Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АНТИБИОТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА КАК ФАКТОР УСТОЙЧИВОСТИ ЯБЛОК К ФИТОПАТОГЕННЫМ МИКРООРГАНИЗМАМ ПРИ ХРАНЕНИИ

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "АНТИБИОТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА КАК ФАКТОР УСТОЙЧИВОСТИ ЯБЛОК К ФИТОПАТОГЕННЫМ МИКРООРГАНИЗМАМ ПРИ ХРАНЕНИИ"

Московский Ордене Левина в Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет имени М.В.ЛОМОНОСОВА

биологический факультет

V На правах рукописи'

Быкова -у*у:

Татьяна Дмитриевна '-V."

антибиотические вещества как фактор устойчивости яблок

к фитопатогенным микроорганизмам при хранении :

(03.00.05 - ботаника)

■ Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических на>к /

Москва - 1976

Московский Ордена Левина л Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет имени М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

БЫКОВА Татьяна Дмитриевна

АНТИБИОТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА КАК ФАКТОР УСТОЙЧИВОСТИ ЯБЛОК К ФИТОПАТОГЕННЫМ МИКРООРГАНИЗМАМ ПРИ ХРАНЕНИИ

(03.00.05 - ботаника)

Автореферат

диссертации на сонскашш ученой степени кандидата биологических наук

/ .....- ЛоЖ^'

Москва - юте |

Работа выполнена в лаборатории иммунитета растений Ордена Ленива Института биохимия ям.Д.Н.Баха АН СССР к в лаборатория холодильной технологии растительных продуктов Всесоюзного научно-иссдедо вате льсжого Института холодильной проиыаигеяности.

Научные руководители:

доктор биологических наук О.Л.Оверечковсвая кандидат технических наук Н. А. Моисеева

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук,

профв ссор Е.П.ижрокоа

кандидат биологических наук Г.Д.Успенская

На официальный отзыв работе направлена в Главный Ботанический сад АН СССР.

Автореферат разослан 1976 г.

Зацита диссертации состоится " » 1976 г. в

' II . ;

15"часов на заседании Специализированного Ученого Совета № 5 Биологического факультета Московского Государственного Университета по адресу: Москва, 117234, Ленинские Горы, Биологический факультет 11ГУ.

и диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета ИГУ.

Ученый секретарь

/Я. о. Александрова /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Удовлетворение потребностей населения в свежих плодах,-а консервной промышленности в свежем сырье,- неразрывно связано с успешный решением проблемы длительного хранения плодов. В условиях современного производства это представляет собой сложную задачу, так как многие методы хранения, вполне удовлетворяющие требования« небольшого хозяйства, оказались неприемлемыми, когда возникла необходимость г хранении огромного количества плодов разных помологических сортов, к току же часто убираемых при неслагоприятншс погодных условиях. В связи с этим появилась необходимость в коренном усовершенствовании существующих методов хранения, а также в разработке новых, позволяющих максимально использовать защитные механизмы естественной устойчивости плодов к фитопатогенным микроорганизмам.

Хотя изучения устойчивости посвящено большое количество работ, биохимические механизму, определяющие разную степень устойчивости плодов, до сих пор остаются еще мало исследованными, а между тем без ;их детального изучения трудно разработать эффективные методы управления устойчивостью с целью сокращения огромных потерь, все еще имеющих место при хранении плодов. Этим и определяется актуальность проблемы, которой посвящена настоящая работа.

Цель и задачи работы - сформулированы во введении настоящего автореферата.

Научная новизна.

Показано, что однлм из важных механизмов устойчивости яблок к фитопатогенным микроорганизмам при хранении является их способность продуцировать фитоалексины. Впервые ус-

таковлено, чю разная степень устойчивости, обусловлена? . как генетическими особенностями плодов ( сортов ), так и условиями их хранения,"связана с количеством образующихся фитоалексинов и стелены» их деградации патогеном, В инфицированных тканях найдено фунгитоксическое вещество ароматической природы, содержаиее основную группу.

Практическая ценность.

Проведепные исследования позволили определить новые биохимические подходы к выбору режииа хранения плодов. -На примере яблок показано, что оптимальный режим хранения, с одной стороны, должен быть основан на'поддержании на достаточно высоко« уровне способности плодов продуцировать фи-тоалексины, а с другой стороны, на подавлении способности паразитарных.микроорганизмов деградировать образующиеся фитоалексины. Полученные данные могут служить основой для разработки объективных методов оценки степени устойчивости плодов при хранении и прогнозирования возможных сроков и режимов хранения.

Апробация работч.

Основные положения рэботч апробированы при выборе оптимального температурного режима хранения яблок..

Материалы диссертации доложены на Ш Всесоюзном биохимическом съезде, 1974 г., Рига,* не 1 и "ПВсесоюэ-• ных научно-технических конференциях молоды специалистов, 1973 и 1975 гг., Москва; а также на Ш Международном конгрессе по холоду, 1975 г,, Москва.

Структура и объем диссертации.

.Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав, в которых изложены результаты экспериментальных исследований, и выводов..Объем работы -'107 страниц машинописного текста, 25 рисунков, 15 таблиц.' Биолиография включает'26-советских работ и !ПЗ'иностранных.

ВВЕДЕНИЕ

Послеуборочное со ере ванне плодов к кх способность сопротивляться жнфекцжонвым аайоЕвваакя* аамсит от генетических особенностей оорта, состояния плодов в момент сына* а также от условий ж длительности хранения. Одним жа основных факторов» ограничивающим возиохяость длительного хрвнеатя плодов, является жх поражение фжтопатогеннниж микроорганизмами.

Известно, что вс* сорта яблок обладают ишь отвоовтельяой устойчивостью х фжтопатогевным микроорганизмам, поражащим кг при хранения. Тек же менее, ато жх свойство в значительной сте-пежж определяет успех хранения. lax как применение фунгицидов в процессе хранения плодов недопустимо в силу высока! остаточной токсичном«, ю в основа успемной зажиты плодов от инфекционных заболеваний должна лежат» присущая растительны« тканям естественная устойчивость* В связя с этим познание механизмов естественной устойчивости плодов с целы» жх регулирования представляется особенно важным.

Согласно современным представлениям о биохимической природе фжтоямиунятета, одним жа важных механизмов аациты служит способность растений продуцировать в ответ на жнфицжрованиа антибиотические вецзства - фи ТО алексины / ЦиПег » Borger , 1940; erulcVBhanlf , 1963; xomiyam*» 1970; Ku5 , 1972; Нет-ликий.Оверецковская, 1973/.

Исследовании рои антибиотических вежеств в устойчивости яблок к фнтопатогевняы микроорганизмам и посвядеаа настоящая работа, аадачамн которой являлось:

I. Установить, существует ли корреляция между фятоалехсин-иой активность» яблок ж степень» ихустойчивостк к фвтопатогенным микроорганизмам при хранении.

Выяснить природу вежа ста, обусловлявакцкх антибиотическую активность яблок.

Пользуюсь случаем выразить глубокую признательность заве-дуюцему лабораторией жкмулятета растений Института биохжмиж им.А.Н.Еаха АН СССР профессору Льву Владжмировячу Иетлжцкому ва постоянное внямавже к работе к цешшв советы.

Объекты и метода исследования

Объектом исследования слухели яблоки относительно устойчивых в хранении лоэдне-знмних сортов Ревет Симиревко, Ренет жам-паасниИ ж менее устойчивого сорта Кальвиль снежный.' Опытные пар-

ыл яблок хранил в каперах ВНИХН* Система охлаждения хакер смешанная; воз душа я с шшоадо аондиодоваров в панельная - с помощью рассольных (этиленгдысоль) батарей, уложенных в станы, пол , потолок и отводящих внелние теплопрятоки. Внутреннее тепловыделения отвадились кондиционерами, расположенными в . антресолі над камерами н связанными о ниш воздутоводамі. Температура и влажность воздуха в каперах регулировались автоматически. Температурно-вдажаостный режвм контролировали термометрами сопротивления, расположенными в различных настах мта-Селя, а также недельными термографами и гигрографами, установленными в центре камер.

Система оіжажденія холодильных камер н средства автоматического регулирования обеспечивали стабильность параметров технологического режима хранения плодов как в объеме камер, так н во временя: колебания средненеоячной температуры составляли 0,2-0,3°С, относительной вдахзостм воздуха - 2-3%, температура плодов в ятабелях различалась в пределах 0,2-0,3°С.

Для подавления жизнедеятельности фнтопатогенных микроор-гавмэмов щ торкожекия процессов послеуборочного созревания плодов нх целесообразно хранить при возможно более низкой температуре, искаючавще* подмерианне тканей. Такой точки зрения придерживается больщмнство исследователей, давние которых убедительно подтверждают, что длительное воздействие субкриос-копических температур (т.е. температур ниже точки аамарзанин плодов) необратимо повреждает плоды /riaicie et al , 1974; Brown *t d , 1974; Tumaki , пгіСані, 1974; Моисеева ж др., 1975; Труды Ыеидународного Института холода,1967, 1973/.

Однако в последние годы появились сообцавия о лучшей сохраняемости многих вимних сортов абдок при температурах ниже точки их замерзания. Указывается, что при условии постепенного понижения температуры до -2 ♦ -З С, образование льда в тканях плодов не является для нхх губительным м при последующем медленном оттаивении подмороженные плоды восстанавливают свое походное качество /Головкин, Цветков* 1965; Головкин, Черныяев, 1970; Бруе в, 1966, 1973/. Существование диаметрально противоположна точек зрения по одному мз центральных вопросов проблемы длительного хранения плодов н явилось одной из причин на-v стоячего исследования.

В навей работе плоды хранили лрн следующих средних темде-

ратурных режимах: гнжекриовкояичесвом -1,3°С (на 0,S°C suie точки замерзания ибдов), иуоириоскопическом -2,3QC (на 0,5°С вое точки замерзания яблок). В последнем гаркавте яблока находились в подмороженном состояния. Контрольные плоды хранили пря нулевой температуре. Относительная влажность воздуха в хакерах поддерживалась на уровне 90%.

В целях адаптации плодов к субкриоскошіческям температурам, а после гранения- в положительным, температура s каперах опиралась постапевно с 2t3°C до -2i—3°С в течение 5-6 недель, а за 2-3 недели до окончания хранения столь ха постепенно по-выиалась*

Плоды инфицировали конидиями вирулентного ж авирулентного втаммов во а буди те ля плодовой гнили яблок ltonllia fructigena fere 8 также зооспорам pbytopbthora in£»at«inû (Mont) . de Eary • Выбор U.fruotigena в качестве основного возбудителя «вфекционных болезней яблок был основан на ранее проведенных наш не следованиях, согласно которым 30-40Jt похерь плодов при холодильном хранены относятся se счет этого патогена. рь.infestons . наоборот, использовали ъ качестве паразитарного гриба, не являвшегося патогеном яблок.

Суопензя) опор паразита получали яра вшмш жх е поверхности культур11 гриба, вырадепного з течение 7-Ю дней па карто-фельяо-глююэкоЯ { M.fructlgeEa ) «ля овояяо! (Ki. infestaoa ) агариэмро ванных средах. Плотность суспензии подсчитывали в камере Горявва. Основная часть исследований выполнена о суспензией, содержащей 7х105 ков./мл.

Дія получения дяффузатов яблок использовали метод "инфекционных лунок" /Иатлнцхяй ж др.,1973/. Вымытые ж простери-ливованные плоды разрезал» з поперечном направлении. На поверхности среаов вырезали полусферические лунки (диаметр I см). Разрезанные яблока помещали в увлажненные кристаллизаторы при комнатной температуре * Через сутки s лункя валивали годну» суспензию спор паразита. Контрольным вариантом служили лунки, заполненные годоі. lepes 18 чесов жидкость из лунок (диффуэаты) ообирали, центрифугировали при 1000g для удаления проросших спор ж испытывали, на Фуыглтоксичность.

* Втаммы гриба были льСевно предоставлены нам каад.бкод.наук Т.Н.Хохркковой (отдел иммунитета ВИР им.Н.И.Вавилсва).

Предполагается,что в контрольные диффуэатн аулу* проникать антибиотические вдцэсгва, присутствующие г интактной ткани в образующиеся в вея в ответ на механическое поранение, тогда как в составе ошиннх диффузатов, кроме того, будут присутствовать антибиотики, воэаикаювде в плодах в ответ на инфицирование - фитоадакскны. Поэтому разница в фунгитоксичноети опыт-ша я контрольных диффуватов принималась за .величину фжтоалек-сняной активности.

Для измерения фунгигокситносги /Эзерецковекая и др., 1968/ в контрольные и опытные диффузаты вносили сяоры гриба, выбранного в качества тест-объекта. На поверхность прадметното стекла помечай наддю диффузатов со спорами объемом 0,01 их. Капли накрывали покровным стеклом, края которого парафинировали. Стекла помечали в чаикд Петри a тариостатироваш при температуре 15°С, Через 18 часов под микроскопом ЫБИ-6 подсчитывала чио-яо проросших спор и эамаряли длину образовавшихся гиф (с помощью окуляр-микрометра). Каждый вариант опыта ставили в трех повторвостях с подсчетом 100 спор аа стекле.

В качества тест-обьекта использовала десятидневную культуру УцзаПша aolani (ilart) Арр. et Wr , КОНИДИИ ' которого неприхотливы в прорастании и относительно велики по размеру, что облегчает их макроскопирование. Культуру í, eoiani выращивали на овсяно-агаровой среда.

Диффузаты пятикратно экстрагировали диатхлоши эфиром до 15 шгаут аа качалке в отиооапиа 1:1 (об:об). Для разделения экстрактов в тонком слое применяли пластинки " siluíoi * (фирма Avallar c^eaboslovakia ). Сна темы ра отворите лей, используемые для разделения, и проявители указаны в тексте.

Дан определения фунгятоксачиости отдельных веществ ва хроматограниах, один из двух идентичных рядов хроматограшш проявляла. Зоны сихякагеля другого ряда, соответствующие по хроматографической подвикностл проявленным веществам, счищали о пластинка а экстрагировали (до полноты извлечения) дазтило-вьш зфаром. Подобен» sa образом элиировали вкеяне пустые (не содержание проявленных веществ) зоны, располохеаные между об-нарушенными соединениями. Элватн концентрировали до одинакового объема к испытывали на фуигитохончаость. Для испытания фуягитоксичности использовали модификации уха описанного микроне года СЗереЦКОВОЕОЙ я др. /1966/.

Все дашшэ оо определения фувгятокситаоота обрабатывай стетистичэсжи, принимая вероятность безояибочного прогнова при р * 0,95 /Плохшгскяй, 1970/.

Вторым методом испытания антигрнбной актявяости, использованным в работе, был катод бноавгографня / Пагщжп , Senfosd. * 1968/. После громатографнчэ с ко го разделения снеси вецэсхв в тонком сдое пластинку выстаивали вод вентилятором Я ОПрЫСКИВалй ГуСТОЙ СуСПенВИеЖ СПОр Clsdcsporluia врр. в жидкой среде Чапека* Суспеази» получали при смывания жидкой средой Чапека культуры гриба, выраяенной в течение 7-10 дней на овсяво-аг&ровой среде. Воохе трехдневной янхуб&цяя во влаж-аой .камере гриб распространялся по пластинке и начинал спороносить. Темные спори гриба появлялись по ввей пластинка, кроме мест, где находились антибиотические вецестве*

Содержание фенольных соединений определяли по метод; Свейяа м Хиллиса / seaia .uixila « 1969/. Уф-спектры ве-цастз снимали не спектрофотометра " spacosd ov via

Ревтдьтазн я их обсуждение

I* фнтоадексинная активность яблок как показатель степени жх устойчивости ж фитопатоганшш микроорганизма* при хранении

Неоднократно отмечалось, что при сильной инфекционной нагрузке ранее устойчивые растения начинали в той иди иной маре поражаться фитопатогеянымж микроорганизмами / toaiy-

«йа, , 1967/. С мой точки зрения представляло интерес выявление завясимостя образования антжгрибних веществ от споровой нагрузки патогена. Результаты проведенного ванн испытания приведены в таблице I.

Таблица I

Влюшиа инфекционной нагрузки tufruatiesna. на фито-алексиннуп ажтяваость диффузатов яблок (сорт Ренат Сидоренко)

Плотность Длина гкф

Диффузатк Птзим K.fructlgeaa ков./ил ItK % от контроля

Контрольные - 12,55*2,70 100

Продолжение таблицы I

7xI03 3,3**0,64 25 Опытные Авирудентный 6х105 б, 54 ±1,58 66

7хЮ5 I3,40¿2,76 105 Опытные Вирудентаый 8x10s I^,99±2,30 118

Оказалось* что максимальное подавление роста гиф тэст-обгакта промоходило при инфицировании яблок сyeneдаже! авирулентного штампа u.fructigena малой плотное»!, содержа-neft 7х103 кон./мл. При увеличении нагрузи в 100 раэ фунгшток- ■ оичяоетъ диффуэатов уменьшалась (роат гиф увеличивается в 2,5 раза). При илфжцяровании яблок вирулентны* втаммом u.rruc-tigen* , независимо от испольвоваяноД нагрузки, место подавления происходило стимулирование роста гиф по сравнению с контролем, чю свидетельствовало о подавление реакции устогчи-вости. Проведенные вами испытания искусственного заражения яблок при использовании различных нагрузок подтвердим полученную закономерность»

Зависимость образования фжгоалвксияов от инфекционной нагрузки фитолатогаиов била раков продамонстрвровава на примерах других раотениВ / Crulckflhanlt , 1962; Qthm * 1959,1960; Нетлицкий, Озерецковская, 1973 ш др./. Результаты определений свидетельствуют о том« что максимальное количество фитоалекси-яов образуется линь при строго определенной инфекционной нагдр-ка. Вшю я ниже этой концентрации количество фатоалекеннов снижается, Повидимому, при слизком палых нагрузках патогенов образуется недостаточное количество индукторов, вызывающих защитные реакция растения, тогда как большая нагрузка подавляет сам изданием защитных реакций.

Полученные нами данные обосновывают также необходимость тщательной деанафехции уборочного инвентаря, упаковочных н складских помецениа с целью предупреждения сильного обсвнелеяия плодов спорами фитопатогенных микроорганизмов.

Следующая серия опытов ставилась с целы» выяснить, как отличается различные по устойчивости сорта яблок по способности продуцировать фитоадексины. Для этого использовали три сорта плодов: относительно устойчивые сорта яблок Ренет Симаренко и Ренет ЕвипанскиЯ я менее уотовчввый сорт Кальвиль снежный.

Для Проверим степени УСТОЙЧИВОСТИ ОСЗВДСТйЛЯЛИ исвусст-венаое заражение плодов 2 сортов вирулентны« итаымом и.£гис-*іе»па . Проведенная через 5 дней оценка результатов инфицирования показала* что средний диаметр распространены инфекции J яблок сорта Ренет Симиренко составлял 20±1,6 ми, тогда как у плодов сорта Кальвиль снежный оказался вдвое большш -39*2,0 мм.

На рио.1 представлены результаты испытания фунгмтоксяч -носім диффуватов указанных сортов яблок. Согласно получеиные данным, для устойчивых сортов Ренет Симиренко ■ Ренет ваыпан-ск«1 характерна и более высокая фнтоалексквная активность (эа-мтрихованные столбики), нем для яблок сорта Кагьвиль снехныВ.

&

SlOO

о

л

f 50

контроль

--Реї .

Симиренко

ю

— шампанский

снежный

Рис.1. Фитоалексинная активность различ-

Ш НО УСТОЙЧИВОСТИ К И. f ruotlgena. СОРТОВ яблок (октяорь;.

Обнаруженная эависиыость ыехду фитоалексинноЯ активностью плодов и нх устойчивостью к фитопатогенныи микроорганизмам дает основание предполагать» что продуцирование фхтоалексияов является ОДНИМ ИЗ факторов УСТОЙЧИВОСТИ яблок К Ц.£гигъ1ееаа.

Исследовали также фитоалаксинную активность яблок в процессе их хранения при температурах внявкриоскопжчвскоа (-1,3°С и 0°С) м субкриосяопичвской (-2»3°С). Соответствующие данное представлены в таблице 2 и на рис.2. Из приведенных данншс вядао, что с увеличение* продолжительности хранения плодов

Таблиаа z

Влияние продолжительноетк периода хранения я температурного режима на фитоалексиннух активность яблок

сорта Йвет Снмиронко. Инфицирование епарулентным жтаммом . ы. ^гисіієепл при пяотвости суспензія 7хІ05 коа./мл.^

Дата

Диффуваты

Прорастайиа конжднй, % ох контроля

Ллидв

як

л-

от

контроля

Октябрь Контрольны« І0О . 12,50*2,38 100

Опытные 18 1*53*0,52 10

Январь Контрольные 100 8,01*1,33 100

Опытные 21 1,92*0,28 24

Март Контрольные 100 8,61*1,46 100

Опытные 44 2,72*0,66 ЗІ

ЙВНІ Контрольные 100 8,70*1,34 100

Опытные 7+ 3,45*0,68 40

Темцеоатура хранения

Октябрь Контрольные 100 12,50*2,38 100

Опытяые 18 I»33*0,52 10

Январь Контрольные 100 7,69*1,42 100

Опытные 23 1,92*0,34 25

Апрель Контрольные 100 14,32*1,58 100

Опытные 55 4,75*0,23 32

Июль Контрольные 100 19,60*1,25 100

Опытные 64 6,6^*0,90 34

Темпеоаттра хранения

Октябрь Контрольные 100 12,50*2,38 100

Опытные 18 1.33*0,52 10

Январь Контрольные 100 13,01*1,87 100

Опытяые 102 12,51*2,03 98

Март Контрольные 100 12,34*2,42 100

Опытные 105 15,50*1,74 126

Иснь Контрольные 100 5,34*1,32 100

Опытные 171 6,30+1,36 129

Ї~ДГ>Н I'll 141) 1' ft "-сій.-

too =

JO

& m

0 É & а £

Рис.2. Фмтовхехсхняая активность яблок сорта Ранет Стреако, хра-яжвтхся прж текпературах: а) 0°С; в)-1,3°С; в; -2,3°С. Вверху -кривив температурних рехгаов.

наблюдается тевдевдия к умеиьиению их фитоалежсинной активности: & мае и, особенно, г иене величава фятовлексинвов активности э а «а та о нов, чем в январе.

Значительное влияние на «вменение фитоалаксняной активности оказывает температуре, пря которой хранили яблоки» Несколько более устойчивую во громеав фйтоадексянную активность имели яблока* хранившиеся ори температуре -1,3°С, по сравнению с нулевой температурой. Последнее соответствовало лучшему внелнему воду к вкусу плодов в меньше ну проценту их потерь.

Наоборот, при температуре воадуха -2,3°С, т.е. ниже точка замерзания яблок, отмечалось резкое уменьменке фунгхтохсичностн опытных дяффузатов и* как результат, исчезновение фитоалексинной активности ухе в январе месяце, т.е. после месячного хранения плодов в подмороженном состоянии. В последующие месяцы фито-алексанная активность оставалась подавленной.

Поскольку в литературе имеются указания о том, что в условиях постепенной дефростации а отеплевая плодов после хранения их в подмороженном состоянии при субкриоскопаче «сой температуре колот быть восстановлена их жизнеспособность, нами была исследована фнтоалексинвая активность как подмороженных яблок (сразу снятых с хранения), так и плодов после их постепенного оттаивания. Такие определения были проведены в различные периоды хранения, начиная о марта месяца. Судя по данным (табл.3), у диф-Фузатов, полученных как из подмороженных, так и из отепленных яблок, фжтоалексинная активность отсутствует (фунгитохснчность опытных диффуватов равна или да» меяьме соответствующее значений контроля).

Таким образом, подмораживание необратимо нарушает способ-кость плодов продуцировать яатоалекскиы, а медленное отепление на вссстанавливает утраченного свойства.

Подмороженные яблоки без предварительного отепления, так же, как и медленно отепленные плоды, после их семидневного выдерживания при коннатлей температуре бурели, мякоть их темнела а становилась рыхлой. Процент микрйбишшаой порчи таких плодов возрастал в 5 раз по сравнению с плодами, хранившимися при вы-шекриоскопичаской температуре.

Таким обрезом, не примере ряда моделей, включающих яблоки разной степени устойчивости к мгисб!евяа , установлена корреляция между фитоалексинной активность» плодов я их

Влияние медленного отепления подмороженных яблок на фидоалексннную активность их диффузатов (сорт Ренет Сиииреяко, инфицирование авлрулентным штаммом 11. £гисЪ1веда яря ПЛОТНОСТИ суспензии 7х103коа«/мд.)

Дата Состо- Диффузаты Прорастание Длина гиф

яние яблок КОНИДИЙ, % от контроля мк % от контроля

юо 1г,у*±г,иг юо

103 15,50+1,74 125

100 18,3041,04 100

99 18,50±1,68 101

Контрольные 100 5,34±1,32 100

Апрель I Опытные 171 6,30±1,36 119

Контрольные 100 9,9511,62 100

П Опытные 137 12,90±1,52 129

Пай Контрольные 100 15,41*2,06 100

0 Опытные 115 20,30±2,02 132

Ишь Контрольные 100 7,21±1,16 100

и Опытные 120 10,90±1,24 152

I-Еодмороженные плоды вынимали из камер и сразу же использовали для определения.

II-Яоднорожениые плоды предварительно медленно отепляли.

устойчивость». Обнаружено, что:

1. Повышение вирулентности зтамма и. гсиотееиа к его инфекционной нагрузки приводит к снижения как устойчивости плодов, так я их фитоадексявдой активности.

2. Сорта яблок, обладавшие больней устойчивость» к м.£гис-, нмэют я больную фитоадексинаую активность.

3. Фитоалексилная активность яблок падает к концу периода их хранения параллельно о уменьшением степени устойчивости.

I

Нарт

п

Контрольные Опытные Контрольные Опытные

Подмораживание необратимо парумает устовчявоси яблок к xi способность продуяировать фитоалексяяы, причем »то свойство яе восстанавливается поел« медленного отепления.

2. Вещества, обусловливавшие аятибиотическу® активность яблок

Установлено, «то многие* кввеотные к настоящему времен! фитоалежсины представляет собой соединения фенольяой природа. Научению роля фенолъных ооедмяеняй в явленна фитоиммувигета пооваяево огромное ЧИСЛО исследований / fark&a , Kiraly , 1962 t Eubln i Ax-t8ühovekaya ,1964 ; Eue ,1964 j Cruicksbank , Parrln ,1954 t Hohrloger , Samborekl ,196? t Метлицкнй,Оэерец-ковсяая, 1968; Kosuge ,1969/. ■ "

Нам представлялось интересным выяснить« существует ли взаимосвязь между количеством фенолъных соединений в состава диф-фузатов к их анткгрибной актнвностьв. Соответствующие данные приводятся в табл.* где характеристика диффуаатов яблок по степени их фунгятоксичности сопоставляется с содержанием.в нхе фенолъных соединений. Судя по данным, приведенным в таблица, различий в содержании феяолъвнх соединений между контрольными м опытными диффузатамж яблок сортов Ренет Симирояко и Кальвиль снежный на обнаружено. Панду тем, зти сорта заметно различаются по уровня фятоалакскнной активности.

Другой пример. Выше уже упоминалось, что у яблок, инфицированных вирулентным ятаммом tt.fmctiseim , фнтоалекп скяяая активность отсутствует, тогда как при заражения «вирулентный итаякон того же грнба этот показатель достаточно четко выражен. Однако количество фенолъных соединений в джффуватах яблок, содержащих конидии авнрулентного итажма, не только на больше, но, наоборот, меньяе, чем в диффузатах, гдепрасутотво-валн копндш! вирулентного ахаяка.

Не было найдено также корреляции между фитоалексияной ак-тнвностьо и содержанием фенолъных соединений и в опытах с плодами, хранивлияися при субкряосхопжчесяой температуре. Хотя опытные диффуваты подмороженных яблок ае обладали фунгятоксяч-аостью, тем не менее, количество фенолъных соединений в них примерно в 1,5 раза больше, чая в контроле.

Отсутствие взаимосвязи между количеством феяольных соеди-

Фунгнтоксичвость днффуватов а содержание в них фенольних соединений

Вариант Днффуааты Прорастание конидий Длина гиф Содержали« фенольних соединений

7 ■ % от контроля % от контроля мкг/мл диффу-вата

Сорті Ренет Симиренко Кальвиль спежиый Контрольные Опытные Контрольные Опытные 100 18 100 43 100 10 100 32 350 350 98 90

Штамм: Вирулентный (6ІІ05 кон./мл) ¿вирулентный , (6x10' КОН./МЛ) Контрольные Опытные Опытные 100 99 32 100 105 21 5«0 544 424

Температура хранения: -1,3°С -2,3°С (подмороженные) Контрольные Опытные Контрольные Опытные 100 22 100 117 100 ' 12 100 100 о о о о

нений н фунгнтоксичаостью днффуватов еще ее означает, что фито-алаксинная активность не может быть обусловлена величиеи отдельных фенольних соединений, которые могли быть ие учтены в использованном вами методе определения общего количества фенолов. По-8тому ваши следующие усилия былв направлены на исследование природы веществ, ответственных за фунгитокоичность опытных диффуэа-хов яблок. Проведенные определения позволили установить, что фунгятоксическое начало может быть экстрагировано ив диффузатов с помощью диатиловсго эфира.

Эфирные екстракти опытных диффузатов яблок сорта Ренет Сими-

ревно хроиатографичаски разделял« на пластинках » siiutol * (растворитель - хлороформ : ацетон 65:15 - об:об). Такни хе - образом исследовали экстракт ладности, в которой в течение 24 часов прорастали конидии M.fructigena в той хе плотнооти, которую использовали для опыта.

Все обнаруженные соединения, равно кзх и внешне пустые зоны мекау ними, счищали с пластинки, элюировали дяэтиловым эфиром я испытывали яа фунгитоксичность (рас.З). результаты определений позволили обнаружить три зоны наибольшей фунгитокс ичво-оти с if = 0,15; Ef я 0,40; Hj. * 0,85, обозначенные нави как зоны А,В,С* В состава выделений гриба эти соединения отсутствовали. Экстракты остальных зон на оказывали заметного токсического действия на рост конидий тест-объекта.

Такие опыты были проведены иени в октябре, когда яблоки обладали относительно высокой устойчивостью к инфекции. Следулций эксперимент по той же схеме был поставлен с диффуэатзш, полученными из яблок в апреле, т.е. в конце хранения, когда устойчивость плодов к микроорганизмам падала. Общий характер данных, полученных в результата хроматографического разделения и испытания иа фунгитоксичность экстрактов диффузатов, собранных в октябре и апреле, совпадал (рис.3). И в том и другом случае токсичность» обладали вещества оодниияи тени ха значениями Кf , однако антигрибная активность этих соединений значительно сильнее проявлялась в октябре, чей в апреле. В результате кривая испытания фуягнтокснчности, полученная в апреле, располагалась значительно выше кривой, соотв о тс твующз й октябри.

Обнаруженный факт соответствует папим приведенный данным о том,что фитоалексжняая активность диффузатов уменьшается в процесса хранения яблок. Одной нз причин этому может быть уменьшение концентрации токсических веществ, образующихся в ответ на инфицирование•

Целый ряд данных литературы свидетельствует о способности фитопатогелов разлагать фитоалексинк, свойственные их растенияи-хозяавам / цеЬата , 1964; Van Heuvel , van Stten , 1973; Da Wit-Elatiova , 1969, 1970/. В СВЯЗИ С ЭТНЫ исследования в этой области правильнее было бы проводить ив только при использовании специфических патогенов того растения, фятоалехсмш которого предстоит исследовать, но н его неспецкфнчаскнх парази-

t j і і ї11 і * г" і і) я и м і

?ЯЄ.З. фунгитоксйчность различных зон хуокатограюге после разделения эфирных ахетрактов диффуватол, собранных в октябре (І) я апреле (2)

тов, с тем, чтобы кор кодировать возможней процесс деградации образующихся фитоадвкскнзв. В табх.5 приведены полученные нами данные о фунгктовснчности диффуэатов, содержащих споры как патогена / M.fructlgeaa /ї *8* * кепатогена / Ph. iofnstaas / яблок. Кав я следовало ожидать , фунгитоксичиость даффуэатоз, содержащих зооспоры рь. inf евъапв , оказалась s 6 раз выяе соответствующей фувгмтоксичн о сти днффузатов, содержащих конидии вирулентного втаииа патогена, и ка 30% больве антягрибной активности джффузатов, где находились конидии «вирулентного итаїша п гроба.

%u.£ructig«ea является широкоепецаалиэярованным фитопатогеном. Поэтому называя этот гриб "патогеном яблок", мы имеем в виду его способность поражать яблоки в числе других растения.

їй тоа леке и иная активность яблок, инфицированных различным* грябажя (сорт Рекет Сяияреяко)

Плот- Дяффу-заты Прорастание конидии, % от контроля Ллжва гиф

Гриб ность суолея- зжв мк % от контроля

паж:

вирулентный 7х105 авирулентный 7x10^

Рй. 1п£еаїапа 5ХІ05

Контрольные 100

Ошткые 90

Опытные 70

Опытные 50

17,40*2,38 100

17«05*1,50 .98

11,49*1,58 66

2,60*0,60 15

Одно! хв прячян, объяснявдей такое равдичва в с тесен» подавления росте тест-объекта, может слухять способность М.і"тис-«ІБвпа дотокоядирова» антибиотические веяеотвв, содержажие-ся в днффуватах, что особенно четко виражено г случае ксподьво-ваняя вирулентного ятаямя гриба.

Антибиотические вецеотва в составе диффузатов яблок, со-держажжх споры их яепатогежа рь. юседъы» ж патогена ы.Ггис^еепа, бшж выявлены о помоцьп метода бяоавтографжя.

Также как я в ранее проведанных испытаниях /си.ряс.З/, в днффуватах был* обнаружены /рис,4/, по крайней мере, три фуягя-токсжческях соеджненжя о т 0,18; IV * 0>43; ^ « 0,85 (еяоте-ма растворителей хлороформ:етилацетат 25:75 - обіоб).

Аналогичным образом, ясподьауя метод Сиоавтография, Сьшя Проявлена хроматограммы, подученные в результате разделения эфирного экстракта жз опытных диффузатов подмороженных плодов (температура хранения -2,3°С о последующей медленной дефроста-пяей; вяфкцнровавве авяруяентным ятаммож п. ггиоЪ1ееэд при плотности суспензия 7x10 кон./мл). Оказалось, что антибиотически е соединения в нем практически яе содержатся, что обменяет ранее установленный намя факт отсутствия жх аятигрибвоЯ активности.

К моменту завершення наян этой частя экспериментального исследования появилось сообщение Брауна к Сьинбурна / вхожа , ЗиОпЬигт, 1973/, которые обнаружила в векротязиронянной ткани яблок, образовавшейся в ответ на кнфкцнрованне несігів.

Рис .4. Баоавтогранка после разделения ляффузатив яблок, .

инфицированных вепатогеном pb.lnfeet»ns (I) и патогеном

K.fi-uctigeaa (2 ),

galligena вгes , анткгриСное вещество - бензойную кислоту. В свяая о атнк можно было предположить, что одним из обнаруженных вами фунгитоксических соединений является бензойная кислота.

Действительно, оказалось, что хроматографичесная подвижное» вещества с Bj. * 0,85 соответствовала положенно свидетеля, представляющего собой кристаллическую бенеойиу» кислоту* Испытуемое оое дина нив так же, как ж бензойная кислота, окра он велось в белый цвет при проявлении диазотированпым я-нятроанилжнож. УФ-спеятр эзяата зоны силикнгаля, находящегося в области расположения этого вещества, совпадал с соответствуем* спектром для чистой бензойной кислоты.

Второе соединение с ■ 0,43, инепцее сапун налу» зову яя-гябнрования, совпадало по положение на хроматограмме с п-окси-

бенаойной кислотой. Ера проявлении диазотированньш п-нгсроанк-лином это вецвсіво, подобно в—ожсибензойкой кислоте, окрзжава-лось в рововато-красный цвет. И, наконец, УФ-спехтр исследуемого вещества оказался идентичным соответствуюламу спектру кристаллической п-оксибенвойной кислоты.

Следует отметать, что предполагаемая п-оксибензойная кислота была обнаружена только в состава даффуэатов, содержащих конидии u.fruotigeua , во їв в диффузатах о зооспорам» Ri. infestons /см.рас.4/. По всей вероятности, патогеж яблок деградирует бензойну® кислоту в соответствии со схемой ее деградации, предложенной Брауном и Свивбурном / вговп , swinbura* < 1973/;

cas ахи

о — о

Б*«юлям молот® О-оя;бі0«і»оМі«я n«mi Прдоядеко»«* пион

СОСЯ ¿Ш

Л.»-

fi' P- ШР0ОІГЄН ЦЧНОИ bJFHOtM кяолотв

г ОН Т

і "Cl. і —'О»

р~ виоивйшпин

В пользу этого свидетельствует также тот факт, что количество хроматографаческн обнаруженной бензойной кислоти в диффузатах, содэржакжх конидия патогена яблок м.ігисїіеоп*. ,

гораздо меньше, чем в случае жвфицироваяжя яблок их непатогеном - Рй. ШГеаЪадо /см.рис.4/.

Ин предположили,что деградация фитоалекскнов,осуществленная патогеном яблок и.Ггисїієеоа , одновременно является процессом кх детоксикацяи. Для этого было необходимо сравнить токсичность бензойной н п-оксибензойжоК кислоX, что я было проделано с помощь» метода баоавтографии. В стартовыэ иятиа

хроиатограмин биля внесены одинаковые концентрация обоях ве-«аохв (20 миг бон войной + 20 нкг я-оксябенаовяой шалот, 50+50, 100+100 и т.д.) /рис.5/. Бкоавтография показала, что зова иягябировзяня бензойной кислоты значительно больна соох-ветствуюлях зон н-онсябензойноЯ я тех же концентрациях, что свидетельствует о больней токсичности бензойной кислом по сравнение с п-оксябензойной. Не исключено поэтому, чхо последняя могла образовываться в инфицированных ткааях лдода в результате деградация бензойной кислоты.

20+20 50+50 100+100 200+200

ыяг/ня

Рис.5. Биоавтограмма,характеризующая токсичность бензойной (I) я в-оксибвнзойной (2) кислот при различных концентрапнях.

По-видимому, малая плододь пятна, соответствующая п-оксж -бензойной кислоте в диффузатах, содержащих конкднЯ: M.fructigana /см, рис.4/, скорее является следствием низкой фунгнтохсичностн этого вещества, чей-его мелок концентрации. Судя по величинам соотвотствупщях зон свидетеля, концентрация н-оксабенэойной кислоту составляет примерно 100 ккг/нл.

Еиоавтограмма, представленная нами ив рис.4, деех основание полагать, что патоген u.fructigena способен деградировать не только бензойную кислоту, но и антигрибное соединение

о Е^ * 0*18* обладающее наибольшей фунгитокскчностью и ваэваа-ноэ вами веществом X. Судя по данный биоавтограима, в составе диффузатов яблок, ияфицированных л.сгиеЪ1веоа , количество вещества X значительно меяьие, чем в диффузатах, содарха-щях зооспоры рь. юСееЪапа •

В свете полученных данных .видно, что о дням на критериев при выборе температурных рехиыов хранения плодов долхно бить на только их максимальная способность образовывать фятоалексины,но и подавление свойства паразитарных грибов деградировать продуцируемые плодама фатоалекоины.

Наличие в составе диффузатов яблок не только бензойной кислоты, но к вещества X, позволяет нам не согласиться с точкой зрения Браува и Свинбурва / вготги , эжШЬигов , 1973/* которые-полагает, что бенаойная кислота является едивсткнным антнгрибшш соединением, ответственным за всю фунгмтоксичнооть инфицированной ткали яблок.

Таким образом, согласно полученным каин данным, в составе диффузатов яблок присутствуют два фунгитовсяческих соединения, из которых вещество X обладает наибольиай антягрибной активностью, Третье вещество, которое, ос наиим предположениям, явлкет-

Результаты проявле**» ьеаестаа X

ГТ-рОЧВИ^Т&ЛН Ива^ опита

Кокцвнтридоаядея серная км логе Мкндня+содик&ц кислот« Векидин+Сбраая КИСЛОТ* Рэвктяв Садьяовского Рее втиз Эряим 1% раствор флорогдккдев* Хаорястое МДМО Хлористая отрый» 20% Кдои»« кроме«« ««яг СУяьФбеяяогял кислота (Яавзоэтрфяаяяая ) Дмеэопгромяша* я-иитро-акляяи Литэним+Бориая мс*оти ЬюифаяоломД СЛНЯЙ г »¿-дпмтрофен ил г* драм и Розовато-красны* Ра«овато-«рас*ыЯ Сарнй К« ЛрОЧЗЛ*«&Я проявляете* Сарай Не П|Э0я»ХЯ«ТбЯ 1алт9ватый Ваша 1лгговатн1 Сиияй Белый

о.г 0,1

а

гоз 2И т гзв ям гб? гв? а« З1э згз хь а» Ряс,6. УФ-спектр и результаты проявления вещества X.

ся п-оксибензойиой кислотой, скорее всего принадлежит к числу продуктов деградация бензойной кислоты. Специально проведенные вайя определения показали, что все три обнаруженных соединения отсутствовали в мицелии ii.fructigeim и составе его видалений.

Хрома «графически очиценнсе вещество X, проявляли различными реareвтак*, результаты проявления приводятся на рис.6. В спектре этого соединения, снятом в УФ-дучах, обнаружены максимумы поглощения сря 211 и 256 ни. Получаоные результаты даст основание предполагать, что вещество X носит ароматический характер к содеркнт ооновную группу.

выводи

1. Обнаружена корреляция между фитоахексшной активность» г степенью устойчивости яблок к одному из основных возбудителей Енфекцнонных заболеваний плодов при хранении :

а) Увеличение вирулентности штамма ы.Ггцо^ееиа н его инфекционной нагрузки приводило как к снижению устойчивости плодов, так к падению их фитоал»койкаой активности.

б) Сорта яблок, обладающие больней устойчивостью к м.ггис-едеепа, вмели и больаув фитоалексввную активность.

в) Фитоадексинная активность яблок падала к концу их хранения параллельно с уменьшением степени устойчивости.

г) Подморакивавие необратимо нарушало устойчивость яблок в их способность продуцировать фитоалексины, причем это свойство не восстанавливалось после их медленного отепления.

Таким образом, определение фитоалексинвой активности плодов может служить объективным критерием для оценки степени их устойчивости к микроорганизмам в процессе хранения.

2. В дяффузетах яблок обнаружен ряд антигрибных соединений. Предполагается, что одно из них является бензойной кислотой, которая под действием ферментов ц.£гисЪ1еопа превращается в п-сксиоенэойную кислоту, обладающую заметно меньшей фунгитоксич-ностью. Непатоген яблок такой способностью ие обладает.

3. Кроне бензойной и п-оксибензойиой кислот.в дкффуэатех найдено «це одво автигрибное соединение, условно названное вемв веществом X. По своей фунг«токсичности оно превосходит бензойную кислоту. Вещество содержит основную группу, имеет ароиатическую природу н максимумы поглощения в УФ-свете при 211 я 236 км.

Список работ, опубликовавшее во нате риалам диссертации

1. Быкова Т.Д., 1973. Исследование виияяжя температурных ракнмоа хранения на устойчивость яблок к инфекционным заболеваниям«-Теансы докладов I Всесоюзной научно-технической конференции молодых специалистов по холодильной технике к технологии.

2. Моисеева H.A., Шкова Т.Д., 1974. 1нтигрибнан акт явность яблок как показатель устойчивости к микроорганизмам при бднзхриоскопических температурах хранения.-Тезисы докладов D Бсесовзного биохимического съезда, fura.

3. Быкова Т.Д., 1975. Антнбнотичесгае вещества яблок, обусловливаете их устойчивость к фнтопатогенным микроорганизмам при хранении .-Тезисы докладов П Всесоюзной научно-технической-конференции молодых специалистов по холодильной технике и технологии.

4. Моисеева H.A., Высоцкая O.K., Курьянова U.A., Торопова В.А., Быкова Т.Д., 1975. Хранение яблок при близнриоскопнческих темперагу pax.-"Холодильная техника", К I.

5. Шкова Т.Д., Давыдова U.A., Моисеева H.A., Озерещковская О.Л.,

1975. Фнтоалекоквная активность яблок как показатель устойчивости к фнтопатогенным микроорганизиам.-*Прикл*биохямкя и микробиология", «ом И, вып.4.

6. Быкова Т.Д., Давыдова М.А., Озерецковская О.Л., Моисееве H.A.,

1976. Антибиотические вещества яблок.-"Мнкологкя и фитопатология". (в печати).

7. Моисеева H.A., Ежове Т.Д., 1976. Фитоалекеинная активность яЛок как показатель устойчивости к фитопатогеякыи микроорганизмам при хранении.-"Холодильная техника", № 2 , (По материалам XIУ Международного конгресса по холоду;.

Материалы диссертации были доложены на I и 0 Всесоюзной научно-технической конференции молодых специалистов, июнь 1973, 1975; на Х1У Международно)! конгрессе по холоду, сентябрь 1975.

ÍJÍ; riÜJlf

ЯІіІіІІІйІшІіШ

Заказ .№ 44.

Тираж 150 экз.

ПМУ Опытного'завода ВНИХИ