Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ ядерного и цитоплазматических геномов у асимметричных соматических гибридов и их полового поколения в роде Lycopersicon

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ ядерного и цитоплазматических геномов у асимметричных соматических гибридов и их полового поколения в роде Lycopersicon"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ КЛІТШШОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

На правах рукопису УДК 575.13.133

ЗАВГОРОДІШ Ганна Валентинівна

АНАЛІЗ ЯДЕРННХ ТА ЦИТОПЛАЗМАТИЧНИХ ГЕНОМІВ У АСИМЕТРИЧНИХ СОМАТИЧНИХ ГІБРИДІВ І ЇХ СТАТЕВИХ ПОКОЛІНЬ В РОДІ ЬУСОРЕІШСОН

03.00.25. - клітинна біологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

Робота виконувалась у відділі цитофізіології та клітинної Інженерії Інституту клітинної біології та генетичної Інженерії НАН України

Науковий керівник - академік НАН України, доктор

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук, професор

Провідна організація - Інститут фізіології рослин НАН

Захист відбудеться 1995 р. о/^од. на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 01.19.01 Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 252143, Київ-143, вул. Заболотного, 148.

З дисертацією можііа ознайомитись в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 252143, Київ-143, вул. Заболотного, 148.

Автореферат разіслано ^ ^**-1 1995 р.

біологічних наук, професор ГЛЕБА Ю. Ю.

ХРАПУНОВ С.М.

доктор біологічних наук, професор КУНАХ В. А.

України

Вчений секретар спеціалізованої ради, кандидат біологічних наук

Л.В.Малишева

- з -

Актуальність проблеми. Багато корисних ознак сільськогосподарсько важливих овочевих культур визначаються не лише ядерними, але 1 цитоплазматичними геномами. Та не завжди вдається домогтися поліпшення цих культур за допомогою традиційних методів селекції. Зокрема, існують певні обмеження при схрещуванні культурного томату з дикими видами роду Lycopersicon. Це обумовлено, по-перше, односторонньою сумісністю культурного томату при схрещуванні з більшістю диких видів томату, тобто коли L. esculentum використовується в якості материнської форми 1, по-друге, одно-батьківським, материнським успадкуванням цитоплазматичних генів при статевій гібридизації. Використання в селекційному процесі різноманітних диких видів томату шляхом соматичної гібридизації, для якої характерне двобатьківське успадкування плазмагенів,. відкриває можливості використання корисних ознак, що кодуються цитоплазматичними геномами цих видів.

В 1991 році в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України були вперше отримані високо-функціональні (фертильні) асиметричні соматичні гібриди з продуктів злиття мезофільних протопластів пластомного хло-рофілдефектного мутанту L. esculentum Mill, та інактивованих гама-променями мезофільних протопластів дикого виду L.

peruvlanum var. dentatum Dun. (Ratushnyak et al., 1991).

Після самозапилення асиметричних гібридів були отримані рослини Fj та F2. До цього часу відомо лише декілька робіт по отриманню фертильних соматичних гібридів в роді

Lycopersicon (Wijbrandl et al., 1990; Sacata and Monma,

1993). Однак, по-перше, ці гібриди були симетричними, а по-друге, у них та їх статевого покоління Ft дослідники аналізували в основному лише ядерний геном. Тому після

■ - 4 -

отримання фертильних асиметричних гібридів L. esculentum + L. peruvianum var. dentatum було доцільно прослідкувати-характер успадкування ядерних та цитоплазматичних геномів рослинами статевих поколінь за допомогою молекулярно-генетичного аналізу. Оскільки публікації по такому молекулярно-генетичному вивченню асиметричних соматичних гібридів та їх статевих поколінь відсутні, проведення таких досліджень було цікавим і актуальним.

Мета та задачі дослідження. В зв’язку з вищесказаним, метою цієї роботи було проведення молекулярно-генетичного аналізу фертильних асиметричних соматичних гібридів L. esculentum Mill. + L. peruvianum var. dentatum Dun., зокрема, вивчення долі ядерних та цитоплазматичних генетичних детермінант на протязі двох статевих генерацій.

Необхідно було вирішити такі задачі:

1. Вивчити та порівняти характер успадкування ядерного

генетичного матеріалу у асиметричних гібридів та їх статевого покоління Fj за допомогою аналізу множинних молекулярних форм ферментів. .

2. Дослідити успадкування генів рибосомальної РНК соматичними гібридами та рослинами двох статевих поколінь за допомогою блот-гібридизації ядДНК з фрагментом 25S рДНК.

3. Вивчити характер сегрегації батьківських пластомів у асиметричних соматичних гібридів.

4. Простежити успадкування мітохондріальної ДНК у сома-

тичних гібридів та статевого покоління, отриманого після самозапилення. ■

Наукова новизна та практична цінність.

Вперше для соматичних гібридів в роді Lycoperslcon ви-'

явлено перебудови в хлоропластному геномі, що свідчить про можливість маніпулювання ним. ,

Вперше для соматичних гібридів простежено успадкування мтДНК в двох статевих поколіннях.

Доведено стабільне успадкування цитоплазматичних геномів. змінених у асиметричних соматичних гібридів, в двох статевих поколіннях.

Вперше проведено комплексне молекулярно-генетичне дослідження фертильних асиметричних соматичних гібридів І,, езсиїепіиш + региуіапига уаг. (ЗепІаШт та їх двох статевих генерацій.

Результати досліджень можуть бути використані в подальших селекційних програмах томату.

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися та обговорювались на Міжнародному симпозіумі по протопластах (Упсала, Швеція, 1991), 1-ому Всесоюзному симпозіумі "Нові методи біотехнології рослин" (Пущино, 1991),

4-Ій Всесоюзній конференції "Екологічна генетика рослин, тварин, людини" (Кишинів, 1991), конференції молодих вчених "Актуальні проблеми фізіології рослин та генетики" (Київ, 1992), Російському симпозіумі "Нові методи біотехнології рослин" (Пущино, Росія, 1993), 2-му з'їзді Українського товариства фізіологів рослин (Київ, 1993), Міжнародному генетичному конгресі (Бірмінгем, Англія, 1993), Міжнародному конгресі по культурі тканин та клітин рослин (Флоренція, Італія, 1994), 4-му Міжнародному конгресі по молекулярній біології рослин (Амстердам, Нідерланди, 1994), Міжнародному симпозіумі по біотехнології та генетичній Інженерії рослин (Київ, Україна, 1994).

Публікації. По матеріалам дисертації опубліковано та

прийнято до друку 17 робіт.

Автор висловлює глибоку вдячність науковому співробітнику Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України МЛІ. Черепу за приємну і плідну співпрацю та допомогу, надану при підготовці роботи, а також науковим співробітникам того ж інституту Ратушняку Я. І. та Рудасу В.А.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, експерементальної частини та обговорення, заключения, висновків та списку літератури, який містить 262 найменувань. Робота викладена на 145 сторінках машинопису та містить 10 рисунків та одну таблицю.

Матеріали і методи.

Характеристика рослинного матеріалу та зондів.

Асиметричні соматичні гібриди Lycoperslcon esculentum Mill, (сорт Fruhe Liebe) + Lycoperslcon peruvianum var. dentatum Dun. (лінія 3772): клони 1D-4D, 7D, 8D та 11D-13D

(Ratushnyak et al., 1991; Ratushnyak et al., 1993). 2. Ста-

теве покоління Fj та Fe, отримане після самозапилення гібридів. 3. Пластомний хлорофілдефектний мутант Pl-alb 1 L. esculentum Mill, сорту Fruhe Liebe (реципієнт 2n=2x=24) (Самсонова, 1970). Насіння було люб’язно надіслано' Т.А. Гавриленко (ВИДІ рослинництва їм. М. І. Вавілова, Санкт-Петербург, Росія). 3. Дикий тип культурного томата L. esculentum Mill. (2п=2х=24) сорту Quedllnburger Fruhe Liebe. Насіння отримане від доктора Х.Леманна (Ін-т генетики, Гатерслебєн.. Німеччина). 4. Дикий вид томату L. peruvianum var. dentatum Dun. лінія 3772 (донор. 2п=2х=24). Насіння було люб’язно надано А.А.Кученко і Н.Ф.Бочарниковою (Ін-т генетики, Кишинів, Молдова).

В роботі в якості зондів для гібридизації днк були використані такі послідовності ДНК: і. Фрагмент гену 25S рРНК

із Citrus limon (Колоша, Фодор, 1986). 2. Послідовність

першої субодшшці цитохромоксидази сохі (Hiesel et al., 1987). 3. Послідовність другої субодиниці цитохромоксидази

сохІІ (Hiesel and Brennlcke, 1983). 4. Послідовність третьої субодиниці цитохромоксидази сохІІІ (Hiesel et-al., 1987). 5. Послідовність апоцитохрому b (cob) (Schuster and Brennlcke, 1985). 6. Послідовність 18S + 5S + 5’nd5 (Brennlcke et al.,

1985). 7. Послідовність субодиниці АТФ-ази 9 (Schuster and

Brennlcke, 1987).

Аналіз множинних молекулярних Форм Ферментів (ММФФ).

Листя 2-3-тижнєвих рослин гомогенізували в буферному розчині для вилучення білків, який містив 0;05 М Трис-НСІ,

0,2% меркаптоетанол (рН=7,5) у співвідношенні 1:3 рослинного матеріалу та буферу. Гомогенат центрифугували протягом ЗО хв. при 40000g. Після цього супернатант відбирали і' переносили в чисту пробірку. Електрофоретичне розділення білків проводили в 7,5% чи 10% поліакриламіднсму гелі. В якості електродної буферної системи використовували розчин вероналу (0,56%) і Трису (0,1%). Виявлення- активності естерази, ма-латдегідрогенази, пероксидази. кислої фосфатази здійснювали згідно Brewer (1970). -

Виділення хлоропластної. мЗтоХондріальної . та ядерної ДНК (хл-. мт- та ядДНК).

ДНК з хлоропластів, мітохондрій і ядер виділяли згідно раніше описаних методик (Wilson and Chourey, 1984; Bookjans et al., 1984) з незначними модифікаціями.

Рестрикцію ДНК приводили згідно рекомендацій постачальників ферментів (НПО "Фермент”, м. Вільнюс, Литва) протягом 8 год при 37° С з надлишком ферменту. .

Рестриктні фрагменти ДНК розділяли методом електрофорезу в горизонтальних 0,6-0,8% агарозних гелях розміром 20 х 18 х 0.4 см (агароза типу I, Sigraa, США). Електрофоретичне фракціонування проводили з використанням Трис-ацетатного буферу. В якості маркерів молекулярних мас використовували ДНК фага X. оброблену ендонуклеазою Hind III. .

Виділення- плазмідної ДНК і приготування зондів.

Для виділення плазмідно! ДНК використовували метод лужного лізису (Birnbolm and Doly, 1979). Клоновані фрагменти ДНК виділяли за методом (Winberg and Hammazekjold, І980).

Радіоактивну мітку [32Р1-дНТФ ("Ізотоп", Ташкент) вводили в ДНК зондів реакцією нік-трансляції, використовуючи набір для мічення ("Фермент", Вільнюс, Литва) за рекомендаціями постачальника.

Гібридизацію ДНК на Фільтрах здійснювали за методом (Charch and Gilbert, 1984).

Результати та обговорення.

1. Успадкування ядеоного геному в двох статевих генераціях асиметричних соматичних гібридів.

1.1. ІзоФерментний аналіз 1 блот-гібридизація ядДНК.

Ізоферментний аналіз виявив відмінність між спектрами ізоферментів соматичних гібридів та їх статевим поколінням Fj. Для соматичних гібридів ізоферменти малатдегідрогенази, пероксидази та кислої фосфатази показали спектри, які були практично Ідентичні таким L. esculentum (Рис. 1 А, Б).

- 9 -

Зокрема, була показана відсутність локусу Арз-1 перуанського томата в спектрах ММФ кислої фосфатази всіх отриманих соматичних гібридів, що говорить про їх асиметричність. ММФ естерази виявили гібридність ядерного генетичного матеріалу у гібридів. При порівнянні всіх проаналізованих ізофермент-них спектрів соматичних гібридів із такими у їх статевого покоління Fj була показана тенденція до переважного виявлення видоспецифічних смуг активності ферментів від перуанського томату, а такоя - відмінність між спектрами самих рослин Fj (Рис. 1 В, Г).

Ядерну ДНК гібридів та рослин двох статевих генерацій Fj і Fa обробляли рестриктазами EcoRV 1 Dral та гібридизували з фрагментом 25S рДНК із Citrus Іішоп. При використанні цих двох ферментів було виявлено гібридну природу ядерного матеріалу соматичних гібридів (Рис. 2 А-Г). Аналіз блот-гібридизації ядДНК-рослин Ft, обробленої Dra І, показав для більшості з них присутність змінених спектрів. Зміни стосувались не тільки рухливості фрагментів, але й ступеня їх ампліфікації. Для рослин Fz в обох випадках була показана відсутність в гібридизаційному спектрі видоспецифічного фрагменту L. esculentura. Але з використанням ферменту Dral в доповнення до -специфічних фрагментів від перуанського томата 5,8 і 5,1 т. п. н. для рослин F2 був виявлений новий, не-батьківський фрагмент.6,5 т.п.н.

1.2. Нестабільність ядерного геному асиметричних соматичних гібпилів.

Отримані дані підтверджують асиметричну природу ядерного генетичного матеріалу соматичних гібридів. Мінливість в рухливості і ступені ампліфікації фрагментів ядДНК рослин Ft

Рис. 1. Спектри множинних молекулярних форм малатдегідроге-нази соматнчйих гібридів (А) та статевого покоління Fj (Б); кислої фосфатази у соматичних гібридів (В) та статевого покоління (Г). А. В: 1-3 - соматичні гібриди 12D, 7D, 8D; 4- L. peruvlanum var. dentatum (3772); 5- L. peruvlanum var. dentatum (3767); 6-

L. esculentum PI alb 1; 7-9 - соматичні гібриди

11D, 4D, 3D відповідно; 10- L. esculentum. Б. Г:

1-3 - клон 4D та його покоління Fj; 4- L.

esculentum Pi alb l; 5- L. peruvlanum var. dentatum (3772); 6- L. esculentum; 7-9 - рослини покоління

F, клону 8D; 10- клон 8D.

Б

: | СЗ" С9Є90»

» 2. і 5 6 7 & 9 Ш Иіг її і а з і) - ... 5 6 7 £ 9

■ .... .... •• - і 1 і * 4 !

0 © 3 1 —... ?. ІЗ Т? *ИВ^

і 1 — і і і

Г

Рис. 2. Авторадіограма блот-гібридизації ядерної ДНК / ЕсоИУ Із фрагментом 25Б рДІІК соматичних гібридів (А) та статевого покоління Еі (Б); ядерної ДНК / Пга І соматичних гібридів (В) та статевого покоління Еі. А, В: і- Ь. репМапит уаг. йепіаіит (3767); 2- клон

1С; З- Ь. езсиІєпШш; 4- Ь. региуіапиш уаг. йепІаШш (3772); 5-13 - клони Ю-40, 70, 8Б,

ПБ-ІЗІ). Б, Г: 1-2 - покоління Еі клону 10; 3- покоління Гі клону 2В; 4- покоління Еі клону ЗБ; 5-6

- покоління Ел клону 40; 7-8 - покоління Е4 клону

8Б; 9- покоління Ег клону 4Б.

:S-J D Ґ* ■■■ -М

1 2 5 >t 5 6 7 & 9 10 М

R I ,; fjJ <«£ •„ ^и.

u fc* '*r »;л. j>b <©* C& f.Jv ,\> .* fcj|

|iW V^/ “** * V f ■"* £*

** W

~.ч 4Й-*

«5©3 O •*

Обд»' «a **

Рис. 3. Рестриктні спектри хлДНК / Sac І (А) та хлДНК / Hind III (Б), та авторадіограма блот-гібридизації хлДНК / Hind III Із сумарною хлДНК (В). 1- L.

esculentum; 2- L. peruvlanum var. dentatum (3772); 3-6 клони 1D-4D; 7- 7D; 8- 8D; 9-11 - 11D-13D.

•G5—

=зп

1Б

rr

і 2. 5 k 5 6 ? &. 9 to

пГ

“»вв •— &SCZ) в» ffi9

Рис. 4. Авторадіограма блот-гібриднзації мтДНІС / Вага НІ соматичних гібридів (А) та статевого покоління Fi (Б), та мтДНК / Sal GI соматичних гібридів (В) та статевого покоління Ft (Г) із зондом 18S+5S=5’nD5. А. В: 1- L. esculentum; 2- L. peruvianum var.

dentaturn (3772); 3- клон SR; 4-12 - клони 1D-4D,

7D, 8D, 11D-13D. Б, Г: 1-2 - покоління Ft клону ID; З- покоління Fj клону 2D; 4- покоління Ft клону 3D;

5-7 - покоління Ft клону 4D; 8-Ю - покоління Ft

клону 8D; 11- покоління F2 клону 4D.

говорить про її нестабільність. А відсутність видоспе-цифічних фрагментів ядДНК культурного томата у рослин F2 свідчить про часткову елімінацію його ядерних генів. Морфологічний аналіз також виявив у рослин F2 наявність більшої кількості морфологічних ознак від перуанського томата.

Таким чином, в даному випадку елімінація ядерних генів культурного томата. очевидно, викликана соматичною несумісністю L. esculentum і L. peruvianum var. dentatum. Можливо, на отриманий результат мала вплив асинхронність батьківських мейотичних циклів та рекомбінація хромосом, що було необхідним для стабілізації гібридного геному рослин F2. Присутність видоспецифічних смуг перуанського томата при ізоферментному аналізі статевого покоління Fi може також свідчити про певні структурно-функціональні перебудови, що проходили у гібридному ядрі в процесі мейозу.

2. Успапкування хлоропластних геномів v соматичних гібридів. ' ' . . •

Для рестриктного аналізу хлДНК гібридів та їх статевого покоління Fi використовували декілька рестриктних ферментів, зокрема, Hlndlll, SacI, Bglll. При використанні рестриктази SacI було показано, що хлоропластна ДНК усіх гібридів, які вивчались, була ідентична спектру хлДНК L. peruvianum var. dentatum (Рис. З А).. Аналогічний результат отриманий і для покоління Fj. Це може свідчити про те, що в цих гібридів відбулась направлена сегрегація хлоропластів.

При використанні рестриктази Hind III для аналізу хлДНК соматичних гібридів була показана, наявність у частини з них змінених спектрів рестриктних фрагментів в порівнянні з батьківськими (Рис. З Б). Було показано відсутність двох

батьківських фрагментів від L. peruvlanum var. dentatum та появу п’яти нових фрагментів. У статевого покоління Fj знайдені аналогічні перебудови хлДНК.

Для більш детального вивчення хлДНК гібридів із зміненими рестриктними спектрами (клони 2D. 3D. 8D. 11D-13D)

застосовувався метод блот-гібридизації хлДНК/HindIII із загальною хлДНК культурного томата. Отримана авторадіограма показала, що зміни хлДНК дійсно відбулися у соматичних гібридів, зокрема, у гібридів 2D. 3D, 7D, 8D. 11D-13D. Тут слід відмітити, що у вищеназваних клонів був збільшений ступінь копійності фрагменту величиною 12,6 т.п. н. У двох гібридів (2D та 3D) був відсутній фрагмент величиною 6,2 т.п.н. У всіх соматичних гібридів із зміненою хлДНК також були наявні чотири додаткові фрагменти 4,1, 2,5, 2,3. 1,8

т.п.н., що не спостерігалися для батьківських форм та інших соматичних гібридів (1D та 4D).

Отриманий результат підтвердив наявність змін в хлДНК асиметричних гібридів, 1 може бути інтерпретований як рекомбінація хлДНК. Подальше рестриктне картування та секвену-вання змінених ділянок хлДНК допоможе визначити природу виявлених перебудов.

3. Аналіз успадкування мтДНК у соматичних асиметричних гібридів та двох статевих поколінь.

Для рестриктного аналізу мітохондріальної ДНК соматичних гібридів 1 статевого покоління Ft та F2 використовували рестриктази НішЛІІ, ВашНІ, Sail и Pstl. Рестриктний аналіз мтДНК з використанням цих ендонуклеаз виявив змінені рест-риктні спектри у соматичних гібридів в порівнянні з батьківськими.

- 16 -

Для більш детального вивчення зазначених змін мтДНК у соматичних гібридів 1 рослин Ft була застосована блот-гібри-дизація Із зондами сохі, сохІІ. сохІІІ, cob, 18S+5S+5'nD5, atp 9.

Блот-гібридизація мтДНК з використанням в якості зонда послідовності 1 субодиниці цитохромоксидази (сохі) практично не виявила змін в спектрах мтДНІС. Лише при гібридизації мтДНК/PstI гібридизаційний спектр соматичних гібридів 1D-4D був ідентичним такому культурного томата, зокрема, за фрагментом величиною 22.9 т.п.н. Однак, для іншої групи гібридів (7D. 8D, 11D-13D) та для перуанського томату був виявлений

фрагмент величиною 19 т.п.н. Аналіз гібридизаційних спектрів рослин Fj також виявив ідентичність їх із спектрами вихідних соматичних гібридів.

При використанні в якості зондів послідовностей сохІІ 1 сохІІІ цитохромоксидази суттєвих відмін в гібридизаційних спектрах соматичних гібридів не виявлено, за винятком розбіжностей в ступені ампліфікації деяких фрагментів.

Використання в якості зонду для блот-гібридизації нук-леотидної послідовності 18S+5S+5’nD5 показало суттєві відміни в гібридизаційних спектрах для всіх рестриктаз. Гібридизація мтДНК/ВашНІ виявила, що гібридизаційні спектри першої групи соматичних гібридів 1D-4D ідентичні спектру L. peruvlanum var. dentatum. Однак, для соматичних гібридів 7D, 8D, 11D-13D знайдений новий гібридизаційний спектр, де був

виявлений додатковий фрагмент 23,1 т.п.н. (Рис. 4 А). Також варто відмітити різницю в ступені ампліфікації фрагменту 18,2 т.п.н. . У першої групи соматичних гібридів (1D-4D) він був значно ампліфікований, а у другої (7D, -8D, 11D-13D) -

ступінь його копійності суттєво зменшувався, тоді як збіль-

шувався ступінь ампліфікації нового Фрагменту 23,1 т. п.н. Гібридизаційний спектр рослин Г, та Гг був ідентичним спектру перуанського томата (Рис. 4 Б). .

Гібридизація мтДНК/ЗаІІ також виявила, що гібридизаційний спектр мтДНК соматичних гібридів Ід-Ад був ідентичний такому Ь. региуіагшт уаг. (ЗепІ.аШт. Гібридизаційний спектр клонів 70, 80, ІЮ-Ш був рекомбінантним (Рис. 4 В). В цьому випадку виявлено два нових фрагменти (15,8 і 13,5 т.п.н.), які були відсутні у батьків. Встановлена також відсутність фрагменту 7,1 т.п.н., характерного для обох батьків. Тільки один соматичний гібрид 1Ю мав цей фрагмент, як і перша група клонів. Однак, це була єдина його відмінність в порівнянні з другою групою гібридів. Для рослин статевого покоління ?! також була показана ідентичність їх гібридизаційних спектрів вихідним соматичним гібридам (Рис. 4 Г).

При гібридизації мтДНК/НІгкЛІІ із цим зондом показані суттєві відміни в гібридизаційних спектрах соматичних гібридів. Так. для гібридів першої групи (Ю-ЗО) показана поява нового фрагменту 7,6 т.п.н., а також відмічена мінливість в ступені ампліфікації фрагментів 17,8 1 14,1 т.п.н. Для клонів 70 1 80 була характерною відсутність цього нового фрагменту, однак фрагмент 5.8 т.п.н. виявився більш ампліфіковаиим. Гібридизаційні спектри мтДНК статевого покоління ?! від рослин першої групи характеризувались більшою одноманітністю і були близькими до такого клону 40. Гібридизаційний спектр мтДНК рослин Гі, отриманих від клону 8Б, був ідентичним його спектру. Гібридизаційний спектр рослини Г2 не мав змін в порівнянні з таким вихідного • соматичного гібриду клону 40. ■

- 18 -

Використання для блот-гібридизації в якості зонду послідовності cob показало такі результати. Для гібриди-' заційних спектрів мтДНК/ВатНІ і мтДНК/HindIII не було виявлено значних змін в спектрах як соматичних гібридів, так і рослин Fj. При гібридизації мтДНК/Sail показані змінені гібридизаційні спектри для соматичних гібридів. Зокрема, виявлено, що соматичні гібриди (клони 1D-4D) мали гібридизаційний спектр, аналогічний L. peruvianum var. dentatum. Тобто у них були присутні фрагменти 21.4, 18,6, 12,3, 10,9

та 10,0 т.п.н. У соматичних гібридів клонів 7D, 8D, 11D-13D додатково до вищезазначених фрагментів був показаний фрагмент величиною 13,5 т.п.н. Гібридизаційні спектри рослин першого покоління виявились Ідентичними таким вихідних соматичних гібридів.

При використанні в якості зонду послідовності atp 9 були виявлені деякі відміни в гібридизаційних спектрах ДНК. зокрема з використанням рестриктази Sail. В цьому випадку частина соматичних гібридів мала спектр мтДНК, ідентичний L. peruvianum var. dentatum (ID, 2D, 4D). Соматичний гібрид 3D мав змінений, гібридний спектр. У нього була виявлена сума батьківських фрагментів. У іншої групи гібридів (клони 7D, 8D, 11D-13D) був другий тип зміненого спектру, де мали місце тільки по одному батьківському фрагменту 18,6 і 12,9 т.п.н.

Таким чином, аналіз мтДНК соматичних гібридів та їх статевого покоління показав наявність значних перебудов, що можуть бути викликані процесами генетичної рекомбінації в гетероплазматичній стадії після злиття протопластів. Виявлені зміни мтДНК успадковувалися рослинами двох статевих генерацій. .

Зведені результати досліджень подані в таблиці 1.

Таблиця 1 Молекулярно-біохімічні характеристики асиметричних соматичних гібридів

Ь. еїсиїспіигп + Ь. рєгиуіапит

1 Ядерний геном Хлоропласти, Мітохондріальїши геном |

1 Генотип Ізофе тенти І ядДНК геном 183+53

1 Ей І Ргх МйГі Аре ГЁсоЯ V Ога І вас І Ніпсі III Сох І Сох II Сох III +5’псі5 соЬ а1р9

ї_езси]еШит МІН Е ! Е Е Е І Е Е Е Е Е Е Е Е Е Е

Ьрепмапит Р Р Р Р Р Р Р Р Р Р Р Р Р Р

^аг.сієтаіит Рип

- 10 Е+Р Е Е ■“"е І Е+Р Е+Р Р Р Р Р Р Я1 Я1 Р

5 20 Е+Р Е Е Е Е+Р Е+Р Р Я Р Р Р Я1 В1 Е+Р

а зэ 'З „ X, 40 Е+Р Е Е Е Е+Р Е+Р Р Я Р Р Р Я1 Я1 Р

Е+Р Е Е Е Е+Р Е+Р Р р Р Р Р Я1 Я1 Р

я 70 Е+Р Е Е Е Е+Р Е+Р Р а Р Р Р Я2 Н2 Я

^ 80 Е+Р Е Е Е Е+Р Е+Р Р я Р Р Р Я2 Я2 Я

§ 1Ю Е+Р Е Е Е Е+Р Е+Р Р я Р Р Р Я2 В2 Я

в 12& Е+Р Е Е Е Е+Р Е+Р Р я Р Р Р Я2 Я2 Я

І 130 Е+Р Е Е Е Е+Р Е+Р Р я Р Р Р Я2 Я2 я

І Рослішії Ґ(

N0 N0 N0 N0 Е+Р Я Р р Р Р Р Я1 Я1 N0

2Р, Ю N0 N0 N0 N0 Е+Р И Р р Р Р Р Я1 Я1 N0

^20 N0 N0 N0 N0 Е+Р Е+Р Р я Р Р Р Я1 Я1 N0

Р,30 N0 N0 N0 N0 Е+Р Я Р я Р Р Р Я1 Я1 N0

І 1Р, 40 Е+Р Е+Р Е Е+Р Е+Р В Р р Р Р Р Я1 Я1 N0

| 40 Е Е+Р Е Е+Р Е+Р Е+Р Р р Р Р Р Я1 Я1 N0

ЗР, 40 N0 N0 N0 N0 Е+Р Я Р р Р Р Р Я1 Я1 N0

1Р,80 Е+Р Е+Р Е+Р Е+Р Е+Р Я Р я Р Р Р Я2 Я2 N0

2г, 80 Е Е+Р Е+Р Е+Р Е4Р я Р я Р Р Р Я2 Я2 N0

ЗР, 80 Е Е+Р Е Е+Р Е+Р я Р я Р Р Р Я2 Я2 N0

; Рослини Гз ! Рі 40

N0 N0 N0 N0 Р р N0 N0 N0 Р Я1 Я1 N0 І

Е - Ь. еїсиІепШт МІН.- К - рскомбіпантішй

Р - регипіапит оаг. сіспіаінт йип. N0 ■ не визначено

ВИСНОВКИ

1. З'ясовано характер успадкування ядерних, хлороплас-них 1 мітохондріальних генетичних детермінант у вперше отриманих фертильних асиметричних соматичних гібридів' L. esculentum Mill. + L. peruvianum var. dentatum Dun. та їх статевих поколінь.

2. Виявлено генетичну нестабільність ядерного геному асиметричних соматичних гібридів, яка проявилася в частковій елімінації ядерного генетичного матеріалу культурного томата у рослин двох поколінь.

3. Цитоплазматичні геноми досліджених соматичних гібридів переважно успадковувались від Lycoperslcon peruvianum var. dentatum.

4. У частини соматичних гібридів були виявлені перебу-

дови хлоропластної ДНК, що, можливо, є наслідком рекомбінації батьківських геномів. '

5. Показано значні перебудови мітохондріальної ДНК соматичних гібридів, які можуть бути результатом рекомбінаційних подій.

6. Показано стабільне успадкування змінених міто-

хондріальної та хлоропластної ДНК рослинами двох статевих поколінь. •

Список робіт, опублікованих по темі дисертації.

1. Piven N.M., Ratushnyak Y. I., RudasV.A., Latypov

S.A., Zavgorodnyaya A.V. Selection of somatic hybrids in Lycoperslcon and Solanum using chlorophyll-deficient mutants and gamma-lrradlatlon // Abstr. VIII Intern. Protoplasts

- 21 -

Symposium. - Uppsala.- 1991,- P.28.

2. Ратушняк Я.И., ПивеньН.М., Латыпов С.А.. Самойлов А. М., Завгородняя А.В., Глеба Ю. Ю. Изменение генетической структуры томата методом "гамма-слияния" протопластов Lycopersicon esculentum Mill, и Lycopersicon peruvianum var. dentatum Dun. // Биополимеры и клетка,- 1991,- Т. 7,- С. 82-91.

3. Ratushnyak Y. I., CherepN. N., Zavgorodnyaya A. V., Latypov S., Borozenko I.V., Rachkovskaya R. I., GlebaY. Y. Fertile asymmetric somatic hybrids between Lycopersicon esculentum Mill, and Lycopersicon peruvianum var. dentatum Dun. // Mol. Gen. Genet.- 1993,- V. 236,- P. 427-432.

4. Ратушняк Я.И., Череп Н.Н., Завгородняя А.В., Латыпов С.А.. Борозенко И. В., Рачковская Р. И., Глеба Ю. Ю. Клеточно-инженерный -синтез фертильных асимметричных гибридов томата методом "гамма-слияния" протопластов У/ Генетика.- 1993.— Т. 29,- С. 164-176.

5. Cherep N.N., Zavgorodnyaya А.V., Ratushnyak' Y.I., Gleba Y.Y. Chloroplast DNA rearrangement in Lycopersicon asymmetric somatic hybrids // Abstr. XVIIth Intern. Congress of Genetics. - Birmingham.- England.- 1993,- P. 191.

6. Ratushnyak Y. I.. Cherep N. N., Zavgorodnyaya A. V., Latypov S.A., Kochevenko A.S., Gleba Y.Y. Alloplazmic Incompatibility in cybrld plants of tomato obtained by cell engineering methods // Abstr. VUIth Intern. Congress of Plant Tissue and Cell Culture. - Firenze.- Italy.- 1994,- P. 102. '

7. Cherep N. N.', Zavgorodnyaya A. V., Ratushnyak'Y. I., Gleba Y.Y. Organelle and nuclear genomes analysis of tomato cybrld" plants // Abstr. 4th Intern. ' Congress of Plant

Molecular Biology.- Amsterdam.- Netherlands.- 1994.- P. 153.

8. Ратушняк Я. И., Кочевенко А. С.. Череп Н. Н., Завго-родняя А.В., Латыпов С.А., Глеба Ю.Ю. Аллоплазм'атическая несовместимость у цибридных растений, обладающих геномом Lycopersicon esculentum Mill, и плазнагенами Lycopersicon peruvlanum var. dentatum Dun.// Генетика (в печати).

9. Zavgorodnyaya A. V., CherepN.N., Ratushnyak Y. I.. Gleba Y.Y. Genetic Instability of asymmetric somatic hybrids Lycopersicon esculentum Mill. + Lycopersicon peruvlanum var. dentatum Dun. // Abstr. Intern. Symposium "Plant biotechnology and Genetic Engineering.- Kiev - 1994,- P. 76.

10. Череп H.H., Завгородняя А.В.. Ратушняк Я. И., Глеба Ю. Ю. Реконструкция хлоропластной ДНК асимметричных соматических гибридов Lycopersicon esculentum Mill. + Lycopersicon peruvlanum var. dentatum Dun. // Генетика ( в печати).

Завгородняя А. В. Анализ ядерного и цитоплазматических геномов у асимметричных соматических еибридов и их полового поколения в роде Lycopersicon

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.25, - клеточная био-

логия, Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 1995.

Защищается 17 научных работ по теме диссертации.

Проведено молекулярно-генетическое исследование асимметричных соматических гибридов Lycopersicon esculentum Mill. + Lycopersicon peruvlanum var. dentatum Dun. и двух половых поколений. Показана нестабильность ядерного генома соматических гибридов, вызвавшая частичную элиминацию

хромосом культурного томата. Показаны также изменения, произошедшие как в хлоропластном, так и в митохондриальном геномах исследуемых гибридов. Эти изменения могут быть следствием генетической рекомбинации. Показано стабильное наследование измененных цитоплазматических геномов в двух половых поколениях. полученых после самоопыления соматических гибридов. ,

Ключевые слова: соматические гибриды; ядернкй, хлороп-

ластный и митохондриальный геномы; рекомбинация.

Zavgorodnyaya A.V. Analysis of nuclear and cytoplasmic genomes of asymetric somatic hybrids and their sex progenies in Lycopersicon genus.

Thesis for gaining a scientific degree of Kandldate of-Biological Sciences on speciality 03.00.25. - Cell Biology,

Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1995.

The results of 17 scientific papers are defended.

Molecular-genetic investigation of asymmetric -somatic hybrids obtained between L. esculentum Mill, and L. peruvlanum var. dentatum Dun. and their two sex generation was carried out. Instability revealed for nuclear genome of somatic hybrids has coused a partial elimination of chromosomes of cultivated tomato. Changes in structure of both chloroplast and mitochondrial DNAs were also revealed which may be explained by genetic recombination of genomes.

A regular inheritance of these changed genomes was traced in two sex generations of corresponding somatic hybrids.

Key words: somatic hybrids; nuclear, chloroplast and

mitochondrial genomes; recombination. .

Підписано до друку 26.01.95 Р формат 60x84/16 апІт> д-ртк. Умов, друк, л. І.О. 'Дираж 100 примірник.Заказ МІ50

цруковано Ц70П ДНПП "11л од вин коне ер в" м. Ки'Ів, Саксаганського ,1