Анализ структурной организации R1/R2 ретротранспозонов и нетранскрибируемого спейсера рибосомной ДНК рыжего таракана Blattella germanica

Каграманова, Арина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ структурной организации R1/R2 ретротранспозонов и нетранскрибируемого спейсера рибосомной ДНК рыжего таракана Blattella germanica
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ структурной организации R1/R2 ретротранспозонов и нетранскрибируемого спейсера рибосомной ДНК рыжего таракана Blattella germanica"

На правах рукописи

Каграманова Арина Сергеевна

АНАЛИЗ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ R1/R2 РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ И НЕТРАНСКРИБИРУЕМОГО СПЕЙСЕРА РИБОСОМНОЙ ДНК РЫЖЕГО ТАРАКАНА BLATTELLA GERMANICA

специальность 03 00 15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ161ЭВЗ

Москва, 2007

003161963

Работа выполнена в лаборатории генетических основ биоразнообразия Института общей генетики им Н И Вавилова РАН

Научный руководитель доктор биологических наук

Муха Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Ким Александр Иннокентьевич

кандидат биологических наук Шайкевич Елена Владимировна

Ведущая организация

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «_» ноября 2007 года в «_» часов на заседании

Диссертационного совета Д 002 214 01 при Институте общей генетики им НИ Вавилова РАН по адресу 119991 ГСП-1, Москва, ул Губкина, д 3 Факс (495) 132-89-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им Н И Вавилова РАН

Автореферат разослан «_» октября 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Полухина Г. Н.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Кластер рибосомных генов (рДНК) является классическим примером мультигенного семейства, у разных видов эукариот в пределах одного кластера располагается от нескольких сотен до нескольких тысяч структурных единиц У всех видов эукариот каждая единица транскрипции рДНК кодирует 18S, 5,8S, 28S, перечисленные в порядке их расположения, начиная с 5'-конца При этом повторяющиея единицы не разбросаны по геному, а формируют кластеры, в которых гены рРНК (18S, 5,8S, 28S) разделены рядом спейсерных последовательностей -внутренними транскрибируемыми (ITS1 и ITS2), внешним транскрибируемым (ETS) и межгенными (IGS), или нетранскрибируемыми (NTS) спейсерами (рисунок 1)

Одной из отличительных черт эволюционной изменчивости рДНК является тот факт, что степень вариабельности различных участков этих генов сильно отличается Гены рибосомных РНК представляют собой наиболее эволюционно консервативные последовательности кластера рДНК, а межгенный спейсер (IGS) -наиболее изменчивую часть этого участка генома В пределах одного генома может содержаться несколько типов IGS Анализ изменчивости данного района рДНК позволяет проследить первые этапы эволюционного процесса, т е возникновение индивидуальных, внутрипопуляционных и межпопуляционных генетических различий, предшествующих возникновению нового вида Регуляторные элементы IGS, такие как промоторы, энхансеры и терминаторы транскрипции рРНК, играют важную роль в регуляции транскрипции рРНК, процессинге пре-рРНК и возможно, в регуляции числа повторов рДНК Очевидно, что структура IGS имеет важное функциональное значение, поскольку различные типы IGS обуславливают различный уровень экспрессии находящихся под их контролем генов рРНК Описание структуры различных вариантов нетранскрибируемых спейсеров эукариот позволит прояснить влияние данных последовательностей на транскрипционную активность рибосомных генов

В настоящее время структура IGS многих видов остается неизвестной В данной работе описана структурная организация двух вариантов IGS рыжего таракана Blattella germanica и проведен сравнительный анализ этих последовательностей

Известно, что одной из важных составляющих генома эукариот являются мобильные генетические элементы (МГЭ) Доля генома, приходящаяся на мобильные элементы может составлять десятки процентов Изучение МГЭ является

важным направлением исследований в области молекулярной генетики и молекулярной эволюции

Известно, что кластеры рибосомных генов многих эукариот служат так называемой «нишей» для множества семейств мобильных элементов Первыми в данном участке генома были идентифицированы R1 и R2 ретротранспозоны D melanogaster, которые интегрируются в высококонсервативный район 28S гена [Dawid and Rebert, 1981, Roiha et a! 1981] Оба элемента (как R1, так и R2) выявлены в идентичных сайтах у всех исследованных видов типа Членистоногие и, в частности, насекомых Данные элементы относятся к несодержащим длинных концевых повторов (non-LTR) ретротранспозонам и являются стабильным компонентом генома членистоногих, несмотря на то, что инсерциии приводят к инактивации генов 28S рРНК

Механизм интеграции R1 и R2 ретротранспозонов являлся предметом изучения многих авторов Несмотря на общность этого механизма для всех non-LTR ретротранспозонов, детали процесса интеграции R1 и R2 ретротранспозонов значительно различаются между собой и, следует отметить, не каждый этап жизненного цикла этих мобильных элементов изучен к настоящему времени достаточно полно

В настоящее время во многих лабораториях мира активно ведутся исследования R1 и R2 мобильных элементов, однако полной ясности в понимании особенностей «жизнедеятельности» данных ретротранспозонов еще не получено

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлась характеристика внутривидовой структурной вариабельности рДНК рыжего таракана, выявляемой на уровне анализа полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ), и последующее сравнительное описание структуры нескольких компонентов рДНК, а именно, R1/R2 ретротранспозонов и нетранскрибируемого спейсера, как гипервариабельных участков этого участка генома, способных обуславливать изменчивость рДНК

В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи данного исследования

1) Провести анализ наследования различных структурных вариантов (Hindlll паттернов) рДНК рыжего таракана в ряду 12 поколений

2) Амплифицировать, клонировать и секвенировать протяженные фрагменты R1 и R2 мобильных элементов рыжего таракана (5'-укороченные копии),

интегрированные в 28S гены рибосомных РНК, и провести их структурно-функциональный анализ

3) Дать структурно-функциональную характеристику клонов, содержащих нативные копии R1 и R2 ретротранспозонов библиотеки генов рыжего таракана, полученной на основе космидного вектора (SuperCosI cosmid "Stratagene") Описать структуру полноразмерной копии R2 ретротранспозона

4) Амплифицировать, клонировать и секвенировать один из вариантов межгенного спейсера рДНК рыжего таракана и провести сравнительный анализ его структуры с ранее описанным в лаборатории вариантом IGS

Научная новизна и практическая ценность работы

Разработка молекулярно-генетических маркеров, позволяющих дифференцировать популяции живых организмов, представляется актуальной задачей, особенно, когда объектом исследования является генетически мало изученный синантропный паразит - рыжий таракан В рамках диссертационной работы показано стабильное наследование различных структурных вариантов рДНК (Hmdlll паттернов) в ряду 12 поколений этого вида насекомых, то есть в течение трех лет существования изосамочьей линии Исследование стабильности наследования молекулярно-генетического маркера является необходимым этапом на пути к практическому применению изучаемого маркера для дифференциации популяций тараканов, определения генетических дистанций между ними и уровня миграции Успешное развитие исследований в данном направлении позволит установить основные пути переноса тараканов и, соответственно, сфокусировать санэпидемиологический надзор в правильном направлении

Впервые выявлены, клонированы и секвенированы протяженные фрагменты (5'-укороченные копии), интегрированных в геном R1 и R2 ретротранспозонов рыжего таракана ß germanica Сравнительный структурный анализ полученных клонов позволил выделить два подсемейства элементов R1, значительно отличающихся по нуклеотидной последовательности Однако все клоны R1 элементов В germanica имели две общие черты - политимидиновый участок (поли (Т)) и сходные дупликации сайта интеграции В нуклеотидной последовательности элементов R2 найдены характерные делеции в З'-области сайтов-мишеней и отсутствие гомополинуклеотидных участков

Показано, что ретротранспозоны R1 В germanica являются первыми представителями мобильных элементов клады R1 ретротранспозонов, содержащими на З'-концах политимидиновые последовательности

Определена полная последовательность нукпеотидов R2 мобильного элемента В germanica Показано, что полноразмерная копия R2 мобильного элемента имеет размер 4343 пн, из которых 3477 пн соответствуют единственной открытой рамке считывания (ORF) В предсказанной in silico последовательности аминокислот выявленной ORF определены функционально значимые домены три домена цинковых пальцев и высококонсервативный домен обратной транскриптазы (Rt)

Проведен филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей аминокислот, соответствующих высококонсервативному домену обратной транскриптазы ORF R2 мобильных элементов различных видов насекомых и ракообразных Можно заключить, что R2 ретротранспозон В germanica является наиболее древним представителем этого класса мобильных элементов насекомых

Известно, что межгенный спейсер рДНК (IGS) эукариот содержит субповторы, обуславливающие регуляцию активности промотора РНК полимеразы I -потенциального уникального инструмента для решения многих экспериментальных задач методами генетической инженерии [Paule & Lofquist, 1996, Sollner-Webb & Tower, 1986, Massin et al, 2005] В рамках данной работы впервые проведен сравнительный анализ двух вариантов IGS В germanica и показаны различия в количестве и типе внутренних субповторов данных последовательностей Впервые описана структура и локализация выявленных субповторов, что открывает возможность дальнейшей экспериментальной проверки их функциональной значимости

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на 9-й конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2005, 10-й школе-конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Пущинского научного центра РАН Пущино, 2006, Конкурсе научных работ молодых ученых, Москва, ИОГен РАН и кафедра генетики Биофака МГУ, 2005, Международном рабочем совещании «Происхождение и эволюция биосферы», Новосибирск, 2005, XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2006», Москва,

2006, Отчетной конференции «Динамика генофондов растений, животных и человека», Москва, 2006, Отчетной конференции «Биоразнообразие и динамика генофондов», Москва, 2007, 4-м Международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, 2007

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 146 страницах и включает стандартные разделы введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы Работа иллюстрирована 33 рисунками, содержит 4 таблицы Библиография - 254 источников зарубежных и отечественных авторов По теме диссертации опубликовано 3 статьи

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов» (Подпрограмма «Динамика генофондов»)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ наследования полиморфных Hindfíl - рДНК маркеров

Рибосомная ДНК эукариот является уникальным структурно-функциональным образованием генома, в котором собраны воедино генетические элементы, обладающие резко различающейся степенью эволюционной консервативности Наиболее консервативными являются гены рРНК - в пределах вида в этих последовательностях выявляют лишь единичные нуклеотидные замены, либо полное отсутствие вариабельных сайтов Наиболее вариабельной областью рДНК эукариот является нетранскрибируемый/межгенный спейсер (IGS)- несколько структурных вариантов которого может содержаться в составе одного генома [Mukha et al, 2007, Mateos and Markow, 2005, Tung et al, 2007, Aranishi, 2005] Очевидно, что для выявления ПДРФ рДНК, обусловленного вариабельностью в пределах IGS, кандидатными являются ферменты рестрикции, узнающие последовательность 28S гена (ближе к З'-концу так, чтобы последовательность от сайта узнавания до конца 28S гена была достаточной для выявления методом блот-гибридизации) - с высокой степенью вероятности данный сайт узнавания фермента рестрикции будет являться консервативным в пределах вида Второй (ближайший с З'-конца 28S гена) сайт должен быть локализован в высоковариабельной области IGS Исходя из описанных особенностей структуры рДНК эукариот, становится ясным, что фрагмент рДНК,

получаемый в результате рестрикции тотальной ДНК эукариотического организма такой эндонуклеазой, с высокой вероятностью после блот-гибридизации с зондом, гомологичным З'-концу 288 гена, будет иметь различную длину у разных представителей данного вида, либо, в случае наличия нескольких типов ЮЭ в пределах одного генома, будет выявлено несколько фрагментов, имеющих различную длину

Кроме того, известно, что определенная часть копий 28Б генов рРНК всех исследованных в этом отношении насекомых содержит инсерции Ш и/или Я2 ретротранспозонов При этом показано, что этот тип мобильных элементов имеет строго сайт-специфическую локализацию в районе, локализованном ближе к З'-концу 28Б генов рРНК Очевидно, что инсерции (или их отсутствие) и ретротранспозонов могут во многом определять результат блот-гибридизации рестриктных фрагментов рДНК с зондом, гомологичным З'-концу 283 генов

Последовательность нуклеотидов нативного повтора рДНК рыжего таракана была определена ранее в нашей лаборатории - каталожный номер вепВапк АР005243 [МикИа е1 а1, 2000]

С помощью соответствующих компьютерных программ были определены сайты локализации всех известных эндонуклеаз, из которых только несколько были выделены в качестве кандидатных Методом блот-гибридизации с зондом, содержащим большую часть гена 28Б рРНК (смотрите рисунок 1), был выявлен внутривидовой Нтд\\\ ПДРФ рДНК рыжего таракана и описаны закономерности наследования различных выявляемых структурных вариантов в ряду поколения Р-| и ¥г [МиМа е1 а1, 2000]

Известно, что исследование стабильности наследования молекулярно-генетического маркера является необходимым этапом на пути к практическому применению изучаемого маркера для дифференциации популяций, определения генетических дистанций между ними и уровня миграции В рамках данной диссертационной работы было показано стабильное наследование различных структурных вариантов рДНК рыжего таракана (Н/псШ1 паттернов) в ряду 12 поколений этого вида насекомых, то есть в течение трех лет существования изосамочьей линии

Рисунок I, Схематичной изображение рибосомных re нон iy tap нот [Mukha et al, 20071,. Рибосом ные гены I8S, 5.SS, 28S разделены друг от друга внутренними транскрибируемыми спенсерами ITS 1 и ÍTS2. Сотки копий рДНК единиц распределены в тандемные ряды повторов, разделенных друг от друга межгенными енейсераш различной длины - IGS] и IGS2. Схематично изображены локализация зонда на кластере рибосом ных генов, негюльзусмого в блот-гибридизации тотальной ДИК В. germanica и распределение сайтов рестрикции Hind III. Вертикальными стрелками с названием рестриктазы Hind UI показано расположение ее сайтов рестрикции: Hind III - сайты в консервативных участках 28S генов; Hind Щ - в вариабельных участках. Треугольниками указаны инсердии мобильных элементов R1 и R2 в 285 гены рРНК рыжего таракана. Стрелками и буквами а/Ьт сId указаны прапмеры, использованные дли амплификации R1/K2 и e/f-для 1GS.

На рисунке 2 представлен результат блот-гибридиэации тотальной ДНК особей рыжего таракана (родителей и их потомков 1, 2 и 12 поколений), обработанной ферментом рестрикции №dt!l с зондом схематично изображенным на рисунке 1.

Известно, что кластер рибосомных генов у В. germanica локализован в X-хромосоме; самки содержат а геноме две Х-хромосомы, самцы - одну. Как видно нз рисунке 2, обе хромосомы самки-родителя содержат кластеры рДНК, у которых после рестрикции Hindi И и блот-гибридиэации с соответствующим зондом выявляются фрагменты одинаковой длины Х-хромосома самца-родителя (Рммца содержит кластер рДНК отличный от тагаао го самки (P.-j.«,™') - после рестрикции Hind III и блот-гибридиэации выявляется один фрагмент большего размера, чем у самки-родителя. Очевидно, что асе самцы первого поколения должны содержать одну из хромосом самки-родителя, а самки первого поколения - одну из хромосом Рммт и одну от Рсанца Анализ наследования описанных структурных вариантов в поколениях Гг показал, что самцы F, содержат одну из родительских Х-хромосом, а самкл F2 две хромосомы 8 разных сочетаниях Аналогичный результат был получен при анализе двенадцатого поколения (Fi2), то есть примерно через 3 года поддержания пинии, ттопученной от индивидуальных родителей, s лабораторных условиях (смотрите рисунок 2, С). Показано, что самцы F(3 содержат одну из родительских Х-хромосом

Таким образом, убедительно продемонстрирована стабильность наследования выявленного Н/теШ! рДНК ПДРФ маркера рыжего таракана, что открывает перспективы его дальнейшего использования для популяционно-генетического исследования этого вида насекомых.

¡JFj

> ■ т^

Рисунок 2. Саузери-олот гибридизация тотальной ДНК В. germanica, обработанной Hind 111 рестриктазой. Каждая дорожка

представляет паттерн X-

хромосомы индивидуальной взрослой особи рыжего таракана. А - родители и ™н потомство самцов (с) и самок 5 5 (9) первого поколения (Fi); В -g О потомство самцов и самок второго поколения (Fi); С -потомство самцов 12™ поколения (FjjJ,

"I?"--

.С . ■

: И 6,5

* * » -

Из изложенных в этой главе результатов и краткого их обсуждения становится ясным, что вариабельность длин выявляемых в серии представленных экспериментов фрагментов рДНК рыжего таракана может быть обусловлена двумя причинами: а) вариабельностью структуры ЮЗ и/или б) инсерциями мобильных элементов в З'-область 288 генов рРНК. До начала наших исследований отсутствовали какие-либо данные о структуре мобильных элементов рыжего таракана, и было дано описание лишь единичного варианта ЮЭ этого вида насекомых. В нижеизложенных главах автореферата будет дано описание полученных нами в ходе выполнения диссертационной работы результатов, восполняющих этот пробел

2 Структурно-функциональная характеристика R1 и R2 ретротранспозонов рыжего таракана

2.1 Выявление интегрированных копий R1 и R2 элементов у представителей отряда Тараканы

Известно, что при транспозициях non-LTR ретротранспозонов, в частности R1 и R2 элементов, часто происходит укорачивание их 5'-конца, главным образом за счет того, что обратная транскриптаза по неизвестным причинам может не дочитывать полностью РНК-матрицу мобильного элемента Как следствие, в 28S гены интегрируются как полноразмерные функциональные копии данных элементов, так и, так называемые, 5'-укороченные копии различной длины Количество дефектных копий значительно преобладает над интегрированными полноразмерными копиями [Perez-Gonzales et al, 2003]

Посредством полимеразной цепной реакции с использованием двух пар праймеров, фланкирующих, соответственно, сайты интеграции R1 [Burke et al, 1993] и R2 ретротранспозонов (рисунок 3), нами были амплифицированы интегрированные копии этих мобильных элементов у различных видов насекомых 1 - В germanice, 2 - Supella ¡ongipalpa, 3 - Penplaneta australasiae, 4 - Periplaneta brunea, 5 - Penplaneta fuliginosa, 6 - Parcoblatta lata, 7 - Cryptocerus punctuiatus, 8 - D melanogaster, 9 - Adalia bipunctata Первые семь видов являются представителями отряда Тараканы, а последние два - эволюционно удаленные от этого отряда таксоны - D melanogaster (Díptera) и A bipunctata (Coleóptera) Как видно на рисунке За, б, каждый вид характеризуется индивидуальным набором 5'-укороченных копий R1 и R2 элементов, варьирующих по своим размерам в широком диапазоне - от ~ 250 пн до ~ 2 7 - 3 0 тпн и от ~ 500 пн до ~ 1 8 тпн, соответственно, причем некоторые виды отличаются наличием мажорных и минорных вариантов (дорожки 2, 3, 4, 5, 8) Общим для всех видов, что вполне закономерно, является наличие полосы в 130 пн и 150 пн, (соответственно для R1 и R2 мобильных элементов), представляющей собой фрагменты 28S рДНК без инсерции

12345М57В9 1 2 3 4 5 М67И

3 б

Рисунок 3. Результат гель-электрофореза продуктов амплификации 5'-укороченных копий R] (а) и R2 (6) разных видов насекомых: 1 - Б. germanica; 2 - Supella ¡ongípalpa-, 3 - Periplaneta australasiae\ 4 - Periplaneta Ьгипеа\ 5 - Periplaneta /uliginosa; 6 ■ РагсоЫаиа lata; 7 - Ctyplocerus ptoKtulatus; 8 -D. melanogaster; 9 - Adalia biptmctata\ M - маркерная ДНК

Таким образом, было показано, что использованные нами праймеры являются «универсальными» и потенциально могут быть использованы для амплификации методом ПЦР и последующего анализа интегрированных копий (как попноразмерных так и «укороченных») R1 и R2 ретротранспозонов всех видов насекомых,

В ходе последующею эксперимента, который проводился на основном объекте наших исследований - рыжем таракане Blattella germanica, был продемонстрирован внутривидовой полиморфизм паттернов 5'-укороченных копий R1 ретротранспозонов На рисунке 4 представлен результат электрофореза продуктов амплификации ДНК самцов, представителей различных популяций этого насекомого.

Очевидно, что описанный паттерн интегрированных 5'-укороченных копий R1 ретротранспозонов представляет собой полиморфный ДНК-маркер, который может рассматриваться как уникальный «отпечаток пальцев», характеризующий индивидуальные особи рыжего таракана. Точнее, поскольку интеграция R1 ретротранспозонов происходит исключительно в рДНК, то есть в Х-хромосомы этого вида насекомых, можно предполагать, что описанный маркер может служить уникальной молекулярно-генетической характеристикой индивидуальных X-хромосом Blattella germanica. Однако отметим, что для использования описанного ДНК-маркера в лопуляционных исследованиях требуются дополнительные

эксперименты, а именно, определение частоты транспозиций этого типа мобильных элементов и стабильности наследования выявляемых паттернов,

тпн

10.0

5.0

3.0

2.0

1.0

0.8 0.5

0,13

Рисунок 4. Внутривидовой полиморфизм паттернов 5'-укороченных копий регрсгранспозонов у самцов рыжего таракана, представителей разных популяций. Дорожки: 1 - США; 2 - Тайвань: 3 - г. Крым; 4 -Г; Курган; 5 - г. Киев; 6 - г. Душанбе;

1 -г. Мтеква.

1 2 3 4 5 6 7

2.2 Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей клонированных 5'-укороченных копий R1 и R2 ретротранспозонов рыжего таракана

С использованием «универсальных» праймеров, фланкирующих сайты интеграции R1 и R2 ретротранспозонов нами были клонированы более 20 вариантов ПЦР-продустов, размер которых варьирован от -500 до -3 тпн. Определена последовательность нуклеотидов пяти клонов, содержащих вставки различной длины (3096, 2249, 1595, 1497, 897 пн) мобильного элемента R1, и шести клонов, содержащих вставки (4547, 2194, 1636. 1531, 1050, 499 пн) мобильного элемента R2

Сравнение последовательности нуклеотидов клоноэ, содержащих вставки R1 ретротранспозонов позволило выделить два подсемейства этого типа мобильных элементов в геноме рыжего таракана, сильно различающихся пс нукпеотидному составу З'-концевой области - 48 5%-сходстеа (рисунок 5).

Известно, что многие виды членистоногих могут содержать в своем геноме более одного подсемейства ретротранспозонов R1 и R2. Например, у видов N. vitripennis (Hymenoptera), Drosophila simulans, D. melanogaster (Díptera) и y Bombyx morí (Lepidoptera) ретротранспозоны R1 и R2 представлены множественными подсемействами которые различаются на уровне нуклеотидной

48 5% сходства

Rla -----ACAACCCACTCGGGACGACAGTCCCAAGTTAGGAAGACAAAACAGGCGATT—CA

Rib CGGCCGGAACCCCTTAGTGGCGAC---CTCGGGTATGGCTGCCATCATACGCCGGTGGTG

Rla GACCTCCCAAGAGGGAGAACGAATCATGGCCTGAATATCGAAATCGACTCAAAGTCGAAT

Rib GTGTAGCCACTGGGAAGTGCCAAGC-TGAAGAGCG-GCCGGACCCGACTGGATTCCAGAG * *** ** ******** * ** * ***** * * *

Rla GCCCCACTAGGGGTAGGCTTCACGACCAAATGGTCACGAAGCAGCCGTGCCCTGGCACTA

Sib GAA—ACTACTGACGA---CCGCGGTCTGCCCAACTCAACATTGCGGCAAGTTGATCGGA

Rla GCCAGGGCCAAAGAGAGGAGA—AATCGAGAGGGAAGCAGTTCTAC--------GAACTA

Rib GCGGAGAATGGAAAGICGAGATTGGCTGGGAGCTCACCACTTICACTGAAAGTGGAGGTA

Rla GCTCCCTAATTAGCCACAAAATCTCTTGGCAATTTACCTGGACATGCCACATGCACGAGT

Rib GCTCCCGAGT—GGCTTAAGGTTTGGCGTCT-CCGGCCCGATCAACACTTAGAATTAAGG

Rla GCTATGGCCGCCACCGAGCACTCAGGAGAAACGCCAATCGATCT—GAAGACAACCGCAT

Rib GAAATAGGTTAGTTTTTGTTTTTAGTAGTTA-GTTGTTTTATTTTTGTAGCTAGTTCTTT * ** * * * ** ** * * * ** * * ** * *

Rla CTTCTGTGT----AAGCAGGGGCCACCAGTAGGGGGACCCCACGTAGGTTAGTCTTAGTA

Rib GTTTTGTATTTTTACTTATATTTTATTTCTACATGTTATCCTAGTA—TTAAGTAGAATA ** *** * * * ****** *** *** * **

Rla TAAACTAGTT---ATAGGCTTAGTTATAGACTAGAATT&ATTTGAACCTACTACTATT-G

Rib GAATTTAGACTAAGTAACCTAACCTGGAAATAAAAACTAAGTTAGAGCAAAAATCAAAAG

Rla TAATTCATGAGCCAAATTGTAATCAAGA---TCACTTTGTAAATCGAGGCTTCCCCAAGG

Rib TATGTTAGATAACAAAATATAACGTAGAATGTAGTATTGTAAATGGAG-TTGGAGTAGTT

Rla GGTACCTTGATAATTGTCAAATCTGTTAAACTTAATAATGTATTACAAATGTATT—CAA

Rib CCCAACCTTCCA—TATAGAAAACAATGTGTATAAAAATGTAATGTAAAAAGATGAATAA * * * * * * ** * *** ****** * *** ** **

Rla TCCTTTTTACACAAATAAACGGTAACCCTTGGGGAGCCTGAGCATACTACGGACCCACTA

Rib ACAGATCAAAAGAGACCAA-GAGGTCCAATTGGGAACCTGAGCATACAACGG-CCTGTTT

Rla TAGACTCAAGATAGTGGGCT---AGTATACTCGGGTTCCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

Rib TAGATACAAGATAACAGGCCTAAAGTATGTGAAGGTTCCC—-TTTTTTTTTTTTTTTTT

Рисунок 5 Сравнительный анализ последовательности нуклеотидов представителей разных подсемейств выявленных R1 ретротранспозонов рыжего таракана (Rla, Rib) *- Идентичные нуклеотиды,

последовательности на 30 - 50%, в то время как элементы одного подсемейства отличались менее чем на 1% [Perez-Gonzales and Eickbush, 2001, Burke et al, 1998, Burke et al, 1993] Присутствие разных подсемейств R1 ретротранспозонов в геноме одного и того же вида, по-видимому, предполагает существование особых механизмов, которые обеспечивают сохранность многочисленных подсемейств в условиях действия согласованной эволюции кластера рибосомных генов, направленной на поддержание идентичности повторяющихся последовательностей [Burke et al, 1993]

Несмотря на значительные различия в нукпеотидных последовательностях, представители обоих подсемейств R1 ретротранспозонов В дегтатса имели две общие черты - поли(Т)-участок на З'-конце (рисунок 5), и сходные дупликации сайта интеграции, размер которых составляет 14 пн (рисунок 6а)

Отметим, нами впервые показано, что З'-концы интегрированных копий R1 ретротранспозонов эукариот могут содержать протяженные поли(Т)-последовательности - до наших исследований были описаны только характерные поли(А)-последовательности, либо отсутствие каких-либо полинукпеотидных мотивов на З'-концах ретротранспозонов

Выявленная нами дупликация сайта мишени (5'-tgtccctatctact-3'), напротив, типична для ретротранспозонов этого типа [Kojima & Fujiwara, 2003, Kojima et al, 2006]

Анализ последовательностей нукпеотидов пяти клонированных 5'-укороченных копий ретротранспозонов R2 рыжего таракана показал следующее Все копии R2 имеют одинаковые З'-последовательности, примыкающие к сайту интеграции 28S рДНК (таблица) Принято считать, что все известные к настоящему времени ретротранспозоны R2 членистоногих имеют сходный сайт интеграции и, следовательно, первый однонитевой разрыв, происходящий во время интеграции этих мобильных элементов, возникает в строго определенном месте [Christensen et al, 2006, Christensen & Eickbush, 2005]

В то же время, для ретротранспозонов R2 рыжего таракана нельзя точно определить место первого однонитевого разрыва, поскольку нукпеотид (G), выделенный в таблице звездочкой, может принадлежать как мобильному элементу (в этом случае первый однонитевой разрыв происходит, как и у других представителей членистоногих) (на рисуноке 66 показано черной стрелкой), так и 28S рДНК (в этом случае положение первого однонитевого разрыва обозначено на рисунке 66 серой стрелкой)

Положение второго однонитевого разрыва и, соответственно, размер делеции в 28S рДНК, у всех ретротранспозонов R2 рыжего таракана были различными (см таблицу) Возможно, это объясняется низкой специфичностью эндонуклеазы этих мобильных элементов (на рисунке 66 возможное положение второго однонитевого разрыва показано пунктиром) Можно предположить также, что вариабельность в размере делеции обусловлена «неаккуратностью» репарации, завершающей процесс интеграции ретротранспозонов R2 (смотрите «Обзор литературы» диссертации, либо [Perez-Gonzalez & Eickbush, 2001])

Особый интерес, с нашей точки зрения, представляет структура клонов 6 и 13 (см таблицу) Эти клоны содержат дуплицированные фрагменты гена 283 рРНК

cGCGCATSAaTGGATTaacGMaTTCccaci^Q^rAremggft'rccGcaGGSCTCMCGcscTa'TT TTGCTAAGGATGACAGGCGCATTTTCÄACAACTTCGGCGGAGGCTTTGCTGGTTACAGCGGGCATCTG

CTaCGGACCCACTATAGACTCAAeATAGTSGGCTaGTATACTCGSGTTCCCCj'i'j'J'j'^'^'J'J'J'J'U'J'j'.ZY TrrmraTCCCrAJCracmTCTaGCGAAACCftCTGCCAaGSGMCSGGCTTGeASeAATCaGCGSGG AAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTCTGGCA

Рисунок 6 Структура сайтов интеграции ретротранспозонов R1 (а) и R2 (б) В germanica а — район интеграции R1 Одиночным подчеркиванием выделены последовательности рДНК Жирным курсивом выделена дупликация сайта-мишени, курсивом - поли-(Т)-участок, праймеры, используемые для амплификации обозначены двойным подчеркиванием

б - район интеграции R2 Стрелками и пунктиром отмечены вероятные места однонитевых разрывов сайга-мишени (пояснения в тексте)

(столбец «дополнительные нукпеотиды» в таблице) Отметим, что в клоне 13 дупликация содержит однонуклеотидную замену (д) (выделена прописной буквой) Механизм возникновения дупликаций гена 28S рРНК в сайте интеграции мобильных элементов R2 становится понятным, если предположить, что кДНК-копии мобильных элементов считывались с рРНК, содержащих последовательности Я2-эпементов Синтез кДНК при этом не останавливался в месте окончания последовательности мобильного элемента, а продолжался за ее пределы Ранее, подобные дупликации обнаруживали и у других видов насекомых

В заключение отметим, что на З'-концах всех выявленных копий ретротранспозонов R2 рыжего таракана не было гомополинукпеотидных последовательностей

Л....,

gagtaäctätgactctcttÄäggtagcaaätg

Таблица Структура 5'- и 3'- областей сайтов интеграции 5'-укороченных копий ретротранспозонов И2 рыжего таракана

КЛОН 3 -конец сайта интеграции в 28S РДНК Дополнительные нуклеотиды 5 -коней ретротранспозона R2 3 -конец ретротранспозона R2 (подчеркнут) и 5 конец 28S рДНК сайта интеграции Размер элемента (ПН)

22 GAGTAACTATGACTCTCTTA--- ATGGCCA CTCGGTGGGGTGTTAGTAAG*TAGCAA 1486

2 GAGTAACTATGACTCTCTT---- GCTGATG 2045

13 GAGTAACE&TGACTCT------- gACIATGAС TTCCTGT 1385

5 GAGTAACTATGACTCT------- TTGATAG 354

6 GAGTAACTATGACT--------- AACTATGAC CTATGTG Э06

Звездочкой обозначен нуклеотид (G), который может принадлежать как мобильному элементу, так и 28S рДНК

3 '-конец ретротранспозона подчеркнут

2 3 Скрининг библиотеки генов рыжего таракана для выявления нативных копий R1 и R2 ретротранспозонов

В нашей лаборатории к б н Капелинской Т В на основе космидного вектора (SuperCosI cosmid "Stratagene") была получена библиотека генов рыжего таракана Показано, что средний размер вставок геномной ДНК составляет ~30-35 тпн Гибридизационный анализ полученной библиотеки с зондами, комплементарными 28S рДНК позволил выявить более 1000 клонов, содержащих фрагменты генов рибосомных РНК

В рамках диссертационной работы с помощью соответствующих зондов, комплементарных 5'-району самых протяженных из описанных выше 5'-укороченных копий R1 (обоих подсемейств) и R2 мобильных элементов, методом гибридизации колоний был проведен скрининг библиотеки генов с целью выявления и последующего анализа нативных копий исследуемых ретротранспозонов

В результате проведенной гибридизации было выявлено а) 19 космид, содержащих R1A ретротранспозон, из них 11 клонов кроме R1A содержали еще и R2 ретротранспозон, б) 7 космид, содержащих R1B ретротранспозон, из них 4 кпона кроме R1В содержали еще и R2 ретротранспозон

Ни одного клона, содержащего только R2 ретротранспозон выявлено не было Возможно, это не является случайным Можно предположить, что для интеграции R2 ретротранспозона в соответствующий сайт требуется предварительная интеграция R1 ретротранспозона, инсерции которого локализуются на расстоянии всего нескольких десятков нуклеотидов от сайта интеграции R2, возможно, предварительная инсерция R1 ретротранспозонов может менять конформацию

хроматина в локальном районе генома и облегчать интеграцию R2 ретротранспозонов

2.4 Структурно-функциональная характеристика полноразмерной копии R2 ретротранспозона рыжего таракана

До начала описания структуры полноразмерной копии R2 ретротранспозона прежде всего следует определиться в том, что есть «полноразмерная» копия ретротранспозона, а не его достаточно протяженная 5'-укороченая копия Мы руководствовались следующим правилом Поскольку обрыв синтеза кДНК-копии ретротранспозона, приводящий к интеграции в геном 5-укороченных копий, происходит, как предполагается, случайным образом, в случайном месте -вероятность нахождения в геноме двух б'-укороченных копий, имеющих абсолютно идентичные 5'-концы, крайне мала В рамках данной работы «полноразмерной копией» мобильного элемента называлась копия, которая содержалась как минимум в трех независимо полученных клонах и имела идентичные 5'-концы

Несколько космид, содержащих вставки R2 ретротранспозонов (смотрите предыдущую главу автореферата) были секвенированы с использованием праймера, фланкирующего сайт интеграции со стороны 5'-конца мобильного элемента - в результате были отобраны две космиды, содержащие идентичные последовательности ДНК этого района

Кроме того, методом ПЦР, с использованием специального набора реактивов, позволяющего амплифицировать протяженные фрагменты геномной ДНК (Long-PCR Enzyme Mix («Fermentas»)), и праймеров, фланкирующих сайт интеграции R2 ретротранспозонов, были амплифицированы и клонированы в плазмидном векторе (pGEM-T-Easy Vector «Promega») несколько фрагментов ДНК, имеющих размер более 4500 пн В ходе дальнейшего анализа было показано, что несколько, из полученных таким образом клонов, содержали вставки исследуемого мобильного элемента, имеющие одинаковые 5'-концы ретротранспозона, идентичные таковым, выявленным ранее в клонах библиотеки генов

Последовательность нуклеотидов нативной (полноразмерной) копии R2 ретротранспозона рыжего таракана представлена на рисунке 7 Показано, что полноразмерная копия R2 ретротранспозона рыжего таракана имеет размер 4343 пн, из которых 3477 пн соответствуют единственной открытой рамке считывания (ORF), 266 пн и 600 пн - 5'- и З'-нетранслируемым областям соответственно В предсказанной in silico последовательности аминокислот выявленной ORF

К jCeiikiäWBfii^jS Setiäeti СТТСТЙССМС.ТГ

.A IT: — ■^ÄniTG^ÄBGECKK

- ' ТТШЙТС

■ - ~ - waamtot :.: MC гЦмЬЖЩЙЙР*»^

MUfrÜW ; Т-лтзябмйстдт ■'.-■IT- -e-;.'.; JkATTilApfh^iG : ЗстфЙ^ЮАлбссЭДТ!^ wc;-«< гс л i г щам а: :

"гласит

ттта^ч :s : ; . ..-я: i -.«■.■-- . . ;. ■ - --. .;„

ffiSCGiaVif-iA5 . ..-■.;, *:- ■ - . - ■

eiiftT 77^1 .... TT.J."1 ¿i»;; .:-,-■...■ .■■.■■.т-т x.7.4ЙЖСК

гаоЙЖг: . .- ■■■■;. -attaa;.-; - _ -' s'i'/^j - . • • • ;.ч лсеййЙв

ч :С1СЯ!7П - - ■ д..-.- tsAfüCii

.S.T.-- ; L ■ ■■ AT :: и™; : ... г ' даротйгоаййз

ÖSWM-csc -а:; s к>■. ■ :;> ; : "л: л: - ' -■:■■■- : д: , ■• } сдг'гхмшаи&сйс

".Vvri-A.',-; - лт.т - AM ■ JÜ. т ■ : г- ■ - Амййгомвде?

гтвйиотс- - -. >i ■ - . " - • \ пл.; ^-гт'тт-- V А

■ -J ■■- fj ,■ - ■ ~ . . . -.

"Tji^jJccT^?»"» ^AOLCGACs-rr^TTftb : ' ; -: ■ i

eteiTSCt? " , . ■ ■ iw ;

... ' 1. - . ■ - ATT -. fci Г kSKjJb ..."■■ 4..*: - Л ЙМ 'jT^reGCTC^CqSCCfliiri'J'G.'ni:

'¿тт а ■т т т>т г с: гт. ^ т т т т т G аоА т'ст . ■ гг~' ?г с.т^сКтейС f С Ст1 'УПвЕшж; т ;г gt :j с

ттетелтсыдттлв твАсасасл гелл tgga taacgaa гдетлегсл

Рисунок 7 Последовательность нуклеотидов пил]юра?мерной копии К2 мобильного элемента В. germanica. 5'- й нетранслируемые области выделены двойным подчеркиванием; открытая рамка считывания - серым цветом: последовательности ДНК гена 28Ü фланкирующие сайт

интеграции мобильного элемента выделены курсивом. Жирным шрифтом выделен предсказанный программой «Neurat Network Promoter Prediction» (htip:/Avww.fruitfly.org/seg tool s/pr omoter.htm h промотор PI Ж полимеразм II; увеличенным шрифтом обозначен нуклеотид - предполагаемый старт транскрипции.

Три дм«на Домин

донкоьих .. ' у .... трвкскрНПТЙЭЫ

иг

гО

* £ Чл-^

¿pi

Рисунок 8. Доменная организация аминокислотной последовательности ОКГ Й.2 мобильного элемента рыжего таракана. А - Общая топология выявленных доменов; Б трёхмерная структура пептидной последовательности,

формирующей три домена цинковых нальисв.

определены посредством программы SMART [Letunic, et al, 2006] (http //smart embl-heidelberg de/) функционально значимые домены три домена цинковых пальцев и высококонсервативный домен обратной транскриптазы (рисунок 8)

Филогенетический анализ (рисунок 9), основанный на сравнении последовательности аминокислот, соответствующих домену обратной транскриптазы R2 ретротранспозонов различных видов насекомых и ракообразных (последние были выбраны в качестве внешней группы), позволяет заключить, что R2

I-В топ

ä ____I-К mantima

* --N vrtnpennis (А)

-•-Р scabsr

, ___I-F auricularm

f-■--D mercatorum

; -1-- P laponica

-N vitripennis (B)

-— В germanica

, ——■-L polyphemus

Рисунок 9 Филогенетическое древо, построенное посредством программы "MEGA" (http //www megasoftware netl с использованием алгоритма «ближайших соседей» (Neighbor-Joining) на основе сравнения белковых последовательностей домена обратной транскриптазы R2 ретротранспозонов разных представителей типа Членистоногие В топ — тутовый шелкопряд, А maritime - ногохвостка, Р japónica - японский жук, P scaber - мокрица, F. auricularia -уховертка, D. mercatorum - муха дрозофила, В. germanica - рыжий таракан, N. vitripennis (А), N väripenms (В) - представители двух подсемейств R2 ретротранспозонов наездника Nasonia vitripennis и L. polyphemus - мечехвост (представитель ракообразных)

ретротранспозон рыжего таракана является наиболее древним представителем этого класса мобильных элементов насекомых, из описанных к настоящему времени

В настоящее время нет полной ясности относительно всех деталей «жизненного цикла» R2 ретротранспозонов насекомых, в частности, во многом остаются неизученными закономерности транскрипции и трансляции этого класса мобильных элементов Предполагается, что R2 ретротранспозоны транскрибируются в составе протяженных молекул пре-рРНК, синтезируемых под контролем промотора РНК-полимеразы I [George & Eickbush, 1999], а трансляция мобильного элемента происходит за счет прикрепления к рибосоме IRES-подобных (internal Ribosomal Entry Sites) структур, формируемых 5'-нетранслируемой областью ретротранспозона [George and Eickbush, 1999] Ни у одного из описанных к настоящему времени R2 ретротранспозонов не было выявлено промоторных

последовательностей, способных обеспечивать транскрипцию за счет активности РНК-полимеразы II [George and Eickbush, 1999]

Молекулярно-генетическая организация генома различных эукариот во многом сходна, в то же время известно, что каждый вид обладает рядом структурных и функциональных особенностей, характерных для того или иного участка генома, в частности, это, безусловно, касается и особенностей «жизнедеятельности» R2 ретротранспозонов В этой связи, с нашей точки зрения, принципиально важным является молекулярно-генетические исследования новых, ранее не изученных видов, то есть традиционно не являющихся «модельными»

Для поиска участков ДНК, потенциально способных обеспечивать транскрипцию за счет активности РНК-полимеразы II (промоторов), посредством программы «Neural Network Promoter Prediction»

(http //www fruitflv org/seq tools/promoter html) анализировали протяженную последовательность ДНК, представляющую собой последовательность R2 ретротранспозона рыжего таракана и фланкирующие сайт интеграции мобильного элемента последовательности рДНК (рисунок 7) В результате проведенной работы с высокой степенью вероятности был предсказан промотор, локализованный в непосредственной близости от начала мобильного элемента (на рисунке 7 выделено жирным шрифтом) Возможно, описанный мобильный элемент является первым представителем R2 ретротранспозонов, транскрибируемым за счет активности РНК-полимеразы II, однако, отметим, что детальное описание транскрипционной активности не входило в рамки данной работы, а будет являться предметом отдельного исследования

3 Клонирование, секвенирование и сравнительный анализ нетранскрибируемых спейсеров рДНК рыжего таракана В. germanica

Промотор, обуславливающий экспрессию генов рибосомных РНК (промотор РНК полимеразы I), в отличие от промоторов РНК полимеразы II, обуславливающих транскрипцию большинства генов, кодирующих информацию о белках, и РНК полимеразы III, обладает рядом уникальных особенностей Во-первых, данный промотор обуславливает гиперэкспрессию РНК Во-вторых, данный промотор не обладает тканеспецифичностью, то есть активно работает во всех типах клеток на всех стадиях развития организма В-третьих, является видоспецифичным [Moss & Stefanovsky, 1995]

В настоящее время механизмы регуляции активности промотора РНК полимеразы I остаются не до конца изученными В то же время, известно, что структура нетранскрибируемого (IGS) и внешнего транскрибируемого (ETS) спейсеров рДНК эукариот во многом определяет уровень экспрессии рибосомных РНК, в частности, регулируя активность промотора РНК полимеразы I Показано, что нетранскрибируемые спейсеры рДНК содержат субповторы, играющие важную регуляторную роль

Структура нетранскрибируемых спейсеров рДНК различных видов эукариот имеет много общих черт [Moss & Stefanovsky, 1995], но в то же время, каждый вид обладает своими индивидуальными особенностями Для многих видов эукариот, в частности для рыжего таракана, показано, что в геноме живого организма может содержаться несколько типов IGS, причем различные типы IGS различаются между собой как по нуклеотидному составу субповторов, так и по их количеству [Paule & Lofguist, 1996, Moss & Stefanovsky, 1995] Ранее в нашей Лаборатории была определена последовательность нуклеотидов одного из вариантов нетранскрибируемого спейсера рДНК (1008 пн) рыжего таракана, представляло интерес определить последовательность нуклеотидов более протяженного варианта IGS этого вида насекомых и провести его сравнение с ранее описанной последовательностью

Посредством ПЦР, с использованием специального набора реактивов (Long-PCR Enzyme Mix («Fermentas»)), и пары ранее описанных [Mukha et al, 2002] «универсальных» праймеров NTS18/NTS28 (примерная локализация на последовательности рДНК указана на рисунке 1), нами был амплифицирован и затем клонирован в плазмидном векторе (pGEM-T-Easy Vector «Promega») протяженный фрагмент геномной ДНК (6500 пн), содержащий фрагменты 18S- и 28S-reHOB рРНК, внешний транскрибируемый спейсер (ETS) и ранее не описанный новый вариант IGS

Последовательность нуклеотидов 18S-, 28S-reHOB рРНК и внешнего транскрибируемого спейсера (ETS), входящих в состав клонированного фрагмента, определяли посредством «пошагового» секвенирования Никаких отличий в структуре этих участков рДНК от ранее описанных нами выявлено не было

Поскольку IGS содержит обилие субповторов, тактика «пошагового» секвенирования оказалась не приемлема для определения последовательности нуклеотидов этого участка ДНК Нами была составлена подробная рестрикционная карта клонированного фрагмента ДНК, содержащего IGS, и по соответствующим

CCCGTCTGGTCGATGCAACGATGAGATCGGGGAGTCCCGTGGGTCGAAAGGCTTTAAACAAGGTGATTTTCTTCTTAGI ^Р^ИЩЩТСТССС^АСЗ, !QTAACK:CCGCATTTgCCgOACgqg&CCTAAC(3CCGGqCGGCGGC AIjGTAGTGCCCTGGCTAATCGCCGC TCCGCCCCTAACGTCGACCGT"

;ggctcggaatcgtctgtaga.cgacttaggtaccgggcggggtgtt

СТАСТССКТАСАйСАСТТСССАСАСТОССАТСТОТТСАСАСТСАТСССТТТТССТТЗ. 2€<ЗА(^АУУСОУСТТСГГСООТТАОу<ЗА<5АССТ OCGGGGTAGTTGGACCTGCTTTTCGCAGGTCCT TTTTTTATGACTTGGTTTTATTTTATTTTGTCTTCT ТАССС GTCAAATATGTATT TGA TTTGCGACCAACCTCCACGTGCGAGATGACTTTTTCA" •: i :

~ CAGAAGCGTTTTGTTTCTGCGTGAGGGGGT

jCGCACGGG_

¡CTCGTGGACTTGGGGGTGC T T TTCGTGAAC JGC». lTAGGTTCGG^CCGCCTAACf_

9. 2ААССТААССТА^^^^^И • - ТТААССТААСССТ». ЗААССТААССТААСАГ9.4AACCTAACCTAAAf_

JrTT TCGTC TTTGGTACCCCATGTCACGGCTTAACAAC ATAGGC G A AT ACCCTT AAT GGTC АСА AAA ' "A "TTAA; ГСААА *AATGGTCC9, 5AACCAAACCTAAACCTCTTGGCCAACCСT7T AAAATT A.ATAAAT1"TTTTTTGTTGGGAAAAAG AA 7 • iATAAATTTTT TTCG7TC GGTAGCCTATGTCAceCTAATACAr/V^ TACCAAGCCATGGTCAT

AAACTACCoGTTGCCA'■ TTAAAATAATGATTTTGTT'"?:i AAAC-AТД—ИИИЩ", •-3GGG7ACCCTATGGIСACCCCCTAAT .ia'--^^-r-T-аьататгагндгтаfzrrТ'ТГЮ^^ИИ'fТСA CGTTGAAATA AAAATTTTTGGTTGAAAAGA'i £BHBBBH' ' :":'CG1 • 1G-T AC С С TTATGGTCACCCT'7 AAT ACGT AGAGGTAGCCT AATGTC ACAAACT AGT ACC AAGC AGGGCCAT AAACT ACCGCTTGCC ACGT T AAAAT AAAAATTT TTGCTGAAAAGATGGT AATT 'ГТТ TTTAA1. 2TC GGTACCCTATGTCACCCTAATGCGTAGAGGTAGCCTAATGTAACAAACAAGTACCAAGCCTGGTCATAAACTGCCGCTTGCCACCTTAAAA TAATAATGTTTGTTGGAAAGT ! ' T1 • 3TCGGTACCCTATGTCACCCTAA7 ACA7AGAGGTAGCCTAATGTCAC

AAACAAGTACCAAGCTTGATCATAAACTACCGCTTGCCACGTT AAAAT AAT AATTTTTGTTGAAAAGAT[HJHB^^P^J|: Г AT 1 .4TCGGTAGCCTATGTCACCCTAATACATAGTGGTAGCCTAATGTCACAAACAAGTACCAAGCCTGGTCATAAACTGCCTCTTGCCACCTT AAAAT AAT AATTTT TGTTGGAAAGTGQBIHIHHHB1"1,1"ТТТТТТТТТГГТТТАТ:1. 5TCGGTAGCCTATATCACCCTAATACA TAGAGGTAACCTAATGTCACAAACAAGTAGCAAGCATGTCCATAAACTACCGCTTGCCACCTTAAATTAATAATTATTTTTGGAAAC7ATC

. ... ^„»„.^ отражающая основные отличия

структуры двух вариантов (1С¿S_l и 1GS2) межгенного спенсера рДНК рыжего таракана Условные обозначения фрагмент гена 28S рРНК серый цвет; начало внешнего транскрибируемого спенсера (ETS) фи ил ею вый цвег; телёнымн тонами обозначены ранее выявленные субповторы: желтым цветом протяженная А/Т богатая область главное структурное отличие сравниваемых вариантов IGS,

\.TCGGAGCA

Рисунок 10. Расположение суб но второй, выявленных посредством программы МЕМЕ [Bailey, et al., 2006] (hltp /bioweb pasteur.fr docs mcme meme. html h в последовательностях межгенного (IGS 2) и внешнего транскрибируемого (ETS) спенсеров рыжего таракана Различными цветами и соответствующими номерами обозначены 10 выявленных субповторов, фигурной скобкой область ETS; жирным шрифтом и курсивом предполагаемая область промотора рДНК [Муха и др.. 2000].

сайтам рестрикции большая часть последователености 1GS была субклонирована в серию перекрывающихся фрагментов, каждый из которых имел протяженность не менее 1000 пн, что позволяло определять его последовательность ДНК посредством «секвенирования флангов», используя стандартные праймеры (M13F/M13R "Promega")

Последовательность нуклеотидов нового варианта IGS и ETS представлена на рисунке 10 Попарное сравнение ранее описанного варианта нетранскрибируемого спейсера рДНК рыжего таракана (IGS_1) с вновь определенным в рамках данной работы (IGS_2) посредством программы ClustalW (http //www genebee msu su/clustal/) показало, что главное отличие между ними заключается в наличии протяженной А/Т богатой последовательности, входящей в состав IGS_2 (рисунок 11)

Для характеристики субповторов, локализованных в пределах последовательностей IGS_2 и ETS, то есть в областях, окружающих промотор РНК-полимеразы I, использовали программу MEME [Bailey, et al, 2006] (http //bioweb pasteur fr/docs/meme/meme html), позволяющую выявлять

повторяющиеся мотивы различной степени сходства в протяженных последовательностях ДНК

Всего было выявлено 10 субповторов протяженностью от -10 до -150 пн (смотрите рисунок 10), каждый из которых представлен в анализируемой последовательности несколькими копиями Отметим, что копии выявленных субповторов не являются абсолютно идентичными между собой, но проявляют статистически значимое сходство, свидетельствующее об общности их происхождения [Bailey, et al, 2006] Отметим, что из десяти выявленных субповторов, три - №2, 5 и 7 являются общими для последовательностей нетранскрибируемего и внешнего транскрибируемого спейсеров (рисунок 10)

Таким образом, впервые описана структура и локализация субповторов в пределах спейсерных последовательностей рДНК, фланкирующих промотор РНК-полимеразы I, что открывает возможность дальнейшей экспериментальной проверки их функциональной значимости известными методами генной инженерии

выводы

1) В линии рыжего таракана Blattella germanica, полученной от одной пары родителей и поддерживавшейся в лабораторных условиях в течение трех лет (12 поколений), выявлено стабильное наследование различающихся структурных вариантов (Н/лсШ1 паттернов) рДНК

2) Выявлены, клонированы и секвенированы протяженные фрагменты (5'-укороченные копии), интегрированных в геном R1 ретротранспозонов рыжего таракана В germanica Сравнение последовательностей нуклеотидов фрагментов R1 ретротранспозонов позволило выделить два подсемейства этого типа мобильных элементов в геноме рыжего таракана, сильно различающихся по нуклеотидному составу З'-концевой области (48 5%-сходства)

3) Впервые в кладе R1 ретротранспозонов эукариот выявлены мобильные элементы, содержащие на З'-концах протяженные политимидиновые мотивы

4) Определена полная последовательность нуклеотидов R2 ретротранспозона В germanica Показано, что полноразмерная копия R2 мобильного элемента имеет размер 4343 пн, из которых 3477 пн соответствуют единственной открытой рамке считывания В предсказанной in silico последовательности аминокислот выявленной открытой рамки считывания определены функционально значимые домены три домена цинковых пальцев и высококонсервативный домен обратной транскриптазы

5) Определена последовательность нуклеотидов нового варианта нетранскрибируемого спейсера рДНК рыжего таракана Показано, что в отличие от описанного ранее, новый вариант содержит протяженную А/Т богатую область В составе нового варианта нетранскрибируемого и внешнего транскрибируемого спейсеров выявлено 10 типов субповторов протяженностью от 10 до 150 пн

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1) Каграманова АС, Королев АЛ, Шал К, Муха ДВ Полиморфизм длин интегрированных копий R1 - R2 ретротранспозонов рыжего таракана (Blattella germanica) как потенциальный маркер для популяционных и филогенетических исследований II Генетика 2006 Т 42 С 501-506

2) Mukha D V, Kagramanova A S , Lazebnaya IV, Lazebnyi О E , Vargo E L and Schal С Intraspecific Variation and Population Structure of the German Cockroach, Blattella germanica, Revealed with RFLP Analysis of the Non-transcribed Spacer Region of Ribosomal DNA//Medical and veterinary entomology 2007 V 21 P 132-140

3) Каграманова А С, Капелинская T В, Королев А Л, Муха Д В Ретротранспозоны R1 и R2 рыжего таракана Blattella germanica сравнительный анализ интегрированных в геном 5'-укороченных копий II Молекулярная биология 2007 Т 41 С 608-615

Тезисы докладов на конференциях-

1) Каграманова АС Выявление и структурный анализ ретротранспозонов рыжего таракана Blattella germanica 9-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века Пущино, 2005,17-21 апреля, С 27

2) Каграманова А С, Капелинская Т В, Королев А Л, Муха Д В Сравнительный анализ интегрированных в геном «5'-недотранскриптов» R1 и R2 ретротранспозонов рыжего таракана Blattella germanica 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века Пущино, 2006, 17-21 апреля, С 20

3) Kagramanova A S, Mukha D V Characterization of the cocroach R1 retrotransposable elements Международное рабочее совещание «Происхождение и эволюция биосферы» Новосибирск, 2005, 26-29 июня, С 278

4) Каграманова А С, Муха Д В Внутривидовой полиморфизм структуры нетранскрибируемых спейсеров рибосомной ДНК рыжего таракана Blattella germanica анализ наследования различных структурных вариантов Международная научная конференция «Ломоносов-2006» Москва, 2006,12-15апреля, С 101

5) Муха Д В , Каграманова А С , Капелинская Т В , Королев А Л , Лазебная И В , Мысина В А , Чумаченко А Г Анализ структурно-функциональной организации и эволюционной изменчивости кластера рибосомальных генов насекомых Отчетная конференция «Динамика Генофондов растений, животных и человека» Москва, 2006, С 45

6) Муха Д В , Капелинская Т В , Королев А Л , Мысина В А , Каграманова А С Анализ структурно-функциональной организации и эволюционной изменчивости кластера рибосомальных генов насекомых Отчетная конференция «Биоразнообразие и динамика генофондов» Москва, 2007, С 54

7) Каграманова А С , Капелинская Т В , Королев А Л , Муха Д В Структурно-функциональный анализ R2 мобильного элемента рыжего таракана Blattella germanica 4-й Международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» Москва, 2007, 12-16 марта, С 276-277

Подписано в печать 03 10.2007 г Исполнено 04 10 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 807 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (¿195) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каграманова, Арина Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭВОЛЮЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ РИБОСОМНОЙ ДНК ЭУКАРИОТ.

1.1 Ключевые процессы регуляции биосинтеза рибосом.

1.2 Организация кластера рибосомных генов в геноме эукариот.

1.3 Межгенный спейсер рибосомной ДНК.

1.3.1 Структура промотора Pol I и его регуляторные элементы.

1.3.2 РНК-полимераза I.

1.4 Эволюционная изменчивость рибосомной ДНК эукариот.

2. МОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ЭУКАРИОТ.

2.1 Общая характеристика мобильных элементов.

2.2 Типы мобильных элементов.

2.2.1 ДНК-транспозоны.

2.2.2 Ретротранспозоны.

2.2.3 Ретрогены (неавтономные ретротранспозоны).

2.2.4 Новые группы мобильных элементов.

2.3 Инсерции в гены рибосомных РНК.

2.3.1 Выявление подсемейств внутри клад R-элементов.

2.4. Эволюционная изменчивость R1 и R2 ретротранспозонов.

2.4.1 Эволюционная изменчивость R1 элементов.

2.4.2 Эволюционная изменчивость R2 ретротранспозонов.

2.5. Механизм интеграции R1 и R2 ретротранспозонов как представителей класса LINE-элементов.

2.6 Применение ретротранспозонов в качестве генетических маркеров.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Выборки В. germanica из природных популяций, использованных в данной работе.

Условия содержания В. germanica.

Постановка скрещиваний.

Выделение тотальной ДНК тараканов.

Полимеразная цепная реакция.

Электрофорез.

Получение очищенных продуктов ПЦР.

Лигирование фрагментов ДНК.

Трансформация клеток Е. coli и селекция колоний.

Приготовление компетентных клеток E.coli.

Трансформация компетентных клеток E.coli.

Выделение плазмидной ДНК методом быстрого лизиса для идентификации истинных рекомбинантов.

Выделение плазмидной ДНК для секвенирования.

Анализ клонов на наличие вставки и ее размеров с помощью ПЦР.

Секвенирование.

Саузерн-блот гибридизация.

Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. АНАЛИЗ НАСЛЕДОВАНИЯ ПОЛИМОРФНЫХ H/WDIII - РДНК МАРКЕРОВ.

2. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА R1 И R

РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ РЫЖЕГО ТАРАКАНА.

2.1 Выявление интегрированных копий R1 и R2 элементов у представителей отряда Тараканы.

2.2 Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей клонированных 5'-укороченных копий R1 и R2 ретротранспозонов рыжего таракана.

2.3 Скрининг библиотеки генов рыжего таракана для выявления полноразмерных копий R1 и R2 ретротранспозонов.

2.4 Структурно-функциональная характеристика полноразмерной копии R2 ретротранспозона рыжего таракана.

3. КЛОНИРОВАНИЕ, СЕКВЕНИРОВАНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ НЕТРАНСКРИБИРУЕМЫХ СПЕЙСЕРОВ РДНК РЫЖЕГО ТАРАКАНА В. GERMANICA.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ структурной организации R1/R2 ретротранспозонов и нетранскрибируемого спейсера рибосомной ДНК рыжего таракана Blattella germanica"

Кластер рибосомных генов (рДНК) является классическим примером мультигенного семейства; у разных видов эукариот в пределах одного кластера располагается от нескольких сотен до нескольких тысяч структурных единиц. У всех видов эукариот каждая единица транскрипции рДНК кодирует 18S; 5,8S; 28S, перечисленные в порядке их расположения, начиная с 5'-конца. При этом повторяющиеся единицы не разбросаны по геному, а формируют кластеры, в которых гены рРНК (18S; 5,8S; 28S) разделены рядом спейсерных последовательностей - внутренними транскрибируемыми (ITS1 и IT32), внешним транскрибируемым (ETS) и межгенными (IGS), или нетранскрибируемыми (NTS) спейсерами.

Одной из отличительных черт эволюционной изменчивости рДНК является тот факт, что степень вариабельности различных участков этих генов сильно отличается. Гены рибосомных РНК представляют собой наиболее эволюционно консервативные последовательности кластера рДНК, а межгенный спейсер (IGS) - наиболее изменчивую часть этого участка генома. В пределах одного генома может содержаться несколько типов IGS. Анализ изменчивости данного района рДНК позволяет проследить первые этапы эволюционного процесса, т.е. возникновение индивидуальных, внутрипопуляционных и межпопуляционных генетических различий, предшествующих возникновению нового вида. Регуляторные элементы IGS, такие как промоторы, энхансеры и терминаторы транскрипции рРНК, играют важную роль в регуляции транскрипции рРНК, процессинге пре-рРНК и возможно, в регуляции числа повторов рДНК. Очевидно, что структура IGS имеет важное функциональное значение, поскольку различные типы IGS обусловливают различный уровень экспрессии находящихся под их контролем генов рРНК. Описание структуры различных вариантов нетранскрибируемых спейсеров эукариот позволит прояснить влияние данных последовательностей на транскрипционную активность рибосомных генов.

В настоящее время структура IGS многих видов остается неизвестной. В данной работе описана структурная организация двух вариантов IGS рыжего таракана Blattella germanica и проведен сравнительный анализ этих последовательностей.

Известно, что одной из важных составляющих генома эукариот являются мобильные генетические элементы (МГЭ). Доля генома, приходящаяся на мобильные элементы может составлять десятки процентов. Изучение МГЭ является важным направлением исследований в области молекулярной генетики и молекулярной эволюции.

Известно, что кластеры рибосомных генов многих эукариот служат так называемой «нишей» для множества семейств мобильных элементов. Первыми в данном участке генома были идентифицированы R1 и R2 ретротранспозоны D. melanogaster, которые интегрируются в высококонсервативный район 28S гена [Dawid and Rebert, 1981;. Roiha et al., 1981]. Оба элемента (как R1, так и R2) выявлены в идентичных сайтах у всех исследованных видов типа Членистоногие и, в частности, насекомых. Данные элементы относятся к несодержащим длинных концевых повторов (non-LTR) ретротранспозонам и являются стабильным компонентом генома членистоногих, несмотря на то, что инсерциии приводят к инактивации генов 28S рРНК.

Механизм интеграции R1 и R2 ретротранспозонов являлся предметом изучения многих авторов. Несмотря на общность этого механизма для всех non-LTR ретротранспозонов, детали процесса интеграции R1 и R2 ретротранспозонов значительно различаются между собой и, следует отметить, не каждый этап жизненного цикла этих мобильных элементов изучен к настоящему времени достаточно полно.

Цели и задачи исследования

В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи данного исследования:

1) Провести анализ наследования различных структурных вариантов (/-//ndlll паттернов) рДНК рыжего таракана в ряду 12 поколений.

2) Амплифицировать, клонировать и секвенировать протяженные фрагменты R1 и R2 мобильных элементов рыжего таракана (5'-укороченные копии), интегрированные в 28S гены рибосомных РНК, и провести их структурно-функциональный анализ.

3) Дать структурно-функциональную характеристику клонов, содержащих полноразмерные копии R1 и R2 ретротранспозонов библиотеки генов рыжего таракана, полученной на основе космидного вектора (SuperCosI cosmid "Stratagene"). Описать структуру полноразмерной копии R2 ретротранспозона.

Научная новизна и практическая ценность работы

Разработка молекулярно-генетических маркеров, позволяющих дифференцировать популяции живых организмов, представляется актуальной задачей, особенно, когда объектом исследования является генетически мало изученный синантропный паразит рыжий таракан. В рамках диссертационной работы показано стабильное наследование различных структурных вариантов рДНК (H/ndlll паттернов) в ряду 12 поколений зтого вида насекомых, то есть в течение пяти лет существования изосамочьей линии. Исследование стабильности наследования молекулярно-генетического маркера является необходимым этапом на пути к практическому применению изучаемого маркера для дифференциации популяций тараканов, определения генетических дистанций между ними и уровня миграции. Успешное развитие исследований в данном направлении позволит установить основные пути переноса тараканов и, соответственно, сфокусировать санэпидемиологический надзор в правильном направлении.

Впервые выявлены, клонированы и секвенированы протяженные фрагменты (5'-укороченные копии), интегрированных в геном ретротранспозонов R1 и R2 рыжего таракана В. germanica. Сравнительный структурный анализ полученных клонов позволил выделить два подсемейства элементов R1, значительно отличающихся по нуклеотидной последовательности. Однако все клоны R1 элементов В. germanica имели две общие черты -политимидиновый участок (поли (Т)) и сходные дупликации сайта интеграции. В нуклеотидной последовательности элементов R2 найдены характерные делеции в 3'-области сайтов-мишеней и отсутствие гомополинуклеотидных участков.

Показано, что ретротранспозоны R1 В. germanica являются первыми представителями мобильных элементов клады R1 ретротранспозонов, содержащими на 3'-концах политимидиновые последовательности.

Определена полная последовательность нуклеотидов R2 мобильного элемента В. germanica. Показано, что полноразмерная копия R2 мобильного элемента имеет размер 4343 пн, из которых 3477 пн соответствуют единственной открытой рамке считывания (ORF). В предсказанной in silico последовательности аминокислот выявленной ORF определены функционально значимые домены: три домена цинковых пальцев и высококонсервативный домен обратной транскриптазы (Rt).

Проведен филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей аминокислот, соответствующих высококонсервативному Rt домену ORF R2 мобильных элементов различных видов насекомых и ракообразных. Можно заключить, что R2 ретротранспозон В. germanica является наиболее древним представителем этого класса мобильных элементов насекомых.

Известно, что межгенный спейсер рДНК (IGS) эукариот содержит субповторы, обуславливающие регуляцию активности промотора РНК полимеразы I - потенциального уникального инструмента для решения многих экспериментальных задач методами генетической инженерии [Paule & Lofquist, 1996; Sollner-Webb & Tower, 1986; Massin et al., 2005]. В рамках данной работы впервые проведен сравнительный анализ двух вариантов IGS В. germanica и показаны различия в количестве и типе внутренних субповторов данных последовательностей. Впервые описана структура и локализация выявленных субповторов, что открывает возможность дальнейшей экспериментальной проверки их функциональной значимости.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Каграманова, Арина Сергеевна

выводы

2) Выявлены, клонированы и секвенированы протяженные фрагменты (5'-укороченные копии), интегрированных в геном R1 ретротранспозонов рыжего таракана В. germanica. Сравнение последовательностей нуклеотидов фрагментов R1 ретротранспозонов позволило выделить два подсемейства этого типа мобильных элементов в геноме рыжего таракана, сильно различающихся по нуклеотидному составу З'-концевой области (48.5%-сходства).

3) Впервые в кладе R1 ретротранспозонов эукариот выявлены мобильные элементы, содержащие на З'-концах протяженные политимидиновые мотивы.

4) Определена полная последовательность нуклеотидов R2 ретротранспозона В. germanica. Показано, что полноразмерная копия R2 мобильного элемента имеет размер 4343 пн, из которых 3477 пн соответствуют единственной открытой рамке считывания. В предсказанной in silico последовательности аминокислот выявленной открытой рамки считывания определены функционально значимые домены: три домена цинковых пальцев и высококонсервативный домен обратной транскриптазы.

5) Определена последовательность нуклеотидов нового варианта нетранскрибируемого спейсера рДНК рыжего таракана. Показано, что в отличие от описанного ранее, новый вариант содержит протяженную А/Т богатую область. В составе нового варианта нетранскрибируемого и внешнего транскрибируемого спейсеров выявлено 10 типов субповторов протяженностью от 10 до 150 пн.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каграманова, Арина Сергеевна, Москва

1. Гвоздев В. А. Подвижная ДНК эукариот. Часть I. Структура, механизмы перемещения и роль подвижных элементов в поддержании целостности хромосом II СОЖ. 1998. Т. 8. С. 8-14.

2. Глазер В.М. Конверсия гена II СОЖ. 2000. Т. 6. №1. С. 23-31.

3. Евгеньев М. Б. Мобильные элементы и эволюция генома II Молекулярная биология. Т. 42. С. 234-245.

4. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск, 2003,460 с.

5. Зиновьева Н.А., Гладырь Е.А., Эрнст Л.К., Брем Г. 2002. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных. Дубровицы: ВИЖ, 113 с.

6. Ким А., Пасюкова Е., Карпова Н., Разоренова О. Геномные факторы, регулирующие транспозиции мобильных элементов дрозофилы // Генетика. 1999. Т. 35. С. 1511-1521.

7. Кусулиду Л., Карпова Н., Разоренова О., Глухов И., Ким А., Любомирская Н., Ильин Ю. Мобильный генетический элемент МДГ4 (gypsy) в линиях Drosophila melanogaster. Особенности структуры,и регуляция транспозиции // Генетика. 2001. Т. 37. С. 15891597.

8. МаниатисТ., Фрич Э., СэмбрукДж. Молекулярное клонирование. Москва, Мир, 1984.

9. Муха Д. В., Андреева Л. Е., Ильичев А. В. Анализ экспрессии чужеродного генетического материала под конторолем гетерогенного промоторов в процессе раннего развития вьюна (Misqunus fassilis) II Генетика. 1996. Т. 32. С. 13487-1391.

10. Муха Д. В., Вигманн Б. М., Шал К. Сальтационные изменения в структуре кластера рибосомных генов в процессе эволюции тараканов рода Blattella II ДАН. 1999. Т. 364. С. 134-139.

11. Нефедова Л., Ким А. Мобильный элемент НВ в геноме Drosophila те/а/7ода$?е/:структурный и функциональный анализ // Генетика. 2007. Т. 43. С. 620632.

12. Пасюкова Е. Г., Нуждин С. В., Филатов Д. Ф„ Гвоздев В. А. Ретротранспозоны геном хозяина: механизмы и эффекты взаимодействия // Молекулярная биология. 1999. Т. 33. С. 26-37.

13. Ратнер В.А., Васильева Л.А. Роль мобильных генетических элементов (МГЭ) в микроэволюции // Генетика. 1992. Т. 28. С. 5-17.

14. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. Москва, Мир, 1998.

15. Appels R., Gerlach W., Dennis E., Swift H., Peacock W. Molecular and chromosomal organization of DNA sequences coding for the ribosomal RNAs in cereals // Chromosoma. 1980. V. 78. P. 293-311.

16. Aranishi F. PCR-RFLP analysis of nuclear nontranscribed spacer for Mackerel species identification // J. Agric. Food Chem. 2005. V. 53. P. 508-511.

17. Arkhipova I., Lyubomirskaya N., Ilyin Y. Drosophila retrotransposons// RG Landers; Austin. Tex. 1995.

18. Arkhipova I., Pyatkov K., Meselson M., Evgen'ev M. Retroelments containing introns in diverse invertebrate taxa II Nature Genet. 2003. V. 33. P. 123-124.

19. Badal M., Portela A., Xamena N., Carbe O. Molecular and bioinformatics analysis of the FB-NOF transposable element II Gene. 2006. V. 371. P. 130-135.

20. Bailey J. A., Liu G., Ehler E.E. An Alu transposition model for the origin and expansion of human segmental duplications // Genom Research. 2003. V. 73. P. 823-834.

21. Bartsch !., Schoneberg С., Grummt I. Evolutionary changes of sequences and factors that direct transcription termination of human and mouse ribosomal genes // Mol. Cell. Biol. 1987. V. 7. P. 2521- 2529.

22. Bateman E., lida C„ Kownin P., Paule M. Footprinting of ribosomal RNA genes by transcriptions initiation factor and RNA polymerase I // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 8004-8008.

23. Bateman E., Paule M. Regulation of eukaryotic ribosomal RNA transcription by RNA polymerase modification // Cell. 1986. V. 47. P. 445-450.

24. Berg D., Howe M.M. Mobile DNA. Washington: Amer. Soc. Microb. 1989.

25. Berg J. M. Zinc fingers and other metal-binding domains // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 6513-6516.

26. Besansky N. A retrotransposable element from the mosquito Anopheles gambiae.l/ Moll. Cell. Biol. 1990. V. 10 P. 863-871.

27. Besansky N., Bedell J., Mukabayire O. Q: a new retrotransposon from the mosquito Anopheles gambiaell Insect. Mol. Biol. 1994. V. 3. P. 49-56.

28. Bird A. A study of early events in ribosomal gene amplification // Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol. 1978. V. 42. P. 1179-1183.

29. Birnstiel M., Chipchase M., Speirs J. The ribosomal RNA cistrons II Prog. Nucleic Acid. Res. Mol. Biol. 1971. V. 11. P. 351-389

30. Blinov A., Sobanov Y., Bogachev S., Donchenko A., Filippova M. The Chironomus thummi genome contains a non-LTR retrotransposon // Mol. Gen. Genet. 1993. V. 237. P. 412-420.

31. Boyd D. C., Greger I., Murphy S. In vivo footprinting studies suggest a role for chromatin in transcription of the human 7SK gene // Gene. 2000. V. 247. P. 33-44.

32. Brosius J. Genomes were forged by massive bombardments and retroelements and retrosequences II Genetica. 1999. V. 107. P. 209-238.

33. Brun R., Ryan K., Sollner-Webb B. Factor C, the specific initiation of the mouse RNA polymerase I holoenzyme, is inactivated early in the transcription process // Moll. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 5010-5021.

34. Bunikis J., Barbour A. Ticks have R2 retrotransposons but not the consensus transposon target site of other arthropods // Insect. Mol. Biol. 2005. V. 14. P. 465-474.

35. Burke D., Malik H.S., Jones J.P., Eickbush Т.Н. The domain structure and retrotransposition mechanism of R2 elements are conserved throughout arthropods. Mol. Biol. Evol. 1999. V. 16. P. 502-511.

36. Burke W., Malik H., Rich S., Eickbush T. Ancient lineages of non-LTR retrotransposons in the primitive eukaryote, Giardia lamblia // Mol. Biol. Evol. 2002. V. 19. P. 619-630.

37. Burke W., Milller F., Eickbush T. R4, a non-LTR retrotrasposon specific to the large subunit rRNA gene of nematodes // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4628-4634.

38. Burke W., Singh D., Eickbush T. R5 retrotransposons insert into a family of infrequently transcribed 28S rRNA genes of Planaria // Mol. Biol. Evol. 2003. V. 20. P. 1260-1270.

39. Burke W.D., Eickbush D.G., Xiong Y., Jakubczak J., Eickbush Т.Н. Sequence relationship of retrotransposable elements R1 and R2 within and between divergent insect species // Mol. Biol. Evol. 1993. V. 10. P. 163-185.

40. Burke W.D., Malik H.S., Lathe W.C., Eickbush Т.Н. Are retrotransposons long-term hitchhikers? // Nature. 1998. V. 392. P. 141-142.

41. Busby S., Reeder R. Spacer sequences regulate transcription of ribosomal gene plasmids injected into Xenopus embryos // Cell. 1983. V. 34. P. 989-996.

42. Busseau I., Berezikov E., Bucheton A. Identification of Waldo-A and Waldo-B, two closely related non-LTR retrotransposons in Drosophila // Mol. Biol. Evol. 2001. V. 18. P. 196-205.

43. Butler D., Metzenberg R. Expansion and contraction of the nucleolus organizer region of Neurospora: changes originate in both proximal and distal segments // Genetics. 1993. V. 126. P. 325-333.

44. Cassidy В., Yang-Yen H., Rothblum L. Additional RNA polymerase I initiation site within the nontranscribed spacer of the rat rRNA gene// Mol. Cell. Biol. 1987. V. 7. P. 2388-2396.

45. Cheng C., Tsuchimoto S., Ohtsubo H., Ohtsubo E. Tnr8, a foldback transposable element from rice // Genes Genet. Syst. 2000. V. 75. P. 327-333.

46. Choe S., Schultz M., Reeder RJn vitro definition of the yeast RNA polymerase l promoter// Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 279-285.

47. Christensen S. M., Bibillo A., Eickbush Т.Н. Role of the Bombyx mori R2 element N-terminal domain in the target-primed reverse transcription (TPRT) reaction // Nucleic Acids Res.2005. V. 33. P. 6461-6468.

48. Christensen S.M., Eickbush Т.Н. R2 target-primed reverse transcription: ordered cleavage and polymerization steps by protein subunits asymmetrically bound to the target DNA // Mol. Cell. Biol. 2005. V. 25. P. 6617-6628.

49. Christensen S., Ye J., Eickbush T. RNA from the 5' end of the R2 retrotransposon controls R2 protein binding to and cleavage of its DNA target site // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2006. V. 103. P. 17602-17607.

50. Clos J., Normann A., Ohrlein A., Grummt I. The core-promoter of mouse rDNA consist of two functionally distinct domains// Nucleic Acids Res. 1986. V.14. P.7581-7595.

51. Coffin J., Hughes S., Varmus H. In: Retroviruses Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1997.

52. Comai L„ Zomerdijk В., Beckmann H., Zhou S., Admon A., Tjian R. Reconstitution of transcription factor SL1: exclusive binding of TBP by SL1 or TFIID subunits // Science. 1994. V. 266. P. 1966-1972.

53. Cullis C., Charlton L. The induction of ribosomal DNA changes in flax // Plant Sci. Lett. 1981. V. 20. P. 213-217.

54. Culotta V., Wilkinson J., Sollner-Webb B. Mouse and frog violate the paradigm of species-specific transcription of ribosomal RNA genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 7498-7502.

55. D'Alessio J., Perna P., Paule M. DNA-dependent RNA polymerases from Acanthamoeba castellanii: Comparative subunit structure of the homogeneous enzymes // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 1122-11287.

56. Dawid I., Rebbert M. Expression of ribosomal insertion in Drosophila: sensitivity to intercalating drugs // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 1267-1277.

57. Dawid I., Rebert M. Nucleotide sequence at the boundaries between gene and insertion regions in the rDNA of D. melanogasterII Nucleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 5011-5020.

58. De Winter R., Moss T. Spacer promoters are essential for efficient enhancement of X. laevis ribosomal trancription // Cell. 1986. V. 44. P. 313-318.

59. Di Nocera P., Casari G. Related polypeptides are encoded by Drosophila F elements, I factors, and mammalian L1 sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 58435847.

60. Doolittle R., Feng D., Johnson M., McClure M. Origins and evolutionary relationships of retroviruses // Q Rev Biol. 1989. V. 64. P. 1-30.

61. Dover G. Molecular drive: a cohesive mode of species evolution // Nature. 1982. V. 299. P. 731-732.

62. Edwards A., Kane C., Young R., Kornberg R. Two dissociable subunits of yeast RNA polymerase II stimulate the initiation of transcription at a promoter in vitro II J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 71-75.

63. Eickbush H., Eickbush D. Finely orchestrated movements: evolution of the ribosomal RNA дёпёв // Genetics. 2007. V. 175. P. 477-485.

64. Ejima Y., Yang L. Trans mobilization of genomic DNA as a mechanism for retrotransposon-mediated exon shuffling // Human Mol. Genet. 2003. V. 12. P. 1321-1328.

65. Elder J. Concerted evolution of repetitive DNA sequences in eukaryotes // The Quarterly Review of Biology. 1995. V. 70. P. 297-320.

66. Elion E., Warner J. An RNA polymerase I enhancer in Saccharomyces cerevisiae // Mol. Cell. Biol. 1986. V. 6. P. 2089-2097.

67. Evgen'ev M„ Arkhipova I. Penelope-l'ike elements a new class of retroelements: distribution, function and possible evolutionary significance // Cytogenet. Genome Res. 2005. V. 110. P. 510-521.

68. Evgen'ev M., Zelentsova E., Shostak N., Kozitsina M„ Barsky V., Corses V. Penelope, a new family of transposable elements and its possible role in hybrid dysgenesis in D. virilis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 196-201.

69. Feng Y. Plant MITEs: useful tools for plant genetics and genomics // Genomics Proteomics Bioinformatics. 2003. V. 1. P. 90-99.

70. Financsek I., Mizumoto K., Mishima Y„ Muramatsu M. Human ribosomal RNA gene: Nucleotide sequence of the transcription initiation region and comparison of three mammalian genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 3092-3096.

71. Finnegan D., Rubin G., Young M., Hogness D. Repeated gene families in Drosophila melanogaster/I Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1978. V. 42. P. 1053-1063.

72. Finnegan D.J. Transposable elements: How non-LTR retrotransposons do it // Current Biology. 1997. V. 7. P. 245-248.

73. Firec S., Read C., Smith D., Moss T. Point mutation analysis of the Xenopus leavis RNA polymerase I core promoter//Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 105-109.

74. Fujiwara H., Ogura Т., Takada N. Miyajima N., Ishikawa H., Maekawa H. Introns and their flanking sequences of Bombyx mori rDNA // Nucleic Acids Res. 1984. V. 12. P. 6861-6869.

75. Gabrielsen O., Sentenac A. RNA polymerase С (III) and its transcription factors // Trends Biochem. Sci. 1991. V. 16. P. 412-416.

76. Gardner M., Hall N., Fung E., White O., Bettiman M., Hyman R., Carlton J., Pain A., Nelson K., Bowman S., et. al. Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum II Nature. 2002. V. 419. P. 498-511.

77. Gebow D., Miselis N., Liber H. L. Homologous and nonhomologous recombination resulting in deletion: effects of p53 status, microhomology, and repetitive DNA length and orientation // Mol. Cell. Biol. 2000. V. 20. P. 4028-4035.

78. Geiduschek E., Tocchini-Valentini G. Transcription by RNA polymerase III // Annu. Rev. Biochem. 1998. V. 57. P. 873-914.

79. George J., Eickbush T. Conserved features at the 5' end of Drosophila R2 retrotransposable elements: implications for transcription and translation // Insect Mol. Biol. 1999. V. 8. P. 310.

80. George J.A., Burke W.D., Eickbush Т.Н. Analysis of the 5' junctions of R2 insertions with the 28S gene: implications for non-LTR retrotransposition // Genetics. 1996. V. 142. P. 853863.

81. Gerbi S. A. Evolution of ribosomal DNA // In: Molecular Evolutionary genetics. N.Y.: Plenum, 1985. P. 419-517.

82. Gokal P., Mahajan P., Thompson E. Hormonal regulation of transcription of rDNA. Formation of initiated complexes by RNA polymerase in vitro // J. Biom. Chem. 1990. V. 265. P. 16234-16243.

83. Golubovsky M. Mobile genetics and forms of heritable changes in eukaryotes // Биополимеры и клетка. 1995. V. 11. P. 29-38.

84. Gray M., Schnare M. Evolution of rRNA gene organization. In: Ribosomal RNA structure, evolution, processing, and function in protein biosynthesis (Eds. Zimmerman & Dahlberg A.). 1996. P. 49-70. New York. CRC Press.

85. Gray Y.H. It takes two transposons to tango: transposable-element-mediated chromosomal rearrangements // Trends in Genetics. 2000. V. 16. P. 461-468.

86. Grimaldi G., Di Nocera P. Multiple repeated units in Drosophila melanogaster ribosomal DNA spacer stimulate rRNA precustor transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 5502-5506.

87. Grimaldi G., Fiorentini P., Di Nocera P. Spacer promoters are orientation-dependent activators of pre-rRNA transcription in Drosophila melanogaster II Mol. Cell. Biol. 1990. V. 10. P. 4667-4677.

88. Grummt I., Kuhn A., Bartsch I., Rosenbauer H. A transcription terminator located upstream of the initiation site affects rRNA synthesis// Cell. 1986. V. 47. P. 901-911.

89. Grummt I., Maier U., Ohrlein A., Hassouna N., Bachellerie J. Transcription of mouse rDNA terminates downstream of the 3' end of 28S RNA and involves interaction of factors with repeated sequences in the 3' spacer // Cell. 1985. V. 43. P. 901-911.

90. Guerreiro M., Fontdevila A. Molecular characterization and genomic distribution of Isis: a new retrotransposon of Drosophila buzzatii II Mol. Genet. Genomics. 2007. V. 277. P. 8395.

91. Henderson A., Eicher E., Yu M., Atwood K. Variations in RNA gene number in mouse chromosome // Cytogenet. Cell. Genet. 1976. V. 17. P. 307-316.

92. Henderson S., Ryan K., Sollner-Webb B. The promoter-proximal rDNA terminator augments initiation by preventing disruption of the stable transcription complex caused by polymerase read-in II Genes Dev. 1989. V. 3. P. 212-223.

93. Henderson S., Sollner-Webb B. A transcriptional terminator is a novel element of the promotor of the mouse ribosomal RNA gene // Cell. 1986. V. 47. P. 891-900.

94. Henderson S., Sollner-Webb B. The mouse ribosomal DNA promoter has more stringent requirements in wVothan in vitro II Mol. Cell. Biol. 1990. V. 10. P. 4970-4973.

95. Hillis D., Dixon M. Ribosomal DNA: molecular evolution and philogenetic inference // Q. Rev. Biol. 1991. V. 66. P. 411-453.

96. Hohjoh H., Singer M. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA II EMBO J. 1996. V. 15. P. 630-639.

97. Holliday R. Gene conversion: a possible mechanism for eliminating selfish DNA // Molecular and cellular mechanisms of mutagenesis. Plenum press, New York. 1982.

98. Hori Y., Tanaka Т., Kikuchi Y. In vitro cleavage of Drosophila 2S rRNA by M1 RNA // Nucleic Acids Symposium Series. 2000. V. 44. P. 93-94.

99. Huet J., Buhler J., Sentenac A., Fromageot P. Dissociation of two polypeptide chains from yeast RNA polymerase A // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 3034-3038.

100. H'in Y., Anan'ev E., Churikov N., Gvozdev V., Georgiev G. A new type of organization of the genetic material in eukaryotes // Biol. Bull. Acad. Sci. USSR. 1978. V. 5. P. 607-610.

101. Jakubczak J., Xiong Y., Eickbush Т.Н. Type 1 (R1) and Type 2 (R2) ribosomal DNA insertions of Drosophila melanogaster are retrotransposable elements closely related to those of Bombyx moriII J. Mol. Biol. 1990. V. 212. P. 37-52.

102. Jones M., Learned R., Tjian R. Analysis of clustered point mutations in the human ribosomal RNA gene promoter by transient expression in vivo II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 669-673.

103. Kajikawa M., Ohshima K., Okada N. Determination of the entire sequence of turtle CR1: The first open reading frame of the turtle CR1 element encodes a protein with a novel zinc finger motif//Mol. Biol, and Evol.1997. V. 14. P. 1206-1217.

104. Kalendar R., Vicient C., Peleg O. Large retrotransposon derivatives: abundant, conserved but nonautonomous retroelements of barley and related genomes // Genetics. 2004. V. 166. P. 1437-1450.

105. Kaminker J., Bergman C., Kronmiller В., Carlson J., Svirscas R., Patel S., Frise E., et. al. The transposable elements of the D. melanogaster euchromatin: a genomic perspective // Genome Biol. 2002. V. 3. P. RESEARCH0084.Epub.

106. Kapitonov V., Jurka J., Rolling-circle transposons in eukaryotes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 8714-8719.

107. Kass D.H., Batzer M.A., Deininger P.L. Gene conversion as a secondary mechanism of short interspersed element (SINE) evolution // Mol.Cell. Biol. 1995. V. 15. P. 19-25.

108. Kazazian H. Mobile elements: drivers of genome evolution // Science. 2004. V. 303. P. 1626-1632.

109. Kerrebrock A., Srivastava R., Gerbi S. Isolation and characterization of ribosomal DNA variants from Sciara coprophila II J. Mol. Biol. 1989. V. 210. P. 1-13.

110. Kidd S„ Glover D. Drosophila melanogaster rDNA containing type II insertions is variable transcribed in different strains and tissues//J. Mol. Biol. 1981. V. 151. P. 645-662.

111. Kidwell M.G., Lisch D. R. Perspective: transposable elements, parasitic DNA, and genome evolution // Evolution. 2001. V. 55. P. 1-24.

112. Kidwell M.G., Lisch D.R. Transposable elements as sourses if genomic variation // in Mobile DNA II. 2002. P. 59-93.

113. Kim A., Belyaeva E., Aslanyan M. Autonomous transposition of gypsy mobile elements and genetic instability in Drosophila melanogaster I/ Mol. Gen. Genet. 1990. V. 224. P. 303-308.

114. Kishimoto Т., Nagamine M., Sasaki Т., Tarakusa N., Miwa Т., Kominami R., Muramatsu M. Presence of a limited number of essential nucleotides in the promoter region of mouse ribosomal RNA gene // Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. P. 3515-3532.

115. Kiss Т., Marshallsay C., Filipowicz W. Alteration of the RNA polymerase specificity of U3 snRNA genes during evolution and in vitro // Cell. 1991. V. 65. P. 517-526.

116. Kojima K., Fujiwara H. Cross-genome screening of novel sequence-specific non-LTR retrotransposons: various multicopy RNA genes and microsatellites are selected as targets И Mol. Biol. Evol. 2004. V. 21. P. 207-217.

117. Kojima К., Fujiwara H. Evolution of target specificity in R1 clade non-LTR retrotransposons// Mol. Biol. Evol. 2003. V. 20. P. 351-361.

118. Kojima K., Fujiwara H. Long-term inheritance of the 28S rDNA-specific retrotransposon R2 // Mol. Biol. Evol. 2005. V. 22. P. 2157-2165.

119. Kojima K., Kuma K., Toh H., Fujiwara H. Identification of rDNA-specific non-LTR retrotransposons in Cnidaria // Mol. Biol. Evol. 2006. V. 23. P. 1984-1993.

120. Konieczny A.,. Voytas D.F., Cummings M.P., Ausubel F. M. A superfamily of Arabidopsis thaliana retrotransposons // Genetics. 1991. V. 127. P. 801-809.

121. Kownin P., lida C., Brown-Shimer S., Paule M. The ribosomal RNA promoter of Acanthamoeba castellanii determined by transcription in a cell-free system 11 Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. P. 6237-6247.

122. Kramerov C.A., Vassetzky N.S. Short retroposons in eukaryotic genomes // International Review of Cytology. 2005. V. 247. P. 165-221.

123. Kuhn A., Deppert U., Grummt I. A 140-base-pair repetitive sequence element in the mouse rRNA gene spacer enhancers transcription by RNA polymerase I in a cell-free system U Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 7527-7531.

124. Kuhn A., Grummt I. A novel promoter in the mouse rDNA spacer is active in vivo and in vitro II EM BO J. 1987. V. 6. P. 3487-3492.

125. La Volpe A., Taggart M., McStay В., Bird A. DNasel-hypersensitive sites at promoter-like sequences in the spacer of Xenopus laevis and Xenopus borealis ribosomal DNA // Nucleic Acids Res. 1983. V. 25. P. 5361-5380.

126. Labhart P. Identification of two steps during Xenopus ribosomal gene transcription that are sensitive to protein phosphorylation // Mol. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 2011-2020.

127. Labhart P., Reeder R. Heat shock stabilizes highly unstable transcripts of the Xenopus ribosomal gene spacer// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 56-60.

128. Labhart P., Reeder R. Enhancer-like properties of the 60/81 bp elements in the ribosomal gene spacer of Xenopus laevis II Cell. 1984. V. 37. P. 285-289.

129. Lalo D., Carles C., Sentenac A., Thuriaux P. Interactions between three common subunits of yeast RNA polymerases I and III // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P.5524-5528.

130. Learned R., Tjian R. In vitro transcription of human ribosomal RNA genes by RNA polymerase I // J. Mol. Appl. Genet. 1982. V. 1. P. 575-584.

131. Lee M., Van der Ploeg L. Transcription of protein-coding genes in trypanosomes by RNA polymerase I //Annu Rev Microbiol. 1997. V. 51. P. 463-489.

132. Leeton P.R., Smyth D.R. An abundant LINE-like element amplified in the genome of Lilium speciosumll Mol. Gen. Genet. 1993 V. 237. P. 97-104.

133. Liao D. Concerted evolution: molecular mechanism and biological implications // Mol. Evol. 1999. V. 64. P. 24-30.

134. Lobo S., Hernandez N. A 7 bp mutation converts a human RNA polymerase II snRNA promoter into an RNA polymerase III promoter // Cell. 1989. V. 58. P. 55-67.

135. Lofguist A. Organization and expression of eukaryotic ribosomal RNA genes. In: Ribosomal RNA structure, evolution, processing, and function in protein biosynthesis (Eds. Zimmerman & Dahlberg A.). New York. CRC Press. 1996. P. 395-420.

136. Lofquist A., Li H., Imboden M., Paule M. Promoter opening (melting) and transcription initiation by RNA polymerase I requires neither nucleotide beta, gamma hydrolysis nor protein phosphorylation// Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 3233-3238.

137. Lohe A., Roberts P. An unusual Y chromosome of Drosophila simulans earring amplified rDNA spacer without rDNA genes II Genetics. 1990. V. 125. P. 399-406.

138. Long E., Dawid I. Repeated genes in eukaryotes // Annu. Rev. Biochem. 1980. V. 49. P. 727-764.

139. Lovsin N., Gubensek F., Kordi D. Evolutionary dynamics in a novel L2 clade of non-LTR retrotransposons in Deuterostomia//Mol. Biol. Evol. 2001. V. 18. P. 2213-2224.

140. Luan D., Eickbush Т.Н. RNA template requirements for target DNA-primed reverse transcription by the R2 retrotransposable element II Mol. Cell. Biol. 1995. V. 15. P. 38823891.

141. Malik H.S., Burke W.D., Eickbush Т.Н. The age and evolution of non-LTR retrotansposable elements// Mol. Biol. Evol. 1999. V. 16. P. 793-805.

142. Mann C., Buhler J., Treich I., Sentenac A. RPC40, a unique gene for a subunit shared between yeast RNA polymerases A and С // Cell. 1987. V. 48. P. 627-637.

143. Margottin F., Dujardin G„ Gerard M., Egly J., Huet J., Sentenac A. Participation of the TATA factor in transcription of the yeast U6 gene by RNA polymerase С // Science. V. 251. P. 424-426.

144. Markos S., Baldwin B. Structure, molecular evolution, and phylogenetic utility of the 5(') region of the external transcribed spacer of 18S-26S rDNA in Lessingia (Compositae, Astereae) // Mol. Phylogenet. Evol. 2002. V. 23. P. 214-228.

145. Marrelli M., Sallum M., Marinotti O. The second internal transcribed spacer of nuclear ribosomal DNA as a tool for Latin American anopheline taxonomy a critical review // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2006. V. 101. P. 817-832.

146. Martin S., Li W., Furano A., Boissinot S. The structures of mouse and human L1 elements reflect their insertion mechanism//Curr.Opin. Genet. 1991 V. 1. P. 505-508.

147. Massin P., Rodrigues P., Marasescu M., Werf S., Naffakn N. Cloning of the Chicken RNA Polymerase I promoter and use for reverse genetics of influenza a viruses in avian cells II J. Virol. 2005. V. 79. P. 13811-13816.

148. Mateos M., Maekow T. Ribosomal intergenic spacer (IGS) length variation across the Drosophilinae (Diptera: Drosophilidae) // BMC Evolution Biology. 2005. 5:46. doi:10.1186/1471-2148-5-46.

149. McClintock B. The origin and behavior of mutable loci in Maize // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1950. V. 36. P. 344-355.

150. McClintock B. The significance of responses of the genome to challenge // Science. 1984. V. 226. P. 792-801.

151. McStay В., Reeder R. A termination site for Xenopus RNA polymerase I also acts as an element of an adjacent promoter // Cell. V. 47. P. 913-920.

152. Melnikova L., Georgiev P. Drosophila telomeres: the non-telomerase alternative // Chromosome Res. 2005. V. 13. P. 431-441.

153. Memet S., Saurin W., Sentenac A. RNA polymerases В and С are more closely related to each other than to RNA polymerase A // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 1004810051.

154. Miller K., Tower J., Sollner-Webb В. A complex control region of the mouse rRNA gene directs accurate initiation by RNA polymerase I // Mol. Cell. Biol. 1985. V. 5. P. 554562.

155. Miyamoto M. Molecular systematics: Perfect SINEs of evolutionary history? // Curr. Biol. 1999. V. 9. P. 816-819.

156. Mizrokhi L., Georgieva S., and llyin Y. Jockey, a mobile Drosophila element similar to mammalian LINEs, is transcribed from the internal promoter by RNA polymerase IIII Cell. 1988. V. 54, P. 685-691.

157. Moran J.V., Holmes S.E., Naas T.P., DeBerardinis R.J., Boeke J.D., Kazazian H.H. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells // Cell. 1996. V. 87, P. 917927.

158. Morgan G„ Roan J., Bakken A., Reeder R. Variations in transcriptional activity of rDNA spacer promoters//Nucleic Acids Res. 1984. V. 12. P. 6043-6052.

159. Moschetti R„ Marsano R., Barsanti P. FB elements can promote exon shuffling: a promoter-less white allele can be reactivated by FB mediated transposition in Drosophila melanogaster If Mol. Gen. Genomics. 2004. V. 271. P. 394-401.

160. Moss Т., Birnstiel M. The putative promoter of a Xenopus laevis ribosomal gene is reduplicated II Nucleic Acids Res. 1979. V. 6. P. 3733-3743.

161. Moss Т., Stefanovsky V. Promotion and regulation of ribosomal transcription in eukariotes by RNA polymerase III Prog. Nucleic Acids Res. Mol.Biol.1995. V. 50. P. 25-66.

162. Mouches C., Bensaadi N., Salvado J.-C. Characterization of a LINE retroposon dispersed in the genom of three non-sibling Aedes mosquito species II Gene. 1992. V. 120. P. 183-190.

163. Mukha D., Sidorenko A., Lazebnaya I., Wiegmann В., Schal C. Analysis of intraspecies polymorphism in the ribosomal DNA cluster of the cockroach Blattella germanica II Insect Molecular Biology. 2000. V. 9. P. 217-222.

164. Mukha D., Wiegmann В., Schal C. Evolution and phylogenetic information content of the ribosomal DNA repeat unit in the Blattodea (Insecta) // Insect Biochemistry and Mol. Biol. 2002. V. 32. P. 951-960.

165. Mullany P., Roberts A., Wang H. Mechanism of integration and excision in conjugative transposons// Cell Mol. Life Sci. 2002. V. 59. P. 2017-2022.

166. Murtif V., Rae P. In vivo transcription of rDNA spacers in Drosophila // Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. P. 3221-3239.

167. Musters W., Knol J., Maas P., Dekker A., van Heerikhizen H., Planta R. Linker scanning of the yeast RNA polymerase I promoter // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 9661-9678.

168. Nagy Z., Chandler M. Regulation of transposition in bacteria II Res. Microbiol. 2004. V. 155. P. 387-398.

169. Neiman M. and Linksvayer T. The conversion of variance and the evolutionary potential of restricted recombination // Heredity. 2006. V. 96. P. 111-121.

170. Neuhaus H., Muller F., Etter A., Tobler H. Type l-like intervening sequences are found in the rDNA of the nematode Ascaris lumbricoides II Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 7689-7707.

171. Nuzhdin S., Mackay T. The genomic rate'of transposabie element movement in Drosophila melanogaster II Mol. Biol. Evol. 1995. V. 12. P. 180-181.

172. Okazaki S., Ishikawa H., Fujiwara H. Structural analysis of TRAS1, a novel family of telomeric repeat associated retrotransposons in the silkworm, Bombyx топ 11 Mol. Cell. Biol 1995. V. 15 P. 4545-4552.

173. Pape L., Windle J., Sollner-Webb B.Half helical turn spacing changes convert a frog into a mouse rDNA promoter: a distant upstream domain determines the helix face of the initiation site // Genes Dev. 1990. V. 52. P. 52-62.

174. Paule M. Comparative subunit composition of eukariotic nuclear RNA polymerases // Trends Biochem. Sci. 1981. V. 6. P. 128-131.

175. Paule M. In: Tanscription of eukaryotic ribosomal RNA polymerase I (Ed. Paule M.). Springer-Verlag, New York, 1998. P. 39-50.

176. Paule M., Lofguist A. Organization and expression of eukaryotic ribosomal RNA genes. In: Ribosomal RNA structure, evolution, processing, and function in protein biosynthesis (Eds. Zimmerman & Dahlberg A.). 1996. P. 395-420. New York. CRC Press.

177. Paule M., White R. Transcription by RNA polymerases I and III // Nucleic Acids Res. V. 28. P. 1283-1298.

178. Pavelitz Т., Rusche L., Matera A., Scharf J., Weiner A. Concerted evolution of the tandem array encoding primate U2 snRNA occurs in situ, without changing the cytological context of the RNU2 locus // EMBO J. 1995. V. 14. P. 169-177.

179. Pavlakis G., Jordan В., Wurst R., Vournakis J. Sequence and secondary structure of Drosophila melanogaster 5.8S and 2S rRNAs and of the processing site between them // Nucl. Acids Res. 1979. V. 7. P. 2213-2238.

180. Perez-Gonsalez C.E. and Eicbush Т.Н. Rates of R1 and R2 retrotransposition and elimination from the rDNA locus of Drosophila melanogaster II Genetics. 2002. V. 162. P. 799-811.

181. Perez-Gonzalez C.E., Burke W.D., Eickbush Т.Н. R1 and R2 retrotransposition and deletion in the rDNA loci on the X and Y chromosomes of Drosophila melanogaster II Genetics. 2003. V. 165. P. 675-685.

182. Perez-Gonzalez C.E., Eickbush Т.Н. Dynamics of R1 and R2 elements in the rDNA locus of Drosophila simulansm И Genetics. 2001. V. 158. P. 1557-1567.

183. Pfleiderer C., Smid A., Bartsch I., Grummt I. An undecamer DNA sequence directs termination of human ribosomal gene transcription // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 4727-4736.

184. Pikaard C., Pape L. Henderson S., Ryan K., Paalman M., Lopata M., Reeder R., Sollner-Webb B. Enhancers for RNA polymerase I in mouse ribosomal DNA // Mol. Cell. Biol. 1990. V. 10. P. 4816-4825.

185. Pilipenco E., Gmyl A., Maslova S., Svitkin Y., Sinyakov A., Agol V. Procariotic-like cis elements in the cap-independent internal initiation of translation on picornavirus RNA // Cell. 1992. V. 68. P. 119-131.

186. Planta R. In: Tanscription of eukaryotic ribosomal RNA polymerase I (Ed. Paule M.). Springer-Verlag, New York. 1998. P. 51-58.

187. Potter S., Truett M., Phillips M., Maher A. Eucaryotic transposable genetic elements with inverted terminal repeats // Cell. V. 20. P. 639-647.

188. Primagi A., Mizrokhi L., Ilyin Y. The Drosophila mobile element jokey belongs to LINEs and contains coding sequences homologous to some retroviral proteins // Gene. 1988. V. 70. P. 253-262.

189. Pruitt S., Reeder R. Effect of topological constraint on transcription of ribosomal DNA in Xenopus oocytes II J. Mol. Biol. 1984. V. 174. P. 121-139.

190. Radebaugh C., Gong X., Bartholomew В., Paule M. Identification of previously unrecognized common elements in eukaryotic promoters. A ribosomal RNA gene initiator element for RNA polymerase I // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 3141-3144.

191. Ray D. SINEs of progress: mobile element application to molecular ecology // Mol. Ecol. 2007.V. 16. P. 19-33.

192. Reader R. Regulatory elements of the generic ribosomal gene // Curr. Opin. Cell. Biol. 1989. V. 1. P. 466-474.

193. Rebatchouk D., Narita O. Foldback transposable elements in plants // Plant Mol. Biol. 1997. V. 34. P. 831-835.

194. Reeder R. Enhancers and ribosomal gene spacers // Cell. 1984. V. 38. P. 349-351.

195. Reeder R., Pennock D., McStay В., Roan J., Tolentino E., Walker P. Linker scanner mutagenesis of the Xenopus laevis ribosomal gene promoter // Nucleic Acids Res. 1987. V.25. P. 7429-7441.

196. Roeder R. In: RNA polymerases (Eds. Losick R., Chamberlin M.). Cold Spring Harbor, New York. 1976. P. 285.

197. Roiha H., Miller J., Woods L., Glover D. Arrangements and rearrangements of sequences flanking the two types of rDNA insertion in D.melanogaster И Nature. 1981. V. 290. P. 749-753.

198. Ruschak A., Mathews D., Bibillo A., Spinelli S., Childs J., Eickdush Т., Turner D. Secondary structure models of the 3' untranslated regions of diverse R2 RNAs // RNA. 2004. V. 10. P. 978-987.

199. Santoyo G., Romero D. Gene conversion and concerted evolution in bacterial genomes//FEMS Microbiology Reviews. 2005. V. 29. P. 169-183.

200. Sawadogo M., Sentenac A. RNA polymerase В (II) and general transcription factors //Annu. Rev. Biochem. 1990. V. 59. P. 711-754.

201. Schimenti J. Gene conversion and the evolution of gene families in mammals // Soc. Gen. Physiol. Ser. 1994. V. 49. P. 85-91.

202. Schnapp G., Schnapp A., Rosenbauer H., Grummt I. TIF-IC, a factor involved in both transcription initiation and elongation of RNA polymerase I // Moll. Cell Biol. 1993. V. 13. P. 6723-6732.

203. Sheen F.-M., Levis R. Transposition of the LINE-like retrotransposon TART to Drosophila chromosome termini // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 91. P. 12510-12514.

204. Simmen K., Bernues J., Parry H., Stunnenberg H., Berkenstam A., Cavallini В., Egly J., Mattaj I. TFIID is required for in vivo transcription of human U6 gene by RNA polymerase III // EMBO J. 1991. V. 10. P. 1853-1862.

205. Smith S., O'Mahony D., Kinsella В., Rothblum L. Transcription from the rat 45S ribosomal DNA promoter does not require the factor UBF // Gene Expr. 1993. V. 3. P. 229236.

206. Smith S„ Oriahi E., Yang-Yen H.-F., Xie W„ Chen C., Rothblum L. Interaction of RNA polymerase I transcription factors with a promoter in the nontrancribed spacer of rat ribosomal DNA//Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 1677-1685.

207. Sollner-Webb В., Tower J. Transcription of cloned eukaryotic ribosomal RNA genes //Ann. Rev. Biochem. 1986. V. 55. P. 801-830.

208. Stoneley M., Willis A. Cellular internal ribosome entry segments: structures, transacting factors and regulation of gene expression // Oncogene. 2004. V. 23. P. 3200-3207.

209. Takahashi H., Okazaki S., Fujiwara H. A new family of site-specific retrotransposons, SART1, is inserted into telomeric repeats of the silkworm, Bombyx mori II Nucl. Acids Res. 1997. V. 25. P. 1578-1584.

210. Tower J., Culotta V., Sollner-Web B. A factors and nucleotide sequences that direct ribosomal DNA transcription and their relationship to the stable transcription complex // Mol. Cell. Biol. 1986. V. 6. P. 3541-3462.

211. Truett M., Jones R., Potter S. Unusual structure of the FB family of transposable elements in Drosophila II Cell. V.61. P. 2588-2596.

212. Tu Z. Three novel families of miniature inverted-repeat transposable elements are associated with genes of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti H Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 7475-7480.

213. Tyler В. Two complex region, including a TATA sequence, are required for , transcription by RNA polymerase I in Neurospora crassa // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18.1. P. 1805-1811.

214. Udomkit A., Forbes S., Dalgleish G., Finnegan D. BS a novel LINE-like element in Drosophila melanogaster // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 1354-1358.

215. Ullu E., Tschudi C. Alu sequences are proposed 7SL RNA genes // Nature. 1984. V. 312. P. 171-172.

216. Vitte C., Panaud O. LTR retrotransposons and flovering plant genome size: emergence of the increase/decrease model // Cytogenet. Genome Res. 2005. V. 110. P. 91-107.

217. Volff J., Hornung U., Schartl M. Fish retrotransposons related to the Penelope element of Drosophila virilis define a new group of retrotransposable elements // Mol. Genet. Genomics. 2001. V. 265. P. 711-720.

218. Warner J. Synthesis of ribosomes in Saccharomyces cerevisiae II Microbiol. Rev. 1989. V. 53. P. 256-271.

219. Wessler S., Bureau Т., White W. LTR-retrotransposons and MITEs: important players in the evolution of plant genomes// Curr. Opin. Genet. Dev. 1995. V. 5. P. 814-821.

220. Williams S., Kennison J., Robbins L., Strobeck C. Reciprocal recombination and the evolution of the ribosomal gene family of Drosophila melanogaster II Genetics. 1989. V. 122. P. 617-624.

221. Windle J., Sollner-Webb B. Two distant and precisely positioned domains promote transcription of Xenopus laevis rRNA genes: analysis with linker-scanning mutants // Mol. Cell. Biol. 1986. V. 6. P. 4585-4593.

222. Windsor A., Waddell C. FARE, a new family of foldback transposons in Arabidopsis // Genetics. 2000. V. 156. P. 1983-1995.

223. Woychic N., Liao S„ Kolodziej P., Young R. Subunits shares by eukariotik nuclear RNA polymerases // Genes Dev. 1990. V. 4. P. 313-323.

224. Xie W., Rothblum L. Domains of the rat rDNA promoter must be aligned stereospecifically // Mol. Cell. Biol. 1992. V. 12. P. 1266-1275.

225. Xiong Y., Eickbush T. Dong, a non-long terminal repeat (non-LTR) retrotransposable element from Bombyx mori И Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 1318.

226. Xiong Y., Eickbush Т. H. The site-specific ribosomal DNA insertion element R1 Bm belongs to a class of non-long-terminal repeat retrotransposons // Mol. Cell. Biol. 1988. V. 8. P. 114-123.

227. Xiong Y., Eickbush T. Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences // EMBO Journal. 1990. V. 9. P. 3353-3362.

228. Yao M. Amplification of ribosomal RNA gene in Tetrahymena // In: The Cell Nucleus: rDNA. Part С (eds. H. Busch and L. Rothblum). Academic Press. N. Y. 1982. V. 12. P. 127153.

229. Ye J., Eickbush T. Chromatin structure and transcription of the R1 and R2 inserted ribosomal RNA genes of Drosophila melonagaster II Mol. Cell. Biol. 2006. V. 26. P. 87818790.

230. Ye J., Perez-Gonzales C., Eickbush D., Eickbush T. Competition between R1 and R2 transposable elements in the 28S rRNA genes of insects // Cytogenet. Genome Res. 2005. V. 110. P. 299-306.

231. Yuan J., Finney M., Tsung N., Horvitz H. Tc4, a Caenorhabditis elegans transposable element with an unusual foldback structure // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 3334-3338.

Информация о работе

Каграманова, Арина Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.15

Диссертация

Анализ структурной организации R1/R2 ретротранспозонов и нетранскрибируемого спейсера рибосомной ДНК рыжего таракана Blattella germanica - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы