Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ взаимодействия и последовательности функционирования генов гороха (PISUM SATIVUM L. ), контролирующих развитие симбиоза с клубеньковыми бактериями

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ взаимодействия и последовательности функционирования генов гороха (PISUM SATIVUM L. ), контролирующих развитие симбиоза с клубеньковыми бактериями"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИЯ

РГБ ОД

- 8 МОИ 1988

На правах рукописи

ЦЫГАНОВ Виктор Евгеньевич

УДК: 577.123:635.656.

АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ ГОРОХА {РШМ 5АТ1У11МЪ.\ КОНТРОЛИРУЮЩИХ РАЗВИТИЕ СИМБИОЗА С КЛУБЕНЬКОВЫМИ

БАКТЕРИЯМИ

Специальности: 03.00.15 - Генетика

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии, Россельхозакадемия.

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук И.А. Тихонович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

И.Н. Голубовская

кандидат биологических наук И.С. Бузовкина

Ведущее учреждение: кафедра микробиологии Санкт-Петербургского государственного университета

Зашита состоится * _" ¿¿¿-¿¡¿¿¿-в-_1998 года в т'С? часов

на заседании диссертационного совета_по защите

диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу 189620, Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, Д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений по адресу 189620, Санкт-Петербург-Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3.

Автореферат разослан " & " _1998 года

Ученый секретарь диссертационного совета:

кандидат биологических наук А.Н. Зарецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фиксация азота в клубеньках бобовых растений (сем. Fabaceae) является одним из важнейших процессов, обеспечивающих использование азота живыми организмами. Знание мсшекулярно-генетических механизмов этого процесса позволит создать эффективные системы азотфиксации.

Одной из первостепенных задач в исследованиях симбиотической азотфиксации является выяснение системы генетического контроля бобово-ризобиального симбиоза со стороны высшего растения. Детальное знание этой системы не только позволит понять тонкие механизмы взаимодействия бобовых растений с клубеньковыми бактериями, но и значительно облегчит селекцию сортов бобовых растений и комплементарных штаммов ризобий, способных формировать высокоэффективные симбиотические системы.

Интенсивное изучение генетического контроля бобово-ризобиального симбиоза со стороны растения-хозяина началось лишь в течение последних 10-15 лет, благодаря широкому применению экспериментального мутагенеза. В исследованиях по выявлению симбиотических генов макросимбионта были использованы более 10 видов бобовых растений (Phillips, Teuber, 1992). Наибольший прогресс в идентификации симбиотических генов был достигнут для одного из наиболее изученных генетических объектов - гороха посевного (Pisum sativum L.), для которого на сегодняшний день было выявлено около 30 таких генов (Sagan et al., 1995). Большинство из них контролируют ранние стадии развития симбиоза (Weeden, LaRue, 1992). В то же время, генетический контроль ряда поздних стадий развития симбиоза (гены, контролирующие эти стадии, типы их взаимодействия и последовательность функционирования), связанных с формированием инфекционных нитей и дифференцировкой симбиосом, оставался малоизученным. Поэтому главной задачей данной работы являлся генетический анализ контроля данных стадий развития бобово-ризобиального симбиоза со стороны макросимбионта.

Данная работа финансировалась Международным проектом "Интербиоазот-2000", ГНТП "Приоритетные направления генетики", РФФИ (гранты 95-04-12573, 96-04-50361, 97-04-50033), Международным научным фондом - ISF (гранты #R6KOOO, #R6K300), Научным департаментом НАТО (гранты HTECH.LG 941297 и 971210), грантом фонда Фольксваген (1/72 935), Соросовскими стипендиями 1995-1997 гг. (гранты а193-б, а96-14, а97-730), стипендией Мэрии С.-Петербурга 1997 г. (грант М97-2.4К-814). Цель и исследования. Целью данной работы являлось выявление, анализ

взаимодействия и последовательности функционирования симбиотических генов в процессе развития клубеньков.

Конкретными задачами данной работы являлись: 1. Выявление новых генов гороха (Pisum sativum L.), контролирующих становление азотфиксирующего симбиоза с клубеньковыми бактериями на различных стадиях, с

использованием естественной изменчивости по симбиотическим признакам, экспериментального мутагенеза и гибридологического анализа;

2. Фенотипическая характеристика вновь подученных симбиотических мутантов и идентификация стадий развития симбиоза, контролируемых выявленными генами;

3. Локализация новых симбиотических генов гороха на генетической карте.

4. Создание двойных мутантных линий с последующей фенотипической характеристикой для анализа типов взаимодействия и последовательности функционирования симбиотических генов, контролирующих близкие стадии развития.

Научная новизна. С использованием ЭМС-мутагенеза линии SGE получено 8 новых Nod", 2 Nod+/" и 14 Fix" симбиотических мутантов гороха. Показано, что мутанты SGENod'-l, SGENod"-3, SGEFix'-l и SGEFix"-2 характеризуются новыми, неизвестными ранее для гороха фенотипами: 1) блок инициации роста инфекционных нитей и массовые скручивания корневых волосков у SGENod"-l и SGENod"-3, 2) гипертрофированные инфекционные нити и аномалии инфекционных капель" у SGEFix'-l и 3) запертые" инфекционные нити и отсутствие эндоцитоза у SGEFbr-2. Анализ фенотипов Nod" и Fix" мутантов, индуцированных на линии SGE показал сложный генетический контроль процесса развития инфекционной нити со стороны растения, который должен быть разделен на 5 стадий: 1) инициация роста инфекционных нитей, 2) развитие инфекционной нити в корневом волоске, 3) последующее ее развитие в кортексе корня, 4) завершающее развитие в тканях молодого клубенька, 5) формирование инфекционных капель. Также впервые для Fix" мутантов бобовых было показано наличие температурозависимости проявления мутаций линий SGEFix"-1 и SGEFix"-2. Генетический анализ показал, что мутации у линий SGEFix"-1 и SGEFix"-2 произошли в ранее неизвестных симбиотических генах гороха. Впервые на генетической карте гороха были локализованы симбиотические локусы sym-27 и sym-Z, причем с использованием локуса sym-Z впервые была доказана целостность группы сцепления IB. Впервые для гороха были созданы линии, несущие в одном генотипе 2 рецессивные Fix" мутации. Фенотшшческий анализ двойных мутантных линий RBT, RBT2 и RBT3 впервые позволил доказать порядок функционирования пар симбиотических генов Sym-31 и Sym-13, Sym-Yи Sym-13 и Sym-Z и Sym-Y.

Практическая значимость. Картированные локусы sym-Z и sym-27 могут служить новыми маркерами генетической карты гороха и использованы для тонкого картирования районов, их содержащих. Использование комбинаций одиночных и двойных мутантных линий позволит выявить молекулярные и биохимические маркеры различных стадий развития бобово-ризобиального симбиоза. Nod", Fix" мутанты и исходные линии могут быть использованы как модели для изучения роли симбиотрофного типа питания азотом в структуре урожая гороха.

Апробация работы. Основные результаты данной работы были представлены на X и XI Международных кон^ессах по азотфиксации (С.-Петербург, 1995, Париж, 1997); I и II

Европейских конференциях по азотфиксации (Сегед, 1994 и Познань, 1996); на 1-ом съезде ВОГИС (Саратов, 1994); 9-ом Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, 1995); на конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 1996); на IV Германо-российском рабочем совещании по биотехнологии (С.-Петербург, 1996); на 2-ой Международной конференции по анатомии и морфологии растений (С.-Петербург, 1997). Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 19

таблиц и 31 рисунок. Список литературы включает наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Растительный материал. Для выявления генотипов гороха, дефектных по симбиотическим признакам, • была использована коллекция формообразцов гороха различного географического происхождения из ВИРа им. Н.И. Вавилова.

Для получения симбиотических мутантов была использована высокопродуктивная лабораторная линия SGE (Kosterin, Rozov, 1993), маркированная морфологическими мутациями: А, /, R, Fs (описание признаков см. Хангильдин, 1990).

В работе была использована коллекция симбиотических мутантов гороха, индуцированных на сорте Finale (Engvild, 1987): RisNod 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, RisFix А, В, С, J, К, L, M, N, О, P, Q, S, T, V, предоставленных К. Ингвиддом (Dr. K.J. Engvild, Agricultural Research Department, Riso National Laboratory, Roskild, Denmark).

Для проведения тестов на аллелизм были использованы маркерные линии из коллекции симбиотических мутантов гороха лаборатории биотехнологии ВНИИСХМ, предоставленные: 2150 (sym-2), С. Бликстом (Dr. S. Blixt, Nordic Gene Bank, Alnarp, Sweden), E69 (sym-7), R25 (sym-8), R72 (sym-9) (Kneen, LaRue, 1986), N24 (sym-11) (Kneen, LaRue, 1987), E135f (sym-13) (Kneen et al., 1990), E132 (sym-27) (Weeden et al., 1990) - T.A. Лярю (Dr. T.A. LaRue, Boyce Thompson Institute for Plant Research, Cornell University, Ithaca, USA), P54 (sym-9), P56 (sym-10), P6 (sym-19), P59 (sym-23), P60 (sym-24), P61 (sym-25), P63 (sym-26), P12 (sym-27),?2 (sym~30) (Due, Messager, 1989; Sagan et al., 1993) - Г. Дюком (Dr. G. Due, station de Genetique et d'Ameliorattion des Plantes, INRA, Dijon, France), K5 (sym-12), K24, (Postma et al., 19886), FN1 (Postma et al., 1990) - Э. Якобсеном (Dr. E. Jacobsen, Agricultural University, Wageningen, The Netherland), 31/6 (sym-2) и Sprint-2Fix" (sym-ЗГ) (Borisov et al., 1992), полученные в лаборатории ранее.

Для локализации симбиотических генов были использованы множественно маркированные линии из коллекции Nordic Gene Bank: NGB1238 (А, b, к, Bra, wb, ild,fl, fr,fru, pro, le, cp-1, te, gp, sru, s, IF, i, r, fit, dt, Pr, coh, t), NGB851 (pa, vim, b, k, dt, pr, wb, tl», st id jy, fl, pro, le, di, mifo, s, oh, F, Fs, i, r ) NGB1515 (b, td, le, och, cor, gl, r), любезно предоставленные С. Бликстом. Также в исследовании была использована линия SGE656 (Uni1ас, т, А), полученная и предоставленная С.М. Розовым (ИЦиГ СО РАН). Штаммы клубеньковых бактерий. Для инокуляции растений клубеньковыми бактериями был использован производственный штамм Rhizobium leguminosarum bv. viceae CIAM1026 из коллекции ВНИИСХМ (Safronova, Novikova, 1996). Инокуляцию проводили по методике, описанной ранее (Borisov et al., 1992). В опыте по проверке возможной супрессии мутантных фенотипов гороха со стороны клубеньковых бактерий, наряду со штаммом CIAM1026, был использован набор эффективных штаммов из коллекции ВНИИСХМ (CIAM) различного географического происхождения: CIAM 1024 (Литва), 1060 (Армения), 1061 (Чехословакия), 1062 (Голландия), 1069 (Индия), 1071 (Белоруссия), 1073 (Венгрия), 1078 (Крым), а также штаммы А1 (Четкова, Тихонович, 1986) и ТОМ (Lie, 1978). Методы исследования. Для экспериментов по определению ацетиленовой редукции, накоплению биомассы и содержания в ней азота, ультраструктурному анализу клубеньков Fix" мутантов, изучению инфекции корней ризобиями Nod" мутантов, растения выращивали в пластиковых сосудах емкостью 6 л, наполненных стерильным песком, по 5 растений на сосуд, в фитотронах (Heraeus Vôtch, Германия) в стандартных климатических усовиях: 16/8 ч - день/ночь, темепратура 21/19°С соответственно, относительная влажность воздуха 75%, освещенность 38000 люкс. Для прививочных экспериментов и экспериментов по проверке возможной супрессии Nod" фенотипа при изменении штамма ризобий растения выращивали индивидуально в керамических сосудах, емкостью 300 мл, наполненных стерильным песком в фитотроне при стандартных условиях, кроме относительной влажности (100% в случае прививочных экспериментов до начала роста привитого побега).

Обработка мутагеном - суховоздушные семена стерилизованные концентрированной серной кислотой (20 мин.) замачивали в водном растворе мутагена (10 часов, 0.15% ЭМС) и высевали для получения семян Мг. Скрининг симбиотических мутантов проводили по методике описанным ранее (Duc, Messager, 1989).

Соответствие реальных расщеплений в поколении F2 теоретическим рассчитывали с помощью критерия х2 (Глотов и др., 1982), частоту рекомбинации между генами рассчитывали по методу максимального правдоподобия (Серебровский, 1970) с помощью прикладных программ для IBM PLANT и CROSS, созданных С.М. Розовым (ИЦиГ СО РАН).

Сбор корней для изучения инфекции корней клубеньковыми бактериями у Nod" мутантов гороха проводили в 4 срока: на 12, 21, 28 и 42 днЯ после посадки семян. На каждом сроке было проверено по 4 растения. С каждого растения было взято по 3-4

боковых корня, которые были окрашены 0.01 % метиленовым синим и проверены на способность к деформации, скручиванию корневых волосков и росту инфекционных нитей с помощью светового микроскопа Opton Axiovert-35 (Германия).

Определение содержания азота в зеленой массе и корнях растений (по методу Къельдаля) на автоматическом приборе Kjeltec-auto 1030 Analyzer (Швеция), определение нитрогеназной активности клубеньков, проводили по методу, описаному ранее (Hardy et al., 1968).

Прививки стеблей мутантных растений на корни исходной линии и наоборот проводили по методике, описанной ранее (Postma et al., 19886).

Ультраструктурный анализ клубеньков мутантных линий SGEFbr-1 и SGEFix -2 и исходной линии SGE проводили по методике, описанной ранее (Borisov et al., 1992).

В опытах по изучению температурозависимости и штаммоспецифичности клубенькообразования у мутантных линий SGEFix"-l и SGEFix"-2 и исходной линии SGE растения выращивали при температурах 15°С, 21°С, 24°С, 27°С при заражении штаммами ризобий CIAM1026, 1061, 1073 в фитотронах в количестве 10 на вариант, сбор растений для анализа проводили на стадии бутонизации-начала цветения.

Во всех экспериментах, в которых проводилось сравнение ростовых параметров, для стандартизации условий использовали ранжированные семена весом 0.110-0.129 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выявление симбиотических гепов гороха.

Скрининг формообразцов гороха с симбиотическими дефектами.

Был проведен скрининг 85 формообразцов гороха из мировой коллекции ВИРа. В результате было отобрано 2 формообразца К320 и К6047, из Палестины и Афганистана, соответственно, содержащих растения, неспособные к клубенькообразованию (Nod"*"''" и Nod" фенотипы, соответственно). Экспериментальный мутагенез линии SGE.

Проанализировано 1342 семьи (более 10000 растений) поколения M2 мутагенеза линии SGE и отобрано 144 перспективных растения с симбиотическими дефектами. После дальнейшей селекции из них отобрано 8 мутантов с фенотипом Nod", 2 мутанта с фенотипом Nod+/" и 14 мутантов с фенотипом Fix-. Частота симбиотических мутантов составила 1.79% (24 мутанта на 1342 семьи). Данная величина в 1.5-2 раза превышает частоты симбиотических мутантов, полученных другими авторами (Duc, Messager, 1989; Sagan, Duc, 1996; Engvild, 1987; Kneen, LaRue, 1988; Jacobsen, 1984; Borisov et al., 1992). Гибридологический анализ формообразца К320-1.

Анализ расщепления по фенотипу растений поколений Fi и F2 от скрещиваний клубенькообразующих растений формообразца К320 и Nod+/" линии К320-1 показали, что мутантный признак у растений К320-1 наследуется моногенно и имеет рецессивное

проявление. Тесты на аллелизм показали, что мутантный ген линии К320-1 аллелен гену sym-2 (типовая линия для этого гена - 31/6).

Гибридологический анализ симбиотических мутантов, индуцированных у линии SGE.

Выяснение генетической детерминации мутантных признаков и характера их наследования.

Анализ расщеплений по фенотипу растений поколений Fi и F2 от скрещиваний родительской линии SGE и мутантных линий SGENodM, SGENod"-2, SGENod"-3, SGENod"-4, SGENod"-6, SGENod"-8, SGEFix'-l и SGEFix"-2 показал, что все изученные мутации наследуются моногенно, и детерминируемые ими мутантные фенотипы рецессивны. Подобный характер наследования симбиотических признаков наблюдался для всех индуцированных симбиотических мутантов гороха, описанных ранее (Brewin et al., 1993).

Комплементационный анализ Noct мутантов, индуцированных у линии SOE.

В комплементационный анализ были вовлечены мутантные линии SGENodM, SGENod"-2, SGENod -3, SGENodM и SGENod"-8. Показано, что мутанты принадлежат к 3 группам комплементации, первую из которых составляют аллельные друг другу мутанты SGENod"-l и SGENod'-З (соответствующему гену был дан предварительный генсимвол sym-A), вторую - аллельные друг другу мутанты SGENod"-4 и SGENod"-8 (sym-B), а третью - мутант SGENod"-2 (sym-C).

Тесты на аллелизм серии Nod" мутантов, индуцированных на линии SGE, с Nod" и Nod1"/" типовыми линиями для генов, выявленных ранее, показали, что мутант SGENod"-3 неаллен всем использованным в данном исследовании типовым линиям. Мутанты SGENod*-2, SGENod"-4 и SGENod"-8 - неаллельны типовым линиям для генов sym-7, sym-8, sym-9, sym-10, sym-11, sym-19 и sym-30.

Комплементационный анализ Fix~ мутантов, индуцированных у линии SGE.

Проведенные тесты на аллелизм мутантов SGEFix"-l и SGEFix"-2 между собой и с типовыми Fix" линиями показали, что оба Fix" мутанта неаллельны друг другу и всем использованным типовым мугантньш линиям, включая мутантов, индуцированных у сорта Finale (см. ниже). Таким образом были выявлены два новых гена гороха (sym-Y я sym-Z, соответственно), контролирующих поздние стадии развития клубенька. Комплементационный анализ коллекции симбиотических мутантов, полученных у сорта Finale.

В анализ были вовлечены 25 генетически неохаракгеризованных мутантов, индуцированных у сорта Finale (Engvild, 1987). Результаты тестов на аллелизм позволили разделить 16 Nod" мутантов на 7 групп и 9 Fix" мутантов - по крайней мере, на 4 группы комплементации. Тссты на аллелизм с типовыми линиями показали, что мутант RisNodl4 аллелен ранее описанному мутанту Е69 (sym-7), мутанты RisNod2 и RisNod20 - мутанту Р6 (sym-19), мутанты RisFixM и RisFixT - мутанту Р63 (sym-26), мутант RisFixQ - Р12 (sym-27).

Сопоставление наших данных с результатами комплементационного анализа французских исследователей (Г. Дюк, М. Саган, Station de Genetique et d'Ameliorattion des

Plantes, INRA, Дижон, Франция) показало, что ряд выявленных групп комплементации представляют новые симбиотические гены, которым были даны новые генетические символы sym-32 - sym-38 (Таблица 1). Таким образом, в ходе данной работы были генетически охарактеризованы 20 симбиотических мутантов и идентифицированы 2 ранее неизвестных симбиотических гена гороха. .

Таблица 1. Комбинированные данные результатов комплементационного анализа серии симбиотических мутантов гороха (проанализированные мутанты и гены, идентифицированные в ходе, данной работы, помечены *).

Ген Мутантный фенотип Мутантные линии Число мутантов

Sym-J~sym-2 Nod^" NGB 2419, NGB 2150 (зарегистрированные генотипы), К 320-Г

Sym-7 Nod" Е69, N12, RisNodl4* 3

sym-S-sym-20 Nod" Е14, R19, R25, R80, RisNodlO, 13, 19, 21, 25, Sprint-2Nod--l, Sprint-2Nod"-2 11

sym-19 Nod" P4, P6, P55, NEU5, NMU1, RisNod2*, 7, 16, 20* 10

sym-26 Fix" P63, RisFixM* ,T* 3

sym-27 Fix' P12, RisFixQ* 2

sym-30 Nod- PI, P2, P3, P53, RisNod6, 9*, 22* 7

sym-32 Fix" RisFixL*, 0* 2

sym-33 Fix" FixFixU 1

sym-34 Nod- RisNodl*, 3, 23*,30* 4

sym-35 Nod" RisNod8* 1 , .. ..

sym-36 Nod" RisNod24*, 26* 2

sym-37 Nod+/" KisNod4 1

sym-38 Nod" RisFixF* 1

sym-Y* Fix" SGEFix'rl* , 1

sym-Z* Fix" SGEFix--2* 1

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СИМБИОТИЧЕСКИХ МУТАНТОВ.

Выявление стадии развития симбиоза, блокированной у мутантов с фенотипом Nod\

Для исходной линии SGE показано нормальное протекание ранних симбиотических стадий. В то же время, у линий SGENod"-2 и SGENod"-6 мутации блокируют развитие симбиоза сразу после стадии деформаций корневых волосков, которые лишь в единичных

случаях завершаются характерным скручиванием; мутантные линии SGENod"-l и SGENod" -3 - характеризуется аномально высоким, по сравнению с исходной линией, процентом скрученных волосков (90-100%, тогда как у линии SGE - 2-3%), но дальнейшего развития инфекции не происходит; мутантные линии SGENod"-4 и SGENod~-8 также как и линия SGENod'-З, - характеризуются высоким процентом скрученных волосков, но у них наблюдается рост инфекционных нитей, которые прекращают свое развитие в корневых волосках. На основании фенопшического анализа была предложена гипотетическая схема последовательности функционирования соответствующих симбисггических генов: sym-C -+ sym-A -* sym-B.

Изучение возможности супрессии Nod~ мутаций гороха клубеньковыми бактериями.

У линий SGENod"-1, SGENod-2, SGENod"-3, SGENod"-4 SGENod"-6, и SGENod"-8 не было обнаружено супрессии мутантного фенотипа ни одним из 11 штаммов различного географического происхождения.

Сравнительное описание мутантов SGEFiX~-l и SGEFix--2 и исходной линии SGE при выращивании растений в стандартных условиях.

Исходная линия SGE формирует ярко-розовые клубеньки, размер которых достигает 5-7 мм. Растения мутантной линии SGEFix"-l обычно формируют многочисленные белые клубеньки (от 0.5 до 2.0 мм) и иногда розовые клубеньки (от 1 до 3 мм). Как правило, растения мутантной линии SGEFix"-2 формируют два типа клубеньков на одном корне: белые (от 0.5 до 4.0 мм) с темной ямкой на дистальном конце клубенька и бледно-розовые клубеньки (от 1.0 до 4.0 мм). Мутантная линия SGEFix"-l формирует повышенное число клубеньков (174.0±17.2), по сравнению с исходной линией (50.3±7.2), в то время как у мутантной линии SGEFix"-2 число клубеньков снижено в два раза (24.0+2.8), по сравнению с исходной линией. Нитрогеназная активность клубеньков отсутствует у обоих мутантов, в то время как у исходной линии SGE ее значение составляет 4.2±0.9 ммоль С2Н4/ч/растение.

Температуррчувствительностъ и штаммоспецифичность проявления мутаций линий SGEFix~-l и SGEFvr-2.

Обнаружена температурозависимость проявления мутаций линий SGEFix"-l и SGEFix"-2. Она проявляется в изменению! общего числа формируемых клубеньков и отношения между разными их типами. У линии SGEFix"-l число розовых клубеньков увеличивается при понижении температуры. У линии SGEFix"-2 максимальное число бледно-розовых наблюдается при оптимальной температуре (21°С), а при высокой температуре (27°С) она характеризуется Nod" фенотипом. Показана также, что соотношение типов клюбеньков у обоих мутантов зависит от штамма микросимбионта, причем у мутантной линии SGEFix"-l такая штаммспецифичность выражена более ярко. Прививки (стебель/корень) мутантных линий SGEFir-1 и SGEFixr-2.

Результаты реципрокных прививок (стебель/корень) между каждым мутантом и исходной линией SGE показали, что фенотипы линий SGEFbr-1 и SGEFbr-2 контролируются корнем.

Ультраструктурный анализ клубеньков мутантных линий SGEFix~-l и SGEFbc-2 и исходной линии SGE.

Клубеньки исходной линии SGE имеют нормальную ультраструктурную организацию, характерную для клубеньков гороха (Brewin, 1991).

Мелкие белые клубеньки мутантной линии SGEFix"-l содержат гипертрофированные инфекционные нити, площадь профиля которых превышает площадь профиля нитей исходной линии в 7-9 раз. Наблюдаются также аномалии развития "инфекционных капель" и процесса эндоцитоза. После эндоцитоза бактериальные клетки продолжают делиться внутри перибактероидной мембраны, при этом полной морфологически выраженной дифференцировки не наблюдается. Симбиосомы и клубеньки вцелом подвержены преждевременной деградации. Розовые клубеньки линии SGEFix"-l не отличаются по ультраструкгурной организации от исходной линии SGE.

Белые клубеньки мутантной линии SGEFix"-2 содержат "запертые" инфекционные нити, окруженные аномально утолщенными клеточными стенками. "Инфекционные капли" не образуются и не наблюдается эндоцитоза бактерий в цитоплазму растительных клеток. В бледно-розовых клубеньках мутантной линии SGEFix~-2 инфекционные нити увеличены в диаметре в 1.5-2 раза по сравнению с исходной линией. При эндоцитозе иногда несколько бактерий окружаются мембраной инфицируемой растительной клетки. Не наблюдается полной морфологически выраженной дифференцировки бактероидов. Наблюдается преждевременное старение симбиосом и клубеньков вцелом.

Для того, чтобы определить порядок функционирования вновь выявленных (sym-Y и syrn-Z) ранее охарактеризованных генов, был проведен сравнительный анализ ультраструктурной организации клубеньков линий SGEFix'-l (sym-Y), SGEFix"-2 (sym-Z), Sprint-2Fix" (sym-31), E135f (sym-13) и FN1. Так как, фенотипы линий SGEFix~-l и SGEFbr -2 имеют неоднозначное проявление, нами был применен принцип "первой наблюдаемой морфологической аномалии", s соответствии с которым первая морфологическая аномалия у линии SGEFix"-2 "запертые" инфекционные нити, а у линии SGEFix'-l аномальный эндоцитоз. Проведенное сравнение позволило построить гипотетическую последовательность функционирования изученных симбиотических генов: sym-Z sym-Y

sym-31 sym-13, FN1 (Рисунок 1). Локализация "поздних" симбиотических генов на генетической карте гороха. Локализация гена sym-31.

Для дальнейшей локализации локуса sym-31 были проведены скрещивания линии Sprint-2Fbr (sym-31 sym-31) с множественно маркированной линией NGB851, несущей маркер 3 группы сцепления sí и с линией SGE656, несущей маркер 3 группы - ип?ас.

Рисунок 1. Последовательность стадий развития симбиоза, блокированных у различных симбиотических Fix" мутантов гороха.

Показано наличие достоверного сцепления между тремя проанализированными локусами (Рисунок 2).

Рисунок 2. Карта исследованного района 3 группы сцепления. M uni sym-31 st

I-----------1-----------------1--------------------------------------1

0 14.1 31.7 70.8 cM

Локализация гена sym-Z.

При анализе расщепления по фенотипу растений поколения F2 от скрещивания линий SGEFix"-2 (sym-Zsym-Z) с множественно маркированной линией NGB 1515, несущей два маркера ГА группы сцепления: ff® и 1. Наблюдалось достоверное сцепление локуса sym-Z с обоими проанализированными локусами. (Рисунок 3).

Рисунок 3. Взаимное расположение проанализированных локусов группы сцепления IA.

d sym-Z I

1..................—-,—.........-.............—I

31.85 35.45 cM

Локализация яокуса sym-27.

Анализ расщепления по фенотипу растений поколения F2 от скрещивания линий RisFixQ (sym-27sym-27) и NGB123S показал наличие достоверного сцепления между симбиотическим локусом sym-27 и маркерами V группы сцепления: gp и if1 (Рисунок 4).

Рисунок 4. Взаимное расположение проанализированных локусов группы сцепления V.

gp sym-27 ¿Я

I---------------------------1.........................1

27.60 25.10 сМ

Аяазиз типов взаимодействия и последовательности функционирования симбиотических генов гороха.

Создание генетических моделей - линий, несущих dee Fbc мутации в одном генотипе.

Для подтверждения предполагаемого порядка функционирования симбиотических генов, выявленного на основе сравнительного ультраструктурного анализа Fix" мутантов, нами было предложено использовать более сложные генетические модели - линии, сочетающие две неаллельные Fix" мутации в одном генотипе. При анализе таких линий можно выяснить последовательность функционирования соответствующих симбиотических генов - проявление мутации в гене, контролирующем более раннюю стадию развития симбиоза, должно эпистатировать над проявлением мутации по гену, функционирующему на более поздней стадии. Создание линии КВТ.

Для выяснения типа взаимодействия и порядка функционирования симбиотических генов Sym-13 и Sym-31 была создана линия RBT, несущая в гомозиготе обе Fix" мутации. Для этого было получено 30 растений поколения F2 от скрещивания линий E135f и Sprint-2Fix". Каждое из растений поколения F2 было скрещено с родительскими мутангными линиями E135f и Sprint-2Fix". От каждого из 30 растений поколения F2 было получено потомство самоопыления. Потомство от проведенных индивидуальных возвратных скрещиваний было проверено по симбиотическим признакам, в результате чего было возможно установить генотип каждого растения поколения F2. При этом ожидалось, что фенотипы растений семей F& будут 3 классов: только Fix+ растения, Fix"1" и Fix" растения (в соотношении 1:1) и только Fix" растения. Данные фенотипические классы соответствовали бы следующим генотипическим классам анализируемых растений F2 по генам sym-13 и sym-31\ доминантным гомозиготам, гетерозиготам и рецессивным гомозиготам (Рисунок 5). Только одно растение показало Fix' фенотип в обоих направлениях возвратных скрещиваний, т.е. имело искомый генотип sym-13sym-13sym-31sym-31. На основе этого растения, после селекции в ряду 10 поколений, была создана линия RBT. Генотип линии был подтвержден контрольными возвратными скрещиваниями. Анализ клубеньков линии RBT.

При анализе внешней морфологии клубеньков линии ИВТ было выявлено, что мутантные аллели генов ¡ут-13 и ¡ут-31 взаимодействуют по типу комплементарное™, что приводит к новообразованию фенотипа в отношении морфологии клубеньков.

Сравнительный ультраструктурный анализ клубеньков линии КВТ и родительских мутантных линий 8ртН-2р1х" и Е135Г показал, что клубеньки линии ИВТ характеризуются сходной с линией 8рпт-2Ь1х" ультраструктурной организацией симбйосом: несколько морфологически недифференцированных бактероидов объединены общей перибактероидной мембраной.

Таким образом, с использованием двойной мутантной линии и морфологического анализа на уровне ультраструктуры было показано, что мутация по гену зут-31 супрессирует фенотипическое проявление мутации по гену ¡ут-13 в отношении дифференцировки бактероидов и структуры симбиосом. Следовательно, ген Бут-З! начинает функционировать на более ранней стадии развития симбиоза, чем ген 5ут-13.

Рисунок 5. Схема селекции линии ИВТ.

Sprint-2Fix" (sym-31sym-3I)

Sprint-2Fbr (sym-31sym-3I) x

Fb 1 Fix+ : 0 Fix" 1 Fix+ : 1 Fix" 0 Fix"1": 1 Fix"

x

4-

E135f (sym-13sym-13)

Sym-13—Sym-31—

4

Sym-13—Sym-31— Sym-13—sym-31 sym-31 sym- 13sym-13Sym-31— sym- 13sym- 13sym-31sym-31

Fio

x E135f (sym-13sym-13)

1 Fix+ : 0 Fix-1 Fix+ : 1 Fix" 0 Fix-1": 1 Fix-

RBT

Создание линий RBT1, RBT2, RBT3.

. Для того, чтобы определить тип взаимодействия мутантных генов sym-Y, sym-Z и sym-13. И подтвердить гипотетический порядок их функционирования, были созданы три линии, двойные рецессивные гомозиготы по двум генам: RBT1 (sym-13sym- 13sym-Ysym-Y), RBT2 (sym- 13sym- 13sym-Zsym, RBT3 (sym-Ysym-Ysym-Zsym-Z). Для создания этих линий был применен второй подход комбинирования двух рецессивных Fix- мутаций в одном генотипе, основанный на выявлении двойного рецессива при анализе расщепления

растений по фенотипу в поколении F3. Данный подход ранее был применен для выяснения типа взаимодействия 2 генов нута: тп4 и mS (Davis, 198S). Использование данного подхода было возможным, поскольку клубеньки всех 3 использованных в данной работе линий легко различались по внешнему виду. Были проведены скрещивания линий SGEFix -1 и SGEFix"-2 и £135f между собой и получено потомство поколения Fj.

В каждом из скрещиваний при анализе растений поколения F2 можно было ожидать расщепление по признаку эффективности клубеньков 9Fix+: 7Fix". В зависимости от характера взаимодействия мутантных генов ожидалось 2 возможных варианта расщепления по фенотипу внутри группы Fix". В случае, если бы наблюдалось эпистатирование проявления одной мутации над другой, группа Fix" расщепилась бы на 2 фенсяипических класса, соответствующих фенотипам родительских мутантных линий в соотношении 3:4. В данной ситуации больший по численности фенотипический клчсс должен включать генотипический класс двойных рецессивных гомозигот. В том случае, когда объединение двух рецессивных Fix" мутаций в одном генотипе приводит к новообразованию фенотипа, отличного от фенотипов родительских мутантных форм, группа Fix" разделилась бы на 3 фенотипических класса в соотношении 3:3:1. Генотипический класс двойных рецессивных гомозигот имеет в данном случае свое фенотигтическое проявление и его легко выделить при анализе потомства поколения F2.

При анализе потомства поколения F2 от скрещивания линий SGEFir-1 и SGEFix"-2 наблюдалось расщепление 41 Fix+ : 11 "SGEFix'-l" : 19 "SGEFix"-2". Данное реальное расщепление совпадает с теоретически ожидаемым 9:3:4 (хг=0.52) (Рисунок 6). Поэтому было сделано предположение об эпистатировании мутантной аллели гена sym-Z над мутантной аллелью гена sym-Y. В дальнейшем был проведен лосемейственный анализ поколения F3. Не было выявлено расщепления в семьях, ведущих свое начало от индивидуальных растений в поколении F2, отнесенных к фенотипическому классу "SGEFbr-2". В то же время, в некоторых семьях, происходящих от растений поколения F2, отнесенных к фенотипическому классу "SGEFix'-l", наблюдалось расщепление на 2 фенотипических класса "SGEFix"-l" и "SGEFix"-2", в других же семьях все растения характеризовались фенотипом "SGEFix"-l" (Рисунок 6).

Таким образом, лосемейственный анализ поколения F3 подтвердил предположение об эпистатировании гена sym-Z над геном sym-Y в отношении внешней морфологии клубеньков. Два растения с фенотипом "SGEFix~-2" в поколении F3, выщепившиеся в семьях, ведущих свое начало от растений поколения F2 с фенотипом "SGEFix"-r, были оставлены для дальнейшего размножения, как возможные дигомозиготы по генам sym-Y п sym-Z. Анализ контрольных возвратных скрещиваний подтвердил, что 2 отобранные комбинации являются искомыми дигомозиготами по генам sym-Y и sym-Z. На основе одной из комбинаций после селекции в ряду 8 поколений была создана линия RBT3 (Рисунок 6).

Аналогично схеме, описанной для линии RBT3, были созданы линии RBT1 и RBT2. При анализе внешней морфологии клубеньков линии RBT2 было выявлено

эпистатирование гена sym-Z над геном sym-13, тогда как анализ линии RBT1 показал, что мутантные аллели генов sym-13 и sym-Y взаимодействуют по типу комплементарности, что приводит к новообразованию фенотипа в отношении морфологии клубеньков.

Рисунок 6. Схема создания линии RBT3.

SGEFix'-l (sym-Ys}'m-Y¡ (мелкие'белые клубеньки фенотип "SGEFÍX--1")

SGEFix"-2 (sym-Zsym-Z) (крупные белые клубеньки с темной ямкой на дистальном конце - фенотип "SGEFíx~-2")

F¡ розовые клубеньки (фенотип SGE)

(Sym-Y—Sym-Z—) i

F2(9:3;4)-3Kcn. 41 фенотип SGE : ¡1 фенотип "SGEFixM" : 19 фенотип "SGEFbc-2" F2{9:3;4) теор. 40 фенотип SGE : 13 фенотип "SGEFbr-1" : 18 фенотип "SGEFix"-2" (X2=0.52)

9 (sym-Y—sym-Z—): Ъ (sym-Ysym-YSym-Z—) : 3 Sym-Y—sym-Zsym-Z

1 sym-Ysym- Ysym-Zsym-Z

ísym-Ysym-YSym-Z—\ 1

sym- Ysym- Ysym-Zsym-Z

x

SGEFix--l

Fb Fg

фенотип "SGEFix'-l'

SGEFix--2

фенотип "SGEFix'-2"

RBT3

ВЫВОДЫ

1. Анализ 85 формообразцов гороха (Pisum sativum L.) из мировой коллекции ВИРа выявил 2 формообразца: К 320 (Палестина) и К 6047 (Афганистан), содержащие растения, неспособные: к клубенькообразованшо со штаммом CIAM1026. Показано, что линия К320-1, происходящая из формообразца К320, несет в гомозиготе рецессивную аллель симбиотического гена sym-2.

2. Получены новые симбиотические мутанты гороха на линии SGE: 8-е фенотипом Nod", 2-е фенотипом Nod+/" и 14 мутантов - с фенотипом Fix". Для мутантов SGENod"-l -SGENod--4, SGENod"-6, SGENod"-8, SGEFix'-l и SGEFix"-2 показаны моногенное наследование и рецессивное проявление мутантных фенотипов.

3. Показано, что мутации линий SGENod"-l - SGENod"-4, и SGENod"-8 принадлежат к 3 различным группам комплементации: sym-Л, sym-B и sym-C, а мутации линий SGEFir-1 и SGEFix"-2 произошли в не идентифицированных ранее генах sym-Y и sym-Z, соответственно. Генетически классифицирована коллекция симбиотических мутантов гороха, индуцированных на сорте Finale. Выявлено, что Nod" мутации принадлежат к 7 различным группам комплементации, две из которых соответствуют генам - sym-7и sym-19, a Fix" мутанты - к 4 группам, две из которых соответствуют генам sym-26 и sym-27.

4. Показано, что развитие симбиоза у мутантов SGENod"-l, SGENod"-2, SGENod"-3 и SGENod"-6 блокировано на стадии инициации роста инфекционных нитей, у мутантов SGENod"-4 и SGENod"-8 - на стадии роста инфекционных нитей в клетках корневых волосков, у мутанта SGEFix"-l на стадиях дифференциации инфекционных нитей в тканях молодого клубенька и формирования инфекционных капель, у мутанта SGEFix"-2 на стадии эндоцитоза бактерий в цитоплазму растительных клеток.

5. На основе сравнительного фенотипического анализа новых и полученных ранее мутантов предложена новая система фенотипических кодов для стадии формирования инфекционных нитей. Фенотипический код Inf подразделен на 5 новых кодов: Iti -инициация роста инфекционной нити (мутанты SGENod'-l, SGENod"-2, SGENod"-3 и SGENod"-6); Ith - развитие инфекционной нити в корневом волоске (SGENod"-4 и SGENod"-8); Itr - развитие инфекционной нити в кортексе корня (ряд мутантов, известных по литературным данным); Itn - развитие инфекционной нити в тканях молодого клубенька (SGEFbc'-l, SGEFix"-2);. Idd - дифференциация инфекционных капель (SGEFix'-l).

6. Показано, что растения мутантных линий SGEFix"-l и SGEFix"-2 при определенных условиях выращивания формируют два типа клубеньков на одном корне. Выявлена температурозависимость и штаммоспецифичность проявления обеих Fix" мутаций. Показано, что мутантные фенотипы линий SGEFix"-l и SGEFix"-2 контролируются генотипом корня.

7. Выяснено взаимное расположение локуса sym-31 и 3-х маркеров III группы сцепления гороха: M, uni и st. Картированы симбиотические локусы sym-Z - в группе сцепления IA между маркерами i и d, локус sym-27 - в группе V между маркерами gp и Iß.

8. Разработаны два метода для получения двойных Fix" мутантов гороха. Созданы двойные мутантные линии: RBT (sym-13sym-13sym-31sym-31), RBT1 (sym-13sym-13sym-Ysym-Y), RBT2 (sym-13sym-13sym-Zsym-Z), RBT3 (sym-Ysym-Ysym-Zsym-Z).

9. Показаны два типа взаимодействия симбиотических генов гороха: эпистаз и комплементарность. С использованием анализа внешенй морфологии, показано, что мутантный ген sym-Z эпистатирует над мутантными генами sym-13 и sym-Y, в то время

как пары мутантных аллелей sym-Y, sym-13 и sym-31, sym-13 взаимодействуют по типу комплементарности.

10. Показано, что в ген Sym-31 функционирует на более ранней стадии развития симбиоза, чем ген Sym-13 в отношении дифференцировки бактероидов и структуры симбиосом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Men А.Е., Borisov A.Y., Rozov S.M., Tsyganov V.E., Tikhonovich LA. The early nodulin gene Enodl2A is in linkage group 3. Pisum Genetics. 1993. V. 25 P. 32-33,

2. Rozov S.M., Borisov A.Y., Tsyganov V.E., Tikhonovich IA. 1993. A new Fix imitation in pea shows linkage with group 3 marker M. Pisum Genetics. 1993. V. 25 P. 45.

3. Борисов А.Ю., Розов C.M., Цыганов B.E., Куликова О.А., Колычева А.Н., Якоби Л.М., Овцына А.О., Тихонович И.А. Выявление симбиотических генов гороха (Pisum sativum L.) с использованием экспериментального мутагенеза // Генетика. 1994. Т. 30. N,

11, с. 1484-1494.

4. Борисов А.Ю., Цыганов В.Е., Колычева А.Н., Якоби J1.M., Моржина Е.В., Камардин Н.Н., Лебский В.К. Получение и характеристика симбиотических мутантов гороха (Pisum sativum L.) // Генетика. 1994. Т. 30. приложение, с. 18.

5. Rozov S.M., Borisov А.У., Tsyganov V.E. Futher evidence that the new Fix gene refers to pea linkage group 3. Pisum Genetics. 1994. V. 26 P. 24-25.

6. Tsyganov V.E., Borisov A.Y., Rozov S.M., Tikhonovich I.A. New symbiotic mutants of pea obtained after mutagenesis of laboratory line SGE. Pisum Genetics. 1994. P. 36-37.

7. Tikhonovich 1.А., Borisov A.Y., Chvabauskene I.A., Kamardin N.N., Kravchenko L.V., Lebsky V.K., Minchin F., Morzhina E.V., Romanov V.I., Scot L., Tchetkova S A, Tsyganov V.E. Plant genetical control at the crucial steps of symbiosis. In: Tikhonovich I.A. et al. (eds.). Nitrogen Fixation: Fundamentals and Application, Proc. of X-th International Congress on Nitrogen Fixation, St.-Petersburg, Russia, May 28 - June 3. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht/Boston/London, 1995, pp. 461-466.

8. Tsyganov V.E., Borisov A.Y., Rozov S.M., Tikhonovich I.A. Isolation of new pea (Pisum sativum L.) symbiotic mutants. Ibid, p. 486.

9. Morzhina E.V., Tsyganov V.E., Borisov A.Y., Lebsky V.K., Tikhonovich I.A. Ultrastructural analysis of nodules in two new pea mutants SGEFix"-1 and SGEFix"-2. Ibid, p. 487.

10. Borisov A.Y., Rozov S.M., Tsyganov V.E., Morzhina E.V., Lebsky V.K., Tikhonovich I.A. Identification of the exact functional sequence of the two pea (Psum sativum L.) symbiotic genes using the genetic model of second level. Ibid, p. 488.

11. Rozov S.M., Borisov AY., Tsyganov V.E., Men A.E., Tikhonovich I.A. Mapping of pea (Pisum sativum L.) genes affecting symbiosis. Ibid, p. 489.

12. Lebsky V.K., Borisov A.Y., Tsyganov V.E., Morzhina E.V., Tikhonovich I.A. May we talk about general mechanisms of plant control over bacteria differentiation into bacteroids. Ibid, p. 492.

13. Morzhina E.V., Tsyganov V.E., Borisov A.Y., Tikhonovich I.A The novel types of interactions between nodule bacteria and pea (Pisum sativum L.) plant caused by the macrosymbiont gene mutations. In Stacey G. et al. (eds). Abstract book of 8th International Congress Molecular Plant-Microbe Interactions, Knoxville, USA, July 14-19, 1996, The University of Tennessee, Knoxville, 1996, H-1S9.

14. Tikhonovich I.A., Borisov A.Y., Lebsky V.K., Morzhina E.V., Tsyganov V.E, Plant genes controlling the fate of bacteria inside the root. Proc. of 8th Internatinal Congress Molecular Plant-Microbe Interactions, Knoxville, USA, July 14-19, 1996, The University of Tennessee, Knoxville, 1996, p. 377-380.

15. A.Y. Borisov, V.E. Tsyganov, E.V. Morhina, J.A. Chvabauskene, N.L. Radukina, L. Skot, S.M. Rozov, V.K. Lebsky, V.I. Romanov, I.A. Tikhonovich. Search for morphological and biochemical characters which mark the stages of symbiosis development controlled by certain pea {Pisum sativum L.) symbiotic genes. Ibid, p. 237.

16. V.K. Lebsky, A.Y. Borisov, E.V. Morzhina, N.I. Provorov, V.E. Tsyganov, I.A. Tikhonovich. Can we reconstruct the Nj-fixing symbiosis evolution using the legume mutants? Ibid, p.245,

17. B.E. Цыганов, А.Ю. Борисов, C.M. Розов, А.Е. Мень, П.М. Грешхофф, И.А. Тихонович. Картирование генов гороха (Pisum sativum L.) с использованием морфологических и молекулярных маркеров. Тезисы конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". Москва, 30-31 октября 1996 - Москва 1996, стр. 88.

18. A.Y. Borisov, S.M. Rozov, V.E. Tsyganov, E.V. Morzhina, V.K. Lebsky, I.A. Tikhonovich. Sequential functioning of Sym-13 and Sym-31, two genes affecting symbiosome development in root nodules of pea (Pisum sativum L.). Mol. Gen. Genet. 1997. V. 254: P. 592598.

19. I.A. Tikhonovich, A.Y. Borisov, N.J. Brewin, Y.A. Chvabauskene, P.M. Gresshoff, V,K. Lebsky, A.E. Men, E.V. Morzhina, N.L. Radukina, V.I. Romanov, S.M. Rozov, L. Skot, V.E. Tsyganov. Genetic dissection of pea (Pisum sativum L.) root nodule morphogenesis. Nitrogen Fixation for the 21st Century. Proc. of Xl-th International Congress on Nitrogen Fixation, Paris, Fiance, July 20-25, Kluwer Academic Publishers, Dordrceht/Boston/London, 1997, pp. 321-322.

20. A.Y. Borisov, V.K. Lebsky, E.V. Morzhina, S.M. Rozov, V.E. Tsyganov, and I.A. Tikhonovich. Study of pea (Pisum sativum L.) symbiotic gene interactions using a panel of lines carrying two Fix" mutations and a comparative study of their nodule ultra structure. Ibid, p. 345.

AO СКВ "Индикатор". Зак3.411 Тир.ЮО Экз. Тел.252-46-66.