объясняется тем, что длительное хранение полимерной суспензии приводит к значительным изменениям поверхностных свойств полимерных частиц. Наибольшее значение энергии взаимодействия полимерных частиц наблюдается в системе 1. Можно отметить, что устойчивость этой суспензии к коагуляции меньше, чем у других исследуемых систем.

Значение эффективного модуля упругости 2Б пленки (е) при малых я для системы 1.6 составляет 21,56 мН/м. Введение красителя в системах 1, 1.1, 1.2, 1.4 не привело к значительным изменениям этой величины. Более низкое значение эффективного модуля упругости при малых л, равное 15,5 мН/м, имеет система с длительным временем хранения (1.5). Минимальное значение этой величины составило 11,99 мН/м для системы 1.3.

Параметры изотерм 2Б пленок, полученных из тест-систем, в которых иммобилизацию иммуноглобулинов на поверхность полимерных микросфер проводили через протеин А, приведены в табл. 6.

Иммобилизация белка на поверхность полимерных частиц привела к изменению параметров изотермы двумерного давления. Максимальная площадь на молекулу увеличилась до 6.2+0.1 мкм2/част, что свидетельствует о снижении агрегации частиц в 2Б пленке. При этом снижение значения я коллапса по сравнению со значением, наблюдаемым в 2Б пленке, полученной из исходной полимерной суспензии, составило 0.25 мН/м. Такое небольшое изменение я коллапса показывает, что ковалентная иммобилизация протеина А на поверхность полимерных микросфер приводит к незначительному увеличению ее гидрофильности за счет экранирования неполярных групп полимера молекулой белка.

Таблица 6

Значения параметров изотерм двумерного давления 2D пленок, полученных из полимерной суспензии 1, на разных этапах получения тест-систем. (Т=293К, рН=4.9)

Тест-система Ао, 2 мкм част мкм2 част Якол, мН/м ГШ"12 мДж/част Ё мН/м н-юЛ мДж/моль

1 5,8 0,57 31,79 102,5 21,5 3,42

1+пр.А 6,2 0,57 31,54 113,8 20 1,31

1+прА+1§С пр/ст чел50МЕ 4,7 0,57 27,95 71,43 18,88 0,864

НпрА+ДО пр/ст чел 25МЕ 4,7 0,57 27,44 74,25 18,84 0,53

НпрА+ДО пр/ст чел 12,5МЕ 3,9 0,57 24,87 51,65 17,99 0,41

прА- протеин Л; IgG- иммуноглобулин G; пр/ст- противостолбнячная человеческая сыворотка.

IgG иммобилизировали на поверхность частиц из растворов с различной концентрацией антител. Из данных табл. 6 видно, что увеличение концентрации антител в растворе приводит к росту значения величины и коллапса. При низкой концентрации антител связывание с протеином А приводит к получению системы с наибольшей гидрофильностью.

Значение величины эффективной двумерной активности полимерной суспензии (у), содержащей на поверхности частиц протеин А, увеличивается по сравнению с значением этой величины для исходной полимерной суспензии. А при аффинном связывании белка-IgG с протеином А, значения эффективной двумерной активности значительно снижаются, закономерно уменьшаясь в соответствии с уменьшением концентрации иммуноглобулина.

Соответственно росту гидрофильности полученных частиц происходит изменение значения величины энергии взаимодействия частиц (Н) в коллапсированном слое. Увеличение гидрофильности приводит к снижению значений энергии взаимодействия частиц, что, вероятно, связано и с ростом заряда на поверхности модифицированной полимерной сферы. потенциал для исходной полимерной суспензии составлял -31.0+0.5 мВ, частиц, содержащих протеин А -34.0+0.5 мВ. Иммобилизация приводит к дальнейшему увеличению значения ^-потенциала до -42.4+0.5 мВ.

Значение эффективного модуля упругости при малых значениях для исходной системы составляет 21,5мН/м, при иммобилизации на полимерные микросферы протеина А значение этой величины уменьшается до

20мН/м, а при иммобилизации IgG значение эффективного модуля упругости снижается до 18,88мН/м, закономерно уменьшаясь до 17,99мН/м, в соответствие с уменьшением концентрации IgG.

В табл. 7 представлены значения параметров изотерм двумерного давления 2D пленок, полученных из тест-систем для диагностирования столбнячного анатоксина. В качестве биолиганда применяли противостолбнячную лошадиную сыворотку (серия С482 К4075). В данной серии экспериментов Fab-фрагмент иммуноглобулина G иммобилизировали непосредственно на поверхность полимерных частиц без использования спейсора - протеина А.

Таблица 7

Значения параметров изотерм двумерного давления 2D пленок, полученных из тест-систем, полученных при иммобилизации на поверхность полимерных микросфер РаЬ-фрагментов в различной концентрации

(Т=293К, рН=4,9)

Тест-система A0-10"Z1 мкм^/г с . -1П"21 ^rrnn 1и , мкм^/г Якол, мН/м н-ю-30, мДж/моль у Ю-12 мДж/г е мН/м

1.2+сыв.пр/ст 750 ME 80,1 5,45 35,89 0,238 2182 19,83

1.2+сыв.пр/ст 375 ME 75,1 5,45 36,67 0,258 1955 19,45

1.2 +сыв.пр/ст 187,5МБ 134,6 5,45 34,36 0,509 2545 19,30

1.2+сыв.пр/ст 93,75МБ 176,0 5,45 38,46 0,232 2941 19,22

1.2+сыв.пр/ст 46,9 ME 101,8 5,45 42,56 0,198 2273 19,50

1.2+сыв.пр/ст 23,4МЕ 68,9 5,45 35,89 0,205 2227 19,70

1.2+сыв.пр/ст 11,7 МБ 64,9 5,45 36,67 0,204 2042 19,93

При иммобилизации Fab фрагмента IgG на поверхность полимерных частиц на порядок уменьшается необходимое количество полимерной суспензии для достижения коллапса 2D пленки. Такое поведение исследуемого образца предполагает наличие в нем высоко поверхностно-активного компонента, который десорбировался с поверхности полимерной частицы при нанесении на межфазную границу вода/воздух. В паспорте иммунопрепарата не приводятся сведения о содержании в нем поверхностно-активных веществ. При выделении, разделении данного типа препарата на стадии осаждения IgG из плазмы крови спиртовым раствором происходит образование белок-липидных комплексов. Таким образом, полученный препарат может содержать неконтролируемое количество липидов или липопротеиновых комплексов.

При формировании 2D пленок на границе вода/воздух образуются смешанные 2D пленки, построенные из полимерных частиц и других ПАВ, содержащихся в сыворотке.

Значения величины А0 экстремальным образом зависят от концентрации раствора иммунологического препарата. Изменение его концентрации может приводить к образованию адсорбционных слоев различного строения, и распределение каждого из ПАВ между слоем и объемом водной фазы в таких условиях может меняться. Часть из молекул, находящихся на поверхности полимерной частицы, может связываться ковалентно с функциональными группами полимера. Другая часть удерживается на поверхности за счет гидрофобных взаимодействий. При попадании такой модифицированной частицы на межфазную границу вода/воздух часть молекул, не имеющих ковалентную связь с поверхностью полимера, может десорбироваться и располагаться самостоятельно на поверхности вода/воздух. Это объясняет экстремальный вид зависимости Ао от концентрации иммунологического препарата.

Зависимость коллапса от концентрации иммунологического препарата имеет также экстремальный вид.

В случае использования образца серии С482 К2590 наблюдается гидрофобизация поверхности частиц при всех исследованных его концентрациях. Наибольший рост я коллапса составил 11 мН/м. Максимальное значение к не совпадает с максимумом на зависимости Ао от концентрации исследуемого препарата.

Зависимость значений величины энергии взаимодействия полимерных частиц в коллапсированном слое (Н) от концентрации сыворотки, использованной для модификации поверхности частиц, имеет также экстремальный вид. Максимальное значение энергии взаимодействия не совпадает с положением максимумов для Ао и я.

Зависимость значений величины эффективной двумерной активности (у) от концентрации иммунологического препарата, иммобилизированного на полимерные микросферы, также имеет экстремальный вид. Максимальное значение эффективной двумерной активности получено для 2D пленки, состоящей из полимерных микросфер, содержащих Fab-фрагмент в количестве 93,75МЕ, что совпадает с максимальным значением Ао в этой же системе.

Значительного изменения значений эффективного модуля упругости 2D пленки (е) при малых значениях п при изменении содержания Fab-фрагмента на поверхности полимерных микросфер не наблюдалось. Среднее значение этой величины составляет 19,6мН/м.

Выводы

1. Созданы новые антительные тест-системы для мониторинга столбнячного и дифтерийного токсинов для экспресс-контроля на качественном и количественном уровнях микробиологического состояния микробной популяции в экосистемах, обсемененности воздушной среды жилых и рабочих помещений токсиногенными штаммами С. &рЬШепае.

2. Создана высокочувствительная тест-система для определения Татт-НогеШ протеина, позволяющая выявлять механизмы формирования уропатогенной популяции микробов из кишечного биоценоза.

3. Систематический анализ изменения коллоидно-химических свойств полимерных суспензий в процессе получения тест-систем высокого качества показал, что необходимо обращать внимание как на срок хранения полимерных суспензий, так и на состав биолиганда.

4. Показано, что свойства полимерных микросфер практически не зависят от порядка введения компонентов в процессе их синтеза, но существенно меняются в процессе хранения из-за изменения строения их межфазного адсорбционного слоя.

5. Установлено, что присутствие поверхностно- активных примесей в биолиганде не позволяет получить высокочувствительные тест-системы из-за недостаточной концентрации специфического белка на поверхности полимерных микросфер.

6. Сопоставительный анализ иммобилизации антител к Ташт-НокГаИ протеину на поверхность полимерных микросфер показал, что чувствительность тест-систем, полученных при связывании биолигандов с полимерными микросферами через протеин А, выше, чем при непосредственном связывании функциональных групп полимера и биолиганда. Полученная по первому варианту тест-система по чувствительности позволяет определять искомый белок на уровне физиологических норм.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Григорьевская И.И.. Станишевский Я.М. Тонкие пленки латексов полистирола, модифицированных сывороточным альбумином человека // Тезисы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002" - Москва-2002-С.-245.

2. Izmailova V.N., Grizkova I.A., Yampolskaya G.P., Harlov A.E., Shvedov E.S., Grigorievskava I.I, Stanishevskiy Ya.M., Grigorieva A.V., Turygin D.S. // Periodic colloidal structures in thin films of latexes, modified by proteins. XII INTERNETIONAL CONFERENCE SURFACE FORCES. Zvenigorod, 2002. P.101.

3. Станишевский Я.М., Лобанов А.Н., Григорьевская И.И., Грицкова И.А., Прокопов Н.И. Создание антительной диагностической тест-системы на лептоспироз // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. "Наука и образование - 2002" Тезисы докладов - Мурманск 2002.-С.-543-544.

4. Измайлова В.Н., Григорьевская И.И., Станишевский Я.М. Тонкие пленки латексов полистирола, модифицированных сывороточным альбумином человека // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. "Наука и образование - 2002" Тезисы докладов - Мурманск 2002.-С.-538.

5. Лобанов А.Н., Станишевский Я.М., Кравцов Э.Г., Григорьевская И.И., Прокопов Н.И. Способ получения антительного диагностикума на столбнячный анатоксин // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. "Наука и образование - 2002" Тезисы докладов - Мурманск 2002.-С.-541-542.

6. Izmailova V.N., Levachev S. M., Yampolskaya G.P., Pelekh V.V., Grigorievskaya I.I. // Rheological parameters of Serum Albumin Interfacial Lauers. 21 СИМПОЗИУМ ПО РЕОЛОГИИ. Тезисы докладов -Осташков 2002.-С.-50.

7. Станишевский Я.М., Скопинцев В.Б., Кравцов Э.Г., Григорьевская И.И., Быков В.А., Грицкова И.А Фагоцитирование полимерных микросфер, иммобилизированных биолигандами, лейкоцитами периферической крови у больных с острым панкреатитом.//Клиническая лабораторная диагностика №10, 2003. С-44-47.

8. Станишевский Я.М., Лобанов А.Н., Грицкова И.А., Кравцов Э.Г., Григорьевская И.И. Создание антительных тест-систем заданной специфичности.// Биомедицинские технологии. Москва-2003.-С.-209-218.

9. Грицкова И.А, Лобанов АН., Станишевский Я.М., Прокопов Н..И., Кравцов Э.Г., Волина Е.Г., Григорьевская И.И. Получение антительных диагностических тест-систем заданной специфичности. //БИОТЕХНОЛОГИЯ теоретический и научно-практических журнал. -Москва- 2003.- Вып.2.-С 81-85.

10. Станишевский Я.М., Григорьевская И..И., Лобанов А.Н., Кравцов Э.Г., Грицкова И.А. Тесты для экспресс-диагностики на основе латекс-

агглютинации.//Биомедицинские технологии.- Москва 2ООЗ.-Вып.2О-С72-80.

11. Станишевский Я.М., Прокопов Н.И., Григорьевская И.И.. Вовк Д.Н. Влияние остаточного мономера в объеме полимерно-мономерных частиц на свойства тест-систем, полученных на их основе.//Материалы международной научно-технической конференции. "Наука и образование -2004" Тезисы докладов -Мурманск 2004.-С.-172-175.

12. Станишевский Я.М., ЛобановА.Н., Григорьевская И.И. Использование полимерных микросфер в качестве иммуносорбентов для конструирования антительных противостолбнячных диагностикумов// Тезисы XXXIX Всероссийской научной конференции по проблемам математики, информатики, физики, химии и методики преподавания естественных дисциплин (Химическая секция)- Москва: Изд-во РУДН, 2003.- С52.

13. Григорьевская И.И.. Сидоренко С.Н., Левачев СМ., Марков А.Г., Грицкова И.А.Изучение свойств полимерных суспензий, используемых для создания тест-систем.// Актуальные проблемы экологии природопользования. Выпуск 6. Ч.1. Сборник научных трудов. Москва. Издательство РУДН. 2004. С 399-402.

14. Григорьевская И.И., Сидоренко С.Н., Левачев СМ., Грицкова И.А. Полимерные микросферы для создания диагностических тест-систем. // Актуальные проблемы экологии природопользования. Выпуск 6. Ч.1. Сборник научных трудов. Москва. Издательство РУДН. 2004. С 397-399.

Григорьевская Ирина Иван овна

Антительные тест-системы на основе полимерных суспензий для мониторинга биополлютантов и других биологических объектов.

В целях решения охраны безопасности жизнедеятельности человека созданы новые тест-системы для обнаружения столбнячного и дифтерийного токсинов, являющихся причиной тяжелых заболеваний, и высокочувствительная тест-система для определения Татт-НогГаИ протеина, позволяющая подойти к выявлению механизмов формирования уропатогенной популяции микробов из кишечного биоценоза.

Впервые прослежено изменение коллоидно-химических свойств полимерных суспензий в процессе получения тест-систем потенциал, диаметр, распределение частиц по размерам, параметры изотерм двумерного давления 2Б пленок) и показано, что качество полученных тест-систем существенно зависит от времени хранения полимерной суспензии и от чистоты биолиганда.

Grigorievskaya Irina Ivanovna

Antibodies' test-systems on the basis ofpolymer suspension for the monitor of biopollutant and other objectives.

New test-systems for toxin detecting tetanus and diphtheritic toxins which cause severe diseases and high sensitive test-systems for Tamm-Horsfall protein detection which allows revealing mechanism of the intestinal biocoenosis uropathogenic germ population formation are develop in order to solve the problem of protection of human security.

For the first time the change of colloid-chemical properties of polymer suspension in the process of creating of test-systems was observed (¡^-potential, diameter, size distribution, n-A isotherm characteristics). It was shown that the quality of the test-system obtained, dramatically depends on the polymersyspensions time storage and the purity of biolygands.

02. ОО

Принято к исполнению 22/02/2005 Исполнено 23/02/2005

Заказ № 617 Тираж: 100 экз..

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Григорьевская, Ирина Ивановна

Введение.

Глава I

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Полимерные микросферы как носители биолигандов.

1.2. Ковалентная иммобилизация биолигандов на поверхность полимерных носителей.

1.3. Создание тест-систем на основе полимерных микросфер.

1.4.Свойства полимерных микрочастиц в тонком слое на межфазных границах.

Глава II

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

II. 1 Исходные вещества.

11.2. Методы исследования.

11.2.1. Получение полимерных суспензий в реакторе.

Н.2.2. Активация карбоксильных групп карбодиимидом.

Н.2.3. Ковалентное связывание биолигандов с функциональными группами полимера, расположенными на поверхности полимерных микросфер.

Н.2.4.Иммобилизация протеина А на поверхность полимерных микросфер.

Н.2.5.Иммобилизация антител на поверхность полимерных микросфер через спейсор-протеин А.

Н.2.6.Реакция латексной агглютинации.

П.2.7. Реакция нейтрализации антител (торможения).

11.2.8. Метод фотон-корреляционной спектроскопии.

Н.2.9. Метод весов Ленгмюра. Метод получения изотерм двумерного давления 2D пленок.

Глава III

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антительные тест-системы на основе полимерных суспензий для мониторинга биополлютантов и биологически важных соединений"

Проблема индикации загрязнения внешней среды продуктами биологического происхождения возникла на этапах открытия возбудителей инфекционных болезней. Экологический аспект ее в начале не выходил за рамки эпидемиологии и эпизоотологии. Методологически она решалась путем выделения из объектов внешней среды самого возбудителя и последующей его идентификации.

С развитием общества загрязнение среды биополлютантами возрастало. Необходимы были специфические методы их индикации. Именно тогда пришлось обратиться к накопленному опыту в области биологической защиты. Было показано, что серологические реакции, визуализация которых основана на эффекте агглютинации, являются наиболее удобными для проведения мониторинга окружающей среды на присутствие определенного биологического компонента в ней. Распространение получили тест-системы, работающие по принципу реакции агглютинации, в которых в качестве носителей биолигандов использовали эритроциты. Однако при их использовании трудно было выполнить основное условие: носитель должен был быть инертным в серологической реакции. Такое условие не всегда может быть соблюдено, поскольку на эритроцитах имеются антигенные детерминанты, к которым в иммунных сыворотках могут присутствовать антитела.

Это обстоятельство побудило исследователей перейти на синтетические носители, где иммунологический феномен неспецифической агглютинации полностью исключается. Кроме того, использование функциональных полимерных носителей позволило расширить варианты иммобилизации биолигандов на поверхности полимерных микросфер за счет ковалентного связывания функциональных групп полимера и биолиганда.

До настоящего времени не было проведено достаточно глубоких исследований фундаментального характера, позволяющих представить физико-химические процессы, протекающие на поверхности носителя, на всех этапах приготовления диагностикума и при выполнении непосредственно серологической реакции. Это в свою очередь не позволяет выдвигать четкие требования к параметрам полимерных микросфер, пригодных для создания диагностикума. В связи с этим подбор таких полимерных суспензий до настоящего времени осуществляется эмпирически.

В настоящей работе сделана попытка подойти к проблеме конструирования антительных диагностикумов, предназначенных для решения различных экологических задач, с позиций изучения состояния межфазного слоя полимерных микросфер на всех стадиях получения тест-систем, начиная с исходной суспензии.

Важным вопросом в этой проблеме до настоящего времени остается продукция токсина популяцией С. 1е1ат, находящейся в различных экологических нишах. Создание антительного диагностикума в этой ситуации позволило бы решить вопрос о контроле токсинопродукции в динамике технологического процесса и выборе приемов его оптимизации.

Не менее важным вопросом, в решении которого антительный диагностикум мог бы выступать в роли инструмента, является формирование уропатогенных вариантов кишечной палочки.

Исходя из этого, целью настоящей работы было: Создание антительных тест-систем для мониторинга биополлютантов и Татт-Но^а11 протеина.

Основные задачи исследования.

1 .Выбрать способ иммобилизации антител различной специфичности на поверхность полимерных микросфер.

2.0ценить изменение коллоидно-химических свойств исходных полимерных суспензий и тест-систем в процессе их создания.

3.Изучить влияние состава биолигандов на чувствительность и специфичность реакции латексной агглютинации.

Научная новизна.

• В целях решения проблемы охраны безопасности жизнедеятельности человека созданы новые тест-системы для обнаружения столбнячного и дифтерийного токсина, являющихся причиной тяжелых заболеваний и высокочувствительная тест-система для определения Татш-НогэГаП протеина, позволяющая выявлять механизмы формирования уропатогенной популяции микробов из кишечного биоценоза.

• Впервые прослежено изменение коллоидно-химических свойств полимерных суспензий в процессе получения тест-систем (^-потенциал, диаметр, распределение частиц по размерам, параметры изотерм двумерного давления 20 пленок) и показано, что качество полученных тест-систем существенно зависит от времени хранения полимерной суспензии и от чистоты биолиганда.

• Сопоставительный анализ различных способов иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер показал, что чувствительность антительных тест-систем, полученных при связывании биолигандов с полимерными микросферами через спейсор, протеин А, выше, чем при непосредственном связывании функциональных групп полимера и биолиганда.

• Установлено, что при создании тест-систем на стадии иммобилизации биолиганда необходимо использовать сыворотки и иммунореагенты, не содержащие примесей поверхностно- активных веществ.

• Впервые было проведено методом Ленгмюра систематическое исследование поверхностных свойств полимерных микросфер (исходных и на различных стадиях производства тест-систем), и показана их зависимость от времени хранения полимерных микросфер и чистоты биолиганда.

Практическая значимость.

1. Сформулированы требования к полимерным суспензиям и к сывороткам биолигандов для получения эффективных тест-систем.

2. Показано, что антительные тест-системы для определения столбнячного и дифтерийного токсинов и Татт-НогэГаН протеина обладают высокой диагностической эффективностью.

3. Составлен лабораторный регламент получения тест-систем.

Положения, выносимые на защиту.

1. Результат исследования коллоидно-химических свойств полимерных суспензий, полученных затравочной полимеризацией стирола, стиролсульфоната натрия и акролеина, и их изменение на всех стадиях получения тест-систем и в процессе хранения.

2. Влияние способа иммобилизации на чувствительность тест-систем.

3. Зависимость чувствительности тест-систем от чистоты биопрепарата.

4. Лабораторный регламент получения тест-систем для определения Татш-НогэГаП протеина, столбнячного и дифтерийного токсина.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Григорьевская, Ирина Ивановна

Выводы

1. Созданы новые антительные тест-системы для мониторинга столбнячного и дифтерийного токсинов для экспресс-контроля на качественном и количественном уровнях микробиологического состояния микробной популяции в экосистемах, обсемененности воздушной среды жилых и рабочих помещений токсиногенными штаммами С. сНрЫЬепае.

2. Создана высокочувствительная тест-система для определения Татт-НогеГаН протеина, позволяющая выявлять механизмы формирования уропатогенной популяции микробов из кишечного биоценоза.

3. Систематический анализ изменения коллоидно-химических свойств полимерных суспензий в процессе получения тест-систем высокого качества показал, что необходимо обращать внимание как на срок хранения полимерных суспензий, так и на состав биолиганда.

4. Показано, что свойства полимерных микросфер практически не зависят от порядка введения компонентов в процессе их синтеза, но существенно меняются в процессе хранения из-за изменения строения их межфазного адсорбционного слоя.

5. Установлено, что присутствие поверхностно- активных примесей в биолиганде не позволяет получить высокочувствительные тест-системы из-за недостаточной концентрации специфического белка на поверхности полимерных микросфер.

6. Сопоставительный анализ иммобилизации антител к Татт-НогеГаП протеину на поверхность полимерных микросфер показал, что чувствительность тест-систем, полученных при связывании биолигандов с полимерными микросферами через протеин А, выше, чем при непосредственном связывании функциональных групп полимера и биолиганда. Полученная по первому варианту тест-система по чувствительности позволяет определять искомый белок на уровне физиологических норм.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Григорьевская, Ирина Ивановна, Москва

1. Li W.-H., Li R., Stasver H.D.H. Monodisperse poly(chloromethylstyrene-co-divinylbenzene) microspheres bu precipitation polymerization.// J. of Polymer Science Part A: Polumer Cemistiy-1999-Vol. 37- Iss.14 -pp.22952303.

2. Bon S. A-F., Vanbeek H., Piet P., German A.L. Emulsifir-Free Synthesis of Monodisperse Core-Shell Polumer Colloids Containing Chormethyi Groups.//J. OF APPLIED POLYMER SCIENCE -995-Vol.58-Iss.l-pp.19-29

3. Sarobe J., Forcada J. Synthesis of Core-Shell Type Polystyrene Monodisperse Particles with Chloromethyl Groups.//COLLOID AND POLUMER SCIENCE -1996-Vol.31-Iss.l-pp.67-79.

4. Miraballesmartinez I., Martinrodriguez A., Hidalgoalvarez R. Chloroactivated Latex-Particles for Covalent Coupling of Antibodies-Application to Immunoassays.//.!. OF BIOMATERIALS SCIENCE-POLYMER EDITION -1997-Vol.l.8-Iss.l0-pp. 765-777.

5. Margel S., Nov E., Fisher I. Polychloromethylstyrene Microspheres-Synthesis and Charaaterization.//J. Polym. Chlem. Ed.-1991-Vol.29-Iss.3-pp.247-355.

6. Magnet S., Guillot J., Guyot A., Pichot C. Cross-Linking Ability of Sturene Butyl Acrilate Copolymer Lattices Functional ized with Glicidyl Methacrylate.// Prog, organ. Coating-1992- Vol.20-Issl-pp73-80.

7. Odeberg J., Rassing J., Josson J.E., Wesslen B. Water-Based Radiotion-Curable Latexes// J. OF APPLIED POLYMER SCIENCE -1996- Vol.62-Iss.2-pp.435-445.

8. Horak D. Straka J., Schneider В., Lednicky F. Pilar J. Poly(Ethylene Dimethacrylate) Particles with Poly(Clycidyl Methacrylate) Functionalities.// Polymer-1994-Vol 35-Iss.6-pp.l 195-1202.

9. Иванчев C.C. Полифункциональные компоненты при радикальной полимеризации и получении полимерных композиций.//Успехи химию-1991 .т.60.-вып.7.-с. 13 68-1290.

10. Елисеева В.И., Полимерные суспензию -М.: Химия, 1980.-295с.

11. Елисеева В.И., Асламазова Т.Р. Эмульсионная полимеризация в отсутствие эмульгатора и латексы на ее основе.//Успехи химии.-1991.-т.60.-вып.7.-с.398-428.

12. Bangs L.B. The Latex Course.// Bangs Laboratories Inc. Carmel. Indianapolis. USA, -1996-V.4-P 1-15.

13. Kawaguchi H. Funational polymer microspherees// Prog. Plym. Sci.-2000.-V.25.-P.1171-1210.

14. Прокопов Н.И., Грицкова И.А., Черкасов B.P., Чалых Ф.Е. Синтез монодисперсных функциональных полимерных микросфер для иммуно диагностических исследований//Успехи химии.-1996.-Т,65.-№2.-с.178-192.

15. Medcalf Е.А., Newman D.J., Gilboa A., Gorman E.G., Price C.P. A Rapid and robust particle-enhanced turbodimetric immunoassay for serum B2-microglobulin //J. Immunol. Methods.- 1990- V.129.-P. 97-103.

16. Medcalf E.A., Newman D.J., Gorman E.G., Price C.P. Rapid, robust method for measuring low concentration of albumin in urine // Clin. Chem.-1990-V. 36.-№. 3.-446-449.

17. Amiral J., Migaud M. Development and application of a new photometric method for fast and sensitive immunoassaus // Eur. Clin. Lab.-1991.-V. 10.-P.28.

18. Calisteo-Conzalez F., Puig J., Martin- Rodriguez A., Serra-Domenech J., Hidalgo-Alvarez R. Influence of electrostatic forces on IgG adsorption onto polystyrene beads // Colloids Surface B: 1994.- V. 2.-P.435-441.

19. Shirahama H., Suzawa T. Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Styrene/2-Hydroxyethyl Methacrylate copolymer latex // J. Colloid Interface Sci.- 1985.-V.104.- №2.-P. 416-421.

20. Suzawa Т., Shirahama H. Adsorption of plasma proteins onto polymer lattices//Adv. Colloid Interface Sci.-1991.-V.35.-P.139-172.

21. Peula-Carsia J.M., Hidalgo-Alvarez R., de las Nieves F.J. Protein coadsorption on different polysteren latexes: electrokinrtic characterization of poltmer colloid stability // Colloid Polym. Sci.-1997.-V.275.-P.198-202.

22. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине./ Под ред. Грызунова Ю.А., Добрецова Г.Е.-М.: Ириус, 1994.-Т.1,2.

23. Okubo М., Hattori Н. Competitive adsorption of fibrinogen and albumin onto polymer microspheres having hydrophilic/hydrophobic heterogeneous surface structures // Colloid Polymer Sci.-1993.-V.271.№12.-P.l 157-1164.

24. Udelstad J., Mfutakamba H.R., Mork P.C., Ellingsen Т., Berge R., Holm L., Schinid R., Jorgedal A., Hansen F.K., Nustad K. Preparation and characterization of monodisperse polymer particles // J. Polym/ Sci., Polym. Symp/-1985.-V.72.-p.225-240.

25. Ober S.K., Lok K.P., Hair M.L. Monodispersed, micron-sized polystyrene particles by dispersion polymerization // J. of Polym. Sci., Polym. Letters Ed.-1985.-V.23.-p. 103-108.

26. Brouwer W.M. The preparation of small polystyrene particles // J. of Appl. Polym. Sci.-1989.-V.38.-p. 1335-1346.

27. Bale M.D., Danielson S.J., Goppert R.E., Sutton R.C. Influence of copolymer composition on protein adsorption and structure rearragements at the polymer surface //Coll. Iterface Sci.-1989.-V.132.-№ 1.-p. 176-187.

28. Грицкова И.А., Крашенинникова И.Г., Аль-Хаварин Д.И., Нусс П.В., Дорохова Е.А., Гжива Никсиньска И. Устойчивые полистирол-метакриловые суспензии с узким распределением частиц по размерам // Коллоидн. ж.-1995,-т.57.-№2.-с.182-185.

29. Суспензионная полимеризация винилхлорида. Стабилизаторы полимеризующейся эмульсии. Сб. обзорной информации.-М.: НИИТЭХИМ, 1975.-c.63.

30. Милицкова Е. А. К вопросу стабилизации размеров гранул суспензионных полимеров // Пластические массы.- 1961-№8.-с.6-8.

31. Munzer М., Trommsdorff Е. Polymerizations in suspension // In: Polymer Processes. — New York.-p. 106-142.

32. Reinhardt H.I., Thiele R. Untersuchungin zur dshontinurlichen suspensions polumerisations von styrol // Plaste b Kautch.-1972.-Bd.l9.№9.-s.645-648.

33. Schulz G.V. Uber die polymerization kinetic in hochkonzentrierten systemen. Zur kinetik des trommsdorffekter an methylmethacrylate // z. Physik. Chem.-l956.-Bd.8.-№5-6.-s.290-317.

34. Суспензионная полимеризация метилметакрилата. Сб. обзорной информации.-М.: НИИТЭХИМ, 1975.-е. 59.

35. Егоров В.В. Радикальная полимеризация поверхностно-активных мономеров. Авто. реф. дисс. в форме научного доклада на соискание уч. степ, д.х.н.- Москва, 1992.

36. K.E.J. Barrett. Dispersion Polymeriztion in Organic Media // Wiley, London-1975-456p.

37. Ahmed S.F., Poehlein G.W. Kinetics of Dispersion Polymerization of Styrene in Ethanol.l. Model Development// INDUSTRIAL & ENGINEERING CHEMISTRY RESEARCH.-1997.-v.36.-Iss.7.-p2597-2604.

38. Прокопов Н.И. Синтез полимерных суспензий с узким распределением частиц по размерам методом гетерофазной полимеризации: Дисс. докт.хим.наук.-М., 1999.

39. Schlund В., Pith Т., Lambla М. Syntheses et caracte-ristigues structurelles de latex reactifs//Macromol. Chem. Suppl.-1985.-№10/1 l.-p. 419-433.

40. Method of proteien coupling with latex beads: Brit. Pat. 2 004892, МКИ С 08 L 89/00, С 08 F 2/44/Fisher Е.А.-заявл. 25.03.1978, опубл. 12.11.1978.

41. Лукин Ю.В., Грицкова И.А. Праведников А.Н., Бахарев В.И. Полиакролеиновые латексыЖ синтез, введение наполнителей и механизм формирования//ДАН CCCP.-1985.-t.285.№1.-с. 195-161.

42. Bastosgonzales D., Hidalgoalvarez R., Deelasnieves F.J. Electrokinetic Behavior of Polystyrene Latex with Different Surface Groups- Effect of Heat-Treatment //J/OF COLLOID AND INTERFACE SCIENCE -1996-v. 177.-Iss.2-pp.372-379.

43. Имнадзе Е.Г. Модификация водной дисперсии синтетического цис-1,4-полиизопрена серусодержащими аминокислотами: Дис. канд.хим.наук.-М., 1987.-175с.

44. Черкасов В.Р. Полимерные суспензии, модифицированные серусодержащими аминокислотами, для иммунохимических исследований: Дис. канд. хим. наук. М., 1992.-138с.

45. Okubo М., Shiozaki М., Tsujihiro М., Tsukuda Y. Preparation of micron-size monodisperse polymer particles by seeded polymerization utilizing the dynamic monomer swelling method //Coll. Polym. Sci.-1991.-v.269.-h.222-226.

46. Particles by Seeded Dispersion Polymerization //COLLOID AND POLYMER SCINCE-1997-v.275-Iss.8-pp.797-801.

47. Takahashi K., Nagai K. Preparation of Reactive Polymeric Microsphereees by Seeded Copolymerization Using a Polymerizable Surfactant Bearing an Active Ester Group //POLYMET-1996-v.37.-Iss.7-pp.1256-1266.

48. Muroi S., Hosoi К., Hashimoto М. The Morphology of Core Shell Latex Particles.// J. Polym. Sci.: Polym. Chem. Ed.,-1984-v.22.-N6.-pp. 13651372.

49. Елисеева В.И. Шапиро Ю.Е., Титова Н.В., Буданов Н.А. О свойствах и микроструктуре композиционных латексных полимеров.// Высокомол. Соед.-1989-т.31 А.-№2.-с.263-268.

50. Чекина Н.А. Синтез носителей иммунореагентов на основе полиметилметакрилата и его сополимеров методами радикальной эмульсионной полимеризации: Афтореф. дис. канд.хим.наук.-сПб.,2003.

51. Гаспарян В.К. Полистирольные латексы в реакциях агглютинации, приготовление и сенсибилизация.// Клиническая лабораторная диагностика.-2001.-№1.-с.43-45.

52. Абраменко Т.В., Алешкин В.А., Мягкова М.А., Соломатникова А.И., Старов А.И. Разработка метода экспресс-диагностики чумы плотоядных на основе реакции латексной агглютинации.// Вопросы вирусологии.-1999.-Т44.-№ 1 .-с.44-46.

53. Базиков И.А. Использование полиакролеинового латекса в получении тест-системы для экспресс-диагностики сифилиса.//Вестник дерматологии и венерологии.-2001.-№4.-с.51-52.

54. Абраменко Т.В., Мягкова М.А., Эмирова Т.А., Сперенский А.И., Станислав М.Л., Лебедева Т.В. Определение ревматоидного фактора в сыворотке крови больных методом латексной агглютинации.// Клиническая лабораторная диагностика.-1998.-№4.-с.40-42.

55. Воробьева З.Г., Бурков А.Н., Блинова Т.В. Определение иммуноглобулинов класса M в реакции агглютинации латекса.// Клиническая лабораторная диагностика.-2000.-№2.-с.23-24.

56. Ерусланов Б.В., Борзенков В.Н., Печерских Э.И., Светоч Э.А., Ураков Н.Н. Разработка латексной тест-системы для ускоренной идентификации возбудителя легионеллеза во внешней среде и в клиническом материале.//Вестник Рос.АМН.-№6.-с.40-44. j

57. Richardson I.R. Latex 34 Legionella pneumoplua species inentiflcation using a commercial latex agglutination kit a potential gross-reaction problem with serogroup -12 //Med.Lab.Sci. 1992.-1992. - v.49. - №2. - p.144 -146.

58. Antifungal action of Carica -Papaya latex-isolation of fungal Cell Wall hydrolyzing enzymes.// Mycoses. 1991.-v.34. - №2. - 1.- p.469 -477

59. Characteristics of inert beads provoking humoral immune responses in gallerin Mellonella Larval. // J.Insect Physiol. 1992. - v.38 - №7, - p.533-541

60. Misengard R.J. Development of rapid latex agglutination test for Periodontel Pathogens.// J.Periodontal. 1992. - v.63 - №7 — p.611-617

61. Parker S.P. Modified latex agglutination test for antibodies of Toxo plasma- gondii in eluates from Guthrie cards. //J. С lin. Pathol. — 1992. — v.45 №10- p.907-909

62. Hazeleger W.C., Beumer R.R., Rombouts F.M. The use of latex agglutination test for determining Campylobacter species. //Microbiol. — 1992.-apl. V.14 №4 - p. 181-184

63. Kanl R., Read J., Mattiasson B. Screening for plant lectins latex agglutination test.//Phytochemistry. -1991.-v.30 №12 -p.4005-4009

64. Гуркова E.M. Аффинная хромотография. // M., Мир. 1980. с. 174

65. Nathan C.F., Cohn Z.А. // J.Exp. Med., vol. 1981 № 154. - p. 1539-1553

66. De Coster, Cambiaso, Masson. Immunological diagnosis of pregnancy in the mare agglutination of latex particles.// The riogenology.1980.-v. 13 №6 -p.433-440

67. Singer J.M., The latex fixation test in rheumatoid disease/// Am.Jmed/-1961-V.31 p.766-775

68. Цанчев В., Повов н., Каларов С., Каракашов А. Лабораторная диагностика ревматических заболеваний. // София, 1964

69. Sam W.C. Latex agglutination assay for Delection of Cholera Toxin.// J.Clin.Microbiol.-1992-V.30 №9 - p.2518-2520

70. Sada E. Delection of Lipoarabinomannan as a diagnostic test for Tuberculosis.//J.Clin.Microbiol.- 1992 v.30 - №9 -p.2415-2418

71. Перфдзе T.B., Халонен П. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. -М.: Медицина, 1985,-с,250

72. Evaluation of two Colored Latex kits the well colex Colour Salmonella test and the Well colex colour Shigella species.// J. Clin.Microbiol.-1992.-v.30 -p.2184-86

73. Hartig W., Paulke B.R., Bruckher G. Fiuorescent latex microspheres for rethograde tracing of neurons in mouse basal forebrain combines with immunocytochemistry a methodical approach.//Acta Histochem.-1992-v.42,-p.261-265

74. Heizmann W.R. Detection of Salmonella in Human Faeces by Rambach Agar and a Color latex agglutination assay.// Med.Microbiol. Lett.-1993.-May.-v. 1 .,2 №3 - p. 131 -137

75. Bernard A., Lauwerys R. Turbidimetric latex immunoassay for serum ferritin.// J.Immunol. Meth.-1984.-v/71 .-p. 141 -147

76. Delarrea L.B. Automated determination of streptolysin 0 antibodies by a turbidimetric latex immunoassay method. //J.Clin.Immunoassay.-1992-v.l5-№3-p. 182-186

77. Saada E. Detection of lipoarobinomannau as a diagnostic test for tuberculosis // J.Clin. Microbiol.-1992.-v.30-№9 p.2415-2418

78. Borque L. Automated quantition nephelometric latex immunoassay for determining Ferritin in human serum // J.Clin.Lab. Anal.-1992-v.6 №4 -p.239-244

79. Collet-Cassart, Masson, Cambiaso. Automated particle-counting immunoassay for a-feroprotein. //J.Clin.Chem.-1981-v.27- №1-3,64-67

80. Limet, Collet-Cassart, Magnusson, Sauvage. Particle-counting immunoassay (PACIA) of ferritin. // J.Clin. Biochem. 1982-V.20 - p. 141147

81. Collet-Cassart, Magnusson,Lesne, Masson. Automated particle-counting immunoassay for digoxine. // Clin.Chem. 1981-V.27 -№7 - p. 1205-1209

82. Polesky H., Hanson S. Comparison of viral hepatitis marker test methods based on AABB-Cap survey data.// Amer. J.Clin.Path.-1981-v.76-№4-p.521-524

83. Kario K., Matsuo Т., Kabayashi H., Matsuo M. Rapid quantitative evaluation of plazma D-Dimer levels in Thrombotic states using an automated latex photometric immunoassay.//Thromb.Res.-1992- May.-v. 166- №2-3 p. 179-189

84. Norde W. Adsorption of proteins from solution at the solid-liquid // Advan/ Colloid and Interface Sei. 1986. - v.25. No 4. P. 267-340

85. Камышный A.JI. Адсорбция глобулярных белков на твердых носителях: некоторые физико-химические характеристики // Ж. физ. химии. 1981.-т. 55. - Вып. 3,- С. 562-580.

86. De Baillou N., Voegel J.C., Schmitt A. Adsorption of human albumin and librinogen onto heparin-like materials. Adsorption isoterms // Colloids and Surfaces. 1985. - v. 16. - P. 271-288.

87. Van Dulm P., Norde W. The adsorption of human plasma albumin on solid surfaces, with special attention to the kinetic aspects. // J. Colloid and Interface Sei. 1983. - v.91. - No. 1. - P. 248-255.

88. Ivarsson B.A., Hegg P.O., Lundstrom K.I., Jansson V. Adsorption of proteins on metal surfaces studied by ellipsometric and capacitance measurements. // Colloids and Surfaces. 1985. - v. 13. - P. 169-192.

89. Norde W., Fraaye J.G.E.M., Lyklema J. Protein adsorption at solid-liquid interfaces: a colloid-chemical approach. // ASC Symposium Series. — 1987. No. 343.-P. 36-47.

90. Norde W., Mac Ritchie F., Nowicka G., Lyklema J. Protein adsorption at solid-liquid interfaces: reversibility and conformation aspects. // J. Colloid and Interfaces Sei. 1986. - v. 112. - No.2. - P. 447-456.

91. Norde W., Lyklema J. The adsorption of human plasma albumin and bovine pancreas ribonoclease at negatively charged polystyrene surfaces. // J. Colloid and Interface Sci. 1978. - v.66. -No. 2.-P. 257-302.

92. Lyklema J., Norde W., Biopolymer adsorption with special reference to the serum albumin-polystyrene latex system. // Croat. Chem. Actia. — 1973. — v.45.- No. l.-P. 67-84.

93. Fair B.D., Jamieson A.M. Studies of protein adsorption on polystyrene latex surfaces. // J. Colloid and Interface Sci. 1980. - v.77. - No. 2. - P. 525-534.

94. Kawaguchi H., Amagasa H., Hagiya Т., Kimura N., Ohtsuka Y. Interaction between proteins and latex particles having different surface structures. // Colloids and Surfaces. 1985. - v. 13. - P. 295-311.

95. Bagchi P., Birnbaum S.M. Effect of pH on the adsorption of immunoglobulin G on anionic polyvinyl toluene model latex particles. // J. Colloid and Interface Sci. 1981. - v.83. - No. 2. - P. 460-478.

96. Kondo A., Kawanot Т., Higashitani K. Immunological agglutination kinetics of latex particles with covalently immobilized antigens. // J. Ferment Boieng. 1992.- v.73.-No. 6.-P. 435-439.

97. Kasuya Y., Fujimota K., Miyamoto M., Jujit Т., Otaka A. Preparation of peptide-carrying microspheres with bioactivity on platelets. // J. Biomater Sci-Polym. Ed. 1993. - v.4. - No. 4. - P. 369-380.

98. Yamada Т., Muzamatsu N., Kondo T. Phagocytosis of monosaccharide9

99. Binding latex particles by buinea Pig Poly. ^ 9

100. Kondo A., Yamasaki R., Higashitani K. Affinity purification of antibodies using immunomicrospheres. //J.Ferment Bioeng.-1992-v.74-№4 — p.226232/

101. Маренникова C.C., Носков Ф.С. Выявление антигена ВИЧ и антител к нему с помощью теста агглютинации с отечественным латексом.// Вопросы вирусологии, 1990,№3,с.254-348.

102. Бровкина А.Н. Разработка диагностических тест-систем для ускоренной индикации энтеробактерий с помощью реакции латекс-агглютинации. Афтореф. дис. канд.биол.наук.-М.,1999.

103. Ramadass P., Samuel В., Nachimuthu К. A rapid latex agglutination test for detection of leptospiral antibodies.// Veterinary Microbiology. 1999, №10 ,р.137-140.

104. Станишевский Я.М. Полимерные дисперсные системы медико-биологического назначения. Дисс. канд. биол. наук. М.,2001.-127с.

105. Ребиндер П.А. Поверхностные явления в дисперсных системах. Коллоидная химия. // Избр. тр. М.: Наука, 1978. Т.1.

106. Григорьева М.Е. Синтез полистирольных латексных частиц для тестирования холестерина. Афтореф. дис. канд.хим.наук.-М.,1990.

107. Марков А.Г. Синтез полимерных суспрензий для иммунохимических исследований. Афтореф. дис. канд.биол.наук.-М.,2004.

108. Щукин Е.Д., Перцов А.В., Амелина Е.А. Коллоидная химия.-М.: Высш.шк., 2004.-445с.

109. Berhard P. Binks Particles as Surfactants — similarities and differences //Current Opinion in Colloid & Interfact Science 7 (2002) 21-24

110. R. Aveyard, J.H. Clint and T. S. Horozov Aspects of the Stabilisation of emulsion by solid particles : Effects of line tension and monolayer curvature energy // Phys. Chem. Chem. Phys., 2003, 2398-2409

111. B.P. Binks and S.O. Lumsdon Transitional Phase Inversion of Solid

112. Stabilized Emulsions Using Particles Mixtures 11 Langmur 2000, 16, 61166120

113. B.P. Binks and S.O. Lumsdon Influence of Particle Wettability on the Type and Stability of Surfactant-Free Emulsions // Langmur 2000,16, 86228631.

114. Marcel Visschers, Jozua Laven, Rob van der Linde. Forces operative during film formation from latex dispersions.//Progress in Organic Coatings 31, 1997, s. 311-323.

115. Berhard P. Binks and Join H. Clint Solid Wettability from Surface Energy Components : Relevence to Pickering Emulsions // Langmur 2002, 18, 1270-1273

116. R. Aveyard, J.H. Clint, D. Nees Small solid particles and liquid lenses at fluid/fluid interfaces //Colloid Polym Sci 278: 155-163 (2003)

117. Г.А. Якубов, О.И.Виноградова, H.J. Butt Исследование влияния линейного натяжения на смачиваемость водой полимерных микросфер. // Коллоид. Ж, 2001, т.63, №4, с.567-575

118. Binks В. P., Lumsdon S.O. Pickering Emulsions Stabilized by Monodisperse Latex Particles: effects of Particle Size.// Langmuir, Vol. 17, № 15, 2001, s. 4540-4547.

119. Dushkin C. D., Lazarov G. S., Kotsev S.N., Yoshimura H., Nagayama K. Effect of growth conditions on the structure of two- dimensional latex crystals: experiment.//Colloid Polym Sci 277, 1999, s. 914- 930.

120. Binks B. P., Lumsdon S.O. Tranaitional Phase Inversion of Solid-Stabilized Emulsions Using Particle Mixtues// Langmuir, Vol. 16, №8, 2000,s. 3748- 3756.

121. Binks B. P., Lumsdon S.O. Catactrophic Phase Inversion of Water- in- Oil Emulsions Stabilized by Hydrophobic Silica.// Langmuir, Vol. 16, № 6, 2000, s. 2539-2547.

122. Ghezzi F., Earnshaw J.C., Finnis M., McCluney M. Morpholgical Analusis of the Effects of ions and Ultraviolet Light on Colloidal

123. Monolayers at te Air- Water Interface.// Journal of Colloid and Interface Science 251, 2002, s.288-303.

124. Butt H. J., Jaschke M., ducker W. Measuring surface forces in electrolyte solution with the atomic force microscope.// Bioelectrochemistry and Bioenergetics 38, 1995, s. 191-201.

125. Green B.W., Saunders F.L.,J. Coll, Interface Sci., 1970, 33, 393.

126. Velikov K.P., Durst F., Velev O.D. Direct Observation of the Dynamics of Latex Particles Confined inside Thinning Water- Air Films// Langmuir, Vol. 14, №5, 1998 s. 1148-1155.

127. Ребиндер П.А., Таубман А.Б. К вопросу об изложении в курсах коллоидной химии устойчивости коллоидов. Колл. Ж., 1962, 23, 3, 359.

128. Ottewie R.N., Talker Т. The Influence of Non-ionic surface Active agents in the Stability of Polystyrene Latex Dispersion. J. Colloid. Interf. Sci., 1968, 227, 1, 108-116.

129. Пьюза П.Н. Диффузия макромолекул.- В кн.: Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов / под. ред. Камминс Г., Пайк Э. М.: Мир, 1987. -с.450.

130. Нейминсон А., Макдональд М. Исследование структуры полимеров в растворе методом квазиупругого рассеяния лазерного света.- В кн.: Новейшие инструментальные методы исследования структуры полимеров /под. ред. Кеннинг Д. М.: Мир, 1982, с. 169-208.

131. А.М.Королюк, В.Б.Сбойчаков. Медицинская микробиология.-учебное пособие. Санкт-Петербург 1999г.

132. Грицкова И.А., ЛобановА.Н., Станишевский Я.М., Прокопов Н.А., Кравцов Э.Г. Получение антительных диагностических тест-систем заданной специфичности. //Биотехнология.-М.-2003 .-Вып.2-С.81 -85.

133. Wood W.G., Gadow A. Immobilisation of Antibodies and Antigens on Macro Solid Phases. A Comparison Between Adsorptive and Covalent Binding//J.Clin.Chem.Clin.Biochem.-1983-21 (12).-p.789-797

134. Ullman T.F., et al. Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay: Measurment of Particle Binding Kinetics by Chemiuminescence./ZProc.Nat. Acad.Sci.-1994-V.91 -p.5426-5430.

135. Carney J. Rapid diagnostic tests emploing latex particles// Anal.Proc.-1990-V.27-p.98-100.

136. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. Под редакцией академика АМН СССР П.Н.Бургасова. М. «Медицина» 1978. 440с.

137. Структура и функции антител. Под редакцией Л.Глинна, М.Стьюарда. Пер. с англ. Доктора медицинских наук Е.В.Чернохвостовой. М., «Мир», 1983, с.216.

138. Дорохова Е.А. Полимерные микросферы для реакции латекс-агглютинации: Дис. .канд.хим.наук.-М., 1991.-108с.

139. Ребиндер П. А. Механические свойства и стабилизирующие действия адсорбционных слоев в зависимости от степени их насыщения. Колл. Ж., 1958, 20, 2, 527-535.

140. Измайлова В.Н., Ребиндер П.А. Структурообразование в белковых системах. М.: Наука, 1974, с.268

141. Б.Д., Горюнов Ю.В. Физико-химические основы смачивания и растекания. -М.: Наука, 1976, гл.1

142. Adamson A.W., Gast A. Physical Chemistry of Surfase — New York: John Willey & Sons, 1997. 808p.

143. Адамсон А. Физическая химия поверхностей. M.: Мир, 1997

144. Sheppard Erwin and Tcheurekdjian. Monolayer Studies IV. Surface Films of Emulsion Latex Particles. J. Colloid. Interf. Sci., 1968, v.28, p.481-486

145. Okubo T. Surface tension of Structured Colloidal Suspensions of Polesterene and Silica Spheres at the Air-Water Interface. J. Colloid. Interf. Sci., 1995, v.l71,p.55-62.

146. Aveyard R., Clint J.H., Nees D., Paunov V.N., Compression and Structure of Monolayers of Charged Latex Particles at Air/Water and Octane Interfaces. Langmuir, 200, v. 16, p. 1969-1979.

147. Ruiz-Garcia J., Gomez-Corrales R., Ivlev B.I. Foam and cluster formation by latex particles of the air/water interface. Physica A. 1997, v.236, p. 97-104.

148. Нейман Р.Э. Очерки по коллоидной химии синтетических латексов. Изд. ВГУ, 235-250. , \