Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аналоги полиаминов, модифицированные азотистыми основаниями, как потенциальные противоопухолевые агенты

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Аналоги полиаминов, модифицированные азотистыми основаниями, как потенциальные противоопухолевые агенты"

РГ6 од

1 з п;он

На правах рукописи

ФЕДОРОНЧУК Тамара Васильевна

ДИАЛОГИ ПОЛИАМИДОВ, МОДЙФМЦИРОВАННЬЕ АЗОТИСТЫМ! ОСНОВАНИЯМИ, КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ АГЕНТЫ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена на кафедре биохимии Российского Университета дружбы народов.

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Березов Т.Т.

кандидат биологических наук, доцент Сяткин С.П.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Познанская A.A. доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Косквитина Т.А.

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

на заседании диссертационного совета Д 053.22.02 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8, медицинский факультет, к._.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: "117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан -Л- у^Ц1 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор В.Э. ТорОек.

Защита состоится _ ЫЛёН^ 1995 года в '

II

часов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: В процессе совершенствования методов лечения злокачественных новообразований человека на передний план в проблеме современной химиотерапии выдвигается разработка и направленный синтез новых высокоэффективных противоопухолевых агентов (Gottesmann, 1993). В последние два десятилетия арсенал применяемых в клинике антиопухолеЕЬГх средств значительно расширился, однако значительная часть их оказалась малоэффективной и высокотоксичной; некоторые препараты были наделены кратковременным действием или существенными побочными эффектами (Белоусова, 1988; Напалков, 1989; Davidson, 1993).

В настоящее время стало очевидным, что методология поиска и подходов разработки новых перспективных химиотерапев-тических соединений направленного действия с заранее заданными свойствами должна базироваться на фундаментальных исследованиях особенностей метаболизма опухолевой клетки (Бере-зов, 1969; Александров, Беспалов, 1991; Горбунова, 1991). В этом отношении особенности биосинтеза и распада полиаминов, являющихся зссенциальными факторами процессов клеточного роста и дифференцировки, могут служить надежной мишенью для синтеза и конструирования противоопухолевых агентов (Porter, Sufrin, 1986; Pegg, 1988; Nishioka, 1993). Кроме того, ключевые ферменты, катализирующие биосинтез и распад полиаминов, также могут служить основой для разработки специфических ингибиторов, оказывающих тормозящий эффект на активность, например, орнитиндекарбоксилазы (ОДК), уровень которой в опухолевых клетках в несколько раз превышает контрольные величины в здоровых клетках (Березов, Сяткин, 1986; Сят-кин, Березов, 1980; Сяткин, 1979).

Альтернативную стратегию поиска противоопухолевых агентов на основе метаболизма полиаминов составляет разработка и синтез аналогов полиаминов направленного действия, способных связываться в клетке в участках связывания нормальных полиаминов и нарушающих функции внутриклеточных полиаминов (Porter, Sufrin, 1986; Porter, Bergeron, 1988; Bergeron et al.,

1989; Edwards et al., 1990).

Недавно синтезированы аналоги полиаминов, модифицированные азотистыми основаниями, с целью получения специфических химических соединений, способных к образованию не только ионных, но и водородных связей с определенными азотистыми основаниями нуклеиновых кислот. Расстояния между отдельными азотистыми основаниями варьируются за счет разной длины алифатической цепи аналога полиамина. Неюторые из подобных соединений образуют комплексы с ДНК и обладают противоопухолевой активностью, зависящей от длины алифатической цепи молекулы полиамина (Лидак, 1989).

Изложенные выше обстоятельства служили основанием для выбора соединений в качестве объекта данного исследования. Предпочтение было отдано девяти веществам сложной химической структуры; в частности аналогам полиаминов, модифицированных аденозином и урацилом, с различной длиной алифатической цепи (Рис. 1). Все эти соединения были синтезированы в Институте органического синтеза АН Латвии (г. Рига) и любезно предоставлены нам для исследования проф. М.Ю. Лидак.

Целью настоящего исследования был поиск потенциальных противоопухолевых агентов среди аналогов полиаминов, модифицированных азотистыми основаниями, способных ингибировать биосинтез полиаминов.

Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Провести скрининг испытуемых веществ в бесклеточных тест-системах для отбора аналогов, ингибирующих синтез полиаминов и активирующих их распад.

2. Провести скрининг тестируемых аналогов полиаминов е клеточной тест-системе.

3. Выяснить возможность существования зависимости между структурой исследуемых веществ и их эффективностью в качестве потенциальных противоопухолевых агентов.

Научная новизна. Проведено исследование воздействия новых аналогов полиаминов, модифицированных аденозином и урацилом, на синтез полиаминов в бесклеточных и клеточных тест-системах. Результаты экспериментов позволили впервые выявить и рекомендовать для дальнейшего исследования ряд

аналогов полиаминов, модифицированных двумя остатками ураци-лов , в качестве потенциальных противоопухолевых средств. Впервые показан различный характер действия соединений I, III, VI и VIII в бесклеточных тест-системах из регенерирующей ткани и ткани опухоли.

Практическая значимость работ. Результаты скрининга испытуемых соединений в бесклеточных тест-системах из тканей с высоким миготическим индексом могут служить теоретической базой для разработки критериев целенаправленного синтеза веществ, обладающих противоопухолевой активностью. Обоснована возможность использования бесклеточных тест-систем для первичного отбора и прогнозирования малотоксичных веществ с потенциальной противоопухолевой активностью. Предложены новые препараты в качестве потенциальных противоопухолевых агентов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Аналоги полиаминов, модифицированные азотистыми основаниями, обладают потенциальной противоопухолевой активностью, которая возрастает в ряду исследуемых соединений: II < IV < I < III < V < VI < VIII < VII < IX. Результаты биохимического и первичного фармакологического исследования позволяют считать целесообразным дальнейшие фармакологические испытания веществ VII, VIII и IX в качестве потенциальных противоопухолевых агентов.

2. Аналоги полиаминов, модифицированные аденозином, в бесклеточных тест-системах из регенерирующей печени крыс и гепатомы Г-27 активируют синтез полиаминов и подавляют действие ферментов их катаболизма. Аналоги полиаминов, модифицированные двумя остатками урацилов , в тех же условиях подавляют синтез полиаминов и путресцина и активируют аминоокси-дазную активность и, таким образом, проявляют потенциальную противоопухолевую активность.

3. Степень модуляции исследуемыми веществами синтеза полиаминов и путресцина, а также ферментов распада полиаминов зависит от количества метшгеновых групп в алифатической цепи аналогов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции "Современная энзимология:

проблемы и перспективы", посвященная памяти академика А.Е. Браунштейна (на теплоходе г. Санкт-Петербург, 1992); на II Всероссийской научной конференции по программе "Университеты России" (г. Нальчик, 1994); на 9-м съезде по витамину Вб и карбонильному катализу и на 3-м съезде по РСй и хинопротеи-нам (г. Капри, Италия, 1994); а также на научных конференциях кафедры биохимии РУДН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура рабою. Диссертация изложена на _

машинописных страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных исследований. обсуждения результатов, заключения и выводов. Список литературы включает _ источника, из них _ зарубежных. Работа содержит _ рисунка и _ таблиц.

Рисунок 1. Структура исследуемых аналогов полиаминов, модифицированных азотистыми основаниями (I - IX):

I - 8-(2-оксиэтил)амино-9-0-0-ксилофуранозиладенин;

II - 8-(3-оксипропил)амино-9-В-D-ксилофуранозиладенин;

III - 8-(2-аминоэтил)амино-9-В-0-ксилофуранозиладенин;

IV - 8-(4-аминобутил)амино-9-8-D-ксилофуранозиладенин;

V - 8-(5-шинопентил)ачино-9-0-й-ксилофуранозиладенин;

VI - 8-(6-амикогексил)амино-у-в-D-ксилофуранозиладенин;

VII - 1,8-бис(урацилил-5-метилен)триметилендиамин;

VIII - 1,4-бис(урацилил-5-метилен)тетраметилендиамин;

IX - 1,6-бис(урацилил-5-метилен)гексаметилендиамин.

- b -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все вещества (I - IX), полученные из Лаборатории химии синтетических лекарственных средств в виде кристаллических порошков, растворяли в теплой дистиллированой воде или среде Игла. Конечная концентрация их в экспериментах составляла 0.1 мМ. В работе использовали, также, известный цитостатик необратимый фермент-активирующий ингибитор ОДК: DL-й-дифтор-метилорнитин (ДФМО). Это был коммерческий препарат фирмы "Sigma" с Мг 182.17. В экспериментах концентрация ДФМО составляла 0.1 мМ и 5 мМ.

Выбранные модели и объекты исследования соответствовали поставленным задачам исследования.

В экспериментах первого этапа скрининга исследуемых веществ использовали белых беспородных крыс - самцов массой 100 - 130 г, содержащихся на стандартном рационе виЕария РУДН со свободным доступом к воде.

Парциальную гепатэктомию (около 70% ткани) выполняли по методике Higgins, Anderson, (1931) под эфирной анестезией. Для получения регенерирующей ткани печени животных забивали декапитацией через 12 часов после операции и извлекали малые дольки печени.

Штамм гепатомы Г-27 получили из Онкологического научного центра РАМН и пассировали на беспородных белых крысах, как было описано ранее И.Н.Швембергер (1970).

Бесклеточные тест-системы представляли собой цитозоль-ную фракцию (20 ООО g х 20 мин при 4°С) 331 - гомогената регенерирующей печени или ткани гепатомы с добавлением необходимых компонентов для проявления активности ОДК: субстрат -L-Орнитин, ко-фактор - пиридоксальфосфат.

Объектом исследования второго этапа скрининга тестируемых веществ служила культура опухолевых клеток карциномы яичника человека (линия CaOv). В суточных культурах заменяли питательную среду 199 средой Игла с 10% сывороткой крупного рогатого скота без глутамина и вместе с ней вносили тестируемые вещества в необходимых для экспериментов концентрациях.

Определение уровней путресцина, спермидина и спермина в бесклеточных тест-системах и клетках CaOv проводили флюоро-метрически, методом тонкослойной хроматографии в модификации

- б -

С.П.Сяткииа и Т.Т.Березова (1981). Активность ОДК в бесклеточных тест-системах определяли также флюорометрическим методом в модификации Т.Т.Березова и С.П.Сяткина (1986). Активности полиаминоксидазы (ПАО) и диаминоксидазы (ДАО) в регенерирующей печени крыс определяли спектрофотометрическим методом Aarsen, Kemp (1964.) в модификации С.П.Сяткина и Т.Т.Березова (1979).Количество белка в пробах исследуемых тканей определяли по Lowry (1951) в модификации С.П.Сяткина (1980).

Оценку биологической активности потенциальных противоопухолевых агентов проводили радиометрическим методом индикации цитотоксического эффекта (Добрынин и др., 1974) .■ Показателем цитотоксической активности веществ служило угнетение включения 3Н-тимидина в ДНК клеток под действием исследуемых веществ.

Для оценки токсического действия аналогов полиаминов использовали показатель темпа роста культуры (ф ), который вычисляли как разность In (количество клеток в момент времени t) и In (начальное количество клеток), деленная на время роста t. Оценку потенциальной противоопухолевой активности испытуемых веществ проводили в баллах.

В зависимости от критериев оценки противоопухолевой активности параметры тест-систем получают определенную дискретную оценку в баллах в пределах от 0 до 10 для каждого вещества. Затем оценки параметров суммируются по определенному критерию оценки и веществам присваивается суммарный балл, который и расценивается как мощность потенциального противоопухолевого действия тестируемого вещества по заданному критерию оценки.

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента (Афифи, Эйзен, 1982). Различия считались достоверными при р < 0.05.

Простой корреляционный анализ проводили вычисляя выборочный коэффициент корреляции г с учетом 95% доверительного интервала как описано ранее (Афифи, Зйзен, 1982; Сепетлиев, 1968). Промежуточные значения коэффициента корреляции 0 < г < 1 указывали о наличии связи между двумя изучаемыми величинами в более или менее сильной степени.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Скрининг модифицированных аналогов полиаминов с потенциальной противоопухолевой активностью в бесклеточных тест-системах.

Задача первого этапа скрининга химических веществ I -IX заключалась в исследовании прямого действия агентов на метаболизм полиаминов. Для реализации этой задачи были выбраны две бесклеточные тест-системы из тканей с высоким мито-тическим индексом, а тленно:

(а) регенерирующая печень крыс - нормально пролифериру-ющая ткань, характеризующаяся усиленным синтезом полиаминов и регистрируемой активностью аминооксидаз ПАО и ДАО (ПАО и ДАО - ферменты катаболизма полиаминов в клетках, причем ПАО участвует в интерконверсии полиаминов);

(б) солидная гепатома крыс Г-27 - опухолевая ткань с паталогической пролиферацией клеток, характеризующаяся усиленным синтезом полиаминов и полной потерей аминооксидазных активностей ( Сяткин, 1979; Сяткин, Березов, 1982).

В результате скрининга действия модифицированных аналогов I-IX на бесклеточных тест-системах (Табл. 1, 2 и 3) был установлен различный механизм действия веществ VII-IX, модифицированных двумя урацилами, по сравнению с производными аденозина-8 (I-VI). Так, бис(урацилил)-аналоги были наделены способностью эффективно подавлять синтез полиаминов в тест-системах и в то же время повышать активность ферментов катаболизма полиаминов в этих же условиях. Эффект действия аналогов полиаминов, модифицированных аденозином, на синтез полиаминов в бесклеточных тест-системах был противоположным. Бис (урацшшл)-аналоги были более мощными ингибиторами ОДК, чем ДФМО. Корреляционный анализ показал, что способность аналогов полиаминов, модифицированных двумя остатками ураци-лов, подавлять активность ОДК в бесклеточных тест-системах слабо зависит от длины алифатической цепи этих веществ.

В отношении аналогов полиаминов, модифицированных аденозином, корреляционный анализ выявил значительную положительную связь между четным количеством метиленовых групп в алифатической цепи и активностью ОДК под действием этих веществ в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени

Таблица 1. Влияние аналогов полиаминов I - IX на активности ферментов биосинтеза полиаминов в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс.

Веще- % Скорость % Скорость %

ство одк ингиб. синтеза ингиб. синтеза ингб.

спермидина спермина

___ 12,6+1.3 0 2,4+1,4 0 1,5±1,1 0

I 18,5+1,3 +46.8а 12,7±2,0* +429 8,9±1,5 +493

II 10,5±0.9 16,7 10,0±1,1 +317 2,5±0,5 +66,7

III 12,2±1,0 3,2 2,5±0,7 +4,2 <0,001 100

IV 22,510,8" +78,6 11,411,0! +375 1,8+0,4 +20,0

V 10,4±1,0 17,5 8,2±1.2* +242 3,6±0,7 +140

VI 19,5±1,0* +54,8 8,4±1,1 +250 <0,001 100

VII 3,5±0,8 72,2 1,3±0,9 45.8 <0,001 100

VIII 15,0±0,6 +19,0 15,0±1,1 +525 <0,001 100

IX 2,4±0,6* 81,0 2,4±1,1 0 1,1+0,5 26,6

ДФМО 7,9±1,0 37,3 1,2±1,3 50 0,8±0,7 46,7

Таблица 2. Влияние аналогов полиаминов I - IX на ферменты синтеза полиаминов в бесклеточной тест-системе из гепатомы Г-27.

Веще- одк % Скорость Z Скорость %

ство ингиб. синтеза ингиб. синтеза ингиб.

спермид. спермина

— 11,3±0,2 0 9,2+0,3 0 5,2±0,3 0

I з,о±од* 73,5 3,0±0,1* 67,4 2,5±0,1* 51,9

II 24,8±0,3* +120 18,9+0,4* +101 11,2±0,4 +115

III 21,2±0,5* +87,6 14,7+0,4* +59,8 6,0±0,4 +15,4

IV 17,0±0,1 +50,4 13,0±0,1* +41,3 8,8±0,1 +69,2

V 1 "1, 3±0,2 0 5,1+0,2* 42,4 5,3±0,1 +2,0

VI 8.1±0,3* 28,3 7,1±0,4* 22,8 4,2±0,5 19,2

VII 1,1±0,7* 90,3 0,б±0,4* 93,5 <0,001* 100

VIII 3,4±0,7* 70,0 3,2+0,7*! 62,5 3,2+0,3* 38,5

IX 2,2±0,6* 80,5 1,7±0,9* 81,5 1,7±0,5* 67,3

ДФМО 8,7±0,2 23,0 8,2±0,2 10,9 4,0±0,2 23,0

) Достоверные отличия от контроля, р i 0,05. а) Знак (+) соответствует X активации ферментов. Активность ферментов представлена в нмоль продукта реакции/ мг белка в 1 час. Результаты показывают среднее М±т из б параллельных экспериментов.

(г = 0,55). Подобных зависимостей между структурой и эффектом на синтез полиашнов в бесклеточной тест-системе из ге-патомы не обнаружено.

Результаты исследования влияния тестируемых аналогов полиаминов на ферменты катаболизма полиаминов ПАО и ДАО (Табл. 3) говорят о значительном активировании ДАО и ПАО из тест-системы регенерирующей ткани под влиянием веществ группы бис(урацилил-5)-алкилдиаминов VII - IX. Корреляционный анализ указывает на возможную функциональную зависимость между длиной алифатической цепи аналогов и активностью ДАО и ПАО под их влиянием (г - 1). Так как ДАО окисляет первичные аминогруппы (Morgan, 1987), сделать какие-либо заключения о возможном механизме этого наблюдения без детального исследования не представляется возможным. Синтезированные ранее вещества сходной структуры, а именно: бис(бензил)-аналоги полиаминов, - оказались субстратами для ПАО из регенерирующей печени крыс (Bitonti et al., 1990). Поэтому можно предполагать наличие этого свойства и у бис(урацилил)-аналогов полиаминов.

Аналоги полиаминов, модифицированные аденозином, воздействовали на ферменты катаболизма полиаминов следующим образом. Все вещества из этой группы ингибировали ДАО. Степень ингибирующего воздействия зависела от четного количества, ме-тиленовых групп в цели аналога: с увеличением количества ме-тиленовых групп процент подавления активности ДАО соединениями I - VI снижался (г = 0,79). Все вещества подавляли, также, активность ПАО, когда субстратом фермента выступал спермин. ■

Применение двух бесклеточных тест-систем из регенерирующей печени и ткани опухоли печени крыс позволило выявить особенности действия испытуемых веществ на биосинтез полиаминов в тканях с нормальной и опухолевой пролиферацией (Табл. 1-3).Так, вещества 8-(2-оксиэтил)амино-9-ксилофурано-зиладент (I) и 8-(6-аминогексил)амино-9-ксилофуранозиладе-нин (VI) стимулировали как синтез полиаминов, так и торможение их катаболизма в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени; в тест-системе из ткани опухоли эти же аналоги, напротив, подавляли синтез полиаминов. Аналоги 8-(2-ами-

Таблица 3. Влияние модифицированных аналогов полиаминов I -IX на ферменты катаболизма полиаминов ПАО и ДАО в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс.

Активности ферментов даны в нмоль Н2О2 /мг белка в 1 час. Результаты показывают М±ш для 6 параллельных определений.

Веще- ПАО, гL ПАО, спермин" % ДАО, я 7.

ство спермидина ингиб. ингиб. путресцин"3 ингб.

— 16,4±0,3 0 44,0±0,8 0 23,2±0.7 0

i 5.6±0,1* 65,9 25,4±0,1* 42.2 13,6±0Д* 41,4

ii 57',0±0".1* +248 20,8±0.1* 52,7 2.8±0.1 87,9

iii 6, ato',2* 58,5 17.Q10.4 61,4 5;о±од* 78.4

iv 32,2+0.3 +96,3 32.8+0.7 25,5 а;о±о,з* 65,5

v 25,4±0 Д* +54,9 зо;д+од* 30,9 17,4+0.1* 25,0

vi 13,6±0Д* 17.1 31,7+0,1" 28,0 20:4+0;1* 12,1

yii 94,2±0,1* +474 98,8±0,1 +125 30;4±0Д* +31,0

viii 120,5±0,3* +635 111,6±0,2* +154 69,4±'1.5* + 199

ix 150.1+0,1 +815 163,9+0,4 +273 138,8±0'Д* +498

Указаны субстраты ферментов для определения их активности. ) Знак (+) соответствует % активации фермента.

Таблица 4. Цитотоксическая активность аналогов полиаминов I-IX и их влияние на темп роста культуры опухолевых клеток СаОу. (В скобках указаны величины, расчи-танные методом пробит-анализа).

Вре- Вуще- се50, Ф Веще- се50, Ф

мя,ч ство мкг/мл ство мкг/мл

0 0,18

24 --- — -0,31 v 100 -0,43

48 -0,20 (97,8) 0.79

72 0,41 0,14

24 i 40±25 -0.14 vi 130 -0,05*

48 0,44* (125,9) 0,34

72 0,59 -0.44

24 ii 20,4±20,0 0.16* vii 150 "1,06*

48 -0,12* (141,3) 1,42*

72 0,67 -0,32

24 iii >1000 0,16* viii >>1000 0,04*

48 (1585) 0.78* (260 мг/мл) 0,35"

72 -0,27* -0,03*

24 iv >>1000 -0.37 ix >>1000 -0,50

48 (468 мг/мл) 0.60* (9,1 г/мл) 0.83

72 0,32* 0,12

*) Достоверные отличия от контроля, р ^ 0,05.

ноэтил)амино-9-ксилофуранозиладенин (III) и 1,4-бис(ураци-лил-5-метилен)тетраметилендиамин (VIII) в бесклеточной тест-системе из регенерирующей ткани не оказывали заметного влияния на синтез полиаминов, но были способны активировать катаболизм полиаминов (вещество VIII) или ингибировать этот процесс в тех же условиях (вещество III). В тест-системе из ткани опухоли вещество III активировало синтез полиаминов в отличие от аналога VIII, который подавлял синтез полиаминов в системе в большей степени, чем известный ингибитор ключевого фермента синтеза полиаминов ОДК - ДФМО.

Способность бис(урацилил)-аналогов подавлять синтез полиаминов и активировать их распад в бесклеточных тест-системах выгодно выделяет эту группу веществ из 9 исследованных аналогов полиаминов и позволяет утверждать, что бис(урацилил) -производные наделены потенциальной противоопухолевой активностью. К тому же, вещество VIII из этой группы аналогов обладало селективным действием по отношению к синтезу полиаминов в опухоли.

Результаты скрининга модифицированных аналогов полиаминов, полученные в бесклеточных тест-системах, необходимо было проверить на клеточном уровне.

2. Исследование биологических свойств модифицированных аналогов полиашгаов в клеточной тест-системе.

Первым шагом тестирования исследуемых веществ в культуре опухолевых клеток человека CaOv (раковые клетки яичника) была проверка их цитотоксической активности на основании данных по синтезу ДНК, в частности по включению меченого ти-мидина в ДНК опухолевых клеток (Табл.4: СЕ50). Результаты этого исследования показали отсутствие цитотоксической активности у бис(урацилил)-алкилдиаминов VIII и IX, что выгодно выделяло этот класс аналогов в свете современного поиска малотоксичных противоопухолевых агентов (Лидак, 1989-, Горбунова, 1991). Цитотоксическая активность по отношению к клеткам CaOv была выявлена у двух оксианалогов полиаминов, модифицированных аденозином: вещества I и II (CEso = 40 и 20 мкг/мл соответственно). Учитывая результаты опытов, полученных с веществами I и II з бесклеточных тест-системах, можно было предположить, что вещество I, оказывающее ингибирующее

(нмоль/105 клеток)

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

180 160 140 120 100 80 60 40 £0 О

J_L.

Количество клеток х 103 900

в

800 700 600 500 400 300 200 100 О

900 800 700 600 500 400 300 200 100 О

1 2 3 0 1 2 3

Время инкубации (сутки)

Рисунок 2. Уровни полиаминов в процессе роста культуры опухолевых клеток CaOv под влиянием тестируемых веществ i (А), viii (В) и ix (С). Контроль показан на рис.(Б). Уровни полиаминов изображены сплошной линией и символами: путресцин - (*); сперми-дин - (в); спермин - (•). Клетки изображены в виде (---о---).

действие на синтез полиаминов в тест-системе из ткани опухоли и обладающее цитотоксической активностью, могло проявить свойства цитотоксического агента на клеточном уровне, вызывая, соответственно, торможение пролиферации опухолевых клеток.

Культура опухолевых клеток CaOv была удобной моделью для исследования антипролиферативных свойств исследуемых аналогов полиаминов. Длительность клеточного цикла составляла всего 44 часа (Николаева. 1979). Результаты исследования СГабл.4: <р) показали, что модифицированные аналоги полиаминов не оказывают тормозящего эффекта на рост опухолевых клеток в первые двое суток инкубации с клетками (кроме вещества VII).

При исследовании влияния аналогов I, VIII и IX на уровни полиаминов в пролиферирующих клетках CaOv (Рис. 2) была открыта индукция синтеза полиаминов в ответ на введение веществ в культуральную среду во всех случаях, как и повышение интенсивности деления клеток на вторые сутки. Существенное ингибирующее действие на синтез полиаминов наблюдалось лишь на третьи сутки инкубации клеток CaDv с веществами VIII и IX, в то время как вещество I в этих же условиях не вызывало заметного снижения уровней полиаминов в клетках (Рис. 2).

Наблюдаемое снижение уровней полиаминов и торможение клеточной пролиферации культуры CaOv под влиянием бис(ураци-лил)- аналогов (Рис. 2) можно, очевидно, объяснить как инги-бирующим действием этих Ееществ на синтез полиаминов в опухолевой клетке, так и возможным участием этих аналогов в "летальном синтезе" ДНК. Для установления истинного положения и механизма действия указанных препаратов необходимы дальнейшие исследования.

В целом, на основании полученных в работе экспериментальных данных при испытании модифицированных аналогов полиаминов в различных тест-системах скрининга можно сделать вывод о потенциальной противоопухолевой активности минимум у трех из 9 исследованных аналогов полиаминов, а именно у бис(урацилил)-алкилдиаминов VII, VIII и IX. Этот вывод подкрепляется также проведенной в работе оценкой противоопухолевой активности веществ, рассчитанной в баллах. Суммарный ряд

возрастания потенциальной противоопухолевой активности аналогов полиаминов, модифицированных азотистыми основаниями может быть представлен в последовательности: II < IV < I < III < V < VI < VIII < VII < IX. Одним из возможных механизмов противоопухолевого действия аналогов VII, VIII и IX на клеточном уровне может быть их ингибирующее действие на биосинтез полиаминов de novo в опухоли, показанное в прямых экспериментах в бесклеточной тест-системе.

Корреляционный анализ связи проявляемой активности аналогов в клеточной и бесклеточной тест-системах показал, что чем меньше цитотоксичность испытуемого вещества, тем выше его способность подавлять синтез полиаминов в бесклеточной тест-системе из ткани опухоли (г = 0,80). Такая же зависимость для цитотоксичных веществ была слабо выраженной (г = -0,13). Поэтому, на основании проведенного исследования можно сделать заключение о возможности использования бесклеточных тест-систем для первичного отбора и прогнозирования малотоксичных веществ с потенциальной противоопухолевой активностью и селективным действием на метаболизм полиаминов в опухолевых клетках среди новых синтезированных аналогов полиаминов .

Результаты экспериментального исследования позволяют рекомендовать бис(урацилил)-алкилдиамины VII, VIII и IX для дальнейшего, фармакологического исследования их в качестве потенциальных противоопухолевых препаратов с возможным селективным действием на опухолевые клетки.

ВЫВОДЫ

1. В бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс модифицированные аденозином аналоги полиаминов I - VI (8-(2-оксиэтил)-, 8-(3-оксипропил)-, 8-(2-аминоэтил)-, 8-(4-аминобутил)-, 8-(5-аминопентил)- и 8-(6-аминогексил)амино-9-B-D-ксилофуранозиладенин) активировали синтез полиаминов и подавляли активности ферментов катаболизма полиаминов; бис-(урацилил)-аналоги полиаминов VII - IX (1,3-бис-, 1,4-бис- и 1,6-бис(урацилил-5-метилен)алкилдиамин) в этих же условиях ингибировали синтез полиаминов в тест-системе и активировали

ферменты катаболизма полиаминов: полиаминоксидазу (ПАО) и диаминоксидазу (ДАО).

2. В бесклеточной тест-системе из ткани опухоли крыс бис(урацилил)-аналоги полиаминов и вещество I, модифицированное аденозином, в значительной степени подавляли синтез полиаминов, в то время как остальные вещества, модифицированные аденозином, напротив, усиливали синтез полиаминов в этих же условиях.

3. Обнаружен различный эффект на синтез полиаминов в двух бесклеточных тест-системах, оказываемый веществами I, III, VI и VIII. Так, аналоги полиаминов I и VI в бесклеточной тест-системе из регенерирующей ткани активировали синтез полиаминов, а в тест-системе из гепатомы подавляли его в значительной степени. Модифицированное аденозином вещество III и бис-(урацилил)-аналог VIII не оказывали заметного влияния на синтез полиаминов в тест-системе из регенерирующей ткани, но в тест-системе из ткани опухоли вещество III активировало, а VIII, наоборот, эффективно ингибировало синтез полиамиков в системе.

4. Наибольшей цитотоксичностью в первые сутки инкубации тестируемых веществ с опухолевыми клетками карциномы яичника человека (CaOv) наделены оксианалоги полиаминов, модифицированные аденозином, I и II с терминальной ОН-группой (СЕ50 = 40 мкг/мл для I и СЕ50 =20,4 мкг/мл для вещества II).

5. Инкубация культуры CaOv с модифицированными аналогами полиаминов (III, VI, VII, VIII и IX) в концентрации 0.1 мМ в течение 72 часов приводила к торможению пролиферации опухолевых клеток.

6. Вещества I, VIII и IX вызывали индукцию биосинтеза полиаминов в опухолевых клетках CaOv при внесении их в куль-туральную среду.

7. На основе простого корреляционного анализа в бесклеточной тест-системе из регенерирующей ткани установлена положительная зависимость между четным количеством метиленовых групп в алифатической цепи веществ и приростом активности орнитиндекарбоксилазы (ОДК) (г = 0,51) под действием аналогов полиаминов, модифицированных аденозином (I - VI) , положительная зависимость между длиной алифатической цепи и ак-

тивностями ПАО и ДАО (г = 0,99) для бис(урацшшл)-аналогов (vii - ix); в бесклеточкой тест-системе из ткани опухоли подобных зависимостей между структурой и функцией не выявлено.

8. По результатам оценки биологического действия исследованные вещества (I - IX) располагаются в следующей последовательности возрастания потенциальной противоопухолевой активности: II < IV < I < III < V < VI < VIII < VII < IX. Эти данные позволяют считать целесообразными дальнейшие предклинические испытания бис(урацшшл)-аналогов полиаминов (VII - IX) в качестве потенциальных противоопухолевых агентов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Федорончук Т.В., Сяткин С.П., ЛуллеИ.Ж., Янсон Я.Я., Лидак М.Ю., Березов Т.Т. Влияние химически модифицированных аналогов полиаминов на биосинтез полиаминов и путрес-цина в бесклеточной тест-системе из гепатомы крыс // Бюлл. Эксп. Биол. Мед.- 1993.- N9.- С. 256-258.

2. Сяткин С.П., Федорончук Т.В., Березов Т.Т. Особенности влияния модифицированных аналогов полиаминов на биосинтез полиаминов и путресцина в бесклеточных системах из быстро пролиферирующих тканей // Фундаментальные основы жизнедеятельности организма в норме и патологии: Сб. матер. II Всеросс. науч. конф. Программы "Университеты России", раздел "Медицина".- Нальчик, 1994.- С. 129-135.

3. Fedorontchouk T.V., Syatkin S.P., Lidack M.Yu., Be-rezov T.T. The biosynthesis of polyamines and putrescine in cell-free system of rat hepatoma as a result of treatment with chemically modified analogs // Modern Enzymology: Problems and Trends / В.1. Kurganov, S.N. Kochetkov, V.I. Tish-kov, Eds.- NY: Nova Science Publishers, Inc., 1994.- (in press).

4. Syatkin S.P., Fedorontchouk T.V., Lidack M.Yu., Be-rezov T.T. Effect of synthetic polyamine analogs on polyami-ne metabolism in cell-free system of regenerating rat liver // Modern Enzymology: Problems and Trends / В.I. Kurganov, S.N. Kochetkov, V.I. Tishkov, Eds.- NY: Nova Science Publishers, Inc., 1994.- (in press).

Fedorontcouk Tamara V. / Russia /.

"Polyamine analogs modified by nitrogen bases as potential antitumor agents".

The paper dilts with the in vitro screening of potential antitumor agents of' 9 new chemically modified polyamine analogs (i - ix), which inhibited the polyamine synthesis in subcellular and cellular systems.

In the first chapter the effects of analogs on the polyamine synthesis and on the activity of two enzymes of polyamine degradation (РАО and DAO) were investigated in cell-free systems of rat regenerating liver and rat hepatoma H-27. It has been shown that bis(uracilyl) polyamine analogs VII - IX are strong inhiditors of polyamine synthesis in test-systems and potentiators of DAO and РАО activities. Polyamine analogs, modified by adenosine, stimulated the polyamine synthesis and inhibited the amine oxidases at the same conditions.

The results of series of experiments on cellular levels (human ovary carcinoma cells CaOv) showed the absence of cy-totocsic activity of bis(uracilyl) analogs; at the same time theese substances could act as antiproliferative agents and decreased the polyamine levels in cells.

In the third chapter the potential antitumor activity of polyamine analogs was calculated in balls. As result, it was received the order of increasing potential antitumor activity between 9 investigated modified polyamine analogs.

Bis(uracilyl) polyamine analogs with different number of' methylen groups were the most active and it was preposed to further investigation as substances having potential antitumor and antiproliferative properties. ^t^

24»0&.,95g, Объем 1,25пу jr„ Тар., 1(%Г Ззк. 292 Tim. 2УДЙ, Одажониквдве, 3