Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ УФ-индуцированных структурно-функциональных изменений белков системы комплемента и эритроцитарных мембран

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Анализ УФ-индуцированных структурно-функциональных изменений белков системы комплемента и эритроцитарных мембран"

г- Г

Воронежский государственный университет

сгэ

С. .

На правах рукописи

ГУСИНСКАЯ Виктория Витальевна

АНАЛИЗ УФ-ИНДУЦИРОВАННЫХ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ БЕЛКОВ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА И ЭРИТРОНИТАРНЫХ МЕМБРАН

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 1995

Работа выполнена в Воронежском государственном университете.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

заслуженный деятель науки РФ, профессор Артюхов Е.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

академик Международной академии наук, профессор Пашков А.Н., доктор биологических наук, профессор Стародуб н. Ф.

Ведущая организация: Московский научно-исследовательский

институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского

Защита диссертации состоится 27 декабря 1995 года в '£_ час. на заседании Диссертационного Совета К 063.48.14 при Воронежском государственном университете по адресу: 394693, г.Воронеж, Университетская площадь, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан " ноября 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук, у

доцент Ковалева Т. А.

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В современной неблагоприятной экологической обстановке, сложившейся в результате интенсивной технологической деятельности человека, остро встала проблема предотвращения и ликвидации целого спектра врожденных и приобретенных его патологических состояний, протекающих на фоне различных нарушений иммунитета - иммунодепрессии, иммуното-лерантнооти, иммунopeактивности и аутоиммунной агрессии. В связи с чем неоспоримым является приоритет проблем современной биологии, физики, химии и медицины, связанных с поиском и разработкой эффективных методов иммунокоррекции организма человека и животных в лечебных и профилактических целях.

В силу замедленной эффективности действия традиционных средств фармакотерапии и накопления нежелательных последствий их применения особую актуальность приобрели методы нефармакологической терапии, в частности, аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК). В настоящее время АУФОК используется в хирургических, акушерско-гинекологических и терапевтических клиниках для лечения самого широкого спектра заболеваний (В.А.Крыленков и сотр., 1983; В. Е.Холмогоров и сотр., 1988; И.И. ¡Куликова, 1992). Лечебный эффект метода связывают с усилением оксигенации крови, купированием гипсксических состояний, с повышением бактерицидных и нормализацией реологических свойств УФ-облученной крови, а также стимуляцией факторов клеточного и гуморального иммунитета (К.А.Самойлова, И.Г.Дуткевич, 1986). Определенная универсальность терапевтического воздействия переливания фотомодифицированной крови на организм находит свое обьяснение в том, что клеточные и гуморальные компоненты крови, подвергнутые УФ-облучению в физиологических дозах, могут оказывать регулирующее действие на иммунную систему, а значит, и на организм в целом.

Исследования по функциональной активности иммунной системы при воздействии оптического (в том числе и УФ) излучения на биосистемы различного уровня организации способствовали формированию нового научного направления - фотоиммунологии, базирующейся на применении современных методов биофизики и иммунологии.

В литературе имеется большое количество работ, вскрывающих механизм действия УФ-света на белки, липиды и их надмолекулярные комплексы - ферментные ансамбли, цитоплазматические мебраны, клетки и т. д. (C.B.Конев, И. Д.Волотовский, 1979; Д.И. Рощупкин, 1979; И. И. Сапе-жинский, 1981; В.Г.Артюхов, 1983; Ю.А. Владимиров, А.Я.Потапенко,

1989; В.А.Крыленков, 1990).

Но несмотря на достаточно большое число работ в области фотобиологии и фотоиммунологии, определенные успехи в использовании метода АУФОК в медицине, сохраняется значительная диспропорция между широтой применения метода и пониманием конкретных механизмов его лечебного действия. Следствием такого положения является неопределенность в анализе процессов, определяющих терапевтический эффект данного метода, отсутствие показаний и противопоказаний его использования, а также дифференцированного подхода при лечении и профилактике различных патологий у людей с учетом их индивидуальных особенностей.

Кроме того, в литературе практически отсутствуют работы, посвященные анализу взаимосвязи процессов дозозависимых структурных фотомодификаций иммунокомпетентных компонентов крови с процессами их функциональной активации, а также определению соотношения вкладов тех или иных фотохимических процессов в эффектах УФ-модификации составляющих крови и возможности их дозозависимой регуляции.

Исходя из вышеизложенного, нами проведены систематические исследования структурно-функциональных фотомодификаций системы сывороточных белков комплемента (одного из факторов неспецифического иммунитета) и эритроцитарных мембран, функционирующих отдельно и в комплексе друг с другом. Так как комплемент представляет собой сложную и полифункциональную систему организма, эффективно участвующую во многих физиологических процессах, мы сосредоточили свое внимание на анализе лишь одной из его функций - гемолитической.

Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы явилось изучение взаимосвязи между структурными и функциональными изменениями белков системы комплемен-

та и компонентов эритроцитарных .мембран^..1шдуцирдванным11_раздинными— дозами УФ-излучения.

Задачи работы предусматривали:

1. Исследование воздействия УФ-излучения (240-390 нм) в диапазоне доз 75,5 + 755 Дж/м2 на модельную гемолитическую систему, состоящую из сенсибилизированных кроличьими антителами бараньих эритроцитов и сыворотки крови человека - источник белков комплемента.

2. Определение дозозависимого соотношения вкладов различных фотопроцессов (прямого и косвенного действия УФ-света), протекающих на эритроцитарных мембранах и в сыворотке крови, в общем эффекте УФ-модификации гемолитической системы.

3. Выявление роли структурно-функциональных фотомодификаций отдельных факторов комплемента в УФ-индуцированном изменении его активации по классическому и альтернативному путям.

4. Изучение взаимосвязи структурных УФ-превращений эритроцитар-ных мембран с проявлением ими своих иммунобиологических свойств.

5. Исследование роли структурно-функциональных изменений мембран эритроцитов и системы комплемента в проявлении терапевтического эффекта метода АУФОК по отношению к больным бронхиальной астмой и язвой желудка.

Научная новизна.

Работа является комплексным исследованием, посвященным анализу взаимосвязи между структурными и функциональными фотомодификациями мембран эритроцитарных клеток, а такие белков системы комплемента сыворотки человека.

Впервые изучено влияние УФ-света на структурно-функциональное состояние взаимодействующих в гемолитической системе компонентов -эритрсцктарных мембран и сывороточного комплемента; определено соотношение вкладов различных фотохимических процессов, протекающих в этих компонентах при различных дозах УФ-облучения, в общем эффекте наблюдаемой фотоинактивации системы комплемента.

Установлено, что определяющая роль в УФ-изменении гемолитической активности системы комплемента принадлежит опосредованному через продукты радикальной природы (преимущественно продукты пероксиднсго окисления липидов) действию УФ-света.

Показано, что ответные реакции системы комплемента на воздействие различных доз УФ-излучения определяются исходным уровнем его активности в сыворотке крови, а также фотомодификациями отдельных его факторов и состоянием функционирования ингибиторных протеиназ.

Разработана схема УФ-индуцированных превращений молекул белка С1д (субкомпонента первого фактора комплемента).

Изучены структурные изменения внешнего примембранного слоя эритроцитарных клеток под действием УФ-излучения, проявляющиеся в модификации их сорбционных, иммуносорбционных и гормонсвязывающих свойств.

Показано коррегирующее действие АУФОК-терапии на структурно-функциональное состояние эритроцитарных мембран и систему комплемента крови больных бронхиальной астмой и язвой желудка.

Практическая значимость.

Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления о молекулярно-клеточном механизме действия УФ-света на отдельные составляющие системы крови, являющиеся ключевыми звеньями в адаптационно-защитной системе организма.

Выявленная дозовая зависимость интенсивности протекания тех или иных фотохимических процессов в различных компонентах крови может явиться теоретическим фундаментом целенаправленного использования УФ-света в медицине.

Предложенные тесты диагностики структурно-функционального состояния систем клеточной рецепции и комплемента могут быть включены в перечень профилактических и терапевтических мероприятий с целью разработки программ индивидуального дифференцированного назначения больным курса фотогемотерапии.

Разработанные нами оригинальные тесты иммуноферментного анализа для изучения инсулинсвязывающей способности эритроцитарных мембран в силу своей простоты и удобства могут быть внедрены в практику лабораторного анализа.

Материалы работы используются в учебном процессе биолого-почвенного Факультета Воронежского госуниверситета (общих курсах - "Иммунология" и "Биофизика", спецкурсе - "Фотобиология").

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Всесоюзной конференции "Применение УФ-облучения крови в медицине и ветеринарии" (Ленинград, 1989); VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991); I съезде "Физиологического общества" (Москва-Пущино, 1993); IX Украинской школе-семинаре "Спектроскопия 'Молекул-и-кристаллов"~СХарьков, 19937т-Научнызг_сессиях_Боронёжско"го"_ госуниверситета (Воронеж, 1990, 1993); Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1995).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 статей и 2 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Фотоинактивация модельной гемолитической системы при действии УФ-излучения в интервале доз 75, 5 + 755 Дж/м2 является суммар-

ным результатом фотопроцессов, протекающих в сыворотке крови и на мембранах сенсибилизированных эритроцитов при определяющей роли УФ-инактивации белков сывороточного комплемента.

2. В сыворотке крови и на мембранах эритроцитов протекают процессы пероксидного фотоокисления липидов, вклад которых в фотоинактивацию системы комплемента зависит от дозы УФ-облучения.

3. Ответные реакции системы комплемента на воздействие УФ-ради-ации определяются исходным уровнем его активности в сыворотке, фотомодификациями отдельных факторов и состоянием функционирования инги-биторнкх протеиназ.

4. Индуцированные УФ-облучением (151 и 2265 Дж/м2) структурные перестройки белка С^ связаны с процессом разворачивания белковой молекулы, не затрагивающим соотношения типов II структуры белка.

5. Модификация маркеров (антигенных детерминант) поверхности клеток, приводящая к изменению сорбционных, иммуносорбционных и гор-монсвязывающих свойств мембран.эритроцитов, является результатом усиливающихся с ростом дозы УФ-облучения процессов пероксидного окисления липидов.

6. АУФОК-терапия оказывает коррегирующее действие на систему гуморального иммунитета и уровень экспрессии антигенных детерминант и рецепторов на поверхности мембран эритроцитов.

7. схема УФ-модификации белка С 1ц.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа включает страниц машинописного текста, 23 таблицы, 39 рисунков. Состоит из введения, семи глав, заключения, выводов и приложения. Список литературы содержит 136 работ, из них 72 отечественных и 64 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ■ В главе представлен обзор основных работ, посвященных системе комплемента, анализу строения и функций ее отдельных компонентов, механизмам активации и регуляции, биологическому и клиническому значению.

ГЛАВА 2. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

Освещены современные воззрения на структуру и функции биологических мембран, в первую очередь эритроцитарных.

- 8 -

ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали модельную систему, в которой комплемент проявляет свою гемолитическую активность по отношению к сенсибилизированным кроличьими антителами бараньим эритроцитам. Определение гемолитической активности системы комплемента проводили по методу Е.Кэбота и М. Мейера (1968), основанному на инициации классического пути его активации.

Функциональную активность отдельных факторов комплемента (С^, С1-С5, В и 0) определяли методом гемолитического титрования (Л.В.Козлов и сотр., 1952) при добавлении к нативной и УФ-модифици-рованной сыворотке крови доноров и больных бронхиальной астмой и язвой желудка специальных реагентов (производства Кировского НИИ гематологии и переливания крови).

Роль опосредованного через продукты радикальной природы (в том числе продукты пероксидного фотоокисления липидов) действия УФ-света на белки изучаемой системы выявляли с помощью антиоксиданта ионола (5■10~7, 5-10"6, 10"5 моль/л) и ТВК-теста на малоновый диальдегид.

Электронные спектры поглощения белка С^ (10"6 моль/л) регистрировали на спектрофотометре СФ-46, ИК-спектры - на многофункциональном инфракрасном спектрофотометре ЗРЕСОЙБ М-80 (Германия).

Кислотно-основное титрование опытных раствороЕ (10~6 моль/л) белка СЮ, осуществляли капельным методом с помощью рН-метра У628.

Для получения теней эритроцитов использовали молекулярно-сито-вой метод (С.Ггоюап е1 а1., 1980), в основе которого лежала гель-фильтрация на сефарсзе 4В и колонки объемом 9 мл (15x51 мм). Содержание белка в эритроцитарных мембранах определяли по методу о.Н.Ьои-гу (1951).

Для изучения структурно-функциональных фотомодификаций эритро--цитарных-мебран-исп&льзоваяи-метод-ко-личее-твенной-сорбции-их-поверх= ностью красителя альцианового синего (Р. А. Арцишевская, К.А.Самойлова, 1984), метод определения экспрессии группоспецифических (А и В) и резус-факторных №Ь(0)) рецепторов в реакции агглютинации со специфическими антисыворотками, а также разработанные нами тесты на основе конкурентного и неконкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с иммобилизацией на поверхность 96-луночных полистироловых микропланшетов теней эритроцитов (100 мкг/мл) или цельных эритроцитов (1,5-108 клеток/мл). Источником поликлональных антител (1,25 мкг/мл) служила стандартная гемолитическая антисыворотка кролика к бараньим эритроцитам и полученная нами антисыворотка крыс к эритро-

цитам человека.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили на ЭВМ типа IBM PC/AT с помощью прикладных статистических программ "Statgraphics".

ГЛАВА 4. О РОЛИ ФОТОМОДИФИКАЦИИ НЕКОТОРЫХ КОМПОНЕНТОВ КРОВИ В ИЗМЕНЕНИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА СЫВОРОТКИ ДОНОРОВ

После УФ-облучения в дозах 75,5; 151; 453; 755 и 906 Дж/мг модельной гемолитической системы в целом (ЕА+С) нами выявлено снижение функциональной активности входящего в неё комплемента по сравнению с его активностью в необлучекной системе соответственно на 17,6; 26; 44; 75,5 и 81% (рис.1).

При исследовании вклада фотохимических превращений отдельных составляющих системы в изменение ее активности показано, что УФ-свет в указанных дозах оказывает инактивирующее действие, усиливающееся с ростом дозы, на белки комплемента (С) в УФ-облученной сыворотке (рис.2), а также индуцирует повышение активности комплемента по отношению к УФ-облученным сенсибилизированным кроличьими антителами бараньим эритроцитам (ЕА) (рис.3).

Сравнительный анализ полученных данных свидетельствует е пользу того, что общий эффект наблюдаемой фотоинактивации комплемента при действии УФ-света в дозах 75,5:-906 Дж/мг на гемолитическую систему в целом обусловлен суммарным вкладом в большей степени процессов УФ-инактиЕации самой системы комплемента сыворотки крови доноров и з меньшей степени - процессов фотомодификации мембран бараньих эритроцитов.

Методическим подходом для определения природы протекающих в изучаемой системе фотопроцессов, а также роли прямого и опосредованного через радикальные продукты действия УФ-света на белки явилось введение в УФ-облучаемую систему и ее компоненты антиоксиданта ионо-ла. Нами выявлен эффект защитного действия ионола (5-Ю"7 моль/л), усиливающийся с ростом дозы УФ-облучения, по отношению ко всей гемолитической системе и взвеси сенсибилизированных эритроцитов. По отношению к УФ-облучаемой сыворотке крови защитное действие ионола (5-10~6 моль/л) с увеличением дозы ослабляется.

На основании полученных данных по снижению модифицирующего влияния УФ-излучения за счет антиоксидангной активности ионола (табл.1) установлено, что с ростом дозы УФ-облучения вклад косвенного действия УФ-света на белки в фотоинактивацию системы в целом увеличива-

о, % 120

100

40

20

75,5

151

755 906 Дж/м

Рис. 1. Дозовая зависимость влияния УФ-света на гемолитическую активность системы комплемента.

Рис.2 . Дозовая зависимость влияния УФ-облучения сыворотки крови на гемолитическую активность системы комплемента.

- И -

ется и определяется возрастающим уровнем интенсивности радикальных процессов на мембранах эритроцитов. В УФ-облученной сыворотке крови с увеличением -дозы интенсивность радикальных процессов падает, при этом усиливается роль прямого инактивирующего воздействия излучения на белки комплемента.

Таблица 1

Вклад косвенного действия УФ-света в фотомодификацию гемолитической системы в целом и ее компонентов

Дозы УФО, Дж/м2 ЕА + С ЕА С

75,5 — не определено 85%

151 15% не определено 26%

453 32% не определено 13%

755 60% 70% 4%

Одним из радикальных процессов, протекающих в биосистемах, является пероксидное окисление липидов (ПОЛ). С помощью ТБК-теста на малоноЕый диальдегид (один из конечных продуктов ПОЛ) показано, что УФ-облучение в интервале доз 75,5 + 755 Дж/м2 всей гемолитической системы и взвеси сенсибилизированных эритроцитов генерирует протекание в них в течение трех суток пострадиационного периода темнового окисления липидов. При этом максимальное накопление МДА в гемолитической системе регистрируется через сутки после ее УФ-облучения в дозе 151 Дж/м2, а на эритроцитарных мембранах - на третьи сутки после УФО в максимальной дозе.

Сравнительный анализ интенсивности пероксидного фотоокисления липидов (ПФОЛ), регистрируемой через 1 час после УФ-воздействия, свидетельствует о том, что протекающие в гемолитической системе радикальные процессы, индуцируемые малыми дозами УФ-радиации, определяются в основном ПФОЛ в сыворотке крови, а при больших дозах - ПФОЛ на эритроцитарных мембранах. При этом вклад процессов ПФОЛ в углубляющуюся с ростом дозы УФ-облучения инактивацию системы увеличивает-

оЯ .

ГЛАВА 5. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ФОТОМОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА

Для выяснения роли фотомодификаций отдельных факторов классического (С1ч, С1-С5) и альтернативного (В и Б) путей активации комплемента в общем изменении его гемолитической активности проведены эксперименты по УФ-облучению в различных дозах сыворотки крови с

Од,2 0,65

0,60

0,55

0,50

0,45

0,40

-Ь

0 151 453 906 1359 1812 2265 Дж/м

Рис. 3. Дозовая зависимость влияния УФ-облучвния сенсибилизированных эритроцитов на гемолитическую активность системы комплемента.

"ср. 0,4

0,2

Собщ, 0

-0,2

-0,4

Рис. 4. Изменения общей активности системы комплемента после УФ-облучения сыворотки крови в различных дозах

Ш- уф0 в дозе 151 Дж/м2 ПЛ 453 Дж/м2;

2265 Дж/м

С общ. - общая гемолитическая активность системы

комплемента в нативной сыворотке (контроль); Х- отличие от контроля недостоверно

последующим определением методом гемолитического титрования активности находящихся в ней компонентов.

Показано,- что УФ-облучение сыворотки крови в дозе 151 Дж/м2 приводит к повышению, а в дозах 453 и 2265 Дж/м2 - к снижению, усиливающемуся с ростом дозы, как общей гемолитической активности входящего в нее комплемента, так и активности отдельных факторов классического пути (рис.4, 5). При этом наиболее фоточувствительнкми являются белки С^, С1 и СЗ. Факторы С2, С4 и С5 проявляют относительную фоторезистентность.

Альтернативная активация сывороточного комплемента и фактора О с увеличением дозы УФ-света з указанном диапазоне интенсифицируются.

Установлено, что ответные реакции комплемента на воздействие УФ-излучения определяются исходным уровнем его функциональной активности в сыворотке, структурно-функциональными фотомодификациями отдельных факторов и состоянием функционирования ингибиторных протеи-наз. Для доноров с исходно низкой комплементарной активностью факторы С^, С1-СЗ и С5 являются определяющими в общем эффекте фотомодификации всей системы комплемента, а фактор С4 - лимитирующим: инактивация ингибиторными протеиназами С4 при дозе 75,5 Дж/м2 делает регистрируемое повышение общей гемолитической активности комплемента невысоким, а при- дозе 3020 Д;«/м2 С4 предотвращает падение общего комплементарного уровня.

После УФ-облучения в минимальной дозе (75,5 Дж/м2) сыворотки доноров со средним комплементарным уровнем наблюдается снижение общей гемолитической активности комплемента, а также активности С1о, СЗ и С5-факторов, являющееся, по всей вероятности, результатом фотоактивации ингибиторных протеиназ. Повышение функциональной активности С1, С2, С4 и С5, но сохранение таковой факторами С^ и СЗ, определяют небольшую степень активации комплемента в УФ-облученной в дозе 3020 Дж/м2 сыворотке. Полученные данные свидетельствуют о корре-гирующем действии УФ-света в малых дозах на систему комплемента.

С целью проведения анализа структурных фотомодификаций белков комплемента были зарегистрированы ИК-спектры реагентов с инактивиро-ванными соответственно факторами С1-С5. УФ-изменения в их ИК-спект-ральных характеристиках носили наиболее общий характер, в связи с чем было уделено особое внимание изучению структурных фотомодификаций одного из ключевых белков - С^.

Дифференциальный (разностный) ИК-спектр узкого диапазона (1800+1200 см"1) белка С1д (рис.6) характеризуется несколькими поло-

0,2

С общ.+тр 0 -0,2 -0,4 -0,6

"ср.

0,4 0,2

С общ.-Ж4 О

-0,2 -0,4 -0,6

"ср.

0,4 0,2 С общ.+Я5 О --0,2

-0,4 -0:6

Рис. 5. Изменение функциональной активности отдельных факторов системы комплемента после Уф-облучения сыворотки крови в различных дозах

- УФО в дозе 151 Дж/м ; ¡Щ - 453 Дж/м2;

щН 2

йь&авая _ 2265 ДЖ/М ' С общ.+Я] - гемолитическая активность соответствующего фактора (С1р, С1-С5)в нативной сыворотке (контроль); Х- отличиэ от контроля недостоверно

сами поглощения, среди которых наиболее выраженными являются Амид I (1636 см"1)- и Амид II (1560 см"1). Увеличение дозы УФ-облучения со 151 до 2265 Дж/м2 приводит к повышению интенсивности поглощения полосы 1308 см-1, характеризующей поглощение квантов ИК-света феноль-ными группами тирозина и метилгидроксильными группами серина.

По составляющим компонентам полосы Амид I было вычислено соотношение типов II структуры нативного и УФ-модифицированного белка С1ч (табл.2). При этом статистически достоверных изменений в соотношении типов II структуры белка после его УФ-облучения не выявлено.

Таблица 2

Соотношение типов II структуры в белке С^ до и после УФ-облучения

Тип II структуры Содержание типа II структуры (%)

0 151 ДЖ/М2 2265 Дж/м2

Неупорядоченная структура (1652 см"1) 47 ± 5 45 ± 5 42 + 5

(З-структура (1620 см"1) 15 ± 5 „ 15 ± 5 15 ± 5

а-структура (1636 см"5) 38 + 5 40 ± 5 43 ± 5

По-видимому, структурные фотомодификации С1я связаны с разворачиванием белковой молекулы, не затрагивающим соотношение типов II структуры, и сопровождаются экспонированием на ее поверхность новых хромофоров ИК-света.

О появлении дополнительных функциональных групп (в частности остатков ароматических аминокислот) на поверхности УФ-облученного белка свидетельствует направление изменений его электронных спектров поглощения в области 280 нм. Возрастание оптической плотности раствора С1ц (10"6 моль/л) с увеличением дозы его УФ-облучения является результатом углубляющегося процесса разворачивания белковой молекулы.

Доказательством разворачивания молекулы С 1ц, усиливающегося с ростом дозы УФ-облучения, является также увеличение ее щелочной и кислотной буферной емкостей, выявленное методом кислотно-основного титрования, при дозе 151 Дж/м2 в среднем на 37%, при дозе 2265 Дж/м2 - на 57% (рис.7).

Анализ кривых титрования растворов нативного и УФ-модифицированного белка С^ (10"6 моль/л) показал, что возрастание кислотной

т, %

Рис. 6. Дифференциальные спектры белка С^ 1 - нативный белок; 2 - после УФО в дозе 151 Дж/м2; 3 - после УФО в дозе 2265 Дж/мг.

Рис. 7. Изменение буферной емкости белка С1я после УФО 1 - нативный белок; 2 - после УФО в дозе 151 Дж/м2; 3 - после УФО в дозе 2265 Дж/мг.

буферной емкости обусловлено появлением на поверхности белковой молекулы остатков аспарагиновой и глугаминсвой кислот в количестве 135 для дозы 151 Д«:/м2 и 175 для дозы 2265 Дж/м2. Увеличение щелочной буферной емкости связано с экспонированием на поверхность молекулы Clq остатков тирозина, лизина, оксилизина и цистеина в количестве 105 и 120 для соответствующих доз.

На основании данных по ЙК- и УФ-спектроскопии, а также кислотно-основного титрования была составлена схема структурных фотомодификаций белка Clq, проявляющихся в разворачивании и разрыхлении III и IV типов структуры молекулы, и, как следствие этого, изменении активных центров Clq. При этом в случае малой дозы УФ-радиации (151 Дж/мг) повышается способность Clq связываться с антителами на поверхности эритроцитов, т.е. увеличивается количество активных Clq-ком-понентов, а, значит, и гемолитическая активность всей системы комплемента по классическому пути активации. Максимальная доза УФ-света оказывает деструктивное воздействие, углубляющее процесс разрыхления молекулы и нарушающее ее функциональные центры. Следствием этого является падение общей гемолитической активности системы комплемента после УФ-облучения в дозе 2265 Дж/м2.

ГЛАВА 6. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ФОТОМОДИФИКАЦИИ ЭРИТРСЦИТАР-НЫХ МЕМБРАН

Для исследования структурно-функциональных фотомодификаций эритроцитарных мембран нами были разработаны оригинальные схемы твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

При последовательной иммобилизации на поверхность полистироловых микропланшетов теней бараньих эритроцитов, поликлональной кроличьей антисыворотки и коньюгата белка А с пероксидазой хрена было выявлено повышение сорбционных по отнопению к носителю свойств УФ-облученных в дозах 75,5 - 1510 Дж/м2 эритроцитарных мембран, что проявляется в увеличении уровня ИФА-сигнала с ростом дозы УФ-света (рис.8). В то же время способность сенсибилизированных эритроцитов (ЕА) абсорбировать на своей поверхности дополнительные антитела, т.е. уровень иммуносорбции, с ростом дозы УФ-облучения снижается (рис.9).

Причиной наблюдаемых фотомодификаций мембран бараньих эритроцитов является изменение их внешнего примембранного слоя - гликокалик-са, что нашло отражение в повышении его способности связывать краситель альциановый синий.

ед.опт. плотности

0,14 г 0,12 -0,10 ■

0,08 -

0,06 - р™

0,04 - _

0,02 -

к 0 - ' ' 1 —^-

75,5 151 453 755 1510 Дж/м2

Рис. 8. Изменение аналитического сигнала ИФАпосле иммобилизации УФ-облученных в различных дозах бараньих эритроцитов

к - средняя величина ИФА-сигнала (D492) в системе с нативными эритроцитами;

dcp =2(Х|-У|)/п - средняя разность между D492 опытных и контрольных образцов (п=12);

dop,

ед.опт. плотности

0,04 г

-0,20

Рис. 9. Изменение аналитического сигнала ИФА после дополнительной посадки Ат на УФ-облученные в различных дозах сенсибилизированные эритроциты

к - 0492 в ИФА-системе ЕА+Ат (п=12) X - отличие от контроля недостоверно

Исследование гормонсвязывающей способности эритроцитарных мембран проводили с помощью ИФА-теста на основе конкурентного взаимодействия поликлональных антител и гормона инсулина за места связывания на поверхности клеток. Зарегистрированное падение уровня ИФА-сигнала в системе с УФ-облученными бараньими эритроцитами свиде-'тельствует о повышении их инсулинсвязываюцей способности.

Структурные фотомодификации эритроцитарных мембран человека также затрагивают их внешнего примембранного слоя и приводят при дозе 75,5 Дж/м2 к повышению их иммуносорбционных (по отношению к Ат) и инсулинсвязывающих свойств, ослабляющихся с ростом дозы УФ-облуче-ния. В то же время УФ-излучение в указанном диапазоне доз индуцирует возрастание агглютинационной активности группоспецифических (А и В) и резус-факторных (НИ(0)) антигенов поверхности клеток, усиливающееся с увеличением дозы. Наибольшим повышением экспрессии характеризуются антигены А (в среднем в 3,6 раза) и В (в 11 раз). УФ-радиация в дозе 1510 Дж/м2 оказывает деструктивное влияние на мембраны человеческих эритроцитов, приводя к резкому падению их агглютинационной активности.

Таким образом, усиливающиеся с ростом дозы УФ-облучения (75,5 * 1510 Дж/м2) процессы ПФОЛ на мембранах эритроцитов индуцируют изменение их ВПМС, видоизменяя общую картину антигенных детерминант и экспрессию рецепторов поверхности клеток.

ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ АУФОК-ТЕРАПИИ НА ОТДЕЛЬНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КРОВИ БОЛЬНЫХ С БРОНХО-ЛЕГОЧНОЙ ОБСТРУКЦИЕЙ И ЯЗВОЙ ЖЕЛУДКА

Нами исследована динамика изменений изучаемых показателей крови у больных при прохождении ими сеансов АУФОК-терапии.

Показано, что АУФОК-терапия больных бронхиальной астмой вызывает активацию каскада реакций комплемента по классическому и альтернативному путям при исходно низком уровне его активности в сыворотке, что обусловлено активацией отдельных факторов (рис.10), а также повышение иммуносорбционных (по отношению к поликлональным и груп-поспецифическим Ат) свойств эритроцитарных мембран.

Терапевтическое действие фотогемотерапии, на больных язвой желудка проявляется в повышении не только активности комплемента и уровня иммуносорбции, но и инсулинсвязывающей способности их эритроцитов (рис.11). Отмечено, что степень возрастания показателей тем Еыше, чем ниже их исходный уровень.

На примере этих двух групп больных показано коррегирующее дейс-

п

-+- -*- С1 -О- С2 -к- СЗ

-О- С4 -¿Г С5 — Собщ.

Рис. 10. Динамика изменений функциональной активности системы комплемента и ее отдельных компонентов в ходе сеансов АУФОК больным бронхиальной астмой с низким уровнем Собщ. п = 1одгХ - средний уровень активности факторов комплемента в условных единицах

* - после сеанса АУФОК, отсутствие * - до сеанса АУФОК

0,08

0,06 1 <

0,04 0,02 0 ¿4 < ! Щ — 1_

1 2 3 4 сеансы АУФОК

Рис. 11. Вклад рецепции инсулина в изменение оптической плотности ИФА-системы в ходе АУФОК-терапии больным язвой желудка

дб49г - разность между Ь,Э2 ИФА-систем без инсулина и с инсулином; Г П - до сеанса АУФОК; г - после сеанса.

твие АУФСК-терапии на систему комплемента и уровень экспрессии антигенных детерминант и рецепторов на поверхности эритроцитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Для исследования механизма действия УФ-излучения на модельную систему гемолитической активности комплемента, включающую в себя бараньи эритроциты, сенсибилизированные кроличьими антителами против них, и сыворотку крови доноров (источник белков комплемента) и выяснения роли фотомодификаций отдельных компонентов (мембран эритроцитов и сыворотки крови), прямого и опосредованного через радикальные продукты действия УФ-света в дозах 75,5 * 755 Дж/м2 в общем эффекте фотоальтерации гемолитической системы была предложена следующая схема постановки экспериментов:

Изучение фотомодификации всей системы ЕА+С: ЕА + С - (ЕА С)* ЕА + С + 1п - (ЕА С + Гп)*

Изучение фотомодификации С: ЕА + С - ЕА + С ЕА + (С + 1п) - ЕА + (С + 1пГ

Жирный шрифт - контрольный растзоо; ноомальнкй шрифт - опытный раствор: *- УФ-облученнкй компонент; ЕА- сенсибилизированные кроличьими антителами бараньи эритроциты: С- сыворотка крови - источник комплемента; 1п- антиоксидант ионол (5-Ю"7; 5-Ю"6; 1С 5 моль/л).

Добавление в изучаемую систему и ее компоненты антиоксидакта ионола позволило определить вклад опосредованного через радикальные продукты действия УФ-света на ее белки.

С помощью ТБК-теста на малоновый диальдегид исследовано влияние процессов пероксидного фотоокисления липидов (ПФОЛ), протекающих на мембранах эритроцитов и в сыворотке крови, на проявление функциональной активности УФ-облученнсй системой комплемента.

Выявленный нами эффект фотоинактивации комплемента при действии УФ-света в дозах 75, 5 + 755 Дж/м2 на гемолитическую систему в целом обусловлен суммарным вкладом преимущественно процессов УФ-инактива-ции белков сывороточного комплемента и в меньшей степени процессов фотомодификации мембран бараньих эритроцитов. При этом вклад радикальных процессов (преимущественно ПФОЛ) в углубляющуюся с ростом дозы УФ-облучения фотоинактивацию системы увеличивается.

Методом гемолитического титрования с использованием специальных реагентов исследовано влияние УФ-света (75,5 * 3020 Дж/м2) на актив-

Изучение фотомодификации ЕА:

ЕА + С - ЕА' + С (ЕА + 1п) + С - (ЕА + 1п)* + С

ность системы комплемента сыворотки доноров и составляющих ее факторов классического (С1а, С1-С5) и альтернативного (В и Б) путей активации. Для выяснения роли фотомодификаций отдельных факторов комплемента в общем эффекте УФ-изменения его гемолитической активности эксперименты проводили по следующей схеме:

Соб14 (САоб1Ц )- общая гемолитическая активность комплемента в сыворотке;'^ - реагент для определения активности соответствующего фактора; * - УФ-облучение в различных дозах

Показано, что ответные реакции комплемента на воздействие УФс-вета определяются исходным уровнем его функциональной активности в скЕоротке, структурно-функциональными фотомодификациями отдельных факторов комплемента С1-С5, В и В), а также состоянием функци-

онирования ингибигорных протеиназ.

Методами ИК- и УФ-спектроскопии, а также кислотно-основного титрования выявлены индуцированные УФ-светом структурные превращения белков системы комплемента на примере С^. Установлено, что УФ-облу-чение в дозах 151 и 2265 Дж/м2 вызывает разворачивание молекулы С^, не затрагивающее соотношение типов II структуры, но сопровождающееся экспонированием на поверхность белковой молекулы остатков ароматических аминокислот (тирозина, тршщтш^^шшзпаншяг. а также аминокислот, содержащих ионогенные группы (глутаминовой и аспараги-новой кислот, лизина, оксилизина, цистеина). С повышением дозы воздействующего УФ-света процесс разворачивания молекулы С^ усиливается. '

Анализ экспериментальных данных позволил нам предложить схему фотопроцессов, приводящих к структурным перестройкам и изменению функциональных свойсте молекул С1а (рис.12).

Исходное структурное состояние молекулы С1д

поглощение энергии УФ-света преимущественно остатками ароматических аминокислот и -Б-Б-связями цистина

структурные изменения, не затрагивающие соотношение типов II структуры: разворачивание белковой молекулы за счет ослабления и разоыва слабых внутримолекулярных связей

при дозе УФО 151 Дж/м2

при дозе УФО "265 Дж/м2

увеличение числа остатков ароматических аминокислот на поверхности белка, возрастание числа кислых и основных ионогенных гр^пп

/

на 37 %

на 57 %

возпастание стерическо-конформа-ционного соответствия активных центров С1д к определенным доменам и Гв'С

!

С1ч

Фотоактивация

увеличение общей гемолитической активности системы комплемента по классическому пути активации

дезорганизация активных центроз С^, нарушение взаимодействия с иммуно глсбуликами

Фотоинактивация С1а I

1

уменьшение общей гемолитической активности системы комплемента по классическому пути активации

Рис. 12. Схема процессов фотомодификации белка С1д

Характер влияния УФ-облучения (75,5 * 1510 Дж/м2) на структуру и некоторые свойства (сорбционные, иммуносорбционные, гормонсвязыва-вщие) мембран, эритроцитов был выявлен в разработанных нами тестах конкурентного и неконкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), а также методами количественной сорбции альцианового синего гликокаликсом эритроцитарных клеток и определения агглютинаци-онной активности группоспецифических (А, В) и резус-факторных (Й1Ш)) антигенов.'Установлено, что усиливающиеся с ростом дозы УФ-облучения процессы ПФОЛ вызывают изменения во внешнем примембран-

ном слое (гликокаликсе) эритроцитарных клеток, нарушая общую картину локализации и набора антигенных детерминант на их поверхности. Следствием этого является изменение 'физической сорбции клеток, а также функционирования на их поверхности систем иммунологической и гормональной рецепции.

При выявлении механизма влияния УФ-света на отдельные составляющие (систему комплемента и мембраны эритроцитов) крови больных бронхиальной астмой и язвой желудка исследовали динамику изменений изучаемых показателей в ходе АУФОК-терапии. Показан эффект корреги-рующего действия УФ-облучения в "терапевтических" дозах на систему гуморального иммунитета и уровень экспрессии антигенных детерминант и рецепторов на поверхности мембран эритроцитов.

ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что УФ-свет (240 - 390 нм) в диапазоне доз 75,5 + 755 Дж/м2 оказывает инактивирующее действие на модельную систему гемолитической активности комплемента.

2. Фотоинактивация гемолитической системы обусловлена суммарным вкладом фотопроцессов, протекающих на мембранах сенсибилизированных кроличьими антителами бараньих эритроцитов и в сыворотке кроЕи при определяющей роли УФ-инактивации белков сывороточного комплемента.

3. Антиоксидант ионол (5-10~7 моль/л) проявляет защитный эффект по отношению к УФ-облученным гемолитической системе и мембранам сенсибилизированных эритроцитов, усиливающийся с ростом дозы УФ-света (75,5 + 755 Дж/м2). Защитное действие ионола (5-Ю-6 моль/л) по отношению к сыворотке крови с увеличением дозы ослабляется.

4. С возрастанием дозы и времени последействия (до трех суток) УФ-облучения в гемолитической системе и примембранном пространстве ^ритрп1тиз^я-лшйЫ111ярдся_кон11ентрятщя мялонопогп диалъдйгила. что является показателем возрастающей интенсивности процессов пероксидного окисления липидов.

5. Вклад в фотоинактизацию гемолитической системы косвенного действия УФ-света (75,5 - 755 Дж/м2) на белки комплемента увеличивается с ростом дозы УФ-облучения (до 60% при максимальной дозе). Основным источником радикальных продуктов являются процессы пероксидного фотоокисления липидов, протекающие при малых дозах в основном в сыворотке, а при больших - на эритроцитарных мембранах.

6. Ответные реакции комплемента на воздействие УФ-ррдиации определяются исходным уровнем его гемолитической активности в сыворотке,

структурно-функциональными фотомодификациями отдельных факторов и состоянием функционирования ингибиторных протеиназ; малые дозы УФ-света оказывают регуляторное действие на процесс активации комплемента по классическому и альтернативному путям.

7. Экспонирование на поверхность белка С1ч, УФ-облученного в дозах 151 и 2265 Дж/мг, хромофоров ИК- и УФ-света, а также дополнительных ионогенных групп является результатом разворачивания белковой молекулы, не затрагивающего соотношения типов II структуры.

8. Фотомодификация антигенных детерминант и рецепторов поверхности бараньих эритроцитов приводит к дозозависимому увеличению сорбционных (по отношению к полистироловому носителю иммунофермент-ной системы и красителю альциановому синему) и инсулинсвязывающих, а также снижению иммуносорбционных (по отношению к специфическим антителам) свойств эритроцитарных мембран.

9. Структурные УФ-модификации зритроштарных мембран человека сопровождаются повышением (при 75,5 Дж/м2) их иммуносорбционных и гормонсвязывающих свойств,ослабляющихся с увеличением дозы УФ-облу-чения (до 755 Дж/мг). Уровень экспрессии группоспецифическкх (А, В) и резус-факторных (Ш1(Б)) рецепторов при этом возрастает.

10. Лечебный эффект метода АУФОК по отношению к' больным бронхиальной астмой и язвой желудка проявляется в регулировании уровня комплементарной активности их сыворотки, повышении иммуносорбционных, а у больных язвой желудка и инсулинсвязывающих свойств эритроцитарных клеток.

11. АУФОК-терапия оказывает коррегирующее действие на систему гуморального иммунитета и уровень экспрессии антигенных детерминант и рецепторов на поверхности эритроцитарных мембран крови больных. Степень возрастания показателей крови тем выше, чем ниже их исходный -(до лечения) уровень.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аргюхов В.Г., Гусинская В.В., Зарубаева Г.И. Роль фотомодификации некоторых компонентов крови в изменении функциональной ак-_ тивности системы комплемента сыворотки доноров //Иммунология.-1990,- Кб,- С.9-12.

2. Артюхов В.Г., Башарина О.В., Гусинская В.В., Наквасина М.А. Применение спектральных методов для выявления структурно-функциональных нарушений белковых систем //VII Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров: Тез. докладов Всесоюзн. конф.- Харьков,

»

1991.- С.10-11.

3. Гусинская В.В., Артюхов В.Г., Белич М.В.. Зарубаева г.И. Уф-модификация отдельных компонентов системы комплемента крови человека //Экспериментально-клиническое использование оптического излучения в медицине.- Саранок, МГУ, 1991.- С.53-57.

4. Артюхов В.Г., Гусинская В.В., Белич М.В. О соотношении вкладов прямого и косвенного действия УФ-радиации в изменение функциональных свойств системы комплемента //Радиобиология,- 1993,- Т.33, ВЫП. 3. - С. 453-458.

5. Башарина 0. В.., Наквасина М. А., Гусинская В. В., Артюхов В. Г. Исследование спектральным методом взаимодействия белков крови с биомембранами //Спектроскопия молекул и кристаллов: Тез. докладов XI Украинской школы-семинара,- Харьков, 1993,- С.188.

6. Артюхов В.Г., Башарина О.В., Вашанов Г.А., Гусинская В.В., Наквасина М. А. Физико-химические основы световой и термической адаптации белковых (ферментных) систем как механизм поддержания устойчивости организмов к экологическим факторам //Состояние и проблемы экосистем Усманского бора.- Воронеж, 1994.- Вып.4.- С.5-13.

7. Гусинская В.В., Воробьева С.А. Структурно-функциональное состояние отдельных факторов системы комплемента УФ-облучекной сыворотки крови человека //Успехи физиол. наук,- 1994.- Т.25, N1.-

С.117-118.

8. Гусинская В.В., Артюхов В.Г., Воробьева С.А. Функциональная активность отдельных факторов системы комплемента УФ-модифицирсван-ной сыворотки крови человека //Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов: Материалы Международного симпозиума.-Воронеж.. ВГУ, 1995,- С. 38-44.

Заказ 398 от 23.11.95 г. Тир. 100 экз. Формат 60 X 90 I/I6. Объем I п.л. Офоегная лаборатория В1У.