Антагонистические взаимодействия патогенного гриба и растения в инфекционной капле, связанные с активацией кислорода

Захаренкова, Татьяна Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Антагонистические взаимодействия патогенного гриба и растения в инфекционной капле, связанные с активацией кислорода
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Антагонистические взаимодействия патогенного гриба и растения в инфекционной капле, связанные с активацией кислорода"

На правах рукописи

4843648

ЗАХАРЕНКОВА Татьяна Сергеевна

Антагонистические взаимодействия патогенного гриба и растения в инфекционной капле, связанные с активацией кислорода

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 3 ОЕЗ 2011

Москва-2011

4843648

Работа выполнена в группе биофизики Учреждения Российской академии сельскохозяйственных наук Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии, с. Большие Вяземы Московской области.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Аверьянов Андрей Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Балнокин Юрий Владимирович

кандидат биологических наук Бабоша Александр Валентинович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им А.Н. Баха РАН

Защита состоится «22» февраля 2011 г. в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.Д. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.

Факс: (495) 977 8018, электронная почта: m-azarkovich@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Автореферат разослан «¿5» января 2011 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций кандидат биологических наук

М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Антагонистические взаимодействия растения с возбудителями болезней надземной части начинаются на его поверхности в инфекционной капле, то есть капле воды, содержащей инфекционное начало. Эта стадия заражения во многом определяет его дальнейшее течение и исход. Здесь микроорганизмы вступают в разнообразные отношения между собой и с растением-хозяином, в том числе и в биохимические, в которых важную роль играют противостоящие друг другу активные форм кислорода (АФК) и антиоксиданты. Некоторые аспекты взаимодействия в инфекционной капле, в том числе, связанные с этими веществами, заслуживают более подробного изучения.

Это, например, влияние самой воды инфекционной капли на взаимоотношения растений с патогенами. Хорошо известно, что капелыю-жидкая влага необходима для заражения надземной части (Tapp, 1975). Однако не исключено, что растения при частом поверхностном увлажнении могут адаптироваться, становясь, напротив, более устойчивыми. В литературе есть лишь косвенные указания на такую возможность. Если устойчивость, индуцированная водой, действительно, существует, то представляет интерес ее механизм, в том числе, участие в нем АФК.

Противоинфекционная роль АФК опосредована, в частности, элиситорами, индуцирующими окислительный взрыв и другие защитные реакции. Возможна и противоположная ситуация, когда АФК хозяина стимулируют выделение элиситоров паразитом. Эта способность может быть проявлением болезнеустойчивости, поскольку диффундирующие элиситоры, по-видимому, раньше, чем связанные, индуцируют защитные реакции (Метлицкий и др., 1973). Ранее показано, что споры гриба Magna-porthe grísea, возбудителя пирикуляриоза риса, под действием экзогенной перекиси водорода выделяют вещества, индуцирующие противоинфекционные реакции каллусов риса устойчивого сорта (Лапикова и др., 2000). Представляло интерес выяснить, происходит ли это с интактными растениями и как связано с их болезнеустойчивостью. Кроме того, поскольку споры и сами образуют АФК (Aver'yanov et al., 2007), следовало выяснить, как это явление влияет на выделение споровых элиситоров.

Антиоксиданты патогенных микроорганизмов, снижая концентрацию АФК, ослабляют АФК-зависимые защитные реакции растений и потому являются факторами патогенности. Со своей стороны, растения способны ингибировать некоторые

другие факторы патогенности, например, литические ферменты {Дьяков и др., 2001). Не исключено, что такой антагонизм затрагивает и чужеродные антиоксиданты. Действительно, супероксиддисмутаза (СОД) после контакта с листьями риса перестает ослаблять супероксидзависимую фунгитоксичность их диффузата (Аверьянов, Лапикова, 1989). Это явление следовало изучить подробнее.

Цель и задачи работы. Целью было выяснение роли АФК, антиокислительных ферментов и элиситоров на ранней стадии взаимодействия растений и патогенных грибов, а именно в инфекционной капле в связи с болезнеустойчивостью. Задачи включали:

1. Оценку влияния длительного поверхностного увлажнения листьев на локальную и системную болезнеустойчивость растений. Выяснение возможного участия АФК в этом явлении;

2. Выяснение возможности выделения элиситоров из грибных спор под действием АФК, добавленных извне или образованных самими спорами;

3. Исследование возможного влияния растения на чужеродные антиоксиданты в связи с болезнеустойчивостью.

Научная новизна работы. Впервые описана болезнеустойчивость растений, двудольного (огурец) и однодольного (рис), индуцированная поверхностным увлажнением их надземной части до заражения. В первом случае устойчивость проявлялась и локально, и системно, а во втором - только локально. На рисе возникновению устойчивости предшествовало и могло быть ее причиной увеличение образования супероксидного радикала (02") листьями.

Обнаружена элиситорная активность экзометаболитов спор М. grísea, проявлявшаяся на интактных растениях риса устойчивого, но не восприимчивого сорта. Она была следствием образования АФК спорами и усиливалась в присутствии экзогенных АФК. Для элиситорной активности был необходим одновременный контакт листьев с низко- и высокомолекулярными экзометаболитами спор.

Описанная ранее (Аверьянов, Лапикова, 1989) потеря способности медь-цинковой СОД после контакта с листьями риса детоксицировать 02" подтверждена на том же и выявлена на других устойчивых сортах, а также в искусственной 02~ -генерирующей системе. Представлены данные, согласно которым экзогенный фермент, а именно ион меди его активного центра, может индуцировать выделение лис-

том соответствующего ингибитора, и что этим ингибитором может быть салициловая кислота.

Практическая ценность работы. Работа является фундаментальной, но указывает возможные направления прикладных разработок. Так, при опрыскивании надземных частей растений следует учитывать, что вода, содержащаяся в агрохимических препаратах, может повышать фоновую продукцию АФК растениями и этим влиять на эффект действующего вещества, которое, в свою очередь, может влиять на эффект воды.

Выявленная способность АФК вызывать выход грибных элиситоров может стать основой для поиска маркеров и индукторов устойчивости.

В качестве средств защиты растений, вероятно, могут применяться также экзогенные ингибиторы антиоксидантов патогена или вещества, активирующие синтез или выделение аналогичных ингибиторов растением.

Экспериментальные данные и теоретические обобщения диссертации могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических факультетов вузов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на 15-м FESPB (Federation of European Societies of Plant Biology) Конгрессе 17-21 июля 2006, Лион, Франция; на Международном симпозиуме «Non-specific innate and acquired plant resistance», 31 августа — 3 сентября 2006, Будапешт, Венгрия; на 15-м International Reinhardsbrunn Symposium «Modera Fungicides and Antifunmgal Compounds», 6-10 мая 2007, Фридрихрода, Германия; на SFFR Plant Oxygen Group Meeting «ROS in Plants. Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants», Гент, Бельгия, 12-14 сентября, 2007; на 9ом International Congress of Plant Pathology, 24-29 августа, 2008; на SFFR Plant Oxygen Group Meeting on Reactive Oxygen and Nitrogen Species «Plant ROS 2009», 8-10 июля, 2009, Хельсинки, Финляндия; на Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс», 9-12 ноября 2010, Москва.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Работа была частью российско-американского проекта № 2682р «Прооксидант-ное/антиоксидантное состояние инфекционной капли в связи с болезнеустойчивостью растений» Международного научно-технического центра. Основные положения диссертации изложены в квартальных и годовых отчетах по проекту и обсуждались с

американским коллаборатором К. Дж. Бейкером (лаборатория молекулярной патологии растений, служба сельскохозяйственных исследований Департамент сельского хозяйства США, Белтсвилл, Мериленд, США).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов, методов и результатов исследований, выводов, заключения и списка литературы. Материал изложен на 147 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 41 рисунок. Список использованной литературы включает 188 работ, из которых 115 на английском языке.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. Растения огурца (Cucumis saíivus L.) восприимчивого сорта Феникс выращивали до стадии семядолей (7 дней) или первого настоящего листа (14 дней). Растения риса восприимчивого сорта Sha-tíao-tsao и устойчивого Zenith выращивали до стадии четырех полностью развернутых листьев (21-33 суток). Первичные каллусы риса сорта Zenith были выращены из зрелых семян риса (Belyanskaya, Shamina, 1993) на агаризованной среде Мурасиге-Скуга. Использовали первый пассаж (20-25 дней).

Возбудителя оливковой пятнистости огурца, гриб Cladosporium cucumeriman Ell. et Arth, изолят С5, культивировали при 25°С на картофельно-глюкозком агаре. Для опытов брали 10-дневную культуру гриба. Возбудителя пирикуляриоза риса, гриб Magnaporthe grísea (Hebert) Barr изолят H5-3 (раса 007), поддерживали при 28'С на агаризованном морковном отваре с кусочками листьев риса восприимчивого сорта. Для опытов бралк 6-16 суточную культуру.

Споры смывали дистиллированной водой, промывали и концентрировали на мембранном фильтре 8 мкм (С. cucumerinum) или центрифугированием 10 мин при 8000 g {M. grísea).

Предобработка растений огурца водой, их инокуляция и оценка симптомов болезни. Наносили 10 капель воды (по 10 мкл) на первый лист до появления остальных или по 5 капель на каждую семядолю до появления листьев или опрыскивали все растение водой (0.5 мл). Обработанные растения помещали в увлажненный бокс на 24 ч. Затем заражали каплями суспензии С. cucumerinum (105 спор/мл) пер-

вый лист (сразу или через 7 дней) или второй (через 7 дней) или третий (через 12 дней) листья. Зараженные растения оставляли на 24 ч в темноте при 18°С в том же боксе.

Визуальные симптомы болезни оценивали через 5-11 дней после заражения. Некоторые капли инокулюма не оставляли видимых симптомов, другие вызывали хлорозы - симптомы слабой восприимчивости или некрозы - сильной восприимчивости. Подсчитывали соотношение этих признаков.

Предобработка растений риса водой, их ннокуляция и оценка симптомов болезни. Четвертые листья полностью интактных проростков фиксировали горизонтально в инокуляционных камерах (Лапикова и др., 1995). На верхнюю поверхность листьев наносили по 6 капель дистиллированной воды (по 20 мкл) с помощью капле-держателей (Аверьянов, Лапикова, 1989) и для локального увлажнения воздуха закрывали камеры крышками. В других случаях листья опрыскивали или погружали в пробирки с водой. Через 17-22 часа капли собирали каплесборником (Аверьянов, Лапикова, 1989) или извлекали листья из пробирок, давали листьям высохнуть и заражали их каплями суспензии (105 спор/мл) М. grísea, используя ту же технику. Затем растения инкубировали 24 ч в темноте.

Визуальные симптомы оценивали (Lattereil et al., 1965) через 7-13 дней после заражения. Симптомы совместимости - это большие (длиной 4 мм и более) желтовато-серые пятна, симптомы несовместимости - мелкие (до 2-3 мм) бурые точки или отсутствие симптомов. Подсчитывали соотношение этих признаков.

Получение диффузатов листьев риса и анализ в них супероксидного радикала. Капли инокулюма или воду после инкубации на листьях собирали и центрифугировали (17 ООО g, 10 мин). Продукцию 02" оценивали по СОД-чувствительному окислению экзогенного адреналина (Bors et. al., 1987). В лунки 384-ячеистой пластины вносили по 35 мкл диффузата, 5 мкл 20 мМ калий-фосфатного буфера (pH 7.8) и 5 мкл воды или 50 мкг/мл СОД. Реакцию начинали добавлением 5 мкл 1 мМ адреналина и оценивали при A4g0 на спектрофотометре Biorad Benchmark Plus.

Оценка фунгитоксичности диффузатов листьев риса. В лунки 96-луночной пластины вносили по 40 мкл воды или диффузатов листьев, 5 мкл воды и 5 мкл суспензии (3.5 х 104 спор/мл) спор М. grísea. Пластину инкубировали 5 ч в темноте при

23 °С. Затем споры фиксировали этанолом. Их прорастание считали под инвертированным микроскопом в 4 повторностях по 100 спор.

Получение диффузатов спор М. grísea и предобработка ими растений рнса. Споры (105 спср/мл) инкубировали 5 ч в воде или 50 мкМ Н202 в темноте при 23°С. Затем добавляли 20 мкг/мл каталазы дая разрушения перекиси и еще через 1 час суспензию центрифугировали (10 мин при 17000 g и 4°С) и кипятили супернатант для инактивации каталазы. В других случаях споры проращивали в воде или в растворе 20 мкг/мл СОД или каталазы. Затем диффузаты спор центрифугировали, кипятили и помещали каплями на листья риса.

В ряде случаев диффузаты спор после кипячения разделяли центрифугированием (17000 g, 30 мин) в фильтрующих мембранных патронах с порами 3 кД.

Оценка прорастания спор С. cucumerinum и анализ 02" в их диффузатах. Споры С. cucumerinum в разных концентрациях (5 х 103, 104, 105 или 5 * 105 спор/мл) 20 ч проращивали в 96-луночных пластинах (по 100 мкл суспензии в лунке) при 18 или 25°С. Часть спор фиксировали этанолом и считали их прорастание.

Образование 02~ в диффузатах спор анализировали по окислению экзогенного адреналина, чувствительному к СОД как описано выше.

Оценка влияния листьев риса на способность экзогенных антиоксидантов ослаблять фунгитоксичность диффузатов листьев. На листья наносили в смеси с суспензией спор (105 спор/мл) М. grísea различные растворы: 50 мкг/мл CuZn-СОД, Fe-СОД, Mn-СОД или БСА или по 3.2 мкМ CuCl2, ZnCl2 или MnS04, или 1 мМ тай-рон, или 10 мМ маннита, или 30 мМ 1,3-диметил-2-тиомочевины. В полученные таким образом диффузаты перед анализом их фунгитоксичности добавляли (или нет) вторую порцию вышеназванных веществ в тех же концентрациях.

Оценка влияния листьев риса на способность экзогенной СОД ослаблять фунгитоксичность 02" -генерирующей системы. Модельную фотохимическую систему рибофлавин-метионин (Аверьянов и др., 2000) добавляли в лунки 96-ячеистой пластины вместе со спорами (3.5 х 104 спор/мл) М. grísea. Туда же добавляли (или нет) свежерастворенную или проинкубированную на листьях СОД. Пластины освещали 0.5 ч при 4-5 клк, затем выдерживали 4.5 ч в темноте и фиксировали споры.

Оценка химической активности СОД. Измеряли активность фермента по торможению восстановления нитросинего тетразолия (NBT) в ксантиноксидазной

системе (Beauchamp, Fridovich, 1971) при А5Ы) на спектрофотометре Biorad Benchmark Plus.

Получение диффузатов каллусов риса и оценка их фунгитоксичности. В

пластмассовые чашки Петри помещали 100 мг каллусов риса и 2 мл суспензии спор М. grísea (105 спор/мл), содержащей (или нет) 50 мкг/мл CuZn-СОД или воды. Через 8 ч жидкую фазу центрифугировали и добавляли в нее СОД в той же концентрации или воду и оценивали фунгитоксичность.

Статистическая обработка данных. Вычисляли средние значения для всех повторностей одного или нескольких опытов, а также стандартное отклонение (SD) (рис.3, 4, 5, 6, 9 и табл. 1, 3, 4), или стандартную ошибку (SE) (рис.1 и табл. 2), или доверительный интервал. Последний считали по критерию Стьюдента для вероятности 0.99 (Р=0.01) (рис.8). Звездочками на рис.1 отмечены значения, достоверно отличающиеся от необработанного контроля при 0.95 (Р=0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние длительного увлажнения листьев огурца на его устойчивость к оливковой пятнистости

Если капли воды инкубировали одни сутки на первом настоящем листе, а затем его заражали, то болезнь проявлялась слабее, чем в неувлажненном варианте (рис. 1а). Это же наблюдалось, если заражали второй (рис. 16) или третий лист (соответственно, через 7 или 12 дней после обработки первого листа водой) или же обрабаты-

вали семядоли, а заражали первый лист. 70 ,

□ без обработки Я

□ капли воды

g 60 i 50 ¡40

10 о

-+-

S60

® so

£40 га

i30 з» s

10 о

□ без обработки

□ ЮТЛИВОДэ!

г-Н

-+-

безеттттомов хлорозы

Ъпомттомое

без симптомов хлорозы некрозы Тип симптомов

Рис.1. Влияние 24-часовой инкубации капель воды на первом листе огурца восприимчивого сорта на симптомы последующего заражения того же (а) или второго листа (б) оливковой пятнистостью.

Следовательно, предобработка водой способствовала как локальной, так и системной болезнеустойчивости, которая развивалась во вновь образованном листе. Интересно было выяснить, наблюдается ли это явление в других патосистемах.

2. Влияние предобработки водой на визуальные симптомы пирикуляриоза риса

Инкубация крупных капель воды на четвертом листе риса до его заражения ослабляла тяжесть болезни (рис. 2). Эффективно было также опрыскивание листа и выпадение на нем конденсата из влажного воздуха, но не погружение листа в пробирку с водой.

необработанные

¡■ни -

капли воды

Л |

^ ;::

! в.щ

1 щи й

Щ ¡Ж

Рис. 2. Влияние разных способов поверхностного увлажнения листьев риса восприимчивого сорта на симптомы их последующего заражения пири-куляриозом.

Следовательно, поверхностное увлажнение листа риса, но только небольшим объемом воды, вызывало локальную устойчивость к пирикуляриозу. Мы предполагаем, что вода при длительном контакте освобождает из клеточных стенок растительные элиситоры, индуцирующие в таком состоянии защитные реакции. Возможно, что элиситоры из погруженного листа не были эффективны из-за их чрезмерного разбавления. Предобработка водой не вызывала системной болезнеустойчивости риса.

Таким образом, поверхностное увлажнение надземной части индуцировало локальную болезнеустойчивость как однодольного, так и двудольного растения, и системную — двудольного. Мы попытались выявить возможное участие АФК в механизме этой устойчивости.

3. Влияние предобработки водой на образование супероксидного радикала в диффузатах листьев риса и их фуигитоксичность

Предобработка водой стимулировала окисление экзогенного адреналина в диффузате незараженных листьев восприимчивого сорта по сравнению с необработанным контролем (рис. 3). Реакция подавлялась экзогенной СОД, свидетельствуя об образовании 02". У устойчивого сорта предобработка водой увеличивала этот показатель только в диффузатах зараженных листьев.

Рис. 3. Генерация супероксидного радикала (по окислению экзогенного адреналина) в диффузатах незараженных листьев риса восприимчивого сорта, необработанных и обработанных водой.

О 10 20 30 40 50 60 Время, мин

Предобработка листьев водой не увеличивала токсичности их диффузатов для спор возбудителя. Следовательно, если АФК участвуют в индуцированной водой болезнеустойчивости, то, вероятно, как сигнальные молекулы, а не токсиканты.

Итак, длительный поверхностный контакт листьев риса с водой увеличивает фоновую продукцию 02~ в инфекционной капле, что предшествует возникновению

—й— обработанный водой -д— необработанный водой —обработанный водой + СОД

' 1 --■■ необработанный водой + СОД

г-А-й

болезнеустойчивости и, возможно, является ее причиной. Различные реакции восприимчивого и устойчивого сортов, вероятно, связаны с их чувствительностью к собственным и грибным злиситорам. Интересно было выяснить, может ли повышенный уровень АФК вызывать выход элиситоров из спор.

4. Визуальные эффекты обработки листьев риса диффузатами грибных спор Чтобы выявить возможное элиситорное действие споровых диффузатов на инактиые растения, споры проращивали в воде или 50 мкМ Н202, которая, как выяснено, не ингибировала прорастания. Действительно, в обоих случаях диффузаты вызывали мелкие некротические пятна (признак устойчивости) на листьях устойчивого, но не восприимчивого сорта риса. Если обработанные листья заражали, то ка устойчивом сорте симптомов не было, как и без обработки. На восприимчивом сорте диффузаты спор достоверно не изменяли тяжесть болезни по сравнению с обработанными водой. Следовательно, если элиситорные свойства споровых диффузатов четко проявлялись, то только на устойчивом сорте.

5. Влияние диффузатов спор ка образование супероксидного радикала

в диффузатах листьев риса Мы попытались выявить еще одну защитную реакцию - генерацию 02\ Результаты согласуются с полученными ранее. Инкубация на листьях диффузата спор, проросших в воде, стимулировала окисление адреналина на устойчивом (Я), но не восприимчивом (Б) сорте (рис. 4).

0,01

0,04

0,03

0,02

Рис. 4. Генерация 02" (по окислению экзогенного адреналина) в диффузатах незараженных листьев риса разных сортов, после нанесения на них воды (1-2еш&, 2-БЬайаойао) или диффузатов спор, проросших в воде (З^ешЛ (К), 4-БЬаНаойао (Б)) или в 50 мкМ Н202 (5-2ешЙ1 (Я), б-ЗЬа^вао (Б)). От-

рицательные величины означают окисление в диффузате, более медленное, чем в воде.

-0,01

0 10 20 30 40 50 60 70

Время,мин

Если споры прорастали в Н2О2, то окисление было еще сильнее. Во всех случаях эта реакция значительно подавлялась экзогенной СОД, что свидетельствует об образовании 02" в диффузатах.

Полученные факты подтверждают предположение, что экзогенные АФК, в том числе образованные растением, могут стимулировать выделение грибных элиситоров, которые индуцируют защитные реакции в несовместимой комбинации.

6. Изучение природы предполагаемого элиситсра Очевидно, что это вещество термостабильно, так как процедура его получения включает кипячение. Поэтому, возможно, что оно низкомолекулярно.

Действительно, удаление низкомолекулярных (менее 3 кД) компонентов лишало диффузат активности (рис. 5). Однако взятая отдельно низкомолекулярная фракция тоже не стимулировала генерации 02" листьями или стимулировала существенно слабее, чем неразделенный диффузат. Если же фракции смешивали, элиситорная активность восстанавливалась полностью. Следовательно, она не была потеряна при разделении, а требовала одновременного присутствия и крупных, и мелких молекул.

0,07

h смесь фракций

неразделенный диффузат

-0,01 в 10 20 30 40 50 60 Время, мин

Рис. 5. Генерация 02" (по окислению экзогенного адреналина) в диффузатах незараженных листьев ^■гомжрчм.фракщ* РИСа УСТОЙЧИВОГО сорта Zenith, после нанесения мокомапекупярнхя фракция на НИХ ВОДЫ ИЛИ ДИффу-зата спор, проросших в 50 мкМ Н202, неразделенного или разделенного на фракции.

7. Оценка влияння эндогенных АФК прорастающих спор на их элиситорную активность

Ранее была обнаружена генерация АФК спорами М. grísea (Aver'yanov et. al., 2007). Поэтому возможно, что споры выделяют элиситоры под действием собственных АФК. Для проверки споры проращивали не в Н202, а в воде или в растворах ка-талазы или СОД. Обнаружено, что диффузаты спор, проросших в растворах антиок-сидантов, не стимулировали окисления адреналина листьями устойчивого сорта (рис.

6). Очевидно, это происходило из-за подавления генерации спорами 02" или Н202. Таким образом, прорастающие споры способны выделять элиситоры под действием не только экзогенных, но и собственных АФК.

* ш- -диффузаты спор в воде —о-вода

диффузаты спор в каталазв -♦-диффузаты спор в СОД

р|1С Рис. 6. Генерация 02" (по оки окислению экзогенного ад-рсн рсналина) в диффузатах не-зар, зараженных листьев риса ус-тод тойчивого сорта Zenith, после еле нанесения на них воды ши или диффузата спор, про-р0С росших в воде, или растворе 2Q , 20 мкг/мл каталазы, или рас-та0, творе 20 мкг/мл СОД.

■0,01 i 10 20 30 40 50 60 Время, мин

Известно, что эндогенные АФК ингибирукгг прорастание спор М. grísea в неблагоприятных условиях, в частности в слишком плотной или, напротив, в слишком разбавленной суспензии (Аверьянов, Лапикова, 1990). Мы получили аналогичные данные с тем же грибом (табл. 1) и с С. cucumerinum. В последнем случае в суспензиях экстремальных концентраций споры не только хуже прорастали и интенсивнее генерировали радикал 02" (рис. 7), но и вызывали гораздо более слабые симптомы на листьях (табл.2), чем при оптимальной концентрации.

Таблица 1.

Прорастание спор М. grísea, в суспензиях разной концентрации.

Влияние 20 мкг/мл каталазы, добавленной в среду прорастания

Концентрация спор (спор/мл) Прорастание спор, %

без каталазы с каталазой

3 х 103 31 ± 3 76 ± 3

105 70 ± 4 77 ± 2

3 x10s 31 ± 2 69 ± 3

Возможно, что при неблагоприятных для прорастания концентрациях спор заражению препятствует не только их плохое развитие, но и выделяемые ими элиситоры.

Итак, АФК могут стимулировать выход элиситоров из спор патогена, что, вероятно, является еще одной защитной реакцией растения. Очевидно, что антиокси-

дангы, подавляющие любые АФК-зависимые защитные реакции, являются факторами восприимчивости. Не исключено, что устойчивый хозяин подавляет антиоксидан-ты паразита. Для проверки такой возможности изучали взаимодействие листьев риса с чужеродными антиоксидантами.

1600

1400

1200

* о 1000

X 800

< 600

400

200

«"ло4

, 25°/5 х 105 ^ г

25°/5х10] 1В°/10°

• \18°/5х 10! *

25°/104

25°/10

_|_I_I_и

Рис. 7. Взаимосвязь между прорастанием спор С. сиси-тегтит и генерацией супероксидного радикала в их диффузатах. Температура (°С) / концентрация (спор/ мл) указаны около каждой точки.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Прорастание спор (%)

Таблица 2.

Зависимость визуальных симптомов оливковой пятнистости на листьях огурца от концентрации инокулюма С. сиситеппит

Концентрация спор (спор/мл)

Частота симптомов (%) указанного типа

без симптомов

хлороз

некроз

10 105 5х105

48 ± 3 ± 46 ±

11 2 14

52 ± 11 39 ± 6 54 ± 14

0 ± 0 58 ± 6 0 ± 0

8. Фунгнтоксичность диффузатов листьев риса и влияние СОД на это свойство в зависимости от ее контакта с листьями

Участие 02" в механизме фунгитоксичности листьев риса многократно подтверждено ее устранением при добавлении бычьей Си7п-С0Д в диффузат. Если же фермент был добавлен в инокулюм (и контактировал с листом), то он не ослаблял фунгитоксичности диффузатов. Более того, вторая порция СОД, добавленная в диффузат, тоже была неэффективна, несмотря на удвоение концентрации. Эти данные,

ранее полученные на отрезках листьев (Аверьянов, Лапикова, 1989), подтверждены на интактных растениях нескольких сортов с той же концентрацией фермента (рис. 8).

Добавки в диффузат: □ без добавок 1СОД

Рис. 8. Влияние 50 мкг/мл CuZn-СОД, добавленной в инокулюм и/или диффузат зараженных листьев риса устойчивого сорта, на токсичность их диффузатов для спор М. grísea. Для контроля в инокулюм добавляли 50 мкг/мл БСА или СОД, инактивированную кипячением.

без добавок

СОД кипяченая СОД

Добавки в инокулюм

БСА

Судя по анализу белка, концентрация СОД после контакта с листьями снижалась, но недостаточно для ослабления ее детоксицирующих свойств. Тем более, это не объясняет неэффективности второй порции. Очевидно, уменьшалась удельная активность СОД. Этого, однако, не удалось показать химическим методом (в системе ксантиноксидаза - NBT). Мы предполагаем, что СОД все же инактивировалась в диффузатах, но ревосстанавливалась в химической тест-системе. Антитоксическая активность СОД, которая проявлялась в диффузатах и терялась при контакте с листьями, была направлена именно против 02, что подтверждается в искусственной 02-генерирующей системе (табл.3).

Таблица 3.

Влияние СОД, проинкубированной на нейтральной поверхности или на незараженных листьях риса устойчивого сорта, на токсичность рибофлавин-метиониновой системы для спор М. grísea

Ингибирование

Добавки в систему прорастания

спор (%)

Без добавок 50 ± 8

50 мкг/мл С1Йп-СОД, проинкубированная на пластике 11 ± 6

То же, проинкубированная на листьях 51 ± 3

Чтобы проверить, характерно ли обнаруженное явление для других суперок-сиддисмутаз, помимо CuZn-СОД испытали Fe-СОД и Мп-СОД из E.coli. Бактериаль-

ные СОД, добавленные в ннокулюм, не теряли своих детоксицирующих свойств. Но они были неэффективны в диффузате листа, контактировавшего с CuZn-СОД.

Низкомолекулярные антиоксиданты (тайрон, маннит и диметилтисмочевина), испытанные по той же схеме, не теряли защитных свойств.

По-видимому, CuZn-СОД (но не другие СОД), соприкасаясь с листьями, индуцировала выход ингибитора, действующего и на нее, и на фермент, добавленный затем в диффузат. При этом Fe-СОД и Mn-СОД, но не низкомолекулярные антиоксиданты были чувствительны к этому ингибитору.

9. Свойства молекулы СОД, индуцирующие выход предполагаемого ингибитора

Мы попытались выяснить, какая часть молекулы CuZn-СОД индуцирует выход ингибитора. Установлено, что если на листья наносили бычий сывороточный альбумин, Fe-СОД или Mn-СОД в той же концентрации (рис. 8), то они не влияли на де-токсицирующие свойства CuZn-СОД, добавленной затем в диффузат. Однако кипяченая CuZn-СОД и хлорид меди (в эквивалентной концентрации), но не цинка индуцировали потерю защитных свойств СОД (табл. 4). Следовательно, выход предполагаемого ингибитора был реакцией не на белок фермента, а на его активный центр, в частности, на ионы меди.

Таблица 4.

Влияние CuZn-СОД или солей металлов ее активного центра, добавленных в инокулюм, на способность СОД, добавленной в диффузат зараженных листьев риса устойчивого сорта, ослаблять его токсичность для спор М. grísea

Ингибирование прорастания спор (%)

Добавки в инокулюм Добавки в Д"ФФУзат

без добавок CuZn-СОД

Без добавок 55 7 18 6

50 мкг/мл CuZn-СОД 45 + 5 47 + 8

3.2 мкМ СиС12 65 + 9 54 + 6

3.2 мкМ ZnCl2 64 + 9 27 + 2

3.2 мкМ СиС12 + 3.2 мкМ ZnCl2 52 + 9 38 + 3

3.2 MKMMnS04 58 + 7 13 + 8

10. Изучение природы предполагаемого ингибитора

Известно, что каталаза (Chen el al., 1993), а также некоторые другие Fe- и Cu-содержащие ферменты (Ruffer et al., 1995; Чуб, 2007) ингибируются салициловой кислотой (СК). В листьях риса ее содержится в несколько раз больше, чем в других растениях (Yang Y. et al., 2004; Chen el al., 1997). Поэтому не исключено, что она может ингибировать и СОД.

Действительно, в диффузатах листьев, которые инокулировали без СОД, экзогенная СК (10 мкМ) значительно ослабляла защитные свойства фермента, добавленного в диффузат (рис.9). При этом СК в отдельности не влияла на токсичность диф-фузата. Так же это вещество действовало на СОД в рибофлавин-метиониновой сис-

Рис. 9. Влияние CuZn-СОД, добавленной в инокулюм и/или диффузат зараженных листьев риса устойчивого сорта, на токсичность диф-фузата для спор

М. grísea. Эффект 10 мкМ салициловой кислоты.

" Добавки в инокулюм

Следует отметить, что химические методы не выявили инактивации СОД салициловой кислотой, как и диффузатами листьев. Значит, СК и искомый ингибитор вели себя сходно.

Косвенное подтверждение участия СК в ингибировании фермента дают опыты, выполненные по той же схеме, но на каллусах риса. Известно, что клеточные культуры риса содержат СК на несколько порядков меньше, чем его листья (Chen et ai, 1997). Возможно, поэтому мы не обнаружили такой четкой потери защитных свойств СОД в диффузатах каллусов, но это происходило, если вместе с ней добавляли СК.

Таким образом, чужеродная СОД, по-видимому, вызывает выход ингибитора из листьев риса, и этим ингибитором может быть СК или родственное ей соединение.

Добавки в диффузат: □ без добавок

fw,4 ллЛяплн

ГЭТП

Возможно, что аналогичные изменения на листьях могут происходить и с антиокислительными ферментами патогена, снижая его жизнеспособность на хозяине. Обнаруженный эффект, возможно, ограничивает применение СОД животного происхождения как инструмента исследования растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе рассмотрены некоторые новые аспекты химических антагонистических взаимодействий патогенного гриба и растения на ранней стадии заражения (рис. 10). Чтобы воспроизвести естественные условия, опыты проводили на полностью ин-тактных растениях без применения раневой инокуляции и смачивателей.

Установлено, что во взаимодействиях хозяина и патогена помимо их экзомета-болитов участвует вода инфекционной капли. Она, благоприятствуя развитию патогена, одновременно может индуцировать болезнеустойчивость, предположительно с участием АФК. Возможно, это связано с эндогенными элиситорами растений, освобождаемыми водой.

Увеличение продукции АФК в инфекционной капле, как растением, так и патогеном, по-видимому, способно активировать выход элиситоров из его спор, что стимулирует образование АФК еще сильнее. Это, в свою очередь, приводит к подавлению развития паразита активными формами кислорода и другим защитным реакциям.

При любом участии АФК в противоинфекционных реакциях растения антиокислители паразита, очевидно, являются факторами патогенности. Не исключено, что антагонизм со стороны растения выражается в ингибировании антиокислительных ферментов патогена, и это является одним из проявлений болезнеустойчивости.

Существенно, что вышеописанные процессы происходят на самой ранней стадии болезни и могут быть критичны для ее дальнейшего развития.

в ==ч

АФК

антпоксидантыг

ингабнтор

Рнс.Ю. Проокислитсльные/ антиокислительные взаимодействия растения и патогена в инфекционной капле.

ВЫВОДЫ

1. Однодневный поверхностный контакт листьев с небольшим объемом воды до заражения индуцирует локальную и системную устойчивость огурца к оливковой пятнистости и локальную устойчивость риса к пирикуляриозу. Это может быть адаптацией к условиям повышенного увлажнения, благоприятным для инфекции.

2. У риса этой реакции предшествует и является возможной ее причиной увеличение продукции 02' листьями. Вероятно, оно является следствием вымывания элиситоров из контактирующих с водой тканей растения.

3. Диффузат спор М. grísea стимулирует продукцию 02' и некротизацию листьев устойчивого сорта риса. Этой элиситорной активности нет, если споры прорастали в растворах СОД или каталазы. Нетоксичная концентрация Н202, напротив, стимулирует ее. В элиситорной активности диффузата спор участвуют как его высоко-, так и низкомолекулярные компоненты. Следовательно, собственные АФК прорастающих спор, а, возможно, и АФК хозяина способствуют выходу грибных элиситоров. Предполагается, что это один из механизмов несовместимости.

4. Чужеродная GuZn-СОД теряет детокеицирующие свойства на листьях риса или в диффузатах таких листьев, ранее контактировавших с ферментом. Предполагается, что растения выделяют ингибитор СОД и, возможно, других антиокислительных ферментов патогена.

5. Салициловая кислота подавляет детокеицирующие свойства СОД в диффузатах листьев и каллусов риса. Не исключено, что она (или родственное соединение) является ингибитором СОД, выходящим из листьев. Индуктором его выхода могут быть ионы меди активного центра фермента.

6. Таким образом, антагонизм растения и патогена в инфекционной капле, осуществляется, в частности, через взаимодействия АФК, элиситоров и антиоксидан-тов, а также, возможно, и других веществ, влияющих на эти взаимодействия.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Aver'yanov A.A., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Romanova T.S.. Gaivorons-kaya L.M., Abramova O.S., Kuznetsov V.V., Baker J.C. (2006) Proox-idant/antioxidant early interactions of rice plant with blast fungus. In: XV FESPB Congress. July 17-21. Lyon-France, Lyon, p. 141.

2. Aver'yanov A.A., Lapikova V.P., Pasechnik T.D., Romanova T.S.. Gaivoroas-kaya L.M., Abramova O.S., Baker J.C. (2006) ROS and antioxidants in the infection droplet as related to rice blast resistance. In: Non-specific innate and acquired plant resistance. August 31- September 3, 2006. Budapest, Hungary, Budapest, p. 17.

3. Aver'yanov A.A., Romanova T.S., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Baker J.C.

(2007) Water droplets on rice leaves induce resistance to blast. In: 15th International Reinhardsbrunn Symposium «Modern Fungicides and Antifungal Compounds. May 06-10, 2007. Friedrickroda- Germany», Friedrichroda, p. 122.

4. Aver'yanov A.A., Romanova T.S.. Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Gaivorons-kaya L.M., Baker C.J. (2007) Alien enzymatic antioxidants can lose their protective potential in contact with rice leaves. In: International Symposium "ROS in Plants. Signalling & Metabolism, Oxidative stress, Antioxidants". September 12-14, 2007, Ghent, Belgium, Ghent, p.57.

5. Aver'yanov A.A., Romanova T.S.. Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Baker C.J.

(2008) How could water droplets on rice leaves reduce severity of rice blast infec-

tion? In: Modern Fungicides and Antifungal Compounds V., Dehne H.W., Deising H., Gisi U., Kuck K.H., Russell P.E., Lyr IL (eds.) Alton, UK: BCPC, p. 52.

6. Aver'yanov A.A., l'aseclinik T.D., Lapikova V.P., Romanova T.S., Gaivorons-kaya L.M., Ahramova O.S., Kuznetsov VI.V., Baker C.J. (2008) Early pro- / anti-oxidative interplay between host and parasite. In: 9th International Congress of Plant Pathology (ICPP 2008). August 24-29, 2008. Torino, Italy, Pisa: EDIZIONI ETS, S2.211-212.

7. Романова T.C.. Аверьянов A.A., Пасечник Т.Д., Лапикова В.П., Бей-кер К.Дж. (2009) Устойчивость риса к пирикуляриозу, вызванная поверхностным увлажнением листьев перед заражением. Физиология растений, 56, 431436.

8. Romanova T.S.. Aver'yanov А.А., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Baker C.J.

(2009) Contact of blast spores to ROS and rice leaves to water may elicit ROS-dependent plant defense responses. In: A SFRR Plant Oxygen Group Meeting on Reactive Oxygen and Nitrogen Species «Plant ROS 2009». July 8-10, 2009. Finland, Helsinki, p. 114.

9. Aver'yanov A.A., Romanova T.S.. Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Abramova O.S., Gaivoronskaya L.M., Baker C.J. (2009) Pro- and antioxidant activiting fungal spores as related to plant disease resistance. In: A SFRR Plant Oxygen Group Meeting on Reactive Oxygen and Nitrogen Species «Plant ROS 2009». July 8-10, 2009. Finland, Helsinki, p. 97.

10. Захареикова T.C.. Аверьянов A.A., Пасечник Т.Д., Лапикова В.П., Бейкер К.Дж. (2010) Выделение элиситоров спорами возбудителя пирикуля-риоза риса под влиянием активных форм кислорода. Физиология растений, 57, 615-619.

И. Захареикова Т.С.. Аверьянов А.А., Пасечник Т.Д., Лапикова В.П., Бейкер К.Дж. (2010) Капли влаги на листьях как фактор устойчивости к инфекциям. В сб.: Всероссийский симпозиум «РАСТЕНИЕ И СТРЕСС». 9-12 ноября, Москва, Москва, с 155-156.

Подписано в печать:

12.01.2011

Заказ № 4813 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Захаренкова, Татьяна Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Антагонистические взаимодействия хозяин-патоген.

1.1.1. Прорастание спор и его подавлйие.

1.1.2. Проникновение в ткани растения.

1.1.3. Функции литических ферментов патогена и их ингибирование.

1.1.4. Фитотоксические вещества грибов и грибоподобных микроорганизмов

1.1.5. Фунгитоксические вещества растения.

1.1.6. Влияние условий среды на взаимодействия растения и патогена.

1.2. Роль элиситоров во взаимодействии хозяин-патоген.

1.2.1. Общие представления об элиситорах.

1.2.2. Элиситоры патогенных грибов и грибоподобных микроорганизмов.

1.2.3. Растительные элиситоры.

1.2.4. Трансдукция элиситорного сигнала.

1.3. АФК во взаимодействиях хозяин-патоген.

1.3.1. Общие представления об АФК.

1.3.2. АФК растений в связи с болезнеустойчивостью.

1.3.3. АФК грибов и патогенность.

1.4. Антиокислители во взаимодействиях хозяин-патоген.

1.4.1. Общая характеристика антиокислителей.

1.4.2. Защита растений от окислительного стресса.

1.4.3. Антиокислители растений при инфекционных болезнях.

1.4.4. Антиокислители грибов при инфекционных болезнях.

1.4.5. Супероксиддисмутаза и каталаза.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Материалы.

2.1.1. Растительный материал.

2.1.2. Грибной материал.

2.2. Методы.

2.2.1. Предобработка растений огурца водой, их инокуляция и оценка симптомов болезни.

2.2.2. Предобработка растений риса водой, их инокуляция и оценка симптомов болезни.

2.2.3. Получение диффузатов листьев риса и анализ в них АФК.

2.2.4. Оценка фунгитоксичности диффузатов листьев.

2.2.5. Получение диффузатов спор М. grísea и предобработка ими растений.

2.2.6. Диализ и ультрафильтрация диффузатов.

2.2.7.Оценка прорастания спор С. cucumerinum, фунгитоксичности их диффузатов и анализ 02" в диффузатах.

2.2.8. Оценка влияния листьев риса на способность экзогенных антиоксидантов ослаблять фунгитоксичность диффузатов листьев.

2.2.9. Оценка влияния листьев риса на способность экзогенной СОД ослаблять фунгитоксичность рибофлавин-метиониновой системы.

2.2.10. Определение общего белка по методу Бредфорда.

2.2.11. Оценка химической активности СОД.

2.2.12. Получение диффузатов каллусов риса и оценка их фунгитоксичности

2.2.13. Оценка химической активности каталазы.

2.2.14. Статистическая обработка данных.

Глава 3. Влияние длительного увлажнения листьев на устойчивость к последующему заражению.

3.1. Влияние длительного увлажнения листьев огурца на его устойчивость к оливковой пятнистости.

3.2. Влияние предобработки водой на визуальные симптомы пирикуляриоза риса

3.3. Влияние предобработки водой на образование АФК в диффузатах листьев риса и их фунгитоксичность.

Глава 4. Влияние АФК на выход растворимых элиситоров из спор гриба.

4.1. Визуальные эффекты обработки листьев диффузатами грибных спор.

4.2. Влияние диффузатов спор на образование супсроксидного радикала в диффузатах листьев.

4.3. Изучение природы предполагаемого элиситора

4.4. Оценка влияния эндогенных АФК прорастающих спор на их элиситорную активность.

Глава 5. Изменение свойств чужеродных антиокислительных ферментов при контакте с листом.

5.1. Фунгитоксичность диффузатов листьев и влияние СОД на это свойство в зависимости от ее контакта с листьями.

5.2. Свойства молекулы СОД, индуцирующие выход предполагаемого ингибитора.

5.3. Изучение природы предполагаемого ингибитора.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антагонистические взаимодействия патогенного гриба и растения в инфекционной капле, связанные с активацией кислорода"

Антагонистические взаимодействия растения с возбудителями болезней надземной части начинаются на его поверхности в инфекционной капле, то есть капле воды, содержащей инфекционное начало. Эта стадия заражения во многом определяет его дальнейшее течение и исход. Здесь микроорганизмы вступают в разнообразные отношения между собой и с растением-хозяином, в том числе и в биохимические, в которых важную роль играют противостоящие друг другу активные формы кислорода (АФК) и антиоксиданты., АФК растений при их избыточной продукции, называемой окислительным взрывом, являются частью механизма болезнеустойчивости. С одной стороны, они непосредственно токсичны для микроорганизмов, с другой - участвуют в иных защитных реакциях, в частности как сигнальные молекулы. Перечисленные факты общеизвестны и подтверждены множеством примеров. Однако некоторые аспекты взаимоотношений партнеров в инфекционной капле, в том числе, связанные с АФК и антиоксидантами, заслуживают более подробного изучения.

Это, например, влияние самой воды инфекционной капли на взаимоотношения растений с патогенами. Хорошо известно, что капельно-жидкая влага необходима для заражения надземной части растений большинством инфекционных болезней (Tapp, 1975), поэтому избыточное увлажнение способствует их распространению. Однако не исключено, что растения при частом поверхностном увлажнении могут адаптироваться, становясь, напротив, более устойчивыми. В литературе есть лишь косвенные указания на такую возможность. Например, что мучнистые росы более распространены и вредоносны на сухих территориях (Agrios, 1988). Если устойчивость, индуцированная водой, действительно, существует, то представляет интерес ее механизм, в том числе, участие в нем АФК.

Противоинфекционная роль АФК опосредована, в частности, элиситорами, индуцирующими окислительный взрыв и другие защитные реакции. Возможна и противоположная ситуация, когда АФК хозяина индуцируют выделение элисито-ров паразитом. Эта способность согласно гипотезе «двойной индукции» (Метлиц-кий и др., 1973) может быть проявлением болезнеустойчивости, поскольку диффундирующие элиситоры, по-видимому, раньше, чем связанные, индуцируют защитные реакции. Ранее показано, что споры гриба Magnaporthe grísea, возбудителя пирикуляриоза риса, под действием экзогенной перекиси водорода выделяют вещества, индуцирующие противоинфекционные реакции каллусов риса устойчивого сорта (Лапикова и др., 2000). Представляло интерес выяснить, происходит ли это с интактными растениями и как связано с их болезнеустойчивостью. Кроме того, поскольку споры и сами образуют АФК (Aver'yanov et al., 2007), следовало выяснить, как это явление влияет на выделение споровых элиситоров.

Антиоксиданты патогенных микроорганизмов, снижая концентрацию АФК, ослабляют АФК-зависимые защитные реакции растений и потому являются факторами патогенности (Аверьянов и др., 1981). Со своей стороны растения способны ингибировать некоторые другие факторы патогенности, например, литические ферменты (Дьяков и др., 2001). Не исключено, что такой антагонизм затрагивает и чужеродные антиоксиданты. Действительно, супероксиддисмутаза (СОД) после контакта с листьями риса перестает ослаблять супероксидзависимую фунгитоксич-ность их диффузатов, по-видимому, за счет выделения ингибитора СОД из листьев (Аверьянов, Лапикова, 1989). Возможный механизм этого явления следовало изучить.

В диссертации рассмотрены механизмы болезнеустойчивости, связанные с АФК, антиокислителями и элиситорами, взаимодействующие в инфекционной капле.

Объектами исследования были две патосистемы: пирикуляриоз риса, вызываемый грибом М. grísea, и оливковая пятнистость огурца, вызываемая грибом Cladosporium cucumerinum. Пирикуляриоз риса является сравнительно простой и широко используемой моделью инфекционных болезней. К тому же, рис одна из важнейших сельскохозяйственных культур, а пирикуляриоз - его самая вредоносная болезнь. Огурец - один из классических объектов для изучения системной индуцированной устойчивости. Следовательно, работа проведена на однодольном и двудольном растениях.

Цели и задачи исследований

Целью работы было выяснение роли активных форм кислорода, антиокислительных ферментов и элиситоров на ранней стадии взаимодействия растений и патогенных грибов, а именно в инфекционной капле в связи с болезнеустойчивостью. В задачи работы входило:

1. Оценка влияния длительного поверхностного увлажнения листьев па локальную и системную болезнеустойчивость растений. Выяснение возможного участия АФК в этом явлении;

3. Исследование возможного влияния растений на чужеродные антиок-сиданты в связи с болезнеустойчивостью.

Научная новизна исследований

1. Впервые описана болезнеустойчивость растений, двудольного (огурец) и однодольного (рис), индуцированная длительным поверхностным увлажнением их надземной части до заражения. В первом случае устойчивость проявлялась и локально, и системно, а во втором - только локально. На рисе возникновению устойчивости предшествовало и могло быть ее причиной увеличение образования супероксидного радикала (0{) листьями, но не токсичности их выделений. По-видимому, 02" участвовал в механизме устойчивости как сигнальная молекула. Предполагается, что капельно-жидкая влага вымывает из клеточных стенок растения элиситоры, которые индуцируют окислительный взрыв и последующие проти-воинфекционные реакции.

2. Обнаружена элиситорная активность экзометаболитов спор М. grísea, проявлявшаяся на интактных растениях риса устойчивого, но не восприимчивого сорта. Она была следствием образования АФК спорами и усиливалась в присутствии экзогенной Н202- Для элиситорной активности был необходим одновременный контакт листьев с низко- и высокомолекулярными экзометаболитами спор.

3. Описанная ранее (Аверьянов, Лапикова, 1989) потеря способности чужеродной медь-цинковой СОД после контакта с листьями риса детоксицировать 02~ подтверждена на том же и выявлена на других устойчивых сортах, а также в искусственной 02" -генерирующей системе. Представлены данные, согласно которым экзогенный фермент, а именно ион меди его активного центра, может индуцировать выделение листом соответствующего ингибитора, и что этим ингибитором может быть салициловая кислота.

Практическая значимость работы

Работа является фундаментальной, но указывает возможные направления прикладных разработок. Так, при опрыскивании надземных частей растений следует учитывать, что вода, содержащаяся в агрохимических препаратах,, может повышать фоновую продукцию АФК растениями, и тем влиять на эффект действующего вещества, которое, в свою очередь, может влиять на эффект воды.

Полученные данные, связанные с элиситорами, могут стать основой для поиска маркеров и создания индукторов устойчивости. В первом случае - это различие реакций восприимчивого и устойчивого сортов риса на обработку грибными элиситорами и увлажнение. Во втором случае новыми индукторами устойчивости могут быть препараты, содержащие природные элиситоры или их синтетические аналоги, или вещества, индуцирующие или повышающие природную элиситорную активность. В частности, возможно выявление химических и физических факторов, стимулирующих выделение элиситоров грибными спорами, не повреждая их непосредственно и не влияя на растения. При этом показано, что действие элиситоров разной природы на устойчивые и восприимчивые сорта может отличаться.

Средствами защиты растений, вероятно, могут быть также экзогенные ингибиторы антиоксидантов патогена или вещества, активирующие синтез или выделение аналогичных ингибиторов растением. Антиокислительные ферменты животных часто используются как инструменты исследования растений. Следует учитывать возможное изменение свойств таких ферментов при контакте с растительными тканями, способное искажать результаты.

Экспериментальные данные и теоретические обобщения диссертации могут быть использованы в курсах лекций для биологических факультетов.

Апробация работы и публикации результатов исследований

Материалы диссертации были представлены: на 15-м FESPB (Federation of European Societies of Plant Biology) Конгрессе 17-21 июля 2006, Лион, Франция; на Международном симпозиуме «Non-specific innate and acquired plant resistance», 31 августа - 3 сентября 2006, Будапешт, Венгрия; на 15-м International Reinhardsbrunn Symposium «Modern Fungicides and Antifimmgal Compounds», 6-10 мая 2007, Фрид-рихрода, Германия; на SFFR Plant Oxygen Group Meeting «ROS in Plants. Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants», Гент, Бельгия, 12-14 сентября, 2007; на 9ом International Congress of Plant Pathology, 24-29 августа, 2008; на SFFR Plant Oxygen Group Meeting on Reactive Oxygen and Nitrogen Species «Plant ROS 2009», 8-10 июля, 2009, Хельсинки, Финляндия; на Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс», 9-12 ноября 2010, Москва.

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Работа была частью российско-американского проекта № 2682р «Проокси-дантное / антиоксидантное состояние инфекционной капли в связи с болезнеустойчивостью растений» Международного научно-технического центра. Основные положения диссертациии изложены в квартальных и годовых отчетах по проекту и обсуждались с американским коллаборатором С.Дж. Бейкером (лаборатория молекулярной патологии растений, служба сельскохозяйственных исследований Департамент сельского хозяйства США, Белтсвилл, Мериленд, США).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Длительный поверхностный контакт листьев с небольшим объемом воды индуцирует локальную и системную устойчивость огурца к последующему заражению оливковой пятнистостью, а также локальную устойчивость риса к последующему заражению пирикуляриозом. Это может быть адаптацией растений к повышенному риску заражения в условиях повышенного увлажнения.

2. Повышению болезнеустойчивости, вызванному водой, предшествует увеличение продукции АФК листьями. Предполагается, что причиной этого явления служит вымывание эндогенных элиситоров из растительных клеток, а следствием - повышение болезнеустойчивости.

3. Диффузат спор возбудителя пирикуляриоза, проросших в Н202 нетоксичной концентрации, стимулирует такие защитные реакции, как окислительный взрыв и затем некротизацию у устойчивого, но не восприимчивого сорта риса. Элиситорные свойства такого диффузата спор проявляются при одновременном контакте его высоко- и низкомолекулярных компонентов с листом. Предполагается, что выделение элиситоров паразита под действием АФК хозяина является одним из механизмов болезнеустойчивости.

4. Диффузаты спор, проросших в отсутствие экзогенной Н202, тоже обладают элиситорной активностью, но меньшей. Для этой активности необходимо образование 02~ и Н202 прорастающими спорами. Предполагается, что в неблагоприятных условиях как активация кислорода, так и выделение элиситоров спорами увеличиваются, способствуя болезнеустойчивости растений.

5. Чужеродная медь-цинковая СОД теряет детоксицирующие свойства при контакте с листьями риса, возможно, из-за ингибитора, выход которого индуцируется ионами меди активного центра фермента. Ингибитором может быть салициловая кислота или сходное соединение. Предполагается, что антиокислительные ферменты патогена также ин-гибируются растением, что тоже может быть одним из механизмов болезнеустойчивости.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов, методов и результатов исследований, выводов, заключения и списка литературы. Материал изложен на 146 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 41 рисунок. Список использованной литературы включает 188 работ, из которых 115 на английском языке.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Захаренкова, Татьяна Сергеевна

выводы

2. У риса этой реакции предшествует и является возможной ее причиной увеличение продукции 02" листьями. Вероятно, оно является следствием вымывания элиситоров из контактирующих с водой тканей растения.

3. Диффузат спор М. grísea стимулирует продукцию 02" и некротизацию листьев устойчивого сорта риса. Этой элиситорной активности нет, если споры прорастали в растворах СОД или катал азы. Нетоксичная концентрация Н202, напротив, стимулирует ее. В элиситорной активности диффузата спор одновременно участвуют его высоко- и низкомолекулярные компоненты. Следовательно, собственные АФК прорастающих спор, а, возможно, и АФК хозяина способствуют выходу грибных элиситоров. Предполагается, что это один из механизмов несовместимости.

4. Чужеродная CuZn-СОД теряет детоксицирующие свойства на листьях риса или в диффузатах таких листьев, ранее контактировавших с ферментом. Предполагается, что растения выделяют ингибитор СОД и, возможно, других антиокислительных ферментов патогена.

5. Салициловая кислота подавляет детоксицирующие свойства CuZn-СОД в диффузатах листьев и каллусов риса. Не исключено, что она (или родственное соединение) является ингибитором СОД, выходящим из листьев. Индуктором его выхода могут быть ионы меди активного центра фермента.

6. Таким образом, антагонизм растения и патогена в инфекционной капле, осуществляется, в частности, через взаимодействия АФК, элиситоров и ан-тиоксидантов, а также, возможно, и других веществ, влияющих на эти взаимодействия.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Aver'yanov A.A., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Romanova T.S., Gaivoron-skaya L.M., Abramova O.S., Kuznetsov V.V., Baker J.C. (2006) Prooxi-dant/antioxidant early interactions of rice plant with blast fungus. In: XV FESPB Congress. July 17-21. Lyon-France, Lyon, p. 141.

2. Aver'yanov A.A., Lapikova V.P., Pasechnik T.D., Romanova T.S., Gaivoron-skaya L.M., Abramova O.S., Baker J.C. (2006) ROS and antioxidants in the infection droplet as related to rice blast resistance. In: Non-specific innate and acquired plant resistance. August 31- September 3, 2006. Budapest, Hungary, Budapest, p. 17.

3. Aver'yanov A.A., Romanova T.S., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Baker J.C.

2007) Water droplets on rice leaves induce resistance to blast. In: 15th International Reinhardsbrunn Symposium «Modern Fungicides and Antifungal Compounds. May 06-10, 2007. Friedrichroda - Germany», Friedrichroda, p. 122.

4. Aver'yanov A.A., Romanova T.S., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Gaivoron-skaya L.M., Baker C.J. (2007) Alien enzymatic antioxidants can lose their protective potential in contact with rice leaves. In: International Symposium "ROS in Plants. Signalling &. Metabolism, Oxidative stress, Antioxidants ". September 1214, 2007, Ghent, Belgium, Ghent, p.57.

5. Aver'yanov A.A., Romanova T.S., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Baker C.J.

2008) How could water droplets on rice leaves reduce severity of rice blast infection? In: Modern Fungicides and Antifungal Compounds V., Dehne H.W., Deising H., Gisi U., Kuck K.H., Russell P.E., Lyr H. (eds.) Alton, UK: BCPC, p. 52.

6. Aver'yanov A.A., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Romanova T.S., Gaivoron-skaya L.M., Abramova O.S., Kuznetsov VI.V., Baker C.J. (2008) Early pro- / antioxidative interplay between host and parasite. In: 9th International Congress of Plant Pathology (ICPP 2008). August 24-29, 2008. Torino, Italy, Pisa: EDIZIONI ETS, S2.211-212.

7. Романова T.C., Аверьянов A.A., Пасечник Т.Д., Лапикова В.П., Бейкер К.Дж. (2009) Устойчивость риса к пирикуляриозу, вызванная поверхностным увлажнением листьев перед заражением. Физиология растений, 56, 431-436.

8. Romanova T.S., Aver'yanov А.А., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Baker C.J.

2009) Contact of blast spores to ROS and rice leaves to water may elicit ROS-dependent plant defense responses. In: A SFRR Plant Oxygen Group Meeting on Reactive Oxygen and Nitrogen Species «Plant ROS 2009». July 8-10, '2009. Finland, Helsinki, p. 114.

9. Aver'yanov A.A., Romanova T.S., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Abramova O.S., Gaivoronskaya L.M., Baker C.J. (2009) Pro- and antioxidant activiting fungal spores as related to plant disease resistance. In: A SFRR Plant Oxygen Group Meeting on Reactive Oxygen and Nitrogen Species «Plant ROS 2009». July 8-10, 2009. Finland, Helsinki, p. 97.

10. Захаренкова T.C., Аверьянов A.A., Пасечник Т.Д., Лапикова В.П., Бейкер К.Дж. (2010) Выделение элиситоров спорами возбудителя пирику-ляриоза риса под влиянием активных форм кислорода. Физиология растений, 57, 615-619.

11. Захаренкова Т.С., Аверьянов А.А., Пасечник Т.Д., Лапикова В.П., Бейкер К.Дж. (2010) Капли влаги на листьях как фактор устойчивости к инфекциям. В сб.: Всероссийский симпозиум «РАСТЕНИЕ И СТРЕСС». 9-12 ноября, Москва, Москва, с 155-156.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе рассмотрены некоторые новые аспекты химических антагонистических взаимодействий патогенного гриба и растения на ранней стадии заражения (рис. 5.6). Чтобы воспроизвести естественные условия, опыты проводили на полностью интактных растениях без применения раневой инокуляции и смачивателей.

Установлено, что во взаимодействиях хозяина и патогена помимо их экзоме-таболитов участвует вода инфекционной капли. Она, благоприятствуя развитию патогена, одновременно может индуцировать болезнеустойчивость, предположительно^ участием АФК. Возможно, это связано с эндогенными элиситорами растений, освобождаемыми водой.

Рис.5.6. Проокислитель-ные/ антиокислительные взаимодействия растения и патогена в инфекционной капле. г

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захаренкова, Татьяна Сергеевна, Москва

1. Аверьянов A.A. (1984) Генерация супероксидных анион-радикалов некоторыми фенолами. Биологические науки, 7, 39-44.

2. Аверьянов A.A. (1991) Активные формы кислорода и иммунитет растений. Успехи современной биологии, 111, 722-737.

3. Аверьянов A.A.; Гужова Н.В.; Мочалов В.В. (1981) Влияние света на биохимические свойства мицелия Fusarium oxysporum Schlecht. Микология и фитопатология, 15, 361-365.

4. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. (1985) Супероксидзависимая фунгитоксич-ность выделений листьев риса. Доклады АН СССР, 282, 1004-1006.

5. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. (1988) Генерация кислородных радикалов фенольными соединениями в связи с иммунитетом растений. В сб.: Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Рига: Рижский медицинский институт, с. 203-222.

6. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. (1989) Взаимодействие Сахаров с гидро-ксильным радикалом в связи с фунгитоксичпостью выделений листьев. Биохимия, 54,1646-1651.

7. Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Петелина Г.Г., Джавахия В.Г. (1989) Повышенная чувствительность пигментных мутантов Pyricularia oryzae к токсичным выделениям листьев риса. Физиология растений, 36, 1088-1095.

8. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. (1989) Ослабление супероксиддисмутазой токсичности выделений интактных листьев риса для спор Pyricularia oryzae. Утрата защитных свойств этого фермента при его инкубации на листьях. Биологические науки, 2, 85-89.

9. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. (1990) Активированный кислород как возможный фактор самоингибирования прорастания спор гриба Pyricularia oryzae. Биохимия, 55, 1867-1873.

10. Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Лебраи М.-А. (2007) Тенуазоновая кислота, токсин возбудителя пирикуляриоза, индуцирует болезнеустойчивость и продукцию активных форм кислорода в растениях риса. Физиология растений, 54, 841-846.

11. Аверьянов A.A., Мерзляк М.Н., Рубин Б.А. (1978) Хемилюминесценция при окислении госсипола пероксидазой. Биохимия, 43, 1594-1601.

12. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. (1989) Простые устройства для работы с капельными диффузатами растений. Биологические науки, N9, 107-111.

13. Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Николаев О.Н., Степанов А.И. (2000) Зависящая от активации кислорода защита риса от пирикуляриоза с помощью рибофлавина и розеофлавина. Биохимия, 65, 1530-1537.

14. Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Петелина Г.Г., Джавахия В.Г., Умнов A.M., Стекольщиков М.В. (1987) Влияние меланина на цитотоксичность кислородных радикалов. Биохимия, 52, 1539-1546.

15. Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Умнов A.M., Джавахия В.Г. (1987) Генерация листьями риса радикала 02~ в связи с устойчивостью к пирикуляриозу. Физиология растений, 34, 373-379.

16. Бараненко В.В. (2006) Супероксиддисмутаза в клетках растений. Цитология, 48, 465-474.

17. Бейли Дж.А. (1985) Механизм накопления фитоалексинов. В сб.: Фитоалек-сины, под. ред. Бейли Дж. А., Мансфилда Дж.В. Киев: Наукова думка, с. 282313.

18. Вавилов Н.И. (1964) Проблемы иммунитета культурных растений. Избранные труды. Т.4. M.-JL: Наука, 518 с.

19. Валуева Т.А., Мосолов В.В. (2002) Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений. Успехи биологической химии, 42, 193-216.

20. Ван-Иттен Х.Д., Метьюз Д.Е., Смит Д.А. (1985). В сб.: Фитоалексины, под. ред. Бейли Дж. А., Мансфилда Дж.В. Киев: Наукова думка, с. 182-214.

21. Верещагин А.Г. (2007) Липиды в жизни растений. М.: Наука, 78 с.

22. Волин М.С., Дэвидсон К.А., Камински П.М. (1998) Механизмы передачи сигнала оксидант — оксид азота в сосудистой ткани. Биохимия, 63, 958-965.

23. Гарибова Л.В., Лекомцева С.Н. (2005) Основы микологии. Морфология и систематика грибов и грибоподобных микроорганизмов., М.: Товарищество научных изданий КМК, 220 с.

24. Гешеле Э.Э. (1964) Основы фитопатологической оценки в селекции. М.: Колос, 200 с.

25. Гойман Э. (1954) Инфекционные болезни растений. М.: ИЛ, 608 с.19.

Информация о работе

Захаренкова, Татьяна Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.05

Диссертация

Антагонистические взаимодействия патогенного гриба и растения в инфекционной капле, связанные с активацией кислорода - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы