Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антиоксидантная активность тканей адаптированных к холоду крыс при гипотермии и самосогревании

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гасангаджиева, Азиза Гусейновна, Махачкала

МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ДАГЕСТАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Гасангаджиева Азиза Гусейновна

АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ТКАНЕЙ АДАПТИРОВАННЫХ К ХОЛОДУ КРЫС ПРИ ГИПОТЕРМИИ И САМОСОГРЕВАНИИ

специальность 03. 00. 04 - "биохимия"

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Заслуженный деятель науки РФ и РД доктор биологических наук, академик РАЕН Эмирбеков Э. 3.,

кандидат биологических наук, доцент Львова С. П.

Махачкала 1999

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................... 5

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Активные формы кислорода и антиокислительная защита тканей 10

1.2. Антиоксидантная система при адаптации к стрессу.......................28

ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Обоснование выбора объекта исследования...................................39

2.2. Постановка эксперимента..................................................................39

2.2.1. Экспериментальные модели...........................................................39

2.2.2. Способ достижения умеренной и глубокой гипотермии.............40

2.2.3. Самосогревание крыс, перенесших гипотермию..........................41

2.3. Препаративные методы исследования..............................................41

2.4. Биохимические методы исследования..............................................42

2.4.1. Определение суммарной антиокислительной активности...........42

2.4.2. Определение активности каталазы.................................................44

2.4.3. Определение активности супероксиддисмутазы..........................45

2.5. Статистическая обработка экспериментальных данных.................47

ГЛАВА III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Влияние многократного холодового стресса на интенсивность перекисного окисления липидов и состояние антиоксидантной

системы тканей......................................................................................48

3.2. Влияние умеренной гипотермии на состояние компонентов антиоксидантной системы тканей крыс..............................................53

3.3. Влияние глубокой гипотермии на состояние компонентов антиоксидантной системы тканей крыс...............................................67

3.4. Влияние унитиола и восстановленного глутатиона in vitro на активность супероксиддисмутазы и каталазы в тканях крыс, адаптированных к многократному холодовому стрессу при глубокой

гипотермии.............................................................................................81

3.5. Компоненты антиоксидантной системы в тканях крыс при самосогревании после глубокой гипотермии......................................88

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................98

ВЫВОДЫ.....................................................................................................126

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................128

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АОА - антиокислительная активность АОС - антиоксидантная система АФК - активные формы кислорода ГПО - глутатионпероксидаза ГР - глутатионредуктаза ГТ - глутатионтрансфераза МДА - малоновый диальдегид ПОЛ - перекисное окисление липидов СОД - супероксиддисмутаза С8Н - глутатион восстановленный

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последнее время все более актуальной становится проблема адаптации к низким температурам в связи с все большим проникновением человека в полярные районы земли и освоением природных ресурсов Севера и Сибири. Гипотермия широко используется в различных областях медицины и экспериментальной биологии, поскольку способствует снижению потребления кислорода тканями и устраняет влияние гипоксии и ишемии (Волколаков, Лацис, 1977; Мешалкин, Верещагин, 1985). Кроме того, для развития повышенной сопротивляемости организма в медицине используется метод холодового закаливания, который применяется для лечения, реабилитации и укрепления здоровья (Меерсон, 1993; Барбараш, 1996). Следовательно, изучение молекулярных механизмов влияние низкой температуры на теплокровный организм является одной из важных медико-биологических проблем.

Влияние холода и гипотермии сопровождается активацией окислительных процессов, что является важнейшим признаком биохимической терморегуляции у теплокровных животных (Хаскин, 1975; Соколовский, 1988), опосредовано вызывающих усиление свободнорадикальных процессов (Эмирбеков, Львова, 1985; Соколовский, 1988; Бородин и др., 1992).

Усиление свободнорадикальных процессов инициирует повреждающее действие низкой температуры на метаболизм и функции организма. Проявлению повреждающего действия свободных радикалов кислорода препятствует антиоксидантная система, которая обеспечивает связывание и модификацию активных кислородных метаболитов (Соколовский, 1988; Поберезки-на, Осинская, 1989; Дубинина, 1992). В связи с этим изучение динамики отдельных компонентов, их вклад в антиокислительную активность различных тканей в норме и при адаптации к холоду представляет значительный интерес.

В литературе имеются экспериментальные данные по адаптации к сильному постоянному холодовому стрессу на некоторые компоненты анти-оксидантной системы в отдельных органах (Куликов и др., 1988; Бородин и др., 1992; Дорошенко, 1995). Однако, отсутствуют систематические исследования, посвященные изучению состояния антиоксидантной системы при адаптации к прерывистому холодовому воздействию в динамике гипотермии разной глубины и длительности.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение суммарной антиокислительной активности, активности супероксиддис-мутазы и каталазы в больших полушариях мозга, гипоталамусе, печени, почке, миокарде, скелетной мышце и сыворотке крови крыс, не подвергнутых и подвергнутых многократному холодовому стрессу, при гипотермии и последующем самосогревании.

Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение влияния адаптации к прерывистым многократным умеренным охлаждениям на состояние антиоксидантной защиты тканей.

2. Исследование сходства и различия в динамике компонентов антиоксидантной системы тканей контрольных и адаптированных к холоду крыс на гипотермию разной глубины и длительности.

3. Определение суммарной антиокислительной активности, активности супероксиддисмутазы и каталазы тканей у самосогревшихся после перенесенной глубокой гипотермии крыс.

4. Изучение органно-тканевых особенностей изменения компонентов антиоксидантной системы при гипотермии разной глубины.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Установлено, что адаптация к периодическому (20-25-кратному) умеренному холодовому (-5°С) воздействию сопровождается усилением суммарной антиокислительной активности и активности каталазы, на фоне снижения активности супероксиддисмутазы.

2. Гипотермия разной глубины (30°, 20°С) и длительности (кратковременная и пролонгированная Зч) у животных, адаптированных и неадаптированных к холоду, приводит к изменению изученных компонентов антиоксидант-ной системы, проявляя как черты сходства, так и различия. Различия наиболее выражены при умеренной гипотермии и последующем самосогревании.

3. Добавление тиолов (глутатиона восстановленного и унитиола) in vitro в ткани гипотермированных (20°С) крыс способствует повышению активности супероксиддисмутазы у животных подвергнутых многократному холо-довому стрессу.

4. Обнаружены органно-тканевые особенности изменения компонентов ан-тиоксидантной системы при гипотермии в тканях мозга, особенно в гипоталамусе, где активность антиоксидантов поддерживается на высоком уровне. Наиболее значительное снижение компонентов антиоксидантной системы при гипотермии отмечается в скелетной мышце.

Научная новизна. В настоящей работе впервые проведены систематические исследования по анализу динамики компонентов антиоксидантной системы в различных тканях (большие полушария мозга, гипоталамус, печень, почка, миокард, скелетная мышца и сыворотка крови) теплокровного организма при гипотермии и последующем самосогревании. Эксперименты проведены в сравнительном аспекте у крыс контрольной группы и у животных, адаптированных к многократному (20-25 раз) периодическому (ежедневно по Зч) холодовому стрессу (-5°С).

Установлено, что адаптация крыс к периодическим Холодовым стрессам приводит к росту в исследуемых тканях суммарной антиокислительной и каталазной активности и снижению активности супероксиддисмутазы.

Обнаружено, что гипотермия разной глубины (30° и 20°С) и длительности (до Зч) у животных неадаптированных и адаптированных к воздействиям холода выявляет сходства и различия в изменении исследованных компонен-

тов антиоксидантной системы тканей. На всех этапах гипотермии крыс обеих групп суммарная антиокислительная и каталазная активность поддерживается на достаточно высоком уровне. Наиболее значительным изменениям при этом подвергается тканевая активность супероксиддисмутазы.

Выявлены органно-тканевые особенности в динамике суммарной антиокислительной активности и активности каталазы при гипотермии и последующем самосогревании: в больших полушариях мозга, гипоталамусе (понижаются в наименьшей степени) и в скелетной мышце (понижаются в наибольшей).

Впервые показана возможность химической регуляции активности супероксиддисмутазы в экспериментах in vitro с добавлением антиоксидантов (глутатиона восстановленного и унитиола) при гипотермии у крыс, адаптированных к многократному периодическому холодовому стрессу.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные представляют интерес для понимания механизма патогенеза холодового повреждения и формирования адаптационных механизмов к длительному действию холода на теплокровный организм. Результаты работы указывают на возможность применения адаптации к холоду в системе лечебных и профилактических мероприятий. Практическая значимость данного исследования определяется возможностью использования ряда изученных показателей антиоксидантной системы для оценки состояния организма, адаптированного к холоду, перенесшего гипотермию.

Материалы, полученные при выполнении данной диссертации, используются в учебном процессе кафедры биохимии ДГУ, при чтении ряда спецкурсов и проведении больших практикумов. Методические аспекты работы включены в учебное пособие "Практикум по биохимии" для студентов по специальности "Биохимия".

Апробаиия работы. Материалы диссертации докладывались на итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава ДГУ

(1996 - 1998), на II съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), на 12 Европейской нейрохимической конференции (Санкт-Петербург, 1998), на совместном заседании кафедры биохимии и НИИ биологии ДГУ (Махачкала, 22 октября 1998).

Публикации. По материалам данного исследования опубликовано 8 работ и 1 статья находится в печати.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Активные формы кислорода и антиокислительная

защита тканей.

Для высших форм жизни очень важно наличие в среде обитания молекул кислорода, реакция восстановления которого до Н20 составляет основу биоэнергетики человека и животных (Ленинджер, 1985; Баблоянц, 1990).

Вместе с тем, О2 является чрезвычайно химически активным соединением, оказывающим при определенных условиях токсическое действие.

Агрессивные свойства кислорода определяются строением его атома и молекулы. Наличие на внешнем энергетическом уровне двух неспаренных электронов и незавершенность орбиты являются причиной образования активных форм кислорода.

В норме основная масса потребляемого кислорода подвергается четырехвалентному восстановлению цитохромоксидазой с образованием молекулы воды, без высвобождения активных интермедиатов. Наряду с этим, в клетке протекают реакции одно-, двух- и трехэлектронного восстановления кислорода в результате само- и энзиматического окисления соединений с образованием активных форм кислорода (АФК): О2 - супероксидного анион радикала, 02* - синглетного кислорода, -ОН - гидроксильного радикала, Н02- - пероксидного радикала, Н202 - пероксида водорода, NO- - нитрора-дикала (Абрамова, Оксенгендлер, 1985; Арчаков, Мохосоев, 1989; Пескин, Столяров, 1994; Меныцикова, Зенков, 1997).

Несмотря на короткий срок жизни (от ~ 8-10"9 до ~ 1-10"6с), АФК успевают запустить цепные реакции, приводящие к образованию органических (R-), алкоксильных (RO) и перекисных (ROO) радикалов (Владимиров, Арчаков, 1972; Соколовский 1988).

АФК являются активными участниками большинства химических процессов, протекающих в клетке, играют важную роль в ферментативных реак-

циях (Соколовский, 1988; Меныцикова, Зенков, 1997). Поэтому процессы генерации АФК при достаточно низкой их интенсивности относятся к нормальным метаболитическим процессам (Соколовский, 1988; Болдырев и др., 1995; Пескин, 1996; Меныцикова, Зенков, 1997). Образуются они во всех клетках, которые используют кислород. Примерно 5% всего поступающего в клетку кислорода расходуется на образование АФК, а 95% - на биологическое окисление (Коган и др., 1997; ВуегкоуБку, Оезпег, 1988). Свободнора-дикальное окисление происходит в электронно-траспортной цепи митохондрий и при микросомальном окислении, т.е. в результате процессов связанных с транспортом электронов не на кислород (Соколовский, 1988; Владимиров, 1989; Болдырев, 1995).

Пути генерации АФК весьма разнообразны (Абрамова, Оксенгендлер, 1985; Зенков, Меныцикова, 1993). Один из возможных путей образования свободных радикалов состоит в одноэлектронном восстановлении молекулярного кислорода ионами двухвалентного железа:

02 + Ре2+-±Н^Ре3+ + П02-

Одноэлектронное восстановление кислорода может приводить и к появлению другого свободного радикала - супероксидного анион-радикала (О 2~): 02+е-->02-

Супероксидный анион-радикал, так же как и Н202, сам по себе мало активен по отношению к молекулярным компонентам клетки. Однако, в присутствии Бе2+ эти соединения вступают в реакцию Хабера-Вейса с образованием гидроксильных радикалов (Владимиров, 1989):

Ре3+ + Бе2+ + 02 Ре2+ + Н2Р2 Ре3++ ОН" + ОН

02~+ Н202 о2 + он~ + он

Образование радикала -ОН возможно также в результате реакции Фен-тона (Владимиров 1989, Болдырев, 1995; Меныцикова, Зенков, 1997):

Fe24" + Н202 -> Fe3+ + ОН" + -ОН Fe2+ + ROOH Fe3+ + RO- + ОНг

Супероксидный анион радикал (OJ ) является первичным интермедиа-том ионно-радикального окисления, сопряженного с образованием активных свободных радикалов -ОН, ROO-, R\ Супероксидный анион-радикал образуется в ходе одноэлектронного восстановления кислорода. В тканях супероксидный анион-радикал генерируется: при неферментативном спонтанном самоокислении ряда химических соединений, особенно при наличии в их составе металлов переменной валентности; как основной или побочный продукт при ферментативных окислительно-восстановительных реакциях, протекающих в присутствии 02; при, так называемом, «дыхательном взрыве» в процессе фагоцитоза (Дубинина, 1989; Зенков, Меныцикова, 1993).

В живых системах 0~ представляет собой промежуточный продукт многих биохимических реакций, таких как окисление тиолов, флавинов, хи-нонов, катехоламинов, птеринов, а также метаболизма ксенобиотиков (Соколовский, 1988; Зенков, Меныцикова, 1993). Однако основные источники его образования - ферментативные системы: NADF-H-оксидаза фагоцитирующих клеток, ксантиноксидаза, митохондриальная цитохром-с-оксидаза и микросомальные монооксигеназы (Биленко, 1989; Владимиров, 1989; Пес-кин, 1996; Коган и др., 1997).

В клетке содержится незначительное количество супероксидного ани-12 11

ханизме зрения, нервного возбуждения и др. (Гусев и др., 1980; Гусев, Пан-ченко, 1982; ВеИеуШе-ЫаЬе!, 1995). Кроме того О^ который образуется в результате активации КАБР-Н-оксидазы фагоцитов, играет важную роль в реализации ими микробоцидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия.

Перекись водорода (Н202) относится к окислителям средней силы. В отсутствии ферментов разрушающих её, она относительно стабильна и может мигрировать в клетки и ткани. В живых организмах основным источником Н202 являются ферментативные реакции с оксидазами: ксантиноксида-зой, оксидазой Ь-аминокислот и другими. Н202 образуется также в результате реакции дисмутации, катализируемой супероксиддисмутазой. Около 80% Н202 генерируемой фагоцитами в очаге воспаления, образуется в результате дисмутации супероксидного анион-радикала супероксиддисмутазой (Меньшикова, Зенков, 1997).

Гидроксильный радикал (ОН-) является наиболее реакционноспособ-ным из АФК, наиболее долгоживущим (по разным оценкам от 2-10"9 до 8-10"9с) и токсичным для биологических систем: он может разрывать любую С-Н- или С-С - связь (Зенков, Меныцикова, 1993).

ОН- радикал образуется в реакциях окисления арахидоновой кислоты, в реакциях Хабера-Вейса, при микросомальном окислении, в реакциях с флавиновыми ферментами и Со(^, однако, основным источником ОН- в биологических системах служит реакция Фентона с участием металлов переменной валентности, главным образом Бе2+ (Владимиров, 1989; Сидорик и др., 1989; Зенков, Меныцикова, 1993).

Радикалы ОН- участвуют в микробоцидном и цитотоксичес�