Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ первичной структуры генома альфавирусов серокомплекса СИНДБИС-ЗЭЛ

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Анализ первичной структуры генома альфавирусов серокомплекса СИНДБИС-ЗЭЛ"

Р№сийская академия медицинских наук иь8сМ?уРвирусологииим.д.и.ивановского

На правах рукописи УДК 578.833.1:578.56; 577.214.5; 578.53

ЛЕБЕДЕВ Андрей Юрьевич

АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА АЛЬФАВИРУСОВ СЕРОКОМПЛЕКСА СИНДБИС - ЗЭЛ

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в лаборатории энзимологии Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ -

доктор медицинских наук, профессор Л.В.Урываев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ -

доктор медицинских наук Е.Н.Прокудина доктор биологических наук В.В. Зверев

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ -

НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалея.

Защита диссертации состоится 28 1996 в 14 часов

на заседании специализированного совета Д 001.20.01 при Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН по адресу 123098, Москва, ул.Гамалеи, д. 16.

Автореферат разослан "¿6 " 1996 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор медицинских наук Н.П.Косякова

Актуальность проблемы.

Альфавирусы занимают особое место среди возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных. Медицинское значение некоторых из них определяется способностью вызывать тяжело протекающие нейроинфекции (энцефалиты, энцефаломиелиты). В более легких случаях, альфавирусы становятся причиной геморрагических лихорадок, нередко осложняющихся артритами с ярко выраженным болевым синдромом.

Альфавирусы серокомплекса ВС-ВЗЭЛ имеют широкое распространение в мире и выделяются на всех пяти обитаемых континентах. Широкий спектр возможных хозяев и переносчиков в природных условиях делает указанные вирусы весьма опасными с точки зрения возникновения эпидемических вспышек альфавирусных инфекций. На территории стран СНГ выделено более двух десятков нльфавирусов, относящихся в основном к серокомплексам Спндбис-ЗЭЛ и Леса Семлики (Д.К.Львов и др., 1989).

Немаловажным является то, что некоторые представители данного рода способны не только вызывать заболевания диких животных, обеспечивая тем самым наличие эндемических очагов, но и являются причиной крупномасштабных эпизоотии среди домашних животных. В первую очередь это относится к вирусам Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ), Восточного энцефаломиелита лошадей (ВсЭЛ) и Западного энцефаломиелита лошадей (ЗЭЛ)(Я.51юре, 1984).

С молекулярно-биологической точки зрения альфавирусы представляют собой удобную модель для изучения процессов взаимодействия вируса и клетки. Данные вирусы имеют относительно просто устроенный вирнон, хорошо репродуцируются в различных клетках, что существенно облегчает их препаративное получение и последующий биохимический анализ. Установлено, что репродукция альфавпрусов, как правило, происходит независимо от функции клеточного ядра. Альфавирусы вызывают индукцию интерферона в клетке, что обеспечивает удобную модель для изучения ее защитных механизмов (Ф.И.Ершов и А.С.Новохатский, 1981).

На протяжении ряда лет альфавирусы интенсивно изучались как западными, так и отечественными исследователями (В.М.Жданов и С.Я.Гайдамович, 1982; J.H.Strauss a. E.G. Strauss, 1994). В результате этих исследований, были получены обширные данные о репликации альфа-вирусов, механизмах отдельных стадий биосинтеза компонентов вириона и их сборки, функционировании и взаимодействий друг с другом вирусных и вирус-индуцированных клеточных белков. Совершенствование методик сек-венирования позволило определить первичную структуру геномов ряда представителей рода Alphavirus (E.G.Strauss a. J.H.Strauss, 1986; В.Е. Волчков и др.,1991; K.Takkinen et al., 1986). Детальное изучение этапов биосинтеза ВС и BJ1C в клетке позволило предложить последовательную схему регуляции их репликации (M.J.ScÎilesinger a. S.Schlesinger, 1986, Yu.Shirako a. J.H.Strauss, 1994), а возможность провести сравнение с другими вирусами данного рода - проверить ее и вычленить наиболее общие особенности функционирования данных вирусов. Изучение закономерностей строения и репликации альфавирусов на моделях вирусов венесуэльского и западного энцефалитов на протяжении многих лет проводится в лаборатории энзимо-логии Института вирусологии. Существенный вклад в изучение антигенных свойств, структуры и морфогенеза вириона, генетики этих вирусов их взаимосвязей с представителями других родов и семейств внесли отечественные исследователи (С.М.Клименко, 1982, Ф.Ф.Быковскии и др., 1984, Я.Я.Цилинский, 1988).

В то же время, следует отметить, что молекулярно-биологический анализ структуры и функции генома и белков альфавирусов проводился главным образом на моделях менее патогенных для человека вируса Синд-бис и вируса Леса Семлики. Другие вирусы этого рода начали активно изучаться только в последние годы.

Особый интерес, с нашей точки зрения, вызывают альфавирусы, относящиеся к серокомплексу Синдбнс-ЗЭЛ. Это обусловлено прежде всего их широким распространением как в мире, так и на территории СНГ (Карелия, Эстония, Удмуртия, Южное Поволжье, Южный Урал, Западная Сибирь, Алтай, Северный Кавказ, Азербайджан, Западная Украина, Средняя Азия).

По данным серологических обследований (Д.К.Львов и др., 1989, Т.М. Скворцова и др., 1989) в ряде регионов России высокие титры антител к вирусам указанного серокомплекса выявляются у более 20% лиц с завоеваниями суставов неясной этиологии. В то же время диагностика инфекций, вызываемых вирусами этой группы затруднена как из-за невыраженной клинической картины заболевания, так и из-за отсутствия коммерческих тест-систем для их обнаружения.

Рекомбинантное происхождение одного из представителей данной серо-группы - вируса ЗЭЛ - заставило по-новому взглянуть на движущие силы эволюции вирусов, в частности - на значение рекомбинации для эволюции вирусов с несегментированным геномом. Кроме тог,о, появляется задача уточнения классификации вирусов, относящихся к серокомплексу Снндбис-ЗЭЛ. Отметим, что в последних классификациях альфавирусов высказываются предложения о выделении вируса ЗЭЛ в особую группу вирусов-рекомбинантов.

Предположение о рекомбинантной природе вируса ЗЭЛ впервые было высказано в работе Hahn et al., 1988. Тем не менее, вирус ЗЭЛ оставался до настоящего времени недостаточно изученным: вывод о его рекомбинант-ном происхождении был сделан Hahn et al. на основании первичной структуры генома только одного штамма ВЗЭЛ (BFS-1703), причем им была проанализирована только 1/3 геномной РНК. Исследования, посвященные сравнению и анализу функциональных сайтов и вторичных структур регу-ляторных участков рекомбинантных вирусов, в настоящее время представлены отдельными сообщениями или практически отсутствуют.

Поскольку традиционно вирус ЗЭЛ на основании антигенной классификации относят к ВС-подобным вирусам, особый интерес вызывает сравнение антигенно значимых участков, а также доменов и сайтов, связанных с взаимодействием между белками оболочки и белком нуклеокапсида в процессе формирования рекомбинантного вириона. Экспериментальные исследования в этой области в настоящее время проводятся группой Strauss (В.Weiss a. S.Schlesinger, 1991; S.Lopez et al., 1994).

Появление работ по рентгеноструктурному анализу белка нуклео-капсида дало возможность проанализировать участки белка С, важные с точки зрения взаимодействия с белками оболочки и латерального взаимодействия (взаимодействия между отдельными копиями С-белка) в процессе формирования рекомбинантного вириона. Подобные исследования позволяют оценить возможность формирования жизнеспособного природного рекомбинанта и экспериментально смоделировать этот процесс.

Выявление среди альфавирусов природных вариантов, допускающих включение в состав зрелого вириона субгеномной 26S РНК, делает необходимым проверку ранее высказанных гипотез о функциональных участках 42S РНК и белка нуклеокапсида, значимых для формирования полноценного вириона. С другой стороны, это свойство, обнаруженное у альфа-вирусов теплокровных, позволяет провести параллели со сборкой мульти-партитных вирусов растений, входящих в одно суперсемейство с представителями рода Alphavirus и имеющих много структурных и функциональных особенностей, объединяющих их с альфавпрусами животных.

Выдвинутая Hahn et al., 1988 гипотеза предполагает рекомбинацию геномов двух родительских вирусов, один из которых обладает выраженными энцефалитогенными свойствами (ВВсЭЛ), а другой не вызывает поражения головного мозга (ВС) с образованием энцефалитогенного вируса с белками оболочки, унаследованными от менее патогенного предка. Это явление позволяет предположить, что существенный вклад в патоген-ность возникшего рекомбинанта внесли белки полимеразного комплекса и белок нуклеокапсида. В связи с этим представляется целесообразным установить происхождение и функциональный вклад в интегративное свойство патогенности и цитоцидности неструктурных белков рекомбинантного вируса ЗЭЛ. Сравнение отдельных функциональных участков белков полимеразного комплекса у разных альфавирусов является одним из подходов для такого анализа. Его результаты могли бы явиться основой для проведения экспериментов по получению рекомбинантных вирусов.

Практическое значение такого рода работы объясняется возможностью создания эффективных вакцинных штаммов, обладающих высокой пммуно-

генностью и широкой перекрестной иммунореактивностью при отсутствии энцефалитогенных признаков.

Предположение о корреляции цитопатичности альфавирусов и развития апоптоза в зараженной клетке с точечными заменами в белке Е2 позволяет более подробно проанализировать этот участок у всех изученных альфа-вирусов. Другим важным практическим результатом такой работы могли бы быть рекомендации по изменению или элиминации этого участка из структуры генома с целью получения слабовирулентных живых вакцин или РНК-вирусных векторов.

Высказанная ранее гипотеза о механизмах гибели клеток при альфа-вирусной инфекции (Л.В.Урываев, 1991) объединяет разрозненные подходы и увязывает основные метаболические изменения в клетке. Обнаруженные черты сходства белка нуклеокапсида и некоторых ядерных РНП-белков клетки, выполняющих транспортную функцию, позволяют сравнить особенности строения вирусного и клеточных белков.

В последние годы накапливается все большее количество данных об эволюционной преемственности отдельных функциональных мотивов, сохраняющихся в структуре модифицированных белков. Углубление знаний об уровнях наследования генетической информации позволит разработать новые подходы к созданию иммуногенных и противовирусных препаратов.

Цель и задачи исследования Все вышеизложенное позволило выдвинуть в качестве основной задачи нашего исследования - уточнение и анализ деталей строения и функционирования генома альфавирусов на модели рекомбинантного вируса ЗЭЛ (шт.МсМШап-16310).

В соответствии с поставленной целью в задачи исследования входило: I) Выяснение первичной структуры генома вируса ЗЭЛ (шт.МсМШап), сопоставление последовательностей отдельных генов двух изученных р настоящее время штаммов вируса ЗЭЛ, а также сравнение вируса ЗЭЛ с другими представителями серокомплекса Снндбис-ЗЭЛ и со всеми

изученными альфавирусами. Уточнение эволюционного происхождения и филогенетических взаимосвязей вируса ЗЭЛ и его отдельных генов.

2) Поиск и локализация в первичной структуре белков вируса ЗЭЛ (шт.МсМШап) участков, функциональная значимость которых была ранее показана дня других вирусов, в том числе и не входящих в род А1р1и1Уни5.

3) Поиск и локализация в геноме вируса ЗЭЛ (шт.МсМШап) функционально значимых участков. Анализ регуляторных участков генома и сравнение их вторичных структур.

В качестве прикладной была поставлена задача по проведению расчетов олнгонуклеотидов для их последующего использования в качестве прай-меров в ПЦР, основываясь на полученных нами данных о первичной структуре генома ВЗЭЛ и участков гомологии отдельных генов альфавирусов.

Новизна и практическая ценность.

На основании детального анализа генома вируса ЗЭЛ (штамм МсМШап-16310-5614) были получены новые доказательства рекомбинант-ной природы этого вируса. Выполнен расширенный сравнительный анализ функционально значимых участков ряда белков альфавирусов.

Локализованы ранее неизвестные у альфавирусов функционально значимые участки - бипартитные сигналы ядерной транслокации в белках пбР2 и С, что объясняет обнаружение этих белков в ядре зараженной клетке и позволяет предположить их регуляторную роль в программируемой гибели клеток. Построена вторичная структура промотора синтеза субгеномной РНК.

В результате сравнения протяженных участков генома ВКЛ, установлена принадлежность данного вируса к ВС-подобным и его филогенетическая близость с вирусом Окельбо.

Полученные данные были использованы при расчете олнгонуклеотид-ных праймеров с целью создания днагностикума для выявления генетического материала ВС-подобных и ВЗЭЛ-подобных вирусов в биопробах и их типирования.

' В методические рекомендации "Организация эколого-эпидемиоло-гического мониторинга территории Российской Федерации". (Москва, 1993.) включены критерии выбора ПЦР-праймеров и условия их использования в ПЦР.

На защиту выносятся следующие положения '

1) На основании сравнительного анализа:

первичных структур генов и белков и функционально значимых участков геномов представителей рода альфавирусов,

- физико-химических свойств белков,

- анализа филогенетических взаимосвязей внутри рода АфИау^ш,

- вторичной структуры участков РНК установлено, что по белкам Е1 и Е2 вирус ЗЭЛ близок к вирусам Синдбис и Аура, образуя вместе с ними группу ВС/ВЗЭЛ-иодобных вирусов, а по белкам полнмеразного комплекса и белку С - к вирусам ВсЭЛ и ВЭЛ, образуя вместе с ними группу энцефалитных вирусов Нового Света. З'-нетранслируемая область ВЗЭЛ включает как ВС-подобные, так и ВВсЭЛ-подобные элементы.

2) В белках вируса ЗЭЛ локализованы потенциальные функциональные мотивы:

- в белке пэР2 - гелнказный мотив, протеазный мотив и бипартнтный сигнал ядерной транслокации (ранее у альфавирусов не описан),

- в белке С - протеазный мотив, сайты взаимодействия с глико-протеинами оболочки, бипартитный сигнал ядерной транслокации (ранее у альфавирусов не описан); уточнена консенсусная последовательность взаимодействия С-белка с большой рибосомальной субъединицей.

- в белках Е2, Е1 и 6К локализованы трансмембранные домены.

3) Анализ первичной структуры участков генома вируса Карельской лихорадки доказывает принадлежность ВКЛ к Синдбис-подобным вирусам.

Публикация работ.

Основные положения диссертации отражены в 12 опубликованных научных работах. Определенные нуклеотидные последовательности депонированы в EMBL.

Апробация работы.

Результаты исследований были представлены и обсуждены на заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН в феврале 1996г. Отдельные этапы проведенных исследований были представлены на III европейском конгрессе по ветеринарной вирусологии (Интерлакен, Швейцария, 1994), X международном конгрессе по вирусологии (Иерусалим, Израиль, 1996) и международной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами" (Иркутск, Россия, 1996).

Автор выражает искреннюю благодарность за продуктивное сотрудничество сотрудникам НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского Т.М.Соколовой, Т.К.Селивановой, Н.А.Парасюк, К.С.Ионовой, Е.И. Самохвалову, В.П.Юферову, а также сотрудникам ВНИИ молекулярной биологин (Кольцово, Новосибирская область) В.М.Блинову, В.Е.Волчкову, П.Ф. Сафронову, С.В.Нетесову, совместно с которыми выполнялись отдельные этапы работы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Вирусы. Для исследований были использованы два вирусных штамма. Лабораторный

штамм ВЗЭЛ-16310 был получен из лаборатории музейных штаммов (проф. Л.Л.Фадеева) НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского и является аттенуированным дериватом (5614) штамма ВЗЭЛ McMillan (лот 16310, приготовлен в 1955 году) (R.Shope, персональное сообщение). Исходно штамм McMillan был выделен в 1941 году в Канаде из головного мозга умершего человека.

Вирус Карельской лихорадки (штамм LEIV-9298) был любезно предоставлен доктором Л.К.Березиной (рук. отдела академик РАМН Д.К.Львов).

BKJI был выделен в 1983 году от комаров Aedes sp. в очаге карельской лихорадки (Д.К.Львов и др., 1985).

Получение ДНК-копии геномов исследуемых вирусов и их секвеиирование. На первом этапе для синтеза ДНК копии, в качестве матрицы нами была использована вирионная РНК, экстрагированная из вирусных частиц фенол-хлороформным методом. Синтез кДНК на матрице РНК, а также синтез второй нити ДНК проводили в соответствии с методикой U.Gubler а. B.J.Hoffman, 1983. Лигирование синтезированных ДНК-когтий с ДНК плазмиды pBR.322, трансформация плазмидами клеток E.coli (М1063), отбор соответствующих клонов (ДНК-ДНК - гибридизация), выделение плазмидных ДНК щелочным методом и рестрикционный анализ полученного материала был выполнен в соответствии с протоколами, приведенными в работах T.Maniatis et al., 1982 и Д.Гловер, 1989.

Секвеиирование вирусспецифических кДНК проводили по методу А.М.Махаш а. W.G.Gilbert, 1977. Полученные продукты.химической модификации исследовались в 12% и 8% ПАА-геле. Электрофорез секвени-руюших гелей проводили в аппарате "Macrophor" (LK.B, Швеция).

Методы компьютерного анализа. Для сравнения величин сходства генов и соответствующих им белков альфавирусов нами было проведено парное выравнивание изученных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей в соответствии с алгоритмом S.B.Needlleman а. C.D.Wunsch, 1970.

Для выявления консервативных областей проведено множественное выравнивание в соответствии с методикой D.G.Higgins а. P.M.Sliarp, 1988.

Вторичная структура РНК была рассчитана в соответствии с алгоритмом, описанным в работе M.Zuker а. P.Stiegler, 1981. Данная методика основана на поиске конформаций с максимальным количеством взаимодействий между нуклеотидами.

Профили гидропатпки исследуемых белков были рассчитаны на основании величин, приведеных в работе J.Kyte а. R.F.Doolitle, 1982.

В поиске потенциальных трансмембранных доменов использованы алгоритмы описанные в работах P.Klein et al.,1985, MJ.K.Rao a. P.Argos,

1986 и D.Eisenberg et al.,1984. Границы трансмембранного домена определялись при сопоставлении результатов, полученных при использовании всех трех методов. , ,

Для построения эволюционных дендрограмм использованы три основных подхода: вычисление сумм квадратов относительных отклонений (W.M.Fitch a. E.Margoliash, 1967), принцип максимальной экономии (L.L. Cavali-Sforza a. A.W.F.Edvards) и принцип максимального топологического подобия (К.Чумаков и С.В.Юшманов,1988).

При расчете олигонуклеотидных праймеров нами была использована программа Oligo 3.4 (стабильность возможных дуплексов оценивалась по формуле, основанной на модели ближайших соседей) (S.M.Freier et al., 1984, P.N.Boreretal., 1974).

Результаты работы и их обсуждение

/. Рекомбгтантная природа ВЗЭЛ и эволюция ВС/ВЗЭЛ-подобных вирусов Впервые предположение о рекомбинантной природе ВЗЭЛ было высказано C.S.Hahn et al., 1988. В качестве модели для исследования указанные авторы избрали штамм ВЗЭЛ BFS-1703. На основании анализа структурной области генома ими был сделан вывод о наличии в составе генома ВЗЭЛ ВС-подобной области (белки Е2 и Е1) и ВВсЭЛ-подобных областей. Тем не менее, вопрос о происхождении большей части генома (неструктурная область) к началу нашей работы оставался не ясным.

Данные о рекомбинации среди различных РНК вирусов с несегменти-рованным геномом, не позволяли исключить возможность мультисайтовой (мозаичной) рекомбинации в неструктурной области ВЗЭЛ. Для уточнения происхождения отдельных генов вируса ЗЭЛ необходимо было провести сравнение их первичных структур, дополнив его сопоставлением отдельных функционально значимых доменов и сайтов.

Нами был проведен анализ первичной структуры генома другого ранее не исследованного штамма ВЗЭЛ - McMillan-16310-5614, причем наряду со структурной также была рассмотрена большая часть

Изучение аяьфавирусы

ВС - подобные ВС - Strauss a. Strauss, 1986 ВОк- Shirako, 1991 ВА- Rumenaph, 1995

5'

cap

fj^s-

N nsP1

nsP?

ВЛС-подобные ВЛС- Takkinen, 1986 BPP- Faragher, 1988 BOHH -Levinson, 1990

ВВсЭЛ - подобные

ВВсЭД- Волчков, 1991 ВВЗЛ - Kinney. 1989

Рекомбинанг

пзРЗ

ВЗЭЛ- BFS-1703—Hahn, 1988

I--1

_п^Г* _jb

t nsP4 ~Н С IE3I Е2 I6KI Н poly-A

рВЗ, р75, р34 р32, рбб, р312. р24

ВЗЭЛ - McMillan

Рис. 1. Классификация и структура генома альфавирусов.

неструктурной области генома (nsP2 и nsP3, а также участки генов nsPi и nsP4). В целом анализу было подвергнуто 67% генома ВЗЭЛ. На рис.1 схематически показаны области генома ВЗЭЛ-McMillan, проанализированные по двум цепям в плазмидах; содержащих перекрывающиеся вирус-специфические вставки.

Работа по расшифровке первичных структур вирусов ЗЭЛ и ВКЛ выполнена совместно с коллективом авторов в лаборатории энзимологии НИИ вирусологии нм.Д.И.Ивановского и НПО "Вектор" (г.Новосибирск) (Л.В.Урываев и др., 1994).

При проведении анализа мы .не ограничил1Ль распетом величин сходства между генами отдельных альфавирусов (табл.1). Для окончательного подтверждения полученных результатов и исключения возможности мозаичной структуры отдельных генов ВЗЭЛ, нами было также проведено сравнение свойств белков ВЗЭЛ, ВС и ВВсЭЛ и построение дендрограмм, иллюстрирующих эволюционные взаимосвязи внутри рода Alphavirus (рис.2). Для сравнительного изучения ряда физико-химических свойств

Табл.1. Величины сходства первичных структур белков тР2, пхРЗ (330 N-концевых ао), Е2 и Е1 у изученных апьфавирусов.

ВС ВА ВРР ВЛС БОНН ВВЭЛ ВВсЭЛ ВЗЭЛ

ВС ■к 67, 9 58, 0 59,7 57, 4 54,7 53,0 53,9

ВА 56, 3 * 55, 9 55, 6 55, 3 52,1 52,3 52, 0

ВРР 40, 5 38, 6 ★ 75,7 69,4 55, 5 55, 4 55,2

ВЛС 39, 3 37,7 67,8 * 70,7 51,7 56, 8 53,8

БОНН 34, 3 35, 8 54,7 56, 6 * 56, 0 54,5 53,8

ВВЭЛ 40,2 40, 4 34,4 34, 6 32, 9 * 72, 5 72, 8

ВВсЭЛ 44,0 43, 1 39, 3 38,8 39, 5 4 6, 9 * 82,9

взэл 67,1 56, 4 32, 2 31, 8 33, 6 38, 1 44,3 *

П5Р2

Е2

ВС ВА ВРР ВЛС вонн ВВЭЛ ВВсЭЛ ВЗЭЛ

ВС * 69, 7 56,4 56,4 55, 8 54,5 53, 3 54,8

ВА 76, 3 * 57, 6 58,5 58, 8 55, 0 55,5 56, 7

ВРР 53, 1 51,4 * 73, 0 70,3 58,2 59,7 60, 6

ВЛС 50, 8 49,5 61,0 * 69,4 55,5 54, 8 56, 4

вонн 48,9 48, 6 56,2 51, 4 * 57, 9 57, 6 59, 7

ВВЭЛ 49,8 47,5 53, 0 51, 4 77, 6 * 66,1 66, 1

ВВсЭЛ 45,3 43, 8 51, 5 51,5 60, 5 58, 9 80,8

взэл 61,5 59, 4 51, 5 48,4 47, 6 47,7 47,3 *

пэРЗ

ЕХ

nsP2

4J Ü ÏJ

nsP3

-Г"

C

T

E2

V

IlsPl

(С-конщиои участок)

I

nsP4

(N-концшой участок)

Puc.%. Эволюционные взшшосвязи изученных альфавирусов.

Рис.3. Сравнение профилей гидропшпики С-белков вирусов ЗЭЛ и ВсЭЛ (слева) и ЗЭЛ и Сиидбис (справа).

белков В ЗЭЛ, в частности гидропатики, нами были разработаны компьютерные программы. На рис.3 представлен результат работы одной из этих программ. Кривые а и Ь - представляют собой расчитанные на основании первичной структуры профили гидропатики С-белков вирусов ЗЭЛ и, соответственно ВсЭЛ и Синдбис. График с - показывает существующие различия между величинами гидропатики двух белков по каждому положению.

Результаты анализа позволили однозначно установить, что по белкам оболочки ВЗЭЛ близок к ВС и образует вместе с ним и вирусом Аура (ВА) единую группу ВС-подобных вирусов. В тоже время, исходя из результатов сравнения белков полимеразного комплекса и белка С, вирус ЗЭЛ должен быть отнесен скорее к ВВсЭЛ-подобным вирусам. При построении эволюционных дендрограмм на основе данных о последовательностях неструк-

турных белков и белка кора ВЗЭЛ образует единую ветвь с ВВсЭЛ и ВВЭЛ (рис.2).

Интересно, что величина сходства в паре ВЗЭЛ (Сев.Америка) - ВС (Африка) выше чем в паре ВЗЭЛ - ВА (Южн.Америка), т.е. сходство между двумя вирусами Нового Света, относящимися к одному серо-комплексу, ниже чем между вирусами, выделенными в различных полушариях. Данный факт становится еще очевиднее, если к анализу привлечь сведения о частично определенных первичных структурах некоторых альфа-вирусов (Ватароа, Майаро). На рпс.4 представлена эволюционная дендро-грамма, построенная на основании данных о первичных структурах С-концсвых областей Е2-белков 13 исследованных к настоящему времени альфавирусов. Как видно из рисунка, вирус Аура образует самостоятельную ветвь эволюции, вычленение которой предшествовало рекомбинации между ВС-подобным и ВВсЭЛ-подобным предками вируса ЗЭЛ. Таким образом, группу ВС-подобных вирусов можно условно разделить на две подгруппы: ВС-подобные вирусы Нового Света (вирус Аура) и ВС-подобные вирусы Старого Света (прототнпный ВС, вирусы Окельбо н Ватароа, а также гипотетический ВС-подобный предок вируса ЗЭЛ).

Возникает вопрос о месте возникновения вируса ЗЭЛ. Описанная выше картина могла бы быть следствием одной из двух следующих ситуации: Если рекомбинация между предками ВЗЭЛ произошла в Новом Свете, то это означает наличие на американском континенте популяции ВС-подоб-ного вируса, существенно более близкого с эволюционной точки зрения к ВЗЭЛ и ВС, чем ВА. Возможно также, что имела место временная реннтродукцня ВС в Новый Свет, причем к настоящему времени данный вирус уже исчез. Однако, если подобная реиитродукция имела место, непонятно, почему рекомбинация произошла именно с этим штаммом, т.к. вероятность данного события меньше, чем вероятность рекомбинации ВВсЭЛ с аутохтонным ВС-подобным вирусом.

Возможно также, что ВЗЭЛ образовался на территории Старого Света. В пользу этого предположения говорит существование в Старом Свете ВЗЭЛ-подобного вируса (У-62). В этом случае, в Новый Свет реинтро-

т

Рис.4. Эволюционная дендрогралта, построенная на основании данных о первичной структуре С-коицевых участков Е2-белков изученных альфа вирусов

Аудировался не ВС, а ВЗЭЛ. К сожалению, в настоящее время отсутствуют прямые данные о циркуляции ВВсЭЛ-подобных вирусов на континентах Восточного полушария.

В целом, указанная проблема может быть окончательно разрешена только при комплексном изучении процесса эволюции альфавирусов с учетом дополнительных данных о'представителях всех серокомплексов данного рода. Ранее этот вопрос обсуждался в работе Я.З.ЬЫшоп е1 а1., 1990.

Сравнение структурных областей двух штаммов рекомбинантного вируса ЗЭЛ (ВЕБ-1703 и МсМП1ап-16310-5614) показал, что различия между этими вирусами соответствуют параметрам штаммовой вариабельности и не превышают. 3,1%. Количество различий по отдельным генам и белкам приведены в таблице 2. Существующие отличия в гликопротеинах оболочки могут быть связаны с антигенными особенностями этих двух штаммов и, возможно, саттенуацней использованного нами штамма.

2. Функционально значимые участки в белках полимеразного комплекса альфавирусов.

В результате проведенного нами анализа первичной структуры неструктурных белков ВЗЭЛ, были локализованы функционально значимые мотивы, неизвестные для данного рода и ранее описанные для альфа-вирусов.

Белок шР2 альфавирусов является полифункциональным и принимает участие как в репликации вирусной РНК, так и в процессинге неструктурного полипротеина. Кроме того данный белок обладает способностью транслоцироваться в ядро зараженной клетки.

Положение основных функционально значимых доменов в структуре белка шР2 ВЗЭЛ показано на рис.5.

Табл.2. Величины вариабельности генов и белков ч паре ВЗЭЛ(BFS-1703)/ ВЗЭЛ (McMillan).

Ген « Белок

Регионы п % п %

Межцистронный

(junction) 0 0 - -

С 16 2,1 4 1,5

ЕЗ 1 0,6 0 0

Е2 25 2,0 13 3,1

6К 2 1,2 1 1,8

Е! 20 1,8* 5 1,4*

З'-нетрансл.

обл.** 1 0,4 - -

* - подсчитаны с учетом делешш соответственно 3 нт и I ао

** - в пределах секвенированной области

Сигналы ядерной транслокации

1

консервативный домен

470 вариабельный помен

794

мотив "А" мотив "Б"

G-XXXX-GKS ,„DE

Нуклеотидсвязывающий паттерн

аминокислоты активного центра протеазы

Рис.5. Функционально-значимые домены в белке nsP2 вируса ЗЭЛ.

Белок nsP2 ВЗЭЛ шт. McMillan можно условно разделить на более консервативный N-концевой и вариабельный С-концевон домены. В N-концевом домене расположен характерный для геликаз нуклеотидсвязывающий паттерн (A.E.Gorbalenya et al., 1989) и состоящий из двух мотивов "А" - GXXXXGK.S (у ВЗЭЛ он расположен в позиции 185-193) и "Б" - DE (у ВЗЭЛ - 252-253). Обоим мотивам предшествуют последовательности гидрофобных аминокислотных остатков (ао) (минимум 2 из 5 для "А" и 3 из 5 ддя"Б"). Данные мотивы строго консервативны у изученных альфавирусов, однако предшествующие им гидрофобные последовательности, а также аминокислотная последовательность внутри мотива "А" имеют ряд особенностей для различных групп альфавирусов. На рпс.6 приведены последовательности нуклеотидсвязывающих паттернов у изученных альфавирусов.

С С-концевым доменом связана протеолитическая активность белка nsP2 альфавирусов. В состав активного центра пБр2-протсазы входят две аминокислоты, консервативные у всех альфавирусов (у ВЗЭЛ это Cys477 к His546).

Несмотря на то, что свои основные функции, связанные с репликацией вирусных РНК, белок nsP2 выполняет в цитоплазме, он также обладает

мотив "А" мотив "Б"

181 й ХХХХ бКБ 193 246 ОЕ 253

ВЗЭЛ пэР2 Т1СУУ а УРСБ СКЭ ЫТЬУ1 ОЕ

ВВсЭЛ пэР2 ..........................О......

ВВЭЛ пэР2 ..........................Е......

ВС ПЭР2 ____I . Т............ЕУ. .V . .

ВЛС ПЭР2 УУ. .Г................01.. V ..

ВРР пзР2 V. . .Г................ЕЫ..V ..

БОНН ПЭР2 V. . ^................ЕУ. .V . .

РУ 2С СЬЪ.Н . Б.-Т ... СУУ1М .0

БУ40 Т УЯЬГК . Р1БЗ ..Т РЬУУР ЕО

1*ЕО 12 СМЬЭЬ . АААА ... СБГУУ .Б

Рис.6. Нуклеотидсвязывающий (геликазный) паттерну изученных альфшшрусов. (РУ 2С - белок 2С пикоршшируса, БУ40 Т- Т-антигеи вируса БУ40, ИЕО ¡2 -12 белок реовируса человека)

способностью проникать в ядро и накапливаться в ядрышке (М.11.М1с11е1 й а!., 1990). Это явление у ВЛС связано с участком 647-651 П5Р2, содержащим последовательность имеющую определенное сходство с другими белками, способными транслоцироваться в ядро (М.Г^ккопеп е1 а1., 1992). Данный участок расположен в пределах вариабельного С-концевого домена, и, как показало проведенное нами сравнение, не имеет выраженного сходства у различных альфавнрусов, В тоже время, в Ы-концевом домене пбРЗ, нами был найден ранее не известный у альфавнрусов бипартитный мотив ядерной транслокацпи, описанный С.Вшй\уа1 а. Я.А.Ьазкеу, 1991. Данный сигнал не имеет точной копсесусной последовательности и должен удовлетворять следующим требованиям: а) сигнал начинается с двух рядом расположенных положительно заряженных ао (арппшн или лизин); б) сразу же после этих ао начинается "спейсерный" участок, состоящий из 10 любых ао; в) из 5 ао, расположенных сразу же после "спепсерного участка" минимум 3 должны быть положительно заряженными. Найденный нами сигнал имеет высокий уровень сходства у различных альфавнрусов. Отметим, что для обоих сигналов в принципе характерно наличие положительно заряженных ао (лизина, аргинина).

Ген белка пбРЗ ВЗЭЛ содержит в своей последовательности 1ЮА (опал) стоп-кодон. Стоп-кодон у ВЗЭЛ находится в характерной для альфавирусов (кроме ВЛС и ВОНН) консенсусной последовательности 1ЮАС, что, возможно, имеет значение для регуляции сквозного считывания неструктурной области генома ВЗЭЛ.

Ранее была показана аутопротеолитическая активность белка пзР4 ВЛС (К.Такктеп е1 а!., 1990) причем, по мнению авторов, функциональный домен данной протеазы находится в непосредственной близости от сайта расщепления шРЗ/пзР4. Результаты сравнения указанных участков у шР4 белков ряда альфавирусов, в том числе ВЗЭЛ, показывают, что в данной области действительно существует консервативная последовательность, характерная для клеточных и ретровирусных аспартатовых протеаз. Учитывая , что иротеазпая активность белка шР4 пока не подтверждается работами ХА.Ьетт а. С.М.Яке, 1991а,Ь (на модели ВС), делать вывод о наличии протеолитической активности в белке п$Р4 ВЗЭЛ преждевременно. Следует также отметить, что ВЗЭЛ, также как и ВВсЭЛ, отличается по первичной структуре предполагаемого функционального сайта протеазы от других альфавирусов. Впрочем, замена происходит на ао со схожими физикохимическими свойствами (0->Е).

Таким образом, сравни тельный анализ первичных структур генов и кодируемых ими неструктурных белков позволил нам локализовать в белках полимеразного комплекса вируса ЗЭЛ ряд функциональных мотивов, как ранее описанных у других представителей рода А1р11ауц-ш, так и неизвестных.

3. Функционально значимые участки в структурных белках.

Белок С - наиболее хорошо изучен у альфавирусов (в основном на моделях ВС и ВЛС). Наряду с чисто структурными функциями (взаимодействие с геномной РНК, сборка нуклеокапсида, взаимодействие с цитоплазматическими доменами оболочечных белков в процессе формирования зрелого внриона), белок нуклеокапсида играет важную роль в развитии инфекционного процесса в клетке.

сигналы ядерной транслокации

аминокислоты, взаимодействующие с цитоплазнатическим доменом белка Е2

М«2 NtSr G1SS L22s AJJJ T23J l24J

1t=i10

1 вариабельный домен 94

участки связывания с РНК

6Г> I и>

83

+

95срз101 участок связывания с LRS i

K/R-PX-K/R-R-X-R-M

H«s d15S s21i аминокислоты активного центра аутопротеазы

Рис. 7. Функционально-значимые домены в белке С вируса ЗЭЛ.

Белок С ВЗЭЛ, также как и С-белки других альфавирусов, можно четко разделить на две области: N-концевую - высоковариабельную и имеющую выраженный положительный заряд и С-концевую - консервативную и слабозаряженную. При анализе аминокислотного состава N-концевого домена обращает на себя внимание присутствие в его составе большого количества положительно заряженных ао (аргинин, лизин) и высокое содержание пролина, что по видимому обусловливает неупорядоченную третичную структуру данной области. На рис.7 показана локализация функционально-значимых доменов в белке С вируса ЗЭЛ.

Значение С-концевой области связано, в первую очередь с ауто-протеазной функцией белка С (G.Aliperty а. M.J.Schlesinger). У ВЗЭЛ в данной области мы локализовали 3 ао - Н136, D158 и S2I0, расположенный в консервативной последовательности GDSG. Эти ао строго консервативны у альфавирусов и входят в состав активного центра сериновой протеазы, третичная структура которой определнена методом рентгеноструктурного анализа на модели ВС (H.K.Choi et al., 1991).

Важной особенностью белка С является его способность к взаимодействию с большой рибосомильиой субъедишщей, что может иметь значение как для процесса декапендацип, так и для регуляции трансляции вируспецифическнх и клеточных РНК. G.Wengler et al. (1992) указывает, что

сайт взаимодействия с рибосомой располагается в регионе 94-105 С-белка ВС (т.е. на границе между N-концевой и С-концевой областями). По данным U.GeigenmuIler et al.(1993) в той же области (75-116) расположен сайт взаимодействия с геномной РНК, т.е. сайт инициации инкапсидации. Проведенное нами расширенное сравнение последовательностей С-белков разных альфавирусов позволило уточнить предложенную консенсусную последовательность данного сайта. В уточненном виде она выглядит как K/R-P-X-K/R-R-X-R. Отметим, что указанный сайт связан именно с инициацией инкапсидации вирнонной РНК, тогда как сам процесс взаимодействия последней с отдельными копиями С-белка в процессе сборки нуклеокапсида, по-видимому, носит неспецифический характер, обусловлен высоким положительным зарядом N-концевого домена С-белка и происходит как за счет образования выраженной вторичной структуры РНК, так и за счет способности белка нуклеокапсида к самосборке (рис.8).

С-белок, также как и nsP2, обладает способностью транслоцироваться в ядро и накапливаться в ядрышке. Исследования M.R.Michel et al., 1990 показали, что в ядре клетки белок нуклеокапсида функционирует как полиморфный регулятор и может либо блокировать синтез клеточных мРНК, либо опосредованно индуцировать синтез определенных клеточных белков. В результате проведенного нами анализа, в белке С ВЗЭЛ был найден бипартитный сигнал ядерной транслокации, аналогичный описанному выше для nsP2. Данный сигнал расположен в вариабельном N-концевом домене белка нуклеокапсида и присутствует у ВЗЭЛ в 4 перекрывающихся копиях (начало - 67, 68, 69, 83 ао). Количество копий бипартитного сигнала в С-белках различных альфавирусов до известной степени коррелирует с их патогенноегью. Так, у ВВсЭЛ бипартитный мотив присутствует в семи копиях (67, 68, 69, 78, 79, 80 ао), а у ВС - в двух (11, 90 ао).

Особый интерес представляет сравнение сайтов, связанных с взаимодействием нуклеокапсида и белков оболочки в процессе сборки вириона. Ранее, в работе C.S.Hahn et al., 1988 на основе анализа аминокислотных различий между вирусами ВС, ВЗЭЛ и ВВсЭЛ было

сделано предположение об особой роли определенных ао в этом процессе. Позже, при рентгеноструктурном анализе белка С ВС было установлено, что указанные ао располагаются на поверхности белка С (Н.К.С1ю1 а а1., 1991). Это позволило провести сравнение остатков, расположенных в указанных положениях (у ВЗЭЛ - М132, N167, в 196, Ь226, А229, Т233, 1249), причем для анализа были использованы последовательности двух штаммов ВЗЭЛ, двух штаммов ВВсЭЛ и двух штаммов ВС (табл.3).

В результате сравнения было установлено, что в одном из указанных положений у ВВсЭЛ (шт. 82У-2137) расположен ао, отличающийся от

Табл.3. Аминокислотные остатки белка С, принимающие участие во взаимодействии с цитоплазматическим доменом белка Е2 у различных альфавирусов.

N по ММ1 ММ1 BFS ВВсЭЛ 82V ВС ВОк N ПО ВС

132 М М F ' F м М 137

167 N N С С N N 172

196 G G N N G G 201

226 L L L Q L L 231

229 ' А А V V А А 234

233 Т Т S S Т Т 238

249 I I V V I I 254

ВВсЭЛ (шт. ВВсЭЛ) и совпадающий с ао у ВС и ВЗЭЛ. Данное наблюдение, в сочетании с данными S.Lopez et al., 1994 о нестабильности химерных вирионов, позволило выдвинуть предположение о том, что возникновению вируса-рекомбинанта предшествовали определенные мутации в генах структурных белков его прародителей, определившие более высокую стабильности рекомбинантного внриона.

Специфическое взаимодействие белка С (в структуре нуклеокапсида^и цитоплазматического (С-концевого) домена белка Е2 имеет исключительно важное значение для сборки полноценных (стабильных во внешней среде) вирионов и исключения фенотипического смешивания, а также для предотвращения встраивания клеточных белков в структуру зрелого вирпона. В связи с этим мы провели сравнение указанного домена вируса ЗЭЛ с аналогичными доменами изученных альфавирусов с использованием новых данных о первичной структуре ВС-подобных вирусов Аура и Ватароа, а также ВЛС-подобного вируса Майаро. В целом, анализ первичной структуры ВЗЭЛ-McMillan подтверждает данные C.S.Halm et al., 1988: остатки V408, 1418, Р420 и T42I отличаются от ао, расположенных в тех же положениях у ВС и совпадают с ВВсЭЛ (рис.9). В то же время сопоставление всех представителей рода Alphavinis показало, что ао в данных положениях могут существенно различаться даже у близко-

ММ1 E2 KARRDCLTPYALAPNATVPTALAVLCCIRPTNA 423

BFS E2 ..................................................................423

ВС E2 ____E...........VI. .S. .L. . .V.SA. . 423

ВОк E2 ____E...........VI. .S. .L.. .V.SA.. 423

BA E2 ..........Q........FLVTLC. .FQR.S. 423

Ватар E2 ................VI. .SV.L..................423

ВВсЭЛ E2 RT.NL.I...K.....Q..IL..L----К. .R. 420

ВЭЛ E2 RS .VA.....R.T...RI.FC......A.TAR. 423

ВЛС E2 A. .SK.......T.G.A. .WT.GI . . .APRAH. 422

BPP . E2 T...K.......T.G.V. .LT.GL.X.APRA. . 422

БОНН' E2 C...R.I...E.T.G..I.FL.G----А.ТАК. 423

MAY E2 V..TK.......T.G.V. .VTIG____АРКАН. 423

Рис.9. Сравнение последовательностей цитоташатических доменов Е2 белков различных альфавирусов (ао, предположительно участвующие во взаимодействии с нуклеокапсидом, выделены).

родственных вирусов (в частности у 4-х Сиидбис-подобных вирусов). Это наблюдение ставит под сомнение значимость конкретных'аминокислотных остатков для взаимодействия С-концевого домена Е2 и белка нуклео-капсида. Вероятно, проблему взаимодействия этих белков в процессе сборки вириона нельзя рассматривать, не учитывая их третичную структуру.

Особый интерес при сравнении первичной структуры белка Е2 у вирусов ЗЭЛ (McMillan и BFS) и ВС (HRSP и Ockelbo) вызывает область 170-220 ао, с которой связывают участие белка Е2 в нейтрализации инфек-ционностп и которая несет наиболее важные антигенные детерминанты (антигенный домен А). Этот интерес в значительной степени обусловлен рекомбинантным происхождением ВЗЭЛ, т.к. происхождение белков оболочки энцефалптогеиного вируса от менее патогенного предка может рассматриваться как своего рода антигенная мимикрия высоковирулентного вируса. Проведенный нами анализ аИтигенно значимого у ВС домена 170-220 позволил выделить 10 аминокислотных положений (на рис.10 они выделены жирным шрифтом), вероятно связанных с антигенными различиями между ВС и ВЗЭЛ. Отметим, что в трех случаях п} десяти происходила замена с потерей заряда и в трех случаях - со сменой

а б в г д е

4-4-1 4- II

ВС Е2 RPRPHAYTSYLEESSGKVYAKPPSGKNITYECKCGDYKTGTVSTRTEITGC

ВОк Е2 . .G.......................................Т........

ММ1 Е2 . .S____К. . .К.А. .Е. Л.......V.........S. . I. . .P.KMN. .

BFS Е2 ..G____К.....A..E..I.......V.........S..I.....KMN. .

а - Mab-50 б - Mab-30 в - Mab-50

г - Mab-50 д - Mab-49 е- Mab-8,51,23,18

Рис.10. Ашпигешю-знашшгй домен (170-220 ао) у ВС/ВЗЭЛ-подобных вирусов.

заряда. В двух случаях (рис. 10 б,е) замены происходили в положениях, значимость которых была ранее показана для ВС в экспе-риментах с моноклональными антителами (J.H.Strauss a. E.G.Strauss,' 1994).

Результаты анализа позволяют нам предположить значимость указанных ао для формирования специфической антигенной структуры вируса ЗЭЛ. Сравнение первичных структур указанных регионов в парах ВЗЭЛ-McMillan - ВЗЭЛ-BFS и BC(HRSP) - ВОк показывает высокий уровень гомологии этих вирусов. Так штаммы ВЗЭЛ отличаются друг от друга по трем, а ВС от ВОк - по двум положениям. Данные отличия отражают штаммовую вариабельность ВС и ВЗЭЛ.

Проведенное исследование может служить основанием для экспериментальной проверки сделанных выводов.

Подробный сравнительный анализ первичной структуры белка El ВЗЭЛ-McMillan, его физико-химические свойства, функциональные участки приведены в тексте диссертации. Считаем необходимым отметить, что домен слияния (80-97 ао), консервативный у альфавирусов, полностью совпадает у ВЗЭЛ и ВС.

4. Регуляторные области генома альфавирусов.

При изучении ВЗЭЛ-ВРБ-ПОЗ, С.Б.НаЬп е! а!., 1988 показали, что.З*-нетранслируемая область данного вируса включает как область высокого сходства с ВС (первые 60 нуклеотидов после стоп-кодона), так и область высокого сходства с ВВсЭЛ (80 нуклеотидов перед поли-А треком), что позволяет предположить наличие в З'-нетранслируемой области второго сайта рекомбинации.

Нами был проведен анализ вторичной структуры данного региона у вирусов Синдбис, ЗЭЛ и ВсЭЛ. Было установлено, что как ВС, так и ВЗЭЛ и ВВсЭЛ содержат в области, прилегающей к стоп-кодону, характерные структуры, включающие ранее описанные для З'-нетранслируемой области повторы. •

В З'-нетранслируемой области вируса Синдбис присутствует три элемента (рис.11 А,Б,В), схожие между собой по структуре. Каждый из этих элементов ("двойных шпилек") образуется при взаимодействии трех пар повторов и включает в себя три шпилечные и две "петлевые" структуры. Повторы, характерные для альфавирусов, связаны в первую очередь с петлями и прилегающими к ним участками. Первая и вторая двойная шпилька (А и Б) у ВС разделены еще одним элементом вторичной структуры (Г), отличающимся от описанных выше. ВЗЭЛ имеет в З'-нетранслируемой области два элемента (Д и Е), аналогичных двойным шпилькам ВС, однако у ВЗЭЛ отутствует элемент вторичной структуры, разделяющий первую и вторую двойную шпильку у ВС.

Аналогичный элемент присутствует также в З'-нетранслируемой области ВВсЭЛ (Ж). Петли данного элемента также образованы повторами, имеющимися в З'-нетранслируемой области. Тем не менее, этот элемент вторичной структуры у ВВсЭЛ существенно отличается от ВЗЭЛ и ВС (прежде всего по размеру шпилечных элементов).

Регион, непосредственно прилежащий к поли-А треку в геномах ВС, ВЗЭЛ и ВВсЭЛ, также формирует характерные элементы вторичной структуры, изображенные на рис.12. Однако, в отличие от области, граничащей со стоп-кодоном, более схожи между собой вторнчные структуры ВЗЭЛ и ВВсЭЛ.

идс или

иле в и си

си и и и и

и и Л С АС

А С С*С А*и

_А С*С Б В С*в

и*АС-А ~ ~ и*АС-А

и*АС-А АС*С А вСА ААС*в А ССА•

АС*С А ССА А йСбСАСи А ССоиССи

А СиСАТСи А ******| и I ******* и

I ******| и А ссссисс А СССАССй

А САСиАСБ Аи*А иАА АСС*СА ЦАА

АС*С ОАА С*С

С*С А*Ч ' С*С

А*и С*С А* и

С*С А* и СЗ*С

С*в А*0 в-и

А*и С*в С*С

23-ССС | А--------------С*С С*С

А* и САСАиААССАСиАиАииААССАиииАиСОА А-27 О

и*А I иАС

сли*А ! с и

АС | и и

исс*с ! А с

с*а I с*с

!

С*С Г | и*А

~ ! инз

и С ВС I в*с

и с ! ВВсЭЛ А*и

А ! и*А

----------------------------------------------I с у

или I с*с

иАС с и ! с*в ж

си и и ВЗЭЛ \ А*0 ~

и и АС | с*й

А с С*С | а*А с

С*С Д Е | и сссскзсис А

с*с а*АС-А ~ | А ******|* и

и^АЭ-А АС*С А рСА | А СССЭСССС А

АС*С А СА А ССАСАСи' 1 | А А

А вссиваис | ******| и | I и

I ******|* ц А ссосисс 1 | СО

А СССАССвС Аи* А иАА | и*А

Аи*С АА С*С I С*С

А*и | А*и

й*С С*С | С*С

С*С А*и | и А

й*С А С

1 А*и и*А | А |

иди |----------------- С----------------3' А |

А*и и*А и*А С*С Ц-й 46 СС 136

Рис. 11. Элементы вторичной структуры 3 '-нетраиашруемых областей трех альфавнрусов.

и с

0 и

А и

А.*и ВВсЭЛ

А* и

и*А

А*и

и*А

и*А

и ииии с и

1 ииис А*и С*Б А*и

С и

I и

I и

А* и и*А А*и

и и

С и А*и С*С А* и А* и А*и А*и А*и и*А Ц*А

ОииАС ААООиС---ПОЛИ-А

и и и с

и О ВЗЭЛ А*и А*и

а и

и*А А*и

А*и

с и I и I и I и и*А А*и А*и А*и А*и С*С А* и

и и и и * I

А*и А* и С А и*А А*и и*А А*и

ООО иОС—поли-А

А-и А и А* и ВС

А*и

с*е

А*и СА*и I и ЦА*и А* и И*А

ОииА САиииС-ПОЛИ-А

Рис. 12. Элементы вторичной структуры З'-нетранслируемых областей трех альфавирусов (участки, расположенные непосредственно перед поли-А треком).

A G

U*A

G*C

С-А А I

С А U* А

с и G*C

А С C*G

А А А |

G*C G*C

G*C U*A

G*C G*C

A* U G*C

G*C A* U

A* U ### U*A

5'-AUA ACGGCUGACCUAAA CCCACCGCCAAAAUGUUU-3•

Рис. 13. Вторичная структура промотора синтеза 26S РНК вируса ЗЭЛ (шт.МсМШап) (показана "+"-нитъ). Знаком ### обозначен стоп-кодон, знаком *** - инициирующий AUG - кодон. (один из трех вариантов).

Таким образом, результаты сравнения первичной и вторичной структуры З'-нетранслируемых области ВЗЭЛ с аналогичными областями ВС и ВВсЭЛ доказывает происхождение этого участка от двух прародителей.

Межцистронный (junction) регион и прилегающий к нему участок гена nsP4 играют важную роль в регуляции процесса репликации альфавирусов. В этой области располагается консервативная последовательность из 21 нуклеотида, которую обычно рассматривают как промотор синтеза субгеномной 26S РНК.

В первичной структуре генома вируса ЗЭЛ также присутствует данная консервативная последовательность. При расчете вторичной структуры РНК в данной области было установлено, что 21-нуклеотидная последовательность формирует шпильку (рис. 15 А), которая, в отличие от элемента Б остается неизменной в трех возможных вариантах вторичной структуры найденных для вируса ЗЭЛ. По-видимому, консерватизм структуры "А" является отражением ее функциональной значимости.

5. Вирус Карельской лихорадки.

Ранее первичная структура вируса Карельской лихорадки была определена только для З'-нетранслируемой области (Yu.Shirako et al., 1991). Сведения о кодирующих областях данного вируса практически отсутствуют. Нами были уточнены и проанализированы последовательности, соответствующие участкам генома вируса Карельской лихорадки (5'-нетранслируемая область - начало гена nsPI и конец гена El - З'-нетранс-лпруемая область). Таким образом, были исследованы участки генома, кодирующие как структурные так п неструктурные белки. Суммарно, было проанализировано около 13% генома ВКЛ.

В результате проведенного исследования установлено, что проанализированные участки геномов ВС и ВКЛ имеют только единичные различия, не превышающие средних величин внутривидовой изменчивости, что позволяет однозначно отнести ВКЛ к ВС-подобным вирусам по двум генам. Следует отметить, что ВКЛ в меньшей степени отличается от выделенного в Скандинавии вируса Окельбо, чем от прототипного штамма ВС (HRSP). Определенная нами структура частично перекрывается со структурой, установленной Yu.Shirako et al., 1991. Оба варианта З'-нетранслируемой области ВКЛ совпадают, за исключением двух нуклеотидов - 1 1562 и 11564 (нумерация - по ВС). В определенной нами последовательности в этих положениях расположены нуклеотиды, аналогичные ВС, а в варианте Yu.Shirako et al.(1991) - аналогичные Вок.

Сопоставление ВС, ВОк и ВКЛ по известным участкам генов nsPI показывает наличие у ВКЛ 6 нуклеотндных замен по сравнению с ВОк и 18 - по сравнению с ВС. Однако, соответствующие им аминокислотные замены единичны: Val34(BC) -> Ala (ВКЛ) и Т11г145(ВОк) -> Met (ВКЛ). Можно предположить, что данные замены имеют отношение к различиям в уровнях репродукции указанных вирусов в клетках комаров и куриных фнбро-бластов.

Различия ВС, ВОк к ВКЛ по проклонированиому фрагменту гена El более существенны: 29 нт и 4 ао в паре ВС/ВКЛ и 3 пт и 2 ао в паре Ок/ВКЛ.

ВОк, ВКЛ

с С

: А С А

1 А и и Ü А и и

: А и и С А и и

А*и А С A*U А С

C*G C*G C*G C*G

U*A G*C С. А G*C

G*C 1 А G*C 1 А

G*C A*U G*C A*U

1 А G*C 1 А G*C

A*U A*U A*U A*U

C*G C*G C*G C*G

C*G C*G C*G C*G

С A G*C и A А и G*C С А С A G*C U A A U G*C С А

Рис.14. Вторичная структура 51-нт-консервативного региона у прототиппого ВС и ВКЛ.

Интересно, что в положении 237, предположительно связанном с нейровирулентностью, у ВКЛ, ВОк и BC(AR339) находится Ala, тогда как BC(HRSP) в данном положении содержит Ser.

Проанализированный фрагмент nsPl белка ВКЛ включает участки метилтрансферазного домена ( Н39 и Dsi-X-X-R (мотивы I и II), мотив IV расположен за пределами проанализированной области).

ВКЛ и ВОк обладают интересной особенностью, ранее не описанной ни для одного альфавируса, за исключением лабораторных мутантов ВС. В участке гена nsPl, соответствующему т.н. 51-нуклеотнд консервативному региону, они содержат единичную замену, приводящую к нарушению стабильности одного из элементов вторичной структуры даннной области (рис. 14). Значение этого факта окончательно не ясно, однако, возможно, с изменением стабильности вторичной структуры в данном регионе связаны некоторые особенности репликации ВКЛ в культурах клеток.

Заключение

Таким образом, выполненная работа позволила получить новые сведения об особенностях происхождения и деталях строения генома альфавирусов серокомплекса ВС-ВЗЭЛ.

Одним из основных результатов проделанной работы следует считать уточнение таксономического положения и происхождения вируса ЗЭЛ. Проведенный нами анализ позволил не только доказать рекомбинантную природу ВЗЭЛ и происхождение области генов неструктурных белков от ВВсЭЛ подобного вируса, но и уточнить положение ВЗЭЛ среди ВС-ВЗЭЛ-подобных вирусов.

В настоящей работе были использованы не только данные о первичной структуре модельного вирсуса и прототипных вирусов(ВС, ВВЭЛ, ВЛС, ВРР, БОНН), но и сведения об последовательностях отдельных участков генов различных штаммов и изолятов. Этот подход позволил нам доказать что расщепление ВС-подобиых вирусов на ВС-подобные вирусы Старого и Нового Света предшествовало возникновению ВЗЭЛ, причем ВС-подобный предок ВЗЭЛ относился к группе вирусов Старого Света. Возможные объяснения этого феномена приведены выше.

В табл.4 приведено сравнение биологических свойств ВС ВЗЭЛ и ВВсЭЛ и особенностей первичных структур их белков. Поскольку у вируса ЗЭЛ именно гены белков полимеразного комплекса и ген белка нуклео-капсида имеют общее происхождение с аналогичными белками ВВсЭЛ, мы предположили, что энцефалитогенные свойства ВЗЭЛ связаны именно с указанными областями генома. Данное предположение поставило перед нами задачу анализа первичной структуры генома ВЗЭЛ и сравнения его с ранее изученными вирусами. Сравнение неструктурных белков изученных альфавирусов и их функциональных сайтов может рассматриваться как один из подходов для определения роли белков полимеразного комплекса в развитии инфекционного процесса и их вклада в интегратнвное свойство патогенности у альфавирусов. Сравнительный анализ структуры отдельных функциональных сайтов позволил нам также исключить мозаичный характер рекомбинации между ВС-подобным н ВВсЭЛ-подобным предками ВЗЭЛ.

Приведенная выше аргументация объясняет особенности методического решения поставленных в нашей работе задач. Обнаруженные функциональные особенности некоторых белков ВЗЭЛ (сигналы ядерного

Табл.4. Биологические особенности вирусов Синдбис, ЗЭЛ и ВсЭЛ и уровни сходства белков Е2 и тР2.

Ведущий Сходство в %

Вирус Хозяин симптом Летальность Е2 шР2

Вирус Синдбис Человек Мышь Пспсхии, лрфШЫ не извесша с ВЗЭЛ-67,1 с ЫЗсЭЛ- 44,0 с ВЗЭЛ-53.У с ВВе'ЭЛ-53,0

Вирус ч;ш;|дм<>| о эпцсфшппа Человек Лошадь Обея.яна Мышь Энцефалшы Энцефалшы Энцефалшы Эпцсфалшы, миокардш ы, М110)111 ы 10-30% с ВС-67,1 с ВВсЭЛ- 44,3 с ВС- 53,9 с ВВсЭЛ-72,5

Вирус ВОС [ОЧНОГО знцсфашпа Человек Лошадь Фазан Цыплспок Мышь Хомяк- Энцефалш и Энцефалшы Энцефалшы Миокардш ы Энцефалшы Энцефалш ы. гепашгы 40 - 70% с ВС- 44,02 с ВЗЭЛ- 44,3 с ВС- 53,0 с ВЗЭЛ- 72,5

транспорта у белков пзР2 и С, участки связывания с геномной РНК и большой рибосомальной субъединицей у белка С) потребовали привлечения для анализа сведений о первичной структуре сходных белков других вирусов и, в некоторых случаях, клеточных белков.

Нами впервые было проведено сравнение вторичной структуры РНК в З'-нетранслируемой области у вирусов Синдбис, ВсЭЛ и ЗЭЛ. Результатом этого исследования стала локализация в данной области ВЗЭЛ-, ВС- и ВВсЭЛ-подобных элементов вторичной структуры, связанных с ранее описанными для апьфавнрусов повторами в пределах указанной области. Данное наблюдение можно рассматривать как подтверждение реком-

бпнантной природы ВЗЭЛ. В то же время, это позволяет ним с высокой точностью определить участок взаимодействия геномов ВС и ВВсЭЛ в процессе рекомбинации.

Окончательное установление роли рекомбинации в эволюции альфавирусов ставит задачу более подробного изучения, типированпя и классификации природных изолятов, ранее относенных к серокомплексу ВС/ВЗЭЛ, что помогло бы с большей вероятностью оценить их эпидемическую опасность.

Результатом проведенного нами анализа стала локализация в белках (пзР2 и С) альфавирусов бипартитного сигнала ядерной транслокации. По-видимому, именно с данным сигналом связано описанное для многих вирусов эгою рода явление транспорта белков п$Р2 и С в ядро зараженной клетки с последующим накоплением в ядрышке. Данное явление может быть связано с регуляцией синтеза клеточной РНК и играть важную роль в процессе апоптоза. Одним из подтверждений этого предположения может быть обнаруженная нами корреляция между патогенностыо вируса и количеством бнпартитных сигналов в белке С у различных альфавирусов.

Проведенные нами исследования подводят итог сравнительного анализа первичной структуры альфавирусов с охарактеризованным геномом на апрель 1996 года. Полученные результаты позволяют по-новому взглянуть на эволюционные взаимосвязи внутри рода А1р1ппчги5 и уточнить особенности происхождения некоторых альфавирусов. Выявленные нами закономерности строения альфавирусов позволили дать объяснение ряда особенностей их репродукции, показанных ранее в экспериментальных исследованиях. Использованные методические подходы могут быть впоследствии применяться как для изучения других представителей данного рода, так и для сравнительного анализа белков вирусов, относящихся к различным таксономическим группам.

Прикладной аспект проделанной работы основан на выполненных нами исследованиях гомологии отдельных участков генома ВЗЭЛ и других альфа-вирусов. Это позволило не только провести расчет специфических праймеров для генотипированпя альфавирусов серокомплекса ВС-ВЗЭЛ, но

п рассчитать наиболее удобные cai'iTbi рестрикции ПЦР-продуктов для дифференциальной диагностики вирусов Синдбис и ЗЭЛ. Последнее положение имеет особенно важное значение для практических целей, когда требуется быстро оценить потенциальные клинические проявления инфекций, вызванных новыми изолятами альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ.

Выводы.

1. На основании полученных данных о первичной структуре геномов двух альфавирусов: вируса западного энцефалита лошадей (ВЗЭЛ) (гены структурных белков, гены nsP2 и nsP3, а также участки генов nsPl, nsP4 и З'-нетранслируомой области) и вируса карельской лихорадки (ВКЛ) (участки генов nsPI, El, а также 5'- и З'-нетранслируемых областей) и проведенного сравнительного анализа первичных структур генов н белков изученных альфавирусов, установлено, что по структурной области (белки Е1 и Е2) вирус ЗЭЛ близок к вирусам Синдбис (ВС) и Аура, образуя вместе с ними группу ВС/ВЗЭЛ-подобных вирусов, а по неструктурной области (белки иолимеразного комплекса) и белку С - к вирусам восточного (ВсЭЛ) и веиссуэльскогого (ВЭЛ) эицефало,миелитов лошадей, образуя вместе с ними группу энцефалитных вирусов Нового Света.

2. Данные сравнительного анализа указывают на необходимость выделения вируса ЗЭЛ (штаммы McMillan и BFS) в отдельную таксономическую группу внутри рода Alphavivus - группу вирусов рскомбинаитов. Различия по проанализированным областям между двумя штаммами вируса ЗЭЛ (McMillan и BFS-17Q3) не превышают 3,1%, что может служить обьяснением их близости но антигенной структуре. Точечные различия между структурными белками двух штаммов являются следствием естественной изменчивости эгих вирусов.

3. Вирус Аура - относится к Синдбис-подобным, а не к ВЗЭЛ-подоб-ным вирусам, однако представляет- собой самостоятельную ве!вь эволюции альфавирусов группы ВС, не связанную с возникновением рскомбннант-ного ВЗЭЛ.

При сравнении участков генома было установлено, что ВКЛ, как и вирус Аура, принадлежит к ВС-подобным вирусам. Сходство между ВКЛ и вирусом Окельбо выше, чем сходство каждого из этих вирусов с ВС, что дает право сделать вывод о близком эволюционном родстве ВКЛ и вируса Окельбо.

4. В первичной структуре генов и белков вируса ЗЭЛ, локализованы ранее описанные для других альфавирусов функциональные домены: гелн-казиый мотив (С|К6-ХХХХ-0К5...0Е), аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра протеазы (С477..Н5.16) и мотив ядерной транслокации (РбдцОККУ) в белке П5Р2; 1ЮА стоп-кодон в гене белка пбРЗ; аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра протеазы в белке С (Hi36.-Df58-.S2ia). В результате сравнения изученных альфавирусов была уточнена консенсусная последовательность (К/Я-Р-Х-К/Я-Я-Х-К-М) для участка белка С, связанного с взаимодействием с геномной РНК и с большой рибосомалыюн субъедпницей.

5. Впервые у шРЗ-белков вируса ЗЭЛ и других альфавирусов показано наличие бнпартитного сигнал ядерной транслокацнн, характерного для ряда нуклеофнльных белков эукарпот. Данный сигнал расположен в консервативной области белка пзР2.

Аналогичный сигнал был локализован в белке С вируса ЗЭЛ и других альфавирусов. Бипартитный мотив может присутствовать в данном белке в нескольких перекрывающихся копиях в зависимости от конкретного вируса, причем количество копий до известной степени коррелирует с патоген-ностыо вируса.

6. На основании сравнительного анализа аминокислотных остатков, связанных с взаимодействием белка нуклеокапснда и цнтоплазматического домена белка Г£2 в процессе сборки внриоиа, сделан вывод о том, что возникновению внруса-рекомбннанта, по-видимому, предшествовали аминокислотные замены в указанных сайтах у ВС- и ВВсЭЛ-подобиых прародителей этого вируса, что могло существенно увеличить стабильность образовавшегося рекомбинантного вириона.

7. В результате сравнения построенных вторнчных структур 3'-нетранс7 лируемых областей альфавирусов в этом участке генома ВЗЭЛ были локализованы ВС-подобные и ВВсЭЛ-подобные элементы, что позволило уточнить положение участка рекомбинации в З'-нетранслируемой области и подтвердить, что ВЗЭЛ образовался в результате двухсайтовой рекомбинации.

8. На основании сравнительного анализа геномов всех изученных к настоящему времени альфавирусов были подобраны оптимальные участки для генотипирования представителен этого рода.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

I ) Uryvaev L.V., Lebedcv A.Yu., Sokolova T.M., Yupherov V.P. / Primary structure of WEE virus genome RNA. Materials of 3-rd Congress of the European Society for Veterinary Virology. Interlaken, Switcherland, Spt 1994. P8-20.

2) T.M.Sokolova, O.V.Bobrova, T.K.Selivanova, A.Yu.Lebedev, L.V.Uryvaev, N.S.Bystrov, D.K.Lvov / Alphavirus genomes recombination in mixed infection of tissue culture. Materials of Xth International Congress of Virology Jerusalem, Israel, 11-16 August, 1996,p.l31.

3) L.V.Uryvaev, A.Yu.Lebedev, T.M.Sokolova, D.K.Lvov / Comparative analysis of nucleocapsid (C) protein of WEEV (McMillan strain) and other alphaviruses putative functional sites. Materials of Xth International Congress of Virology Jerusalem, Israel, 11-16 August, 1996, p.131.

4) Урываев Л.В., Волчков B.E., Юферов В.П., Самохвалов Е.И., Лебедев А.Ю., Сафронов П.Ф., Нетесов С.В. / Первичная структура белков полимеразного комплекса nsP2 и nsP3 подтверждает рекомбинантную природу вируса Западного энцефалита. Доклады АН -1994 - T.335-N6.-C.8I3-8I8.

5) Урываев Л.В., Лебедев А.Ю., Соколова Т.М., Юферов В.П. / Первичная структура гена С и кодируемого им белка нуклеокапсида у вируса Западного энцефаломиелита лошадей. Доклады АН -1995 - т.344 -N3. -с.397-401.

6) Урываев Л.В., Петров Н.А., Соколова Т.М., Самохвалов Е.И., Лебедев А.Ю., Селиванова Т.К., Парасюк Н.А., Ионова К.С., Гринев А.А. /

Анализ превичнон структуры участков генома вируса Карельской лихорадки. Вопросы вирусологии - 1995-N5 - с. 198-202

7) Л.В.Урываев, А.Ю.Лебедев / Сравнительный анализ первичной структуры белка нуклеокапсида вируса западного энцефаломиелита лошадей и других альфавирусов. Вопросы вирусологии - 1996 - N4 -принято к печати.

8) Т.М.Соколова, Т.К.Селнванова, А.Ю.Лебедев, Н.С.Быстров, В.Л.Громашевскпй, Н.А.Парасюк, К.С.Йонова, Л.В.Урываев / Сходство и различие вцрусов Западного энцефаломиелита лошадей (ЗЭЛ) по генам неструктурного белка №Р2 и структурных белков С и Е2. Вопросы вирусологии - 1996 - N5 - принято к печати.

9) Т.М.Соколова, Т.К.Селнванова, А.Ю.Лебедев, Н.С.Быстров, Н.А.Парасюк, К.С.Попова, Л.В.Урываев / Вирусы Синдбпс разного географического присхождения и дифференцирование их от вирусов Западного энцефаломиелита лошадей методом полимеразной цепной реакции. Вопросы вирусологии - 1995 -N3 - с.117-122

10) Л.В.Урываев, Т.М.Соколова, Т.К.Селнванова, А.Ю.Лебедев, Н.А.Парасюк, К.С.Попова, Н.С.Быстров, Д.К.Львов / Разработка методов определения маркеров лихорадки Синдбис и Западного энцефаломиелита лошадей с помощь(о полимеразной црпной.реакции и латекс-агглютинации. Материалы международной научной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами", 24-26 сентября 1996 г., Иркутск.

11) Т.М.Соколова, Т.К.Селиванова', А.Ю.Лебедев, В.Л.Громашевскпй, Д.Л.Львов, Л.В.Урываев / Даннь)е о генетической структуре вируса У-62, выделенного в Удмуртии. Материалы международной научно]'! конференции "Вирусные, рнккетсиозщие и бактериальные инфекции, переносимые клещами", 24-26 сентября 1996 г., Иркутск.

12) Л.В.Урываев, А.Ю.Лебедев, Т.М.Соколова, Т.К:Селиванова / Впрусы-рекомбинанты - новая подгруппа рода А1рИаУич15. Материалы межг дународной научной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами", 24-26 сентября 1996 г., Иркутск.