Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антиоксидантная система защиты клеток при воздействии ксенобиотиков

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Антиоксидантная система защиты клеток при воздействии ксенобиотиков"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

ТБ ОЯ

р Г"'. .. На правах рукописи

УДК 615.285.7:576.311.347 БАТИ РОВ Бабир Мехманович

АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА ЗАЩИТЫ КЛЕТОК ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ КСЕНОБИОТИКОВ

03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТАШКЕНТ—1994

Работа выполнена в лаборатории структурной организации биологических мембран Института биохимии АН РУз.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор А. К. МИРАХМЕДОВ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, К. Н. НИШАНБАЕВ, кандидат биологических наук Т. М. ИШАНХОДЖАЕВ

Ведущая организация:

Ташкентский Государственный Университет, биолого-почвенный

факультет.

Защита диссертации состоится . » СЛк^ГГ-дрС . 1994 г

в « . . . » ч. на заседании специализированного совета Д 015.16.2] по защите диссертаций ученой степени доктора наук при Инсти туте биохимии Академии Наук Республики Узбекистан по адресу 700143, г. Ташкент, ул. X. Абдуллаева, 56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт; биохимии АН РУз.

Автореферат разослан « .¿Ь .» . . . 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

С. А. БУРХАН01

- -

Актуальность проблемы. Мспользование в течении двитедыю-; •> периода времени в сельском хозшгстве, проиншленности л биту пестицидов, способных на!«пливаться в почве, продуктах питания, атмосферном воздухе и воде создало в. настоящее время глобальную проблему в охране окружающей среды.

После получения Республикой Узбекистан статуса незаЕйси-мого Государства первоочередной задачей поставленной правительством перед биологами, химиками и другими специалистами база разработка новых высоко?#ективных препаратов, обладающих широким спектром действия на растения, и вместе с тем, ма?.о-токсичных для человека и яивотних: В качестве/таковых в насто-ятее время применяются пестициды типа Харваде и его производных, которые с токсикологических и санитарно-гигиенических по-гший считаются маютоксичннми, а в минимальных количествах лх рассматривают в качестве биостимуляторов роста растений.

На основании многих исследований посвященных изучению эффектов различных пестицидов обнаружено, что в ряду органов и тканей печень в наибольшей степени подвержена влиянию пестицидов, а из клеточных органоидов основной мишенью действия этил соединений являются митохондрии.

Из литературных данных известно, что при отравлениях $ос-фороорг-эпическими и хлороорганичес!Шми пестицидами происходят нарушения-'на уровне митохондрий, цитоплазмы и ядерного аппарата (Гиаэтуллина.3.3 и др, 1991, ЛЬтзс! I, е1 а1, 1982) . Причем установлено, что в.первую очередь, независимо от рассматриваемой клеточной структуры, пестициды оказывают модифицирующее влияние на структурно-функциональное свойства биологически мембран (СЬ<?(Ч)гка V. . И. а1, 1937).. В то же время, следует отметить с сожалением, что в литературе имеются лишь разровненные сведения о действии на метаболические процессы малотоксичных препаратов, широко используемых в настояиее время в сельском хозяйстве,, в качестве пестицидов. Изучение этого вопроса является весьма актуальным, - как для понимания механизма действия малотоксичннх пестицидов, так и для решения практических задач., связанных с .применением этих препаратов в различных от-• -раслЯк народного -хозяйства. ' -.'•-...■

ч-лп _и_ задачи исследования. Целью наших исследований явилось изучение механизма действия пестицида Харвзде-25ф (произ-

водство Великобритания) на.некоторые структурно-функциональные параметра митохондрий и выявление возможности коррекции обнаруженных нарушении, применением аятиоксцданта гислвдина.

Для достижения намеченной цели были определены следующие задачи:

.. - изучить влияние Харваде - 25 ф в сочетании с гиспидином на морфологическую характеристику печени крыс;

- исследовать фосфолипидный состав '.мембран' митохондрий Пачым, при затравке животных- Харваде - 25 ф в сочетании с гиспидином;

- изучить функциональное; состояние ыитохондрий печени крыс,: затравленных пестицид сш и после введением антиоксвданта;

- исследовать перешюное окисление липидов (ПОЛ) ыитохондрий печени при действии Харваде - 25 ф и гиснидшш;

- исследовать активность помиферыентных систем митохондрий гепатоцитов при сочетанном действии пестицида и гиспидина.

Научно-практическая ценность работы. Результаты йастоащой работы дополняют сведения о механизме действия малотоксичных ксенобиотиков на структуры и функции 'митохондрий. Полученные данные помогут выявить некоторые закономерности, возникаюаше яри действии пестицида на функционального состояние митохондрий печени, которые следует учитывать при разработке санитар* но-гигиенических регламентов по производству и применению пестицидов. . .

Результаты исследований свидетельствует о высоком антиок-сидантноы свойстве гиспидина, и о целесообразности применении его при. патологическом состоянии организма сопровождающемся усилением ПОЛ.

Апробация работы. Результаты работы доложены на 5-оы международном конгрессе, по клеточной биологии,на 2-ой международной конференция по клеточной мембране.Madrid (Spain) 1992 p. Н

Публикации По тема** диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части с обсуждением результатов,-заключения, выводов.списка использованной литературы, вкойчашцего 170 наименований, в том числе 82 иностранных и нршкженяя. Работа изложена на ц-у -страницах ма • оиношюного текста, 'включат 5 расункоь и.у таблиц.'.'-

Результаты и их обсуждения Объектом исследования служили . самцн беспородных белых пр»с массой 180-200 г. Затравку животных пестицидом Харсаде -25 ф и лозе 1/10 ДЦ50 проводили внутрижелудочио специальном иондом в течение 5 лней. йивотных забирали на 1, 3 л 7 сутки после начало затравки. В качестве антйокевдаита использовяпп гиспидин / Сзэ !!jci О5 / производное а-стирилперона, и выделенный из этилшетатного извлечения гриба орехового дерева в Институте химии растительных веществ ЛИ РУз /Сиров и др.1937/. Животных забивали на 6-, 8- и 12-е сутки после начала затравки.

Митохондрий из печени выделяли по общепринятому методу D.F. Parsons, U.Y. Simsori /1967/.

Для изучения морфологических «вменений в печени )фкс применяли гистологические методы. Кусочки органов ливотинх сразу после забоя фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали парафином. Парафиновые срезы толштюн 6-7 мш окрашивали гематоксилин эозином и по Вал-Гиаону.

Осороотъ потребления кислорода митохондриями измеряли полярографическим методом. В качестве субстрата окисления использовали сукцинат и й-кетаглутарат. ■

НАД'N-оксидааиую и сукцииатоксидазную активности митохондрий определяли по методу Y.Hatefi et al и др. /1962/ в кодификации М.М. Рахимова и К. Т. Ллиатова /1977/

Экстракция липидов проводили по методу Pi.J.Folch et al /1957/. Количество отдельных фракций $юсФолипидов определял?! методом проточной горизонтальной хроматографии.

Дскорбат -иадисимое и НАДО ■ ^зависимое ЮЛ определяла m содержанию малонового диальдегида. /ЩА/, содержание ЦДЛ- с использованием й-тиобарбитуровой кислоты /ТБК/.

Интенсивность процессов ПОЯ выражали з ыкиоль/мип/иг бе~ ва. В последнее время раскрыты многие сторона нарушения .t-f-ra-боли?ма липидов при действии ксенобиотиков. " Накоплено значительное количество эксперименталных данных о глубоких н нного-обравиых изменениях липидиого состава, липопероксидацяя, опти-оксидантных свойств в клетке и некоторых ввутрмкяето'ших орга-неллах. Тем не мене«, многие вопросы остаются не ввясневнши.

В настоящее время при оценке токсико-гигменическкх свой те пестицидов наряду с биохимическими методами широко примен к>тся общеморфологические и электронно-микроскопические метод мы, позволяющие уже на раннем этапе токсического воздейств обнаружить функциональные изменения в клетках,которые в дал нейшем могут быть причиной развития ряда патологических сост яний.

В связи со сказанным, в этой серии экспериметов изуча морфологии гепатоцитов печени крыс, которым вводили пестицид течении 5 дней. На 1 сутки эксперимента обнаружено эначител ное расширение просветов и вастойное полнокровие централь« пен и сосудов триад. Стенки меддольковых и внутридольшвых с судов отечны, эндотемей их набухший.

Наблюдается расширение синусоидных капиляров. Желчи протоки расширены. Утолщенные кологеновые волокна окружают о дельные центральные вены и сосуды триад. Обнаружена выражеин, отчетность портальной соединительной ткани, разрыхление и и фильтрация.её'лимфоцитами с примесью макрофагов, фиОробласто тучных и плазматических меток.

Отмечается выход клеток инфильтрата из псртальной (сист ми) стромы в пернпортальных ступенчатых некрозов. В некотор] местах отмечается образование соединительных септ, соединяют периферическая зоны (порто-портальные фиброзы). В болыпинст; случаев повсеместно выявляются средне- и крупнокапельное дю фузное ожирение печени.

Гепатоднты характеризуются выраженным полиморфизма встречаются как крупные, так и келькие формы, со светлой и б! эофилькой цитоплазмой. Ядра большинства гепатоцитов мелкм гиперкромные, округлой или овальной формы. В вакуавизировали клетках ядра крупные с интенсивно окрашенным гдыбками хромат] на.

На 3 сутки после Б-дневного введения в организм животш пестицида Харваде -26 ф, морфологическая картина печени в о; ; участках имеет дольчатую структуру, на других-фрагментир; егс;5 на ложные дольки, окруженные тонкими прослойками соедиш тельной ткани с явлением отека.

На 7 сутки отмечается некоторое улучшение морфологичесю

эртине печени. Об это» свидетельствует воостайобшш бакоч-)го строения, уменьшение степени дистрофических и некротичес-

IX изменений, наряду с этим, сохраняется отек строш и виражные .дисциркуляторные изменения.

Результаты исследования показали, что при введении в ор-шивм затравленных животных гиспндина, на 1 сутки, дольчатое •роение печени в значительной мере восстановлено по сравнению пестицидным.поражением в этот же срок. При этом наблюдается ■суствие никроциркуляторних расстройств.

В перифирических и средних отделах долек сохраняется серенная вакуольная дистрофия. Однако, вакуоли значительно ■нывих размеров, по сравнению с 1 и 3 сутками, а »слетками с ■лочной дистрофией полностью отсутствует. Жировая дистрофия отличии от 1 суток, пестицидного отравления, выявляется лить | периферии некоторых долек.

Во всех зонах долек выявляется большое число гипертрофи-ванних клеток, характеризующихся наличием а еру п ник гиперхром-

X ядер и высокой базофилией цитоплазмы. В центральных отде-х долек строение многих гепатоцитов норыаливуетсч, но иногда тречается гепатоциты с зернистой дистрофией.

На 3 сутки затравки пестицидом Харваде-25ф и лечении спидином. в отличии от предыдущего срока, наблюдается почти, а нал нормализация »¿орфологичес»юй картины пораженной печени, кроциркуляторные расстройства, а таюге отечные и воспали-вьиые изменения в строме полностью отсутствует. Рядом с Сочами триад располагается единичные мелкоочаговые илфильтра-, фиброблаотические процесс»!, так же ш и в предь&увдех сро-<, полностью отсутствуют.

Валочное строение печени восстановлено. В периферических »ах отдельных далек все еще выявляются средне-капельная *и-?ая дистрофия, в большинстве ае долек дистрофические измене-I не выявляются. В промежуточных »1 центральных отделах некоих долек встречается гепатоциты с зернистой дистрофией, всех отделах долек выявляются гипертрофированные тки, характеризующиеся грубо-зернистой цитоплазмой и крупны-гиперхромными ядрами.

На основании проведенных обще-морфологически* иоодедсва-I можно сделать заьлючение о том, что пероральное введение б

организм пестицида в течении 5 суток наряду с дисциркудягорными явлениями в системе аортальной вены, сопровождаются вираженина дистрофическими процессами на уровне клетки и субклеточных структур печени. Бри этом наибольшее структурные изменения в печеночных клетках отмечается на 1 сутки после 5-ти дневного введения в организм пестицида. Наблюдаемые изменения в некоторой степени восстанавливается лишь па V сутки после 5-ти дневной затравки. При одновременном введении антиощюлительнаго препарата гиспидина и пестицида, уже на..3-й сутки наблюдается частичное восстановление нарушенной морфологической картины печеночных клеток, при этом дистрофические и некротические изменения выражены слабее. .

На б и 7 сутки эксперимента печень опытных животных почти не отличается от таковш у контрольных.. Следовательно, гиспи-дин, восстанавливая ангиоксидантную способность печени, предупреждает развитие глубоких патологических изменений стромы и паренхимы печени.

В следующей серии экспериментов ш изучали влияние Харва-де - 25 ф на фосфолипидный состав.

Данные, представленные в таблице 1 показывают, что при действии пестицида на 1 сутки, после Б-дневной затравки, наблюдается достоверное снижение фосфотидилхолина (ФХ), фосфотм-дилзтанолаыина (ФЭ) и дифосфотидилглицерола (ДФГ) фракций, что приводит к уменьшению содержания суммы фосфолипидов, на фоне увеличения уровня ФК и лизопроивводных фосфасипидов. Следует отметить повышение содержания холестерина и соотношение ХС/Ф1 на 1 сутки после 5-дневной ватр-вки животных Харваде-2Б ф.

введение животным антйоксвдаита-гиспидина приостанавливает, вероятно, дальнейшую деградаций липидных компонентов митохондрий. Это приводит к частичному восстановлению до исходногс уровня пгюцентного соотиошеная ФХ, ФЭ и ДФГ фракций фосфолипидов, уменьшает уровень фосфзтидной кислоты и ливопроизводны) фосфолипидов. Однако суммарное содержание фосфолипидов находи ся на прежнем, низком, по сравнению с контролем,уровне,хотя соотношение ХС/ФЛ приближается к исходным значениям.

На 3 сутки после Б-дневной затравки животных Харваде-25 ( ко обнаружено кггаи-либо существенных изменений по сравнению <

Таблица 3

Влияние Харваде-25 ф и гиспидина на фосфолипвдкый состав митохондрий печени в 1-ые сутки после затравки ( в 7. к общему липидйому фосфору, Щя>, п-7)

(¿осДюлипиды | Контроль | Харваде-25 ф )Харваде-25 ф+ 1 1 | гиспидин

ФХ 42,5 ± 0,90 3S.6 + 0,56х 40,7 + 0,62

да ?гл ± о,51 30,1 ± 0,44х 31,3 t 0,26

ДФГ 14,4 + 0,33 13,0 í 0,31х 1-3,6 i 0,22

ас 3,3 ± 0,62 3,6 t 0,68 3,4 + 0,53

ФИ 2,S i 0,41 3,3 ± 0.54 3,1 i 0,41

СМ ' 0,9 + 0,27 1,7 i 0,65 1,4 ± 0,34

í'K 2,2 f 0,53 4,4 j 0,61х 2,9 + 0,56

ЛФЛ 1,2 í 0,65 3,8 t 0,32х 2,3 í 0,25

Ф.П мкМолъ 12,4 í 0,61 10,1 i 0,37х 10,7 + 0,31

ХС мкНоль 4.2 t 0.26 4,76 i 0.2.9

ХС/ФЛ 0,338 0,471 0.410

X - Р < 0,05

первыми сутками, хоти и наблюдается, некоторое снижение содержания некоторых Фракций фосфолшшдов и соотношения ХС/ФЛ, что происходит в основном за счет вероятно тенденции к увелечевд№ уронил суммы фосфолипидов.

При введении антиотезданта-гиспидина приводит к более ги пасшими, чем в первые сутки, изменениям в линидном составе митохондрии. Наблюдается восстановление до исходного уровня и;оиентного соотношения ФХ и Я9 фракций, однако суммпрное со-ц--ряаиие фоефодипидов но изменяется. Не обнаружены ивмененич я -оотнокении других Фракций фосфояипндов.

На У сутки после 5-дневной затравки жпротннх Хпрваде-26 ф (т-збл.2) таске г соблюдается снижение соотпсвепия ТХ, Ф? н -ДОГ {•ракций фосфолинидоп.однако эти ирмеиетга ме^ое внракеят», /меньшенно Ш фракции не достоверно.

Привлекает к себе внимание менее ныражонное увеличение« 1С» сравнен»*) с контролем содержании Ф!<. и лшюпротатцннх |ос-

фолипидов и снижение суммарной фракции фосфэлипцдов. Это сви детелъствует о том, что Харваде -Е5 ф не вызывает необратимы изменении в липидном составе митохондрий и после определенног периода возможно восстановление до исходного соотношения фос. фолипидного спектра.

Добавление антиоксиданта-гиспидина, вероятно, ускоряе процесс восстановления лилидного спектра. Это мы молем види по увеличению процентного соотношения ФХ, ФЗ, и ДФГ фракци фосфолипидов и снижения уровня ЯК н днзопроизводных фосфолипи дов при добавлении гиспидина на 7 сутки после затравки Харва де-25 ф.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют том, что пестицид Харваде-25 ф вызывает существенные изменен« в липидном составе митохондрий печени крью при многодневке затравил животных.

Однако, в отличии от других пестицидов является мене токсичным и через определенное время, возмоашо, восстановлен}! исходного соотношения липидов в митохондриалькой фракции пече ни крыс.

Таблица 2

Влияние Харваде-25- ф и гиспидина на фосфолипндный состав митохондрий печени крыс на 7 сутки после затравки (в 1 к -общему дипидному фосфору, n»7, Mim).

Фосфолипиды | Контроль . ¡ 1 1 Харваде- ■25 ф | Харваде-25 | гиспидин

ФХ 42.5 ± 0,00 40,1 ± 0,72 41,2 i 0,65

ФЭ •32V7 + 0,51 31,0 ± 0,44х 32,1 + 0,54

ЛФГ 14,4 + 0,33 13,9 ± 0,31 14.1 ± 0,25

<1С 3,3 ± 0,62 3,6 + 0,52 3,4 ± 0,48

■ т 2,8 ± 0,41 2,9 i 0,46 3.0 ± 0,51

см 0,9 ± 0,27 1,4 ± 0,35 1,6 + 0,44

ФК 2,2 í 0,53 3,4 i 0,61 3,8 + 0,38

ЛФЛ 1,2 0,65 2,6 t 0,48 1,8 + 0,35

ФЛ мкМолъ 12.4 t 0,61 11,0 t 0,21* 11,3 + 0,26

ХС мкМоль 4,2 i 0,26 4,7 i 0,32 4,3 i 0,33

КС/ФЛ 0.338 0. ,403 . 0, ,376

X - Р < 0,05

- е -

Обнаруженные изменения в липидном составе митохондрий при затравке животных Харваде-25 ф обусловлены, вероятно, дву).'.я основными причинами: инициализацией процессов ПОЛ и активацией эндогенных фосфолнпаз.

Известно, что ПОЛ подвергаются в оснавном липиды, имеющие в своем составе ненасыщенные жирные кислоты. В митохондриях такими лнпидами являются, чаще всего, Ф9 и Ш фракции фосфолипи-дов, в которых во втором положении находятся в основном поли-неласыщенные мирные кислоты. Вероятно и в нашем случае именно зти фосфолипвды, подвергшиеся свободно-радикальному окислении, затем легко удаляются из мембраны митохондрий. Так как окисленные фосфолипиды менее заякоренные в мембране, вследствие утраты своего разветвленного строения.

Потеря мембраной митохондрий подобных массивных фрашдай фосфолипидов приводит к снижению содержания суммы фосфолшидов и вероятно, к разрыхлению линндного бислоя, что в свою очередь делает доступным для эндогенных фосфолипаз отдельные классы фосфолипидов.

Обнаруженное в наашх исследованиях увеличение содержания диаопродуктов фосфолипидов приводит к дальнейшей деградации липидного бислоя, так как лизофосфолипвды обладают детергент-шдот свойства!«!.

Вероятно, именно в этот момент включаются адаптационные резервы гепатоцигов, которые предотвращают дальнейшую деградацию мембраны митохондрий. Одним из этих механизмов является, возможно, повышение уровня холестерина в митохондриях. Известно, что ХС. добавленный в бмелой иэ яасыщениых липидов, разжижает липидинй бисяой и сасазывает противоположный эффект на бислой из неназьщенных линвдов.

Действие антиоксиданта-гиспидина основано, вероятно, на улавливании свободных радикалов, которые образуются при неполном окислении кислорода в дыхательной цепи митохондрий, и таким образом цепная реакция свободнорадикадьяого окисления липидов затухает и прекращается дальнейшая деградация липидного бислоя.

Изменения Функционального состояния митохондрий лечит крыс при действии Харваде-25 ф и влияние на эти показатели гиспидияа.

Обиарудшнныо сдвиги в структурных компонентах митохондрий печены крыс при отравлении Харваде-25 ф предполагаются возникновение изменений и в функциональных свойствах.

В таблице 3 представлены результаты по влиянию Харваде-25 ф на параметры функционального состояния митохондрий печени через I сутки после 5-дневной затравки.

Таблица 3.

Изменения нашзателей функционального состояния митохондрий печени крыс, при действии Харваде-25 ф, и гиспидина чере» I сутки после 5-дневной затравки пестицидом.

( в наноат Ог/мин/мг. белка; п=*7, М±ш; Р < 0.05 )

Показатели! Контроль | Харваде-25 ф | Харваде-25 ф+ | | | Гиспидин

(субстрат окисления-сукцинат)

ъ 39,1 * 1,9 32,4 ± 1,6 38,6 1- 1,4

ъ . 120,0*3,7 91,7 ± 3,1 114,2 ± 2,9

и 42,4 ± 2,0 38,0 ± 1,7 40,6 ± 1,9

VoнФ 154,3 t 4,6 121,2 ± 3,4 142,5 ± 5,1

дк 2,83 * 0,07 2,41 ± 0,06 2,81 ± 0,05

да/о 1,91 ± 0,04 1,76 ± 0,05 1,86 $ 0,06

(субстрат окисления- й-кетаглутарат)

ч 27,4 ± 1,4 20,7 ± 1,0 22,1 ± 1,2

ъ 65,3 ±2,7 48.4 i 2,1 42,6 ± 3,1

; 26,9 ±1,3 23,7 ± 1,1 21,8 ± 1,4

\?Д,[ф 67,2 ± 2,9 53,4 ± 2,6 50,7 ± 3,1

дк 2,63 ± 0,06 2,26 ± 0,04 2,18 ± 0,04

АДФ/0 2,43 ± 0,06 2,04 ± 0,05 1,95 ± 0,06

Из представленных данных видно, что в случае использования в качестве субстрата окисления сукцината скорость дыхания ьш-сжондрий гепатоцитов в состоянии Vz и У4 уменьшается соответственно на 18,2. и 10,4%, а скорость фосфорилируодего окисления сукцината (Уз) - на 241. Это приводит к соответственному уменьшению величины дыхательного контроля па Чансу-Вильямсу и 1соэ34ициента АДО/0 на 14,9 и &%. Наблюдалось тагане снижение икорости окисления сукцината при добавлении в среду

инкубации митохондрий ДИФ, что указывает на возможное ингиби-рование при действии пестицида переноса электронов по дыхательной цепи.

Аналогичные эксперименты проводили и на 3-й сутки после 5-дневного введения Харваде-2Б Ф. Обнаружено, что Харваде-25 ф вызывает увеличении дыхания в состоянии Уг, Уз, Уднф когда источником субстрата окисления слудил сукцинат. В этих условиях дыхание митохондрий в состоянии не изменяется, что приводит к увеличению ДК на 5%. При этом отношение АДФ/О существенно не изменяется по сравнению с митохондриями выделенными из печени крыс через сутки после 5-дневного введения пестицида.

На 7 сутки после 5-дневной затравки, токсический эффект Харваде-25 ф на биоэнергетические процессы в митохондриях печени крыс заметно снижается: сукцинатный путь окисления существенно не отличается от контроля (табл.4). Однако в этот же срок исследования при использовании «-кетаглутарата в качестве субстрата окисления отмечается заметное увелечение дыхания во всех метаболических состояниях, по сравнению с предыдущими сроками исследования, хотя и остаются низкими по сравнен®) с контролем ('/э-на 15%, на 11%), вследствии чего наблюдается уменьшение ДК и коэффициента АДФ/О.

Таким образом, при отравлении организма пестицидом Харваде-25 ф в митохондриях печени замэтно подавляется дыхания и эффективность окислительного фосфорилкрования причем наиболее глубокое нарушение наблюдается в НАД'Н-зависимом участке дыхательной цепи митохондрий.

Введение гиспидииа крысам отравленным Харваде-25 ф на 1, 3-й и 7 сутки после Б дневного введения гиспидииа приводит к некоторому восстановлению нарушенных процессов дыхания и окислительного фосфорилирования. '

На 1 сутки после совместного введения гиспидииа с Харваде-25 ф (табл.3) наблюдалось незначительное снижение окисления сукцината в митохондриях гепатоцитов во всех метаболических состояниях на 5-8% по сравнению с контролем. В результате этих изменений наблюдалось недостоверное снижение сопряжения препаратов митохондрий, оцениваемое по величине дыхательного контроля и коэффициента АДФ/О.

Таблица 4

Влияние гиспидина на дыхание и окислительное фосфорилиро-ваиие митохондриях печени крыс на 7-ые сутки после

5-дневного введения 1/10 ЛДзо Харваде-25 ф (наноатоы .Ог/мг. белка/мин; n=7: Mim: Р< 0.05)

Показатели) Контроль; Г Харваде-25 ф | Харваде-25 ф( I I I Гиспидин

(субстрат окисления-сукцинат)

V2 40,9 1 2,2 38,1 t 1,4 39,3 i 1,3

v3 127,5 ± 2,0 121,4 ± 3,6 129,1 + 2,4

V4 44,6 i 1,8 43,8 t 1,5 43,5 t 2,1

УдНФ 147,2 i 1,8 138,6 ±3,2 144,6 t 3,5

дк 2,86 ± 0,05 2,77 ± 0,03 2,87 i 0,04

АДФ/0 1,89 i 0,04 1,85 ± 0,04 1,88 ± 0,05

(субстрат окисления- а-кетаглутарат)

v2 27,7 ± 1.6 26,2 ± 1,Б 28,1 i 1,6

v3 63,1 ± 2,8 58,2 + 2,4 64,6 + 3,1

Ч 26,1 i 1,4 23,3 i 1,2 25,2 t 1.6

УДНФ 65,2 ± 3,1 61,7 i 2,9 63,8 i 2,5

дк 2,61 * 0,05 2,50 ± 0,06 2,56 i 0,06

/да/о 2,44 t 0,03 2,31 ± 0,04 2,41 i 0,05

На 3 сутки после ежедневного введения указанного препарата в митохондриях печени крыс, затравленных пестицидом Харваде-25 ф„ Сиоэнергеитические показатели полностью восстанавливается до нормальных величии и практически не. отличается от показателей ннтактных еивотных.

При использовании ot-кетаглутарата в качестве- субстрата окисления при сочетенном действие пестицида и антиоксиданта, наблюдалось аналогичная картина как к при использовании сукци-ната.

Таким образом, совместное введение в организм животных пестицида Харваде-25 ф и гкспидина приводило к повышению скорости переноса ьяектронов ст сукцината до молекулярного кислорода и эффективности окислительного фосфорилирования. При атом окисление субстратов no HAJ.-H - зависимое/ пути и их АТФ симте-

-ируютая способность значительно уменьшались. ))а ная взгляд, воомотно при действии гиспидина происходит переключение дыха-■;?льной цепи с окислением по НАД"Н-зависимому пути на сукцн-ппттип путь.

Следующим этапом наиих исследований было сравнительное изучение Харваде-25 ф и гиспидина на активность полиферыентных систем митохондрий печени крыс.

В таблице 5 представлены данные по изменению активноотей ЯАД'Н, сукцинат и цитохрсмоксидаз митохондрий печени крыс яри действии самостоятельного и совместного с Харваде-25 Ф и гиспидина на 1 и 7 сутки после 5-ти дневного введения пестицида.

Из представленных результатов видно, что активность НАДН-оксицазной системы дыхательной цепи митохондрий более чувствительна к действию Харваде-25 ф . Так ее активность снижается на ЗОХ при пестицидном отравлении,в первые сутки тогда как снижение активности сукцинат-оксндазн и цитохром-с-гассвдазы в этих же условиях составляет 13 и 15 X соответственно.

Дальнейшее исследование динамики изменения активности полифермэнткых систем митохондрий печени на 7 сутки после 5-дневнего введения пестицида показало; что к этому сроку ин-гибирувдий эффект Харваде-25 ф на активности изученных ферментов выражен значительно слабее (см.табл. 5).

Талям образом, на основании полученных данных мсдаю заключить, что при действии пестицида Харваде-25 ф в митохондриях печени крыс наблюдается снижение полиферментных систем, что очевидно связано с ингибированяен скорости переноса-электронов в различных фрагментах дыхательной цепи. Наиболее значительной ингибнрование происходит по НАД-Н-оксвдазной ветви дыхательной цепи. Наблюдаемое явление не восстанавливается даже на 7 сутга? после 5-дневного отравления. Введение антиоксиданта-гиспцдина в организм отравленных крыс стабилизирует сукцинат-и цитоя-ром-оксидазнне системы дыхательной цепи митохондрий печени крыс.

Проведенные исследования дают основания считать, что Харваде-25 ф оказывает различной степени выраженности лнгкбнру»-

Таблица 5

Влияние гиспидина на активность полиферментных систем митохондрий печени крыс на 1-ые сутки после 5-дневного введения пестицида Харваде-25 ф в-дозе 1Л0 ДИ50 ( п » 6; М ± ш Р < 0.05 ).

|Активность, наноатом кислорода /ыин/ыг бедка

Показатель j —----

| Контроль | Харваде-25 ф | Харваде-25 ф II I + гиспидин

НАД'Н оксидаза 67 ' t 4 47 + 3 41 + 2

Сукцинат. оксидаза 124 i 6 108+4 116 i 5

Цитохром С-оксвдаза 171 t 8 146 t 6 158 i 7

Влияние гиспидина на активность полиферментных систем митохондрий печени крыс на 7-е сутки после 5-дневного введении пестицида Харваде-25 ф в доае 1/10 ЛДбо (п - 6; М + ш Р < 0.05).

(Активность, наноатон -кислорода /мин/мг белап

Показатель!----------------—-—

! Контроль I Харваде-ЕЬ ф | Харваде-2Г» ф

I

| + гиспидин

HAJÍH оксадаза 66 i 4

54 t 3

61 i 4

Сукцинат оксидаза

120+0 124 i 7

124 í 5

Цитохром

С-оксид аза 17Z + 8 168 +

.174 i 9

•у-.ъь дгйслше на оксвдааные систеш мембран шнтохондрий печени

Крыс.

Одной из причин вызывающей изменения состояния липидного бислоя биологических мембран может явиться нарушение скорости липидов-процесс, когда липиды клеточных мембран окисляются молекулярным кислородом до перекисей и других продуктов. Свобод-норадикальная цепь окисления липидов формирует один из путей, при котором кислород становится токсичным для аивых организмов.

Таблица 6

Влияние тисйидина на уровень ЬЭДА в митохондриях печени крыс на 1,3 и 7 сутки после 5-дневной затравки пестицидом Харваде-25 ф в дозе 1Л0 ДЦ50 (п-7; М- го)

| ?.ЩА ыюшлъ/иш/нг белка |

-;-1--—I-г-~т----I

Фракции1НАДФ.Н |аскорбат (НАДФ.Н |аскорбат 1НАДФ.Н |аскорбат | | зависимое | зависимое | зависимое | зависимое | зависимое | зависимое | ) 1 сутки | 3 сутки | 7 сутки )

Контоль +0.016 +0.010 +0.018 +0.0011 +0.017 ¿0.010

0.004 0.001 0.002 0.001 0.002 0,016

Харваде +0.043 +0.028 +0.030 ^0.020 '+0.022 ±0.014

25 ф 0.006** о. оде** 0.004* 0.002" 0.003 Л

Харваде

25 ф» 0.026 0.020 0.022 0.015 0.018 0.011

гиспидин + + ± ' 1 ± *

0.005 +0.002* +0.001 +0.001* +0,001 +0.001

** Р< 0,001; * Р< О, 05

В таблице б представлен^ данные по изменения уровня малонового диальрегида (ЩА) митохондрий печени интактных и отравленных Харваде-25 ф крыс.

На 1 сутки после 5-дневного введения Харваде-25 ф в митохондриях печени крыс увеличивается как ферментативное, так и

аскорбат-зависимое перекиснсе окисление липидов, в 2,7 и 2,8 раза соответственно по сравнению с контролем.

На 3 сутки после затравки пестицидом снижение в митохондриях НАДФ'Н-эаиисимого и аскорбатаависшого ПОЛ продалжается хота оро и менее выражено и составляет 1,5 и 1,8 раза по сравнению с контролем.

Разница в перекиснои окислении липидов между опытом и контролем становится ещё менее значимой на 7 сутки после 5-дневиой затравки крыс Харваде-25 Ф, Но в этом сроке значение ПОЛ не достигает контрольных величин, особенно ЮЛ протекающей по аскорбат-зависимому пути.

В следующей серии экспериментов исследовали действие ан-тиоксвданта-гиспидина на образование ЩА.

Показано, что в первые сутки после ежедневного ■введения гиспйдина б митохондриях печени аатравленных животных наблюдается снижение уровни МДА, НАДФ.Н -зависимое в О,Л раза, а аскорбат зависимое в 0,3 раза соответственно, хотя этот показатель остается высоким но сравнению с контролем. Ирм введении гиспвдина затравленным пестицидом Харваде-25 Ф крысам на 3 сутки наблюдается восстановление значение ферментативного ПОЛ достигающее почти исходных величии в митохондриях печени затравленных крыс. Отмечается также снижение аскорбат-зависимого ПОЛ по сравнению с уровнем ПОЛ ь 0,2 раза, которое но все же ке достигает уровня значение в норме. |1а 7 сутки в митохондриях печени крыс, аатравленных пестицидом Харваде-25 ф, наблюдается полная.коррекция в аскорбат-зависимом НОЛ после введения гисшдина.

Таким образом, результаты исследования показывают, что Харваде-25 ф вызывает стимуляцию аскорбат-зависимого НАД«- -В зависимого ИОЛ в митохондрий печени крыс, которое происходит, воздално, вследствие подавлению активности защитных ферментных систш (Глугатион-пероксидааз, СОД и т.д.). Введение антиокси-данта гкегшдина приводить к торможению процессов ГШ в митохондриях печени, вероятно, в результате улавливания активных радикалов и гашения цепной реакции окисления липидов.

ВЫВОДЫ

1. Введение Харваде-25 Ф крысам в течении 5-ти дней в дозе 1/10 ЛДйо приводит к. возникновению дистрофических явлений, сопровождающихся ультраструктурньши ивменениями.. На 7. сутки после введения препарата намечается тенденция к восстановлен™ структур« гепатоцитов. Введение гислидинз способствует неполь-ному восстановлению морфологической картины печени.

2. Установлено, что Харваде-25 ф вызывает снижение содержания ФХ, ФЭ и суммы фосфолипидов и повышает образование лизоформ фосфолипидов и ХС. Гиспидин' не увеличивает колотество фосфолишщов, однако восстанавливает их соотношения и уменшает уровень лизопроизводных фосфолипидов.

. 3. Харваде-25 ф вызывает ингибирование ддыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий печени крыс. Совместное введение гиснидина- и пестицида способствует почти полному восстановлению изученных показателей.

4. Обнаружено иигнбирование активностей шгаохром-с, cvk-■пшат и НАЛ" И- оксндаэных с!!стем при действии Харваде-25 ф НАД' Н-оксидаза по сравнению с другими оксидазачи подвержена более выраженному влиянию пестицида. Гиспидин полностью снимает эффект пестицида на сукщшат и цитохрсм-с оксидаз.

Б. Харваде-25 ф стимулирует реакции перикисного окисления липидов в митохондриях, протекающю по аскорбат и НАДО'Н-зависимом путям. Гиспидин снижает до нормального уровня образование малонового диальдегица по аскорбат-зависимому пути.

в. Механизм действия Харваде-25 ф, на функциональное состояние митохондирий имеет принципиальное сходство с механизмом действия высокотоксичных хлор-и фосфороргэпических пестицидов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Влияние Пегинола С-2000 на дыхание и окислительное фсхзфорилирорние митохондрий печени крыс, отравленных бутилглп-таксом /Р.Д.Рус.тамов, Б.М.Батиров, Д.С.Туйчиева, А.К.Мирахме-дов. // Еюлл. экопер. Биология и медицины.- 1992.

-Т. С. XIII. - N5. -С. 489-491.

2. Pest.icide effect on the morpbofiinctional properties arid enzyme systems of cell membranes. A.K.Mirakhmedcv, K.P.Oc-hilov. B.M.KaUrov, D'.Kh. Khnmidov / 5 th .International Cong-ross on cell Biology. Madrid ( Spain ). 26 th-31 st July, 1992. y.p. 148.

3. Hyzpldlne antioxidant effect on functional ztste of rat mitochondria upon intoxication of Harvade 25 F. А.К.Ш-rarhmedov, R.D.Rastawov, B.M.Batirov, K.R.Ochilov. 2.nd. JUBMB CONFERENCE Biochemistry of Cell Membranes.- Sertember 29-0cto-ber 3, 1993 Bari Jtali p.180.

4. Р.Д.Рустамов, Б.М.Батиров, А.К.Мирахмедов /У Влияние гнспидина на окислительное фосфорилирование и на уровень пере-кисного окисления дипидов мембран митохондрий печени крис. Узбек, биол. журнал.- 1994. -ИЗ., С. 3-6.

" Хужайрани антиоксидант химоя системасига ксенобиотикларви таъсири "маввусидаги диссертация шннкнг кисКача мазани.

Узоц ва»?г давошща к/хукалигвда, сакоатда ва маиший тур-мушда кУлладшшб келинаетгап пестицидларш* сувда, атмосфера ^авссида ва тупроода ййрилиб грятн атроф му^итнинг ^имоясида-ги хозирги аамоннинг энг долэарб муаымоларндан бири б^либ цол-мок>да.

Шу ыуносабат била»! Хсфваде-25 ф пестицидининг митохондри-яда кечадиган айрим жараенларга таъсири ва келиб чи^адиган уз-гаришларни гиспидин антиоксидантини куллащ билан тугри йулга солиб юбориш имкониятлари ачикландн.

Таъсмр кучи унча катта булмаган Харвгде-25 ф иестициди ^улайра пардаси фосфслипид таркибида ва калачуш жигари vitro-хондрияск функционал ^олатида сеэилардн узгаришгар кшшкн цайд этилди. Антиоксидантлик хусусиятнга зга булган гиспидин-ирепе-ратиникаламушларга юборилиши юкори даражали липидларни перекисли оксицяашш жграЗнини пасайювига ва бу аса уз навбатила житар ^удаираларк митохондрияларидаги ферментлар фаодлигини, нафас олишни шикастланган холатларини тнкланииига олкб келади.

Олинган натижал-зр асосида Харваде-25 ф нинг митохондрия-ларга таьсир механизми за^арли гггьсири кучли булган пестицид-лардан принципная жинатдан фарк 1$илыасдшгини ва гиспидинни юкори антиоксидантлик хусусияти тугрисида шунингдек уни орга-низмда липидлар перекисли оксидлаяиши сабабчи буладиган касал-лик ^олатларида кулла® максадга мувофик деган хулосага келинди.

Antioxidant system of protection under the effect of xenoblotics

Accumulation In soil, food products, atmosphere and water characteristic of pesticides used in agriculture, Industry and every day life for a long time, is cosntituted now the global ecological problem.

In this connection it is important to study mechanism of "Harvade-25 " pesticide action on some mitochondrial processes and to find the possibility for correction of the discovered disorders by means of an antioxidant - hispidine.

it is.establisshed that low toxio " Harvade-25 " pesticide causes considerable disorders in nsemhrpne phospholipid era»-position and in rat liver mitochondria functional state, Administration to rats of hispidine characetrized with antioxidant properties gave lipid peroxidation increase, which in Its turn leads to the restoration of the disordered respiration and activity of hepatocyte mitochondrial enzymes.

On the basis of the results obtained the conclusion has been made that mechanism of ,v Harvade-25 " action on mitic-hondria does not differ frcn the one Gf highlu toxic pesticides. Hispidine has been estimated to possess high antioxidant property to be used under pathological state of organism, ao-coBpanied by lipid peroxidation increase.

IIOTrWnitl !" ПСЧЯТ1, •••'•'.•

<!)»1}>млт Глмагн 60X81!Vr,. !:>«дгл nniorpruf скпя »Nj !. Iîu-мгь *ГОГЛПРИПТ». ОГ>мм < Tup.iJK - * .Ч.чк;« /«.'»' ••

Тштогряфпд ii.i.iaTC.itiCTn;» «ф<ш* ЛИ ÍVмужики, УиЧикган. 70017Г. Т;никсиг. гр. M П>г«.к(м«, 79. .