Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ структуры генов изолятов вируса африканской чумы свиней, выделенных на территории Российской Федерации

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Анализ структуры генов изолятов вируса африканской чумы свиней, выделенных на территории Российской Федерации"

На правах рукописи

005555178

ВАРЕНЦОВА Алиса Алексеевна

АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ГЕНОВ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

03.02.02 «Вирусология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук 1 3 НОЯ 2014

Владимир-2014

005555178

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии) и федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук Власова Наталья Никифоровна

Верховский Олег Анатольевич -доктор биологических наук, профессор AHO «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных», президент

Ярыгина Елена Игоревна -

доктор биологических наук, старший научный

сотрудник

ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», профессор кафедры радиобиологии и вирусологии им. академиков А.Д. Белова и В.Н. Сюрина

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии

Защита состоится 9 декабря 2014 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир, мкр. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте vvww.arriah.ru ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир).

Автореферат разослан «5» ноября 2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наукТатьяна Валентиновна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы исследования. Африканская чума свиней (АЧС) -вирусная болезнь домашних и диких свиней, характеризующаяся высокой контагиозностью и летальностью, сверхострой, острой, подострой до хронической и инаппарантной формами течения [1]. Вирус обладает высокой степенью патогенности (смертность приближается к 100%) и его распространение наносит огромные экономические потери, складывающиеся из затрат на проведение ветеринарно-санитарных и карантинных мероприятий, убоя всего поголовья на территории очага болезни и ограничений в международной торговле [8]. Вирус АЧС передается при прямом контакте больных и здоровых животных, клещами и механически.

Изменчивость вируса АЧС обуславливает наличие более 500 изолятов и штаммов, различающихся по своим биологическим свойствам. Поэтому вопрос группирования и классификации изолятов, в частности, генотипирования и сероиммунотиповой идентификации изолятов вируса, выделенных в очагах болезни, является главенствующим. На необходимость изучения и паспортизации полевых изолятов вируса АЧС неоднократно указывалось на совещаниях экспертов ФАО/ЕЕС и МЭБ по АЧС [7].

Детальный анализ структуры и функций отдельных генов позволяет выработать критерии, по которым будет проводиться группирование изолятов и штаммов. Исследования структуры генов, кодирующих поверхностные белки вируса АЧС, вызваны обоснованным предположением об изменении патогенности вируса, циркулирующего на территории РФ.

Особый интерес представляет изучение изменений поверхностных белков вируса АЧС, поскольку они обеспечивают процесс прикрепления вирионов к чувствительным клеткам и его интернализации. Белки, изменения в которых приводят к снижению репродукции вируса АЧС, могут быть отнесены к трем группам: белки прикрепления и интернализации, белки, участвующие в морфогенезе вируса АЧС, и вирусспецифические ферменты [13]. Выявление различий в белках вышеуказанных групп позволит установить связь изменений вирулентности, происходящих в процессе репродукции вируса в различных чувствительных системах или у природных изолятов, с определенными изменениями фенотипа.

Для детального изучения структурных и функциональных особенностей вирусспецифических белков методами генной инженерии требуется создание клонотеки генов, которые могут быть использованы не только в качестве источника для получения нужного трансгена, но и как матрица для экспрессии рекомбинантного белка. Однажды созданная библиотека генов может храниться и использоваться неограниченно долго.

Следовательно, работа по созданию клонотеки генов вируса АЧС и изучению их структурно-функциональных особенностей является актуальной.

1.2 Степень разработанности проблемы. При изучении основ патогенности и иммуногенности таких сложно организованных вирусов, как вирус АЧС, необходимо создание и использование модельных вирусов, адаптированных к репродукции в стандартных культуральных системах. Для изучения структуры и уникальных свойств возбудителя АЧС был получен изолят вируса АЧС ВА71V, адаптированный к репродукции в перевиваемой культуре клеток Vero, который на настоящий момент является референтным штаммом для валидации диагностических тест-систем [14].

В исследованиях АЧС создание клонотек генов ее возбудителя позволило изучить роль клеточного иммунитета в устойчивости чувствительных животных к АЧС [22], определить структуру и функции генов различных изолятов и штаммов вируса АЧС. Кроме того, создание клонотек иммунологически значимых генов является эффективным подходом в разработке современных диагностических средств и ДНК-вакцин. В 2011 г. L.K. Dixon с соавторами разработали стратегию для получения ДНК-вакцины против АЧС на основе использования клонотеки генов возбудителя [12].

1.3 Цели и задачи исследования. Основной целью данной работы являлось изучение структурных особенностей генов, кодирующих иммунологически значимые белки вируса АЧС, выделенного на территории РФ, и конструирование библиотеки данных генов. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

а) на основе анализа отечественной и зарубежной литературы изучить структурные особенности генов B646L (vp72), CP204L (vp30), KP177R (vp22), 061R (vpl2), EP402R (CD2v), CP530R (pp62), CP2475L (pp220) и E183L (vp54) вируса АЧС;

б) определить нуклеотидные последовательности генов B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L вируса АЧС изолятов, выделенных на территории РФ в 2007-2013 гг., и провести сравнительный анализ их структуры;

в) сконструировать библиотеку генов вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12;

г) изучить культурально-биологические свойства вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12;

д) провести адаптацию изолята Krasnodar 06/12 к перевиваемым культурам клеток и изучить культурально-биологические свойства адаптированных вариантов.

1.4 Научная новизна результатов исследований. Впервые в РФ создана клонотека генов CP204L, KP177R, 061R, EP402R, B646L, E183L и фрагментов генов CP530R, CP2475L вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12, клонированных в составе

векторной молекулы pJET 1.2/blunt. Впервые опубликованы в базе данных GenBank нуклеотидные последовательности генов B646L (KJ195685), CP204L (KJ195684), KP177R (KJ380912), 061R с прилегающим к нему интергенным регионом (KJ380913), EP402R (KJ195682), E183L (KJ380910) и фрагментов генов CP530R (KJ380911), CP2475L (KJ195683) вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12, а также нуклеотидные последовательности гена 061R с прилегающим к нему интергенным регионом изолятов Volgograd 2010 (JQ771680.1), Stavropol 2008 (JQ771679.1), Orenburg 2009 (JQ771678.1), Elbrus 2008 (JQ771677.1), Armenia 2007 (JQ771676.1) и гена K177R изолятов Stavropol 2008 (JQ771692.1), Rostov 2009 (JQ771691.1), Orenburg 2009 (JQ771690.1), Krasnodar 2008 (JQ771689.1), Elbrus 2008 (JQ771688.1), Armenia 2007 (JQ771687.1).

Получен аттенуированный вариант вирулентного изолята Krasnodar 06/12 вируса АЧС - штамм Krasnodar 2/13, с измененными биологическими свойствами (характер гемадсорбции, патогенность для свиней), прошедший 51 последовательный пассаж на перевиваемых культурах клеток.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы. Анализ структуры генов вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12, подобранных для создания клонотеки генов, позволил установить 100%-ю гомологию нуклеотидных последовательностей полноразмерных генов 061R, KP177R, CP204L, E183L и B646L, а также фрагментов генов CP530R, CP2475L и ~98,2%-к> гомологию нуклеотидных последовательностей гена EP402R изолятов Krasnodar 06/12 и Грузия 2007/1.

Плазмидные конструкции, входящие в состав клонотеки генов вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12, были использованы для определения структуры отдельных генов и являются основой для создания альтернативных источников генетического материала, положительного контроля в ПЦР-диагностике, а также получения рекомбинантных вирусов и ДНК-вакцин.

Получен клон pET32b(+)/ASFVp22 в клетках Е. coli штамма BL21(DE3) pLysS, который является альтернативным продуцентом антигена вируса АЧС.

Полученный аттенуированный вариант вируса АЧС штамм Krasnodar 2/13, адаптированный к репродукции в перевиваемых культурах клеток, используется в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для получения специфического антигена и постановки непрямой реакции ТФ ИФА и РНИФ с целью выявления антител к вирусу АЧС.

Разработаны «Методические указания по выявлению вируса африканской чумы свиней в пробах крови и патологических материалов, отобранных от павших или вынужденно убитых свиней, в реакции прямой иммунофлюоресценции (РПИФ)», «Методические указания по изоляции вируса африканской чумы свиней в культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней», «Методические рекомендации по

выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток лейкоцитов свиней» и «Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток костного мозга свиней», утвержденные в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 18 ноября 2013 г., 20 декабря 2013 г., 24 июня 2014 г. и 24 июня 2014 г., соответственно.

1.6 Методология и методы исследования. Методология проведенных исследований включает стандартные процедуры с использованием различных материалов и естественно восприимчивых животных. В работе использовали молекулярно-биологические (ПЦР, секвенирование, анализ нуклеотидных последовательностей, создание рекомбинантных конструкций), вирусологические (вирусовыделение, культивирование вируса, постановка биопроб) и серологические (ТФ ИФА, РПИФ, РНИФ) методы исследований.

1.7 Положения, выносимые на защиту:

а) нуклеотидные последовательности генов B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L вируса АЧС и их сравнительный анализ;

б) филогенетический анализ генов, кодирующих CD2v и vpl2 с интергенным регионом, позволяет распределить российские изоляты на субгруппы, соответствующие их ближайшему родству;

в) клонотека рекомбинантных клонов Е. coli, несущих гены B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L вируса АЧС;

г) адаптированный вариант вируса штамма Krasnodar 2/13 для получения специфического культурального антигена вируса АЧС.

1.8 Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ГНУ ВНИИВВиМ н.с. А.С. Казаковой, вед.н.с. О.В. Капустиной и ФГБУ «ВНИИЗЖ»: к.в.н. А.С. Першину, к.б.н. Н.Г. Зинякову, вед. биологу И.В. Шевченко за помощь в проведении отдельных этапов работы; д.б.н. Н.С. Мудрак, д.б.н., проф. С.С. Рыбакову, д.б.н., проф. К.Н. Груздеву за консультативную помощь; д.б.н., проф. [Дрыгину В.В.[ за содействие в выполнении работы. Автор выражает признательность зав. реф. лаб. по АЧС, к.в.н. А.С. Иголкину.

1.9 Степень достоверности и апробация результатов. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2010-2012 гг.) и на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2013-1014 гг.), на международной научно-практической конференции (УГСХА, Ульяновск, 2011 г.), на научно-практической конферецнии (Новый Свет, Украина, 2012 г.), на конференции молодых ученых (ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир, 2012 г.), на 7-м международном конгрессе по вакцинам (г.

Ситжес, Испания, 2013 г.), на семинаре Северных и Балтийских стран (г. Гданьск, Польша, 2013 г.), на региональной молодёжной научной конференции (Владимирский филиал ФГОБУ ВПО Финансового университета при Правительстве РФ, г. Владимир, 2014 г.). Достоверность результатов исследований подтверждена комиссионными испытаниями.

1.10 Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано девять научных работ, в том числе три статьи в зарубежных журналах и три статьи в изданиях по Перечню ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.

1.11 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения; иллюстрирована 12 таблицами и 20 рисунками. Список использованной литературы включает 134 источника, из них 96 иностранных. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы

Вирусы. В работе был использован вирус африканской чумы свиней изолятов Armenia 2007, Krasnodar 2008, Elbrus 2008, Stavropol 2008, Orenburg 2009, Rostov 2009, Volgograd 2010, Kashino 04/13 и Krasnodar 06/12, выделенных в 2007-2013 гг.

Культуры клеток. Использовали первичную культуру клеток альвеолярных макрофагов свиньи (AMC), костного мозга свиньи (ККМС), лейкоцитов свиньи (J1C) и перевиваемые культуры клеток: почки свиньи (PK-15), почки африканской зеленой мартышки (CV-1, BGM, MARC 145) и почки поросенка (ППК), полученные из отдела культивирования клеток (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Питательные среды, сыворотки, растворы и реактивы: среда ДМЕМ с 10 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Sigma, США); реактивы для постановки ПЦР в соответствии с паспортом к Taq-ДНК-полимеразе (а-фермент, Россия) с геноспецифическими праймерами; среда SOB/SOC, SOB-arap; ампициллин (50 мг/мл); растворы IPTG и X-Gal; 1% раствор теотропина («А 24»); 1,1,2-трифтортрихлорэтан (фреон-113); фосфатный буферный раствор; забуференный физиологический раствор; субстратный раствор с АБТС; конъюгат протеина А, меченный пероксидазой хрена; 9М мочевина; 50мМ раствор декстран сульфата; ФИТЦ-конъюгат моноклональных антител к vp72 вируса АЧС (CISA-INIA, Испания); Taq-ДНК-полимераза, Pfu ДНК-полимераза, эндонуклеазы рестрикции; референтные

специфические к вирусу АЧС сыворотки (CISA-INIA, Испания), полевая, шесть экспериментальных и гетерологичные сыворотки крови свиней к вирусам КЧС, РРСС и т.д.

Наборы реактивов: «ДНК-сорб-В вариант 50» ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора; GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific); GeneJET Plasmid Maxiprep Kit (Thermo Scientific).

Клетки E. colt, плазмиды и праймеры: штаммы DH5a и BL21(DE3) pLysS (Promega), плазмидные вектора pJET1.2/blunt (Thermo Scientific) и pET32b(+) (Novagen), специфические олигонуклеотиды.

Животные. В опытах использовали клинически здоровых свиней крупной белой породы живой массой 20-25кг, шесть голов.

Культивирование вируса АЧС, вирусовыделение, постановка реакции гемадсорбции. Проводили в соответствии с методическими указаниями, разработанными в ФГБУ «ВНИИЗЖ» [5].

Приготовление культурального антигена. Проводили методом, описанным Першиным A.C., с использованием культуры клеток CV-1, штамма Krasnodar 2/13 вируса АЧС [6].

Электрофорез ДНК в агарозном геле и очистка ПЦР-продуктов.

Электрофорез проводили согласно методу, описанному J. Sambrook с соавторами (2006 г.) [18]. Очистку ПЦР-продуктов от агарозного геля проводили с помощью набора GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific), согласно инструкции производителя.

Определение нуклеотидных последовательностей. Определяли секвенированием по методу, описанному F. Sanger с соавторами (1977 г.) [20].

Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. Web-ресурсы: базы данных NCBI, EMBL. Компьютерные программы Redasoft Visual Cloning 3.0, BioEdit 6.0.7. и MEGA 5.05 [17, 9, 16].

Клонирование генов. Осуществляли согласно методу, описанному Д. Гловер (1989 г.) [3] и J. Sambrook с соавторами (1989 г.) [18].

Постановка реакции прямой и непрямой иммунофлуоресценции.

Проводили согласно методикам, описанным Р.Н. Bool с соавторами (1970 г.) [10] и С. Sanchez-Botija (1970 г.) [19].

Постановка твердофазного иммуноферментного анализа. Проводили согласно методике, описанной F.M. Hamdy и А.Н. Dardiri (1979) [15].

Статистическая обработка результатов исследований. Статистическая обработка включала расчеты средних арифметических значений, коэффициентов

вариации, достоверности статистической разницы между средними величинами, определенными по разностному методу Стьюдента-Фишера, расчет стандартных отклонений результатов определения титров вируса, выраженных в lg, обработку результатов с помощью пакета прикладных программ STATGRAPHICS® Centurion XV, версия 15.1.02 [21].

2.2 Результаты собственных исследований

Создание клонотеки генов вируса АЧС. За отправную точку анализа были приняты восемь иммунодоминантных генов вируса АЧС: B646L (vp72), CP204L (vp30), KP177R (vp22), 061R (vpl2), EP402R (vpCD2v), CP530R (pp62), CP2475L (pp220) и E183L (vp54).

Поскольку в ранее проведенных исследованиях были оптимизированы условия синтеза копий генов B646L, CP204L, E183L [4], то подбор режимов амплификации проводили только для синтеза генов 061R, KP177R, EP402R и фрагментов генов CP2475L и CP530R.

Оптимизация условий синтеза проходила по подбору температурного режима отжига праймеров, концентрации ионов магния и количества циклов амплификации. Концентрация MgCl2 в реакционной смеси варьировала от 1 до 4 мМ, что позволило повысить эффективность связывания праймеров с матрицей ДНК вируса АЧС без потери специфичности. Для амплификации генов B646L, EP402R, E183L 2,5 мМ MgCb использовали 3 мкл, для генов KP177R, CP530R, CP2475L - 2 мкл, для гена CP204L - 3,5 мкл, для гена Об 1R - 4 мкл.

Температуру отжига праймеров подбирали экспериментально постановкой реакции с градиентом температур от 42 до 62°С с шагом ГС на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технологии, Россия). Подобраны следующие режимы (Таблица 1):

Таблица 1 - Режим амплификации полноразмерной копии генов 061R, KP177R, EP402R и фрагментов генов CP2475L, CP530R

Параметры Кол-во циклов Температурный режим

EP402R 061R KP177R CP2475L CP530R

Предварител ьный цикл 1 98°С - 2 мин 98°С - 2 мин 98°С —2 мин 98°С—2 мин 98°С-2 мин

Денатурация 95"С — 30 95"С — 30 95"С - 30 95 "С - 30 95"С — 30

Отжиг 35 сек 47°С — 30 сек 52°С - 30 сек 52°С - 30 сек 50°С - 30 сек 55°С-30

праймеров сек 72°С - 120 сек 72°С - 60 сек 72°С — 60 72°С- 120 сек 72°С— 120

Элонгация сек сек сек сек сек

Завершающи й цикл 1 72°С - 5 мин 72°С - 5 мин 72°С-5 мин 72°С - 5 мин 72"С — 5 мин

Клонирование проводили в плазмидном векторе pJETl ,2/Blunt.

Плазмидные ДНК полученных клонов анализировали в ПЦР на наличие встройки, в результате чего отобраны клоны, содержащие копии указанных генов вируса АЧС. Полученные на матрицах рекомбинантных плазмид ПЦР-продукты секвенированы, и определена нуклеотидная последовательность восьми клонированных генов.

В результате экспериментов была сконструирована клонотека из 24 клонов для 8 генов вируса АЧС, рекомбинантные плазмиды: рХЕТ 1 С02уКга8пос1аг06/12 содержит встройку размером 1134 п.о.; р.1ЕТ1р12Кга8Пос1аг06/12 - 421 п.о.; рШТ 1 р22Кгазпоёаг06/12 - 754 п.о., pJETlp30Krasnodar06/12 - 680 п.о.; р ШТ1 р54Кгазпоёаг06/12 - 717 п.о., р.ГЕТ1рр62Кга8поёаг06/12 - 1645 п.о.; р.ШТ1р72Кга8шгёаг06/12 - 1981 п.о., р./ЕТ1рр220Кга8гкх1аг06/12 - 1042 п.о.

Использование клонотеки генов для создания продуцентов. Для использования клонов как источников рекомбинантных антигенов провели переклонирование копии гена К17711 в экспрессирующую плазмиду рЕТ32Ь(+). После анализа плазмид полученных клонов отобраны 2 клона со встройкой гена К177Я: рЕГП2Ь(+)/А8РУр22. Специфичность встройки подтверждена ПЦР и рестрикционным анализом (Рисунок 1).

Примечания: А - электрофореграмма результатов ПЦР на наличие р22 и р12 (для сравнения) с рекомбинантными плазмидами в качестве матрицы: M - ДНК фага Lambda/PstI; 1 - ПЦР-продукт р12 (матрица pJETlpl2Krasnodar06/12); 2 - ПЦР продукт р22 (матрица pET32b(+)/ASFVp22); Б - электрофореграмма разделения продуктов рестрикции в агарозном геле; M - маркер; 1- pET32b(+)/ASFVp22 рестрицированная по сайтам рестрикции BamHI/HindIIl; 2 - нерестрицированная рекомбинантная плазмида pET32b(+)/ASFVp22.

Рисунок 1 - Электрофореграммы проверки рекомбинантной плазмиды pET32b(+)/ASFVp22 на наличие встройки нуклеотидной последовательности гена

K177R вируса АЧС

После накопления антигена определили его активность и специфичность в ТФ ИФА. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Выявление антител к вирусу АЧС методом непрямого ТФ ИФА с использованием рекомбинантного и референтного антигена

Разведение Сыворотки Рекомбинантный антиген р22 (ОП450) Референтный антиген**

Референтная сыворотка* Экспериментальная сыворотка 1 Экспериментальная сыворотка 2 Экспериментальная сыворотка 3 Экспериментальная сыворотка 4 Экспериментальная сыворотка 5 Экспериментальная сыворотка 6 Контрольная сыворотка Референтная сыворотка* Контрольная сыворотка ***

1 50 0.942 0.674 0.512 0392 0.544 0.456 0.616 0.198 4.785 0.298

1 100 0.789 0.411 0.318 0.267 0.385 0.303 0.480 0.102 3.985 0.216

1 200 0.516 0.312 0.167 0.098 0.152 0.239 0.276 0.097 1.982 0.189

1 400 0.389 0.202 0.066 0.056 0.087 0.119 0.098 0.076 1.095 0.125

1 800 0.301 0.145 0.062 0.056 0.052 0.058 0.056 0.050 0.942 0.156

1 1600 0.240 0.123 0.054 0.057 0.055 0.059 0.053 0.056 0.520 0.134

1 3200 0.202 0.098 0.067 0.056 0.058 0.054 0.059 0.054 0.240 0.164

Примечания: * - положительная референтная сыворотка к вирусу АЧС; ** -референтный антиген №403 для выявления антител к вирусу АЧС (МЭБ); ***-контрольная отрицательная референтная сыворотка к вирусу АЧС (в таблице приведены средние значения оптических плотностей, п=4).

Проверка активности связывания рекомбинантного белка р22 показала, что полученный антиген специфически взаимодействует с антителами положительной референтной сыворотки и экспериментальными сыворотками крови свиней, инфицированных вирусом АЧС, и не взаимодействует с антителами гетерологичных и отрицательных контрольных сывороток. Положительным считали результат, где оптическая плотность пробы превышала более чем в 2,1 раза средний показатель оптической плотности контрольных образцов.

Изучение культурально-биологических свойств изолята Krasnodar 06/12. Для сравнительного анализа изменений генома необходимо было охарактеризовать культурально-биологические свойства изолята Krasnodar 06/12.

На первом пассаже в культуре клеток АМС появление гемадсорбции не наблюдали, на втором пассаже на 3-4 сутки наблюдали появление плотной гемадсорбции с эффективностью поражения монослоя 1-2 клетки с прикрепленными эритроцитами в поле зрения. Результаты вирусовыделения подтверждены в РПИФ и ПЦР при исследовании проб инфицированной культуры клеток.

Для изучения стабильности свойств выделенного изолята провели еще два последовательных пассажа в культуре AMC. Основными маркерными признаками при вирусвыделении являлись наличие и характер гемадсорбции, скорость репродукции и уровень накопления вируса в культуре клеток AMC. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты вирусовыделения и изучения репродукции изолята Krasnodar 06/12 вируса АЧС в культуре клеток АМС (п=3)

№ пассажа Время появления ЦПД (сутки) Характер гемадсорбции Количество эритроцитов на клетку Титры накопления (Ig ГАдК5(/си ) Скорость репродукции (сутки)

1 - - - - -

2 7 Плотная >50 4,1 ±0,63 8-9

3 5-6 Плотная >50 5,5±0,04 7

4 5-6 Плотная >50 6,Ö1±Ö,<» 7

5 5 Плотная >50 d,5±Ö,2l 6

Из приведенных в таблице 3 результатов видно, что на втором пассаже наблюдали формирование плотной гемадсорбции из более чем 50 прикрепившихся к инфицированной вирусом АЧС клетке эритроцитов, а уровень накопления вируса на 8-9 сутки после заражения достиг 4,1±0,63 lg ГАдЕ50/см3. К пятому пассажу характер гемадсорбции не изменился, а уровень накопления вируса на шестые сутки достигал 6,5±0,21 lg ГАдЕ50/см3.

Проверка биологических свойств показала, что по характерным клиническим признакам, уровню виремии, наступлению гипертермии и времени наступления гибели зараженных свиней изолят Krasnodar 06/12 не отличается от изученных изолятов вируса АЧС, выделенных ранее на территории РФ.

Адаптация вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12 к репродукции в перевиваемых культурах клеток. Адаптацию проводили на культуре клеток РК-15. Первые пять пассажей - при дозе заражения 0,1 ГАдЕ на клетку, с длительностью пассажа 14 суток. При последующих пассажах доза инокуляции составляла 0,01 ГАдЕ на клетку. На седьмом пассаже на седьмые сутки отмечали гроздеподобное округление клеток монослоя и дальнейшую их деструкцию. Титр вируса на уровне 10 пассажа составлял 5,87 ГАдЕ5(/см3.

Сравнительный анализ клинических признаков у свиней, зараженных исходным и адаптированным изолятами, не выявил значительных отличий.

Поскольку по данным литературы известно, что термочувствительные вирусы реагируют на понижение температуры культивирования снижением вирулентных свойств, для аттенуации вируса проводили его селекцию при пониженной температуре репродукции - 29-31°С в течение пяти последовательных пассажей в

культуре клеток РК-15. Отбирали только те пробы, в которых появление ЦПД наблюдалось на 5-6 сутки.

Для дальнейшей аттенуации вируса использовали культуру клеток СУ-1, в которой было проведено 25 последовательных пассажей. За время адаптации наблюдали изменения в характере гемадсорбции, скорости репродукции, времени появления ЦПД (Таблица 4).

Изучение уровня накопления вируса АЧС в РПИФ проводили с использованием ФИТЦ-конъюгата моноклональных антител к ур72 на панелях культуры клеток СУ-1, инфицированной адаптированным к репродукции в данной культуре клеток вариантом вируса АЧС. После фиксации клеток 75% ацетоном на 4-5 сутки и инкубации с конъюгатом в люминесцентном микроскопе наблюдали характерное специфическое окрашивание клеток, содержащих фабрики сборки вируса АЧС (Рисунок 3).

Таблица 4 - Результаты репродукции адаптированного варианта изолята Krasnodar 06/12 вируса АЧС в культуре клеток CV-1 (п=3)

№ пасс ажа Время появле ния ЦПД (сутки) Характер гемадсорбц ИИ Кол-во эритроц итов на клетку Титры накопления в AMC (Ig ГАдЕ5о/см ) Скорость репродук ИНН в AMC (сутки) Титры накопления в CV-1 (Is ГАдЕзд/см) Скорость репродук нин CV-1 (сутки)

1 В Плотная >50 4,05±0,53 8-9 3,11±0,37 -

5 7 Плотная >50 5,51 ±0,47 7 3,94±0,45 14

10 5-6 Полуплотна я 30-50 6,52±0,06 6 4,75±0,53 10

15 5-6 Полуплотна я 30-50 7,01 ±0,09 5-6 5,95±0,47 7-8

20 5 Рыхлая 10-30 7,01±0,1 5 6,01 ±0,52 6-7

25 4 Рыхлая 10-30 6,87±0,15 5 6,51 ±0,49 5-6

Из результатов, приведенных в таблице, 4 следует, что при культивировании вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12 в культуре клеток CV-1 сроки накопления вируса сократились с девяти до пяти суток, а титры увеличились с 3,11±0,37 до 6,51±0,49 lg ГАдЕ50/см3. Изменение гемадсорбирубщих свойств, произошедших в процессе адаптации вируса, представлены на рисунке 2.

В

Примечания: А - культура клеток АМС, инфицированная вирусом АЧС изолята Krasnodar 06/12, 10-го пассажа в CV-1; Б - культура клеток АМС, инфицированная вирусом АЧС изолята Krasnodar 06/12, 20-го пассажа в CV-1 (стрелкой указана гемадсорбция); В - интактная культура клеток АМС (при увеличении микроскопа х400).

Рисунок 2 - Изменение характера гемадсорбции в процессе адаптации варианта изолята Krasnodar 06/12 вируса АЧС и деструктивные изменения в культуре клеток CV-1, вызванные репродукцией адаптированного варианта вируса АЧС изолята

Krasnodar 06/12

Примечания: А - увеличение люминесцентного микроскопа хЮО, Б -увеличение люминесцентного микроскопа х200, В - увеличение люминесцентного микроскопа х400.

Рисунок 3 - Выявление антигена в препаратах культуры клеток CV-1, инфицированной адаптированным вариантом вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12

Для изучения биологических свойств адаптированного варианта вируса АЧС, прошедшего 26 пассажей в культуре клеток РК-15, а затем 25 последовательных пассажей в культуре клеток CV-1, вируссодержащий материал был инъецирован двум подсвинкам крупной белой породы живой массой 20-25 кг в дозе 1000 ГАдЕ. В ходе проведения опыта инъецированные свиньи оставались клинически здоровыми 30 суток (срок наблюдения).

Температурная реакция животных на введение адаптированного варианта вируса АЧС Krasnodar 06/12 26-го пассажа РК-15 оставалась в пределах физиологической нормы, в то время как было установлено наличие вируса в крови инфицированных животных на 7-12 сутки в РГАд, РПИФ и ПЦР. При патологоанатомическом вскрытии признаки, характерные для АЧС, отсутствовали.

Полученный адаптированный к репродукции в культуре клеток CV-1 вирус штамма Krasnodar 2/13 вызывал характерное ЦПД и его титр накопления достигал 6,5-7,0 lg ГАдЕ50/см3 на 5-6 сутки, что свидетельствовало о его пригодности в качестве источника для получения специфического антигена. С этой целью культуру клеток CV-1 на трех клинских матрасах инокулировали вируссодержащим материалом в дозе заражения 10"3 ТЦД50 на клетку. Проверку специфичности полученного антигена осуществляли постановкой непрямой реакции ТФ ИФА (Таблица 5).

Таблица 5 - Оценка специфичности полученного культурального антигена

(п=3)

Характеристика сыворотки Титры антител специфических сывороток при исследовании их с различными антигенами

Наименование титр в РЗГАд специфический культуральный антиген АЧС *** антиген

* SS 1:320 1:2000 1:1600

** SS - 1:40 1:20

SS1 1:24 1:800 1:80

S52 1:16 1:400 1:40

SS3 1:8 1:200 1:20

SS к вирусу РРСС, КЧС, болезни Ауески, Тешена - - -

NS - - -

Примечания: * - референтная сыворотка; ** - слабо-положительная

референтная сыворотка; *** - референтный антиген №403 вируса АЧС (МЭБ); ББ1— ЗЭЗ - положительные в вирусу АЧС экспериментальные сыворотки крови свиней с биопробы.

Проверка специфичности выявления антител к вирусу АЧС показала, что полученные образцы могут быть использованы в качестве специфического антигена для постановки непрямого ТФ ИФА с целью выявления антител к вирусу АЧС. Кроме того, установлено, что белки полученного антигена взаимодействовали только с антителами референс-сывороток к вирусу АЧС и не взаимодействовали с антителами

гетерологичных сывороток крови свиней, иммунных к вирусам КЧС, РРСС и т.д., что говорит его специфичности.

Анализ нуклеотидных последовательностей генов вируса АЧС. Проведенный анализ нуклеотидных последовательностей подтвердил, что клонированные копии генов соответствуют таковым целевых генов вируса АЧС или их функциональным участкам.

Выравнивание нуклеотидных последовательностей клонированных генов показало, что нуклеотидные последовательности полноразмерных генов 061R, KP177R, CP204L, E183L и B646L и фрагментов генов CP530R и CP2475L изолятов Krasnodar 06/12 и Грузия 2007/1 идентичны.

Для нуклеотидных последовательностей клонированного гена EP402R изолята Krasnodar 06/12 и аналогичного гена изолята Грузия 2007/1 была установлена -98,2%-я гомология: были найдены две нуклеотидные замены в положениях нуклеотидов 990 и 994: аденин на цитозин и аденин на тимидин, соответственно. Результаты анализа аминокислотной последовательности CD2v показали, что нуклеотидная замена в положении нуклеотида 990 не повлекла за собой существенных изменений, а замена нуклеотида в положении 994 привела к изменению аминокислоты и создала «стоп-кодон» (332-я аминокислота), в результате которого сократилась ОРС с 1081 до 996 нуклеотидов.

По данным D.A.G. Chapman, образование «стоп-кодонов» в последовательности данного гена является для него специфичным и может привести к снижению гемадсорбирующей способности вируса АЧС и, как следствие, вирулентности в целом [11].

Анализ профиля гидрофильности/гидрофобности показал, что образование «стоп-кодона» не затрагивает области, ответственные за адсорбщию эритроцитов к инфицированным клеткам. Филогенетический анализ гена EP402R российских, европейских и африканских изолятов методом «ближайших соседей» показал, что в отдельную группу вошли изоляты западно-европейского происхождения. Отдельно расположились африканские изоляты Pretorius kop/96/4 (Рг4) и Malawi Lil-20/l. Российские изоляты вошли в одну группу (Рисунок 5).

■li#m_BAriV CD2v

- at»Hi_NHff>6e CD2v

- 1*Ыв1«_ВапапсаОэ C02v

i»olat«_Ponalag>«_90 CD2v ¡•olet*_Mefr*^B6 CD2v ■•olM«_CtHmbra_B7 C02v ■»otM*_Almodov«>_9!№E 1 CD2v i»rt«»_Bw»n_97/l CD2V •t™m_ET6 CD2v i»ol«t«_CKJRT_ee/3 C02. !a_P>MoiiuBke|^9«M CD2v -■t(*m_M«lawi_Lri-20Jl CD2tf

IiMlM«_Gao4gia_2D07/1 CP3v iaolM#_Ki*BnD4lvr_06/12 CD2v >aotM»_K»ahmo_04/13 CD2v

Рисунок 5 - Дендрограмма, построенная на основании данных гомологии нуклеотидных последовательностей EP402R (CD2v) изолятов и штаммов вируса АЧС, выделенных на территории РФ, Западной Европы и Африки

По данным Angulo А. (1993-1992 гг.), наиболее вариабельным участком генома, изменяющимся при пассировании вируса, является интергенный регион, поэтому проанализировали вариабельность гена 061R и прилежащего интергенного региона у изолятов Volgograd 2010, Elbrus 2008, Stavropol 2008, Orenburg 2009, Krasnodar 06/12, Kashino 04/13 и Armenia 2007.

Выявлены две вариабельные области, располагающиеся от 195 до 248 и от 296 до 320 нуклеотида в нуклеотидной последовательности гена 061R и интергенного региона.

Для гена 061R российских изолятов и изолята Armenia 2007 были установлены изменения в области между 67 и 105 аминокислотами, но они не затрагивали гидрофобный трансмембранный домен. Структурные изменения не затронули и гидрофильную область: N-связывающий сайт гликозилирования (NCG последовательность). Цистеиновые основания, ответственные за димеризацию белка, располагались в vpl2 идентично у всех семи штаммов вируса АЧС, что позволяет сделать предположение, что функция белка не изменена. Наибольшая степень различий у изолятов, выделенных на территории РФ, имелась у Krasnodar 06/12 и Stavropol 2008. Поскольку анализ нуклеотидных последовательностей клонированных генов показал идентичность структуры полноразмерного гена 061R изолятов Krasnodar 06/12 и Georgia 2007/1, можно сделать вывод об их максимально близком родстве.

Однако результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена 061R российских, западно-европейских и африканских изолятов, а также Georgia 2007/1 и Armenia 2007 показали значительное разнообразие в данном гене с прилежащим к нему интергенным регионом.

Филогенетический анализ по гену 061R показал, что российские изоляты, а также изоляты Georgia 2007/1 и Armenia 2007 относятся к одной и той же группе, но все российские изоляты имеют между собой отличия от 7 до 15 нуклеотидов, причем данные отличия позволяют распределить изоляты на субгруппы, соответствующие их ближайшему родству (Рисунок 6).

iaoJM«_Kr»an<xJer_06/12 р12 i»o)»t*_K»mhioo О-t/П р12

- tsolat*_Elbfu«_2006 p12

-i*o!M*_Of*nburo_2009 P12

■-i»ol«t«_St»WTOpot_2008 p12

^-i»ol»t«_A/'W*™*_2007 p!2

.2010 p12 l*olat*_LIS57 p12 l»ot«*_BA7 IV pi 2 i*ol«l«_BA71 p12 i*ol«la_E*pane_70 p12 l«o*et*_OURT_6a/3 p12

- ilrain_TEH61 p12

_j- ■•olM»_KtR69 p12

I-«trwn_Kenya_1950 p12

•tf»n_SPE5J pt2

OOl

Рисунок 6 - Дендрограмма, построенная на основании данных гомологии нуклеотидных последовательностей 061R (р12) и интергенного региона штаммов вируса АЧС, выделенных на территории РФ, Африки, Западной Европы, а также

Грузии и Армении

Изоляты Stavropol 2008, Orenburg 2009 и Armenia 2007 составляют одну группу, Georgia 2007/1, Elbrus 01/08 и Krasnodar 06/12 входят во вторую группу. Перечисленные изоляты относятся к одной субгруппе, в отличие от изолята Volgograd 2010, который расположился отдельно. Возможно, его отличие от остальных исследуемых изолятов связано с тем, что выделенный от дикого кабана вирус изолята Volgograd 2010 циркулировал в популяции кабанов и прошел неограниченное количество пассажей, минуя репродукцию в домашних свиньях.

Таким образом, из восьми выбранных генов именно анализ гена 061R с интергенным регионом позволяет выявить родство изолятов вируса АЧС.

Сравнительный анализ молекулярно-биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ в 2007-2013 гг. Полученные данные и анализ литературы по структуре отдельных генов и биологических свойствах возбудителя АЧС позволили определить корреляцию признаков (Таблица 6). Из приведенных в таблице данных следует, что генотип (B646L) и серотиповая принадлежность (E183L) российских изолятов стабильны и не изменились с 2007 г., однако многие из них имеют разную пассажную историю (интергенный регион и ген 061R). Кроме того, наметилась тенденция к снижению вирулентности циркулирующего вируса (MGF 360) [2].

Таблица 6 - Молекулярно-биологические свойства российских изолятов

Изолят Armenia 2007 (свинья) Elbrus 2008 (кабан) Orenburg 2009 (свинья) Volgograd 2010 (кабан) Krasnodar 06/12 (свинья) Kashino 04/13 (кабан)

Длительность инкубационного периода(сутки) 1-3 1-2 1-3 1-3 5-6 5-7

Длительность болезни(сутки) 5-7 5-7 9-12 7-12 12-13 12-20

Выраженность клинических признаков ± - + ± + +

Серотип -E183L 8 8 8 8 8 8

Генотип -B464L II II II II II II

Гемадсорбция HP402R + + + + + +

Вирулентность - MGF-360 + + + + + ±

Родство Georgia 2007/1 -061RH интергенный регион 97,19% 98,44% 97,83% 99,68% 100% 100%

Поскольку генетический анализ в настоящее время является самым быстрым методом выявления изменчивости возбудителей, то при наличии нескольких эндемичных по АЧС областей в РФ целесообразно для первичной оценки изолята использовать именно этот подход, как наиболее эффективный.

Сопоставление данных литературы и собственные исследования по анализу структуры генов вируса АЧС, кодирующих иммунодоминантные белки, позволили разработать схему предварительной систематизации вновь выделенных изолятов, которая сводится к следующим этапам:

а) определение генотипа нового изолята - анализ гена В6461.;

б) определение серотипа вируса — анализ гена Е183Ь;

в) определение вирулентности циркулирующего изолята - анализ МвР 360;

г) определение уровня родства изолятов - анализ гена и межгенного региона

об т.

Следует отметить, что эта схема служит лишь для предварительной оценки изолятов и не является постулатом, так как в дальнейших исследованиях будет уточняться и корректироваться. Однако, на настоящий момент, она может служить для первичной оценки свойств вновь выделенного изолята.

Таким образом, проведенный анализ генов российских изолятов позволил разработать подходы для предварительной оценки их биологических свойств.

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

3.1 Выводы

а) в результате подбора праймеров и оптимизации условий ПЦР получены копии генов B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, E183L и фрагменты генов CP530R и CP2475L, клонирование которых позволило создать библиотеку генов вируса АЧС, включающую 5,2% его генома;

б) секвенированием было доказано, что клонированные нуклеотидные последовательности генов B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, CP530R, CP2475L и EI83L вируса АЧС изолятов Krasnodar 06/12 и Georgia 2007/1 идентичны, а нуклеотидные последовательности клонированного гена EP402R изолята Krasnodar 06/12 и аналогичного гена изолята Georgia 2007/1 имеют гомологию ~98,2%;

в) анализ вариабельности гена 061R изолятов: Volgograd 2010, Elbrus 2008, Stavropol 2008, Orenburg 2009 и Armenia 2007 показал, что его интергенный регион имеет две вариабельные области от 195 до 248 и от 296 до 320 нуклеотида, которые различаются у изолятов Volgograd 2010 и Elbrus 2008, выделенных от дикого кабана, и имеют максимальную гомологию у изолятов от домашних свиней;

г) в результате проведенного анализа вариабельности генов и биологических свойств возбудителя АЧС изучаемых изолятов разработана схема первичной оценки вновь выделенных изолятов на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей четырех генов: B646L, E183L, MGF 360, 061R и его интергенного региона;

д) изолят Krasnodar 06/12 обладает культурально-биологическими свойствами, не отличающимися от свойств изученных ранее изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ, в то время как его адаптированный вариант Krasnodar 2/13 индуцирует появление рыхлой гемадсорбции в АМС, накапливается в культуре клеток CV-1 до 7,0 lg ГАдЕ50/см3, авирулентен для свиней при дозе заражения 1000 ГАдЕ/голову;

е) адаптированный к росту в перевиваемых культурах клеток CV-1 вариант Krasnodar 2/13 обладает высокой эффективностью репродукции и пригоден для получения вирусспецифического антигена с целью выявления антител к вирусу АЧС как в непрямой ТФ ИФА, так и РНИФ.

3.2 Практические предложения. Плазмидные конструкции, входящие в состав клонотеки генов вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12, могут быть использованы в качестве основы для создания альтернативных источников генетического материала, положительного контроля в ПЦР-диагностике, а также для получения рекомбинантных вирусов и ДНК-вакцин. Полученный клон

pET32b(+)/ASFVp22 в клетках Е. coli штамма BL21(DE3) pLysS может быть использован в качестве альтернативного продуцента антигена вируса АЧС.

Полученный атгенуированный вариант вируса АЧС Krasnodar 2/13, адаптированный к репродукции в перевиваемых культурах клеток, используется в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для получения специфического антигена и постановки непрямой реакции ТФ ИФА и РНИФ с целью выявления антител к вирусу АЧС.

Разработаные «Методические указания по выявлению вируса африканской чумы свиней в пробах крови и патологических материалов, отобранных от павших или вынужденно убитых свиней, в реакции прямой иммунофлюоресценции (РПИФ)», «Методические указания по изоляции вируса африканской чумы свиней в культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней» «Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток лейкоцитов свиней» и «Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток костного мозга свиней», утвержденные в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 18 ноября 2013 года, 20 декабря 2013 года, 24 июня 2014 г. и 24 июня 2014 г., соответственно, предлагаются для использования в диагностических и научно-исследовательских лабораториях.

3.3 Перспективы дальнейшей разработки темы. Одним из важнейших направлений разработки данной темы является расширение библиотеки генов вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12 и других изолятов, выделенных на территории РФ, и создание банка генов вируса АЧС в связи с отсутствием такового в РФ.

Вторым важным аспектом является изучение изменений генетической структуры возбудителя АЧС, происходящих в природе и в процессе его адаптации к репродукции в перевиваемых культурах клеток. В связи с этим необходимым является определение нуклеотидных последовательностей генов CP204L, 061R, EP402R, CP530R, E183L KP177R с интергенным регионом и фрагментов генов CP2475L, B646L варианта вируса АЧС Krasnodar 2/13 и проведение их сравнительного анализа с нуклеотидными последовательностями изолята Krasnodar 06/12.Третье важное направление - совершенствование схемы предварительной систематизации вновь выделенных изолятов на основе анализа определенных генов.

4. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АМС — альвеолярные макрофаги свиньи AT - антитело

АЧС - африканская чума свиней ГАдЕ - гемадсорбирующая единица ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ККМС — культура костного мозга свиньи

КЧС - классическая чума свиней

МЭБ - международное эпизоотическое бюро

п.о.- пар оснований

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РГАд - реакция гемадсорбции

РЗГАд - реакция задержки гемадсорбции

РНИФ - реакция непрямой иммунофлюоресценции

РПИФ - реакция прямой иммунофлюоресценции

РРСС - репродуктивно-респираторный синдром свиней

ТФ ИФА- твердофазный иммуноферментный анализ

ТЦД50 - 50%-я тканевая цитопатическая доза

ФАО/ЕС - продовольственная сельскохозяйственная организация Евросоюза ФИТЦ (FITC) - флюоресцеина изотиоцианат (Fluorescein isothiocyanate) ЦПД - цитопатогенное действие

CV-1 - перевиваемая культура клеток почек африканской зеленой мартышки

MGF - мультигенное семейство

PK-I5 - перевиваемая культура клеток почек свиньи

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бакулов, И.А. Проблемы современной эволюции африканской чумы свиней / И. А. Бакулов, В.В. Макаров // Вестн. с.-х. науки. - 1990. - № 3. - С. 46-55.

2. Варенцова, А.А. Сравнительный анализ свойств изолятов вируса африканской чумы свиней / А.А. Варенцова, С.Г. Ремыга, В.Л. Гаврилова [и др.] // Ветеринария. - 2013. -№ 12. - С. 27-32.

3. Гловер, Д. Новое в клонировании ДНК. Методы / Д. Гловер. - 1-е изд. -М.: Мир, 1989. - С. 209-236.

4. Казакова, А.С. Конструирование продуцентов рекомбинантных белков р72, рЗО и р54 вируса африканской чумы свиней: дис. ... канд. биол. наук: 03.02.02 / Казакова Анна Сергеевна. — Покров, 2013. - 125 с.

5. Методические указания по изоляции вируса африканской чумы свиней в культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней / А. А. Варенцова, И. Ю. Жуков, С. Г. Ремыга [и др.]; ФГБУ "ВНИИЗЖ". - Владимир, 2013. - 14 с.

6. Першин, А.С. Совершенствование способа получения моноклональных антител к структурному белку рЗО вируса африканской чумы свиней с использованием рекомбинантных конструкций: дис. ... канд. вет. наук: 06.02.02 / Першин Андрей Сергеевич. - Покров, 2013. - 119 с.

7. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней / И.Ф. Вишняков, Н.И. Митин, Ю.И. Петров [и др.] //

Актуальные вопр. ветеринарной вирусологии: материалы науч.-практ. конф. «Классическая чума свиней - неотложные проблемы науки и практики» / ВНИИВВиМ.-Покров, 1995. -С. 141-143.

8. African swine fewer eradication: The Spanish model / M. Arias, J.M. Sanchez-Vizcaino, A. Morilla [et al.] // Trends in Emerging Viral Infections of Swine / ed. A. Morilla, K. Jin, J. Zimmerman. -1st ed. - Ames, Iowa, USA, 2002. - P. 133-139.

9. BioEdit sequence alignment editor version 6.0.7 [Электронный ресурс] / Т. Hall // Ibis Therapeutics. - Carlsbad, CA, USA, 2004. - Режим доступа: http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html (проверено 21.05.2013)

10. Bool, P.H. Le diagnostic par immunofluorescence de la peste porcine Africana / P.H. Bool, A. Ordas, C. Sanchez-Botija // Rivista del Patronato de Biologia Animal. -1970.-Vol. 14.-P. 115-132.

11. Comparison of the genome sequences of nonpathogenic and pathogenic African swine fever virus isolates // D.A.G. Chapman, V. Tcherepanov, C. Upton, L.K. Dixon / J. Gen. Virol. - 2008. - Vol. 89. - P. 397-408.

12. Dixon, L.K. Current approaches for African swine fever virus vaccine development [Электронный ресурс] / L.K. Dixon // African Swine Fever Diagnostics, Surveillance, Epidemiology and Control: Workshop, Nairobi, Kenya, 20-21 July 2011. -Режим доступа: http://www.s1ideshare.net/lLRl/current-approaches-for-african-swine-fever-virus-vaccine-development (проверено 22.03.2014).

13. Dixon, L.K. The structure and function of the african swine fever genome / L.K. Dixon // Rev. Sci. Techn. Off. Int. Epiz. - 1986. - Vol. 5, № 2. - P.469-475.

14. European Union reference laboratory for African swine fever (ASF) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://asf-referencelab.info/asf (проверено 03.06.2014).

15. Hamdy, F.M. Enzime-linked immunosorbent assay for the diagnosis of African swine fever/ F.M. Hamdy, A.H. Dardiri // Vet. Rec. - 1979. - Vol. 105. - P. 445446.

16. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods / K. Tamura, D. Peterson, N. Peterson [et al.] // Molecular Biology and Evolution. - 2011. - Vol. 28. - P. 2731-2739.

17. Redasoft Visual Cloning 3.0 [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.redasoft.com (проверено 17.04.2013).

18. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. - 2nd ed. / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. -N. Y.: Cold Spring Harbor, 1989.

19. Sanchez-Botija, С. Diagnosis of African swine fever by immunofluorescence / C. Sanchez-Botija // Bull. Off. Int. Epiz. - 1970. - Vol.73. - P. 1025-1044.

20. Sanger, F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitirs / F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1977. - Vol. 74. - P. 5463-5467.

21. STATGRAPHICS® Centurion XV User Manual [Электронный ресурс]. -Режим доступа: http://gendocs.ru/v31715/%D0%BF%D 1 %80%D0%B E%D0%B3%D 1 %80%D0%B0%D0 %BC%D0%BC%D0%B0 - statgraphics centurionxv (проверено 26.09.2013) (проверено 22.09.13).

22. The cellular immune recognition of proteins expressed by an African swine fever virus random genomic library / J.S. Jenson, A. Childerstone, H. Takamatsu [et al.] // J. Immunol. Methods. -2000. - Vol. 242, № 1-2. - P. 33-42.

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Варенцова, А.А. Клонирование гена K'177L (р22) вируса африканской чумы свиней / А.А. Варенцова, А.С. Казакова, Н.Н. Власова // Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: материалы Междунар. науч.-практ. конф./ УГСХА. - Ульяновск, 2011. - Т. 1. - С. 61-65.

2. Моноспецифическая сыворотка к рекомбинантному белку рЗО для изучения африканской чумы свиней (АЧС) [Электронный ресурс] / А.С. Казакова, А.А. Варенцова, А.С. Першин, С.А. Белянин, Т.Э. Южук, В.М. Лыска, С.П. Живодеров, Н.Н. Власова // Научный журнал КубГАУ. - 2011. - №71(07). - С. 1-15. -Режим доступа: httn://ei.kubagro.ru/201 l/07/pdf/45.pdf (проверено 25.07.2013).

3. Варенцова, А.А. Клонирование и сравнительный анализ последовательности гена 061R (р 12) изолятов вируса африканской чумы свиней, циркулирующего на территории Российской Федерации [Электронный ресурс] / А.А. Варенцова, А.С. Казакова, Н.Н. Власова // Адаптационные стратеги живих систем: Междисциплинарная научная конференция: тез. докл. - Киев, 2012. — С. 19-20. Режим доступа: http://www.as20! 2. science-center.net/Files/BookAdaStrat2012%20ContrastColor.pdf.

4. Comparative sequence analysis of genes encoding outer proteins of African swine fever virus isolates from different regions of Russian Federation and Armenia / N.N. Vlasova, A.S. Kazakova, A.A. Varentsova, T.A. Akopian, E.S. Kostryukova // Intern. J. Virol, and Molecular Biology. - 2012. - Vol.1, №1. - P. 1-11.

5. Comparative sequence analysis of genes encoding outer proteins of African swine fever virus isolates from different regions of Russian Federation and Armenia / N.N, Vlasova, A.S. Kazakova, A.A. Varentsova, T.A. Akopian, E.S. Kostryukova // African

Swine Fever Symposium, May 15-17, 2012. / Biosecurity Research Institute at Kansas State University, USA. - Kansas, 2012.

6. Varentsova, A.A. Construction of a gene bank of immunologically relevant proteins of African swine fever virus Krasnodar 2012 isolate [Электронный ресурс] / A.A. Varentsova, I.R. Imatdinov, N.N. Vlasova // 7th Vaccine & ISV Congress October 27-29, 2013, Sitges, Barcelona, Spain. - Sitges, 2013. - P. 113. - Режим доступа: https://elsevier.conference-services.net/secureProgrammeLogin.asp?conferenceID=3595 (проверено 27.06.2013)

7. Сравнительный анализ свойств изолятов вируса африканской чумы свиней / А.А. Варенцова, С.Г. Ремыга, В.Л. Гаврилова, [и др.] // Ветеринария. - 2013. -№12.-С. 27-32.

8. Варенцова, А.А. Клонотека генов, кодирующих иммунологически значимые белки вируса АЧС изолята Краснодар 2012 / А.А. Варенцова, Н.Н. Власова, К.Н. Груздев // Вестник Владимирского филиала Финансового университета. -Владимир, 2014. - Вып. 2. - С. 22-25.

9. Конструирование библиотеки генов, кодирующих иммунологически значимые белки вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12 / А.А. Варенцова, И.В. Шевченко, Н.Г. Зиняков, Н.Н. Власова, К.Н. Груздев, В.В. Дрыгин // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. - 2014. - № 5—1. - С. 28-35.

Подписано в печать 08.10.2014 г. Формат 60»90 1/16. Усл. печ. л.1. Тираж 80 экз Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».