Анализ нуклеазной фрагментации хроматина кодирующих областей генов триптофандиоксигеназы (to) и тирозинаминотрансферазы (tat) в различных функциональных состояниях

Павлова, Евгения Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ нуклеазной фрагментации хроматина кодирующих областей генов триптофандиоксигеназы (to) и тирозинаминотрансферазы (tat) в различных функциональных состояниях
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Анализ нуклеазной фрагментации хроматина кодирующих областей генов триптофандиоксигеназы (to) и тирозинаминотрансферазы (tat) в различных функциональных состояниях"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Павлова Евгения Юрьевна

АНАЛИЗ НУКЛЕАЗНОЙ ФРАГМЕНТАЦИИ ХРОМАТИНА КОДИРУЮЩИХ ОБЛАСТЕЙ ГЕНОВ ТРИПТОФАНДИОКСИГЕНАЗЫ (to) И ТИРОЗИНАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ (tat) В РАЗЛИЧНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ " "YT' СОСТОЯНИЯХ

03.00.04.-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008 .

003460435

Работа рыполнена на кафедре биохимии Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Прияткина Татьяна Николаевна

Оффтщалыше оппоненты:

доктор биологических наух, профессор Пучкова Людмила Валентиновна кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Петухова Ольга Александровна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова (РАН)

совета Д.212.232.09 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете (СПбГУ) по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А.М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан «_»_2008 г.

Ученый, секретарь диссертационного совета .

Защита* диссертации состоится «

_2009 г. в ' " часов на заседании

кандидат биологических наук

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Механизм транскрипции эукариотических генов остаётся нерешённой проблемой и актуальной задачей молекулярной биологии. Горячей точкой в этом направлении являются исследования путей выхода ДНК из компактной (нуклеосомной) формы для осуществления матричных функций.

Первым биохимическим показателем преобразования нуклеосомной структуры хроматина при дерепрессии генов явились данные о доступности внутрикоровой ДНК для ДНКазы I. При действии этого фермента не наблюдается образования мононуклеосом, вся ДНК кодирующих областей переваривается до кислоторастворимого материала. С использованием нового подхода для высокоточного анализа ДНК-гистоновой ассоциации ш vivo, включающего иммунопреципитацию фрагментов хроматина teg-мечеными гистонами и сканирование преципитата на содержание ген-специфических сегментов, было показано, что как промоторная ДНК, так и ДНК единиц транскрипции многих активных генов не связана с гистонами. О декомпахтизации нуклеосом в участках транскрипции свидетельствуют и данные ультраструктурного анализа 70-х - 80-х годов. Однако в хроматиновой оси транскрибируемых участков иммунохимическими методами выявляются все коровые гистоны. Более того, ДНК кодирующих областей активных и компетентных к транскрипции генов, полиостью расщепляемая ДНКазой I до кислоторастворимых продуктов, резистентна к действию микрококковой нуклеазы (МНазы). По вопросу о том, соответствует ли характер протекции нуклеосомному типу организации хроматина, данные противоречивы.

В первых исследованиях, проведённых на глобиновых и овальбуминовых генах с использованием ещё техники гибридизации в растворе, не было обнаружено различий между активным и репрессированным их состояниями по скорости переваривания ДНК МНазой я её распределению в спектре фрагментов, кратных структурной единице. В ряде работ огмечался более быстрый распад части активного хроматина до моно- и коротких олигонуклеосом.

Последующие анализы методом блот-гибридизации выявили большое разнообразие дерепрессированных генов по характеру МНазной фрагментации их кодирующих областей. Так, одновременно существуют данные, подтверждающие как неизменность позиции нуклеосом и длины нуклеосомного повтора при активации гена, так и его удлинение или укорочение. Обнаружены нарушения нуклеосомной повторяемости МНазных разрывов, а также продукция фрагментов монотонно убывающих по длине [Cohen, Sheffery, 1985; Simpson, 1991; Clark, 1995].

В качестве причин неоднозначности результатов рассматривают множественность состояний, в которых могут быть представлены индивидуальные гены и их участки в клеточной популяции. Действие внутриядерных нуклеаз и протеаз во время инкубации ядер и потеря нативной конформадии хроматина при накоплении одно- и двунитевых разрывов ДНК [Caplan et.al., 1987] создают дополнительные трудности в оценке наблюдаемых характеров его фрагментации экзогенными ферментами.

Удобной моделью для сравнения характера нуклеазной фрагментации в составе ядер активного и репрессированного хроматина являются гены to и tat. Эти гены представлены одной копией в геноме крыс. Их экспрессия тканеспецифична и две ступени активации разделены во времени. Состояние компетентности к транскрипции устанавливается только в предшественниках гепатоцитов на конечных стадиях эмбриогенеза и сохраняется при последующих клеточных генерациях. Транскрипция индуцируется в раннем постнатальном развитии. Такая система регуляции to и tat генов исключает присутствие в клетках печени взрослых животных их репрессированных форм.

Целью данной работы явился сравнительный анализ доступности ДНК в кодирующих областях to и tat генов для фрагментации МНазой, ДНКазой I и ДНКазой II, различающихся по механизму нуклеолитического действия, в активном, компетентном к транскрипции и репрессированном состояниях - в ядрах клеток печени и мозга новорождённых и взрослых крыс.

Для выполнения этой цели решались следующие задачи:

1. Получение ДНК-зондов - сегментов кодирующих областей to и tat генов из содержащих их рекомбинантных плазмид. Мечение ДНК-зондов флуоресцирующим агентом при амплификации в системе со случайными праймерами.

2. Сравнение длины фрагментов ДНК общего (репрессировнного) и активного {to и tat генов) хроматина, продуцируемых МНазой, ДНКазой I и ДНКазой II в ядрах клеток печени взрослых крыс при различных концентрациях ферментов.

3. Сравнение характера фрагментации гена to МНазой и ДНКазой I в репрессированном (в ядрах клеток мозга) и ахтивном (ядрах клеток печени) состояниях.

4. Сравнение длины фрагментов гена to, продуцируемых МНазой и ДНКазой I в компетентном к транскрипции (в ядрах клеток печени новорождённых крыс) и репрессированном (в ядрах клеток мозга) состояниях.

5. Фракционирование хроматина - разработка условий избирательной экстракции фрагментов активных генов из МНазных гидролизатов ядер клеток печени крыс.

6. Анализ длины ДНК и белкового состава фракций фрагментов, выходящих в солевые растворы различного состава.

7. Определение степени обогащения полученных фракций ДНК активных генов с использованием методов дот- и блот-гибридизации с сегментом кодирующей области гена to.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На всйм протяжении кодирующих областей to и tat генов как в компетентном к транскрипции, так и в активном состояниях, не обнаруживается нуклеосомных устройств - цепей нуклеазорезистентных компактных частиц, разделенных сегментами свободной ДНК (межнуклеосомными линкерами).

2. В кодирующей области гена to в компетентном к транскрипции состоянии отсутствуют сайты ДНК, доступные для МНазной фрагментации. Включение транскрипции приводит к появлению нерегулярных МНазочувствительных участков, которые, возможно, фланкируют элонгирующие РНК полимеразы.

3. ДНК единиц транскрипции активированных (компетентных к транскрипции) и активных to и tat генов чувствительна к ДНКазе I: при распаде общего хроматина под действием ДНКазы I до мононуклеосом (достижении лимита нуклеазного переваривания) to- и íaí-ДНК переходит в кислоторастворимую форму.

4. По характеру фрагментации хроматина дерепрессированных to и tat генов ДНКаза II сходна с МНазой.

5. Фрагменты кодирующей области гепа to, образующиеся в ядрах клеток печени при действии МНазы, осаждаются в инкубационной среде. Раствор средней ионной силы, содержащий ионы пирофосфата и Mg2+ (0,05М tris-HCI буфере pH 7,5; 0.04 М тетрапирофосфата натрия; 0.005 М MgCl2 и 0.2 М NaCl, ПФР [Прияткина и др., 1997]), эффективен в экстракции полноразмерных единиц транскрипции to, их сегменты удерживаются в нерастворимом ядерном осадке. Степепь обогащения нуклеотидными последовательностями гена to растворимой в ПФР и осаждающейся фракциях близка к 50-кратной (в сравнении с суммарным хроматином).

Научная новизна. Впервые показано, что преобразование (ремоделирование) нуклеосомиой структуры хроматина на всём протяжении кодирующих областей to и tat генов предшествует инициации транскрипции. В in vivo ремоделировляной форме повторяющиеся структурные единицы хроматина не подразделяются на "коровую" и линкерную области, различающиеся по доступности ДНК к нуклеазам. На протяжённых участках вся внутринуклеосомная ДНК расщепляется ДНКазой I и, одновременно, не обнаруживает сайтов для МНазных разрывов, соответствующих межнуклеосомным линкерам.

Практическая значимость работы. Полученные данные вносят вклад в решение ряда актуальных проблем молекулярной биологии, касающихся механизмов эукариотической транскрипции, организации нуклеогастоновой матрицы, формирования активной конформация хроматина (компетентного к трансхригщии состояния), как одной из стадий многоступенчатого процесса их активации. Результаты проведенных исследований могут оказаться полезными в таких областях практической молекулярной биологии и экспериментальной медицины как регуляция экспрессии чужеродных генов в зукариотических клетках, продукция терапевтических белковых препаратов и др., развитие которых имеет большое значение в лечении наследственных заболеваний.

Материалы диссертационной работы используются в курсе лекций по структурно-функциональной организации хроматина для магистров кафедры биохимии биолого-почвенного факультета СПбГУ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XVIII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001), на международном симпозиуме «Biological mobility: new trend in research» (Пущино, 2001), 2-ой конференции Московского Общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Москва, 2003), III Съезде биофизиков России (Воронеж. 2004), 8-ой Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), XV Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005), Девятой Всероссийской Медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006), IV съезде Всероссийского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск. 2008), на научном семинаре кафедры биохимии биолого-почвенного факультета СПбГУ (Санкт-Петербург, 5.12.2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 1 статья в реферируемом журнале, 1 статья в сборнике «Нервная система» (Издательство С.-Петербургского университета) и 9 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 103 страницах, содержит 2 таблицы и 23 рисунка. Список литературы включает 218 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Препараты ядер получали из клеток печени и мозга беспородных белых крыс после лизиса цитоплазмы в растворе 0,5% тритона X 100 в буфере ТКМ как описано ранее

(Прияткина и др., 1997). Обработку очищенных ядер МНазой проводили в 0,010 М трис-НС1 буфере с pH 8,0, содержащем 1,5 мМ СаСЬи 1 мМ ПМСФ в градиенте температуры от 0° до 20°С в течение 10-15 мин. Интенсивность переваривания ДНК регулировали только вариациями концентрации фермента. Обработку ДНКазами I и II вели при тех же условиях в буфере ТКМ, разведённом в 2 раза и в 0,010 М трис-HCl с pH 8,0, содержащем 0,8 мМ MgCh идя ДНКазы I и II, соответственно. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА, ЭГТА и ДС-натрия.

ДНК депротеинизировали фенолом в стандартных условиях и анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле [Маниатис и др.,1984]. Фрагменты ДНК с агарозных гелей переносили на мембрану HybonN+ электрофоретически с использованием аппарата Blotter для полусухого переноса.

ДНК плазмид pUC19x(pC) [Shinomiya et.al., 1984], содержащей ген tat, или рТО(Е-3.3) [Чихиржина и др., 1993], включающей центральный сегмент кодирующей области гена to, выделяли из клеток бактерий методом щелочного лизиса и очищали равновесным центрифугированием в градиенте плотности CsCl [Маниатис и др.,1984]. ДНК-зонды -фрагменты рестрикции кодирующей области генов to и tat, получали после препаративного электрофореза смеси реириктов в б% ПААГ. Для флуоресцентного мечения фрагментов генов и их детекции в гибридах использовали наборы фирмы "Amersham". Условия дот- и блот-гибридизация соответствовали рекомендациям фирмы "Amersham". Для детекции ДНК-зондов в гибридах использовали высокочувствительную рентгеновскую плёнку Hyperfilm ("Amersham").

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Мы попытались свести к минимуму артефактную фрагментацию ДНК при исследовании действия экзогенных ферментов. Дня сохранения целостности хроматина до обработки нуклеазами, все операции по очистке ядер проводили при 0'С, промывающие растворы предварительно охлаждали до -ГС —2*С. При нуклеазной фрагментации хроматина выделенные ядра инкубировали с ферментами в течение 10-15 мин при градиенте температуры от 0'С до +20'С. Интенсивность переваривания ДНК регулировали только вариациями концентрации ферментов.

Для определения длины нуклеазорезистентиых участков (всех вариантов распределения в кодирующих областях доступных к нуклеазному перевариванию сайтов) ядра инкубировали при насыщающей концентрации ферментов. Для выявления нуклеазочувствительных зон использовали широкий диапазон их концентраций.

Фрагменты генов to и tat в суммарной ДНК нуклеазных гидролизатов выявляли с помощью блот-гибрвдизация. В качестве зондов использовали сегменты их кодирующих

областей - зонд ТАТ1 с координатами (+800/+3700 п.н.) и ТО 1 (+5000/+8300 п.н.). Проводили прямое сравнение длины фрагментов общего (отражающего репрессированное состояние) и активного (to и tat генов в ядрах печени) хроматина, а также фрагментов гена to в репрессированном (в ядрах мозга) состоянии, образующихся под действием МНазы, ДНКазы I и ДНКазы II.

Фрагментация ДНК кодирующей области to tat генов микрококковой, нуклеазой

в составе ядер печени и мозга крыс. Рис.1, демонстрирует типичную картину

расщепления ДНК хроматина печени и мозга крыс при концентрации МНазы,

обеспечивающей достижение лимита в переваривании ДНК в составе ядер.

Рис.1. Фрагментация ДНК общего хроматина и хроматина кодирующей области гена to в ядрах клеток печени и мозга крыс при концентрации МНазы 120 Ащ) едЛмг ДНК.

А ~ Эпектрофореграмма фрагментов ДНК в 1% агарозном геле, окраска бромистым этидием. Б -автограф с электрофореграммы после гибридизации с зондом ТО I. В - гибридизация с флуоресцентно-меченой суммарной ДНК из клеток печени крыс.

1 и 2 - ДНК из ядер клеток печени и мозга крыс, соответственно, инкубированных в отсутствие МНазы; 3 и 4 - из тех же ядер, инкубированных с МНазой. М - Маркер: ДНК фага А, рестрицированная Hindin, в качестве положительного контроля гибридизации добавлено около 2 пкг немеченой ТО I ДНК, цифры - длина фрагментов рестрикции (в п.н.).

При этих условиях большая часть общего хроматина переваривается преимущественно до моно- и динуклеосом (А. дор. 3 и 4). При этом в спектре фрагментов отчетливо выявляется пик высокополимерной ДНК (А, дор. 3 и 4, верх). Результаты гибридизации фрагментов с зондом ТО I (рис 1, Б) оказались неожиданными. При условиях, когда в репрессированном хроматине МНазные разрывы ДНК реализуются в каждом или, реже, в каждом втором межнуклеосомном линкере, в гидролизатах сохраняются протяжённые (от 1500 до 20000 п.н.) фрагменты гена to (рис. 1, Б, дор. 3), часть из которых сопоставима с величиной его единицы транскрипции (около 20000 п.н.). В ядрах мозга (в репрессированном состоянии) (Б, дор. 4) тот же ген расщепляется на моно- и динуклеосомные фрагменты, как и общий хроматин (J\, дор. 3, В, дор. 3 и 4).

Чтобы определить 5'- и 3'- границы МНазоустойчивых зон на нуклеотидной последовательности гена to в ядрах клеток печени, ДНК, выделенные из ядер, инкубированных без МНазы, и МНазных гидролизатов рестрицировали Xhol, и образующиеся фрагмента гибридизовали последовательно с зондами ТО 1-2800 и ТО 1500 (рис. 2, A) [Nedospasov, Georgiev, 1980]. Фрагменты, выявляемые в МНазных гидролизатах имеют длину от 6 до ~ 10000 п.н. в 3'- и 5'- направлении от сайта

А В В

1 2 3 4 М 12 3 4 М 1 2 3 4 М

рестрикции Xhol (рис.2 Б, В, дор. 4). Наблюдаемая максимальная длина фрагментов показывает, что в гидролизатах сохраняются фрагменты, включающие полноразмерные единицы транскрипции гена to.

_ TOI

—«-И-73Т-

III м __к » с

toi.»»

roTwn

Рис.2. Определение 5'- и 3'- границ фрагментов to гева в ядрах клеток печени крыс методом непрямого концевого мечевня ДНК.

А - Xhol и EcoRI сайты рестрикции в кодирующей области гена to, позиции ^^^^ зондов ТО 1-2800 и ТО 1-500, Б -

Электрофореграмма фрагментов ДНК в 23130 ^Я^^^К ЫИЧИМ "/0 агаРозном геле, окраска бромистым

mif КЗ И |И» этидием. В и Г - Автографы после

ж) В^иВ ЩуШ^^5 ™®Ридизации с зондами то 1-2800 (В) и

И^^ 1 и 2 - ДНК из ядер инкубированных без ВВ-М МНазы, исходная (1) и обработанная flj^^B^HBj рестриктазой Xhol (2), 3 - ДНК из ядер,

обработанных МНазой ((¿0 А2м ед./1мг ' 1 i 4 м 1 1 1 * м *** ДНК); 4 - та же после рестрикции Xhol.

М - Маркер: ДНК фага X, рестрицированная Hindlll, добавлено около 2 пкг немеченых ТО [-500 и ТО 1-2800 ДНК. Ml - Маркер: 1 kb Ladder («Fermentas»).

Кривая фрагментации общего хроматина и кодирующей области гена Ш в ядрах

1 2 3 4 5 М 1 2 3 4 5 М

В гидролизатах ядер печени обнаруживается минорная фракция относительно

коротких фрагментов Го-хроматина, которые имеют свою динамику МНазного распада

(рис.3, Б, дор. 2, 3). Эта фракция накапливается в интервале от 20 до 60 Аги едЛмг ДНК

МНазы (рис. 3, Б, дор. 2, 3) и не сохраняется при достижении лимита в МНазном переваривании ДНК в составе ядер (рис. 3, Б, дор. 4 и 5).

клеток печени при возрастании концентрации МНазы представлена на рис. 3. А Б

-23130

-4361

Рпс.З. Фрагментация хроматина кодирующей области гена № в ядрах клеток печеня крыс при возрастании концентрации МНазы.

! - ДНК исходных ядер; 2 - 5 - ДНК из ядер печени, обработанных МНазой при 20, 40, 80, 120 Ам ед./1мг ДНК, соответственно.

М - Маркер: ДНК фага X, рестрицированная НЫШ. Остальные обозначения как на рис Д.

Наблюдаемая резистентность к действию МНазы не является спецификой только to гена, другой ген tat, который, тоже дерепрессирован в клетках печени крыс, обнаружил сходный характер распада.

Таким образом, в ядрах печени МНзза продуцирует три класса фрагментов гена to: полноразмерные единицы транскрипции to, их крупные субфрагмеиты гетерогенной величины и минорную фракцию низкомолекулярной fo-ДНК.

Если я условиях лимита переваривания в гидролизатах сохраняются полноразмерные единицы транскрипции, то их сегменты гетерогенной величины происходят из других генных копий, содержащих в кодирующих областях нерегулярные МНазочувствительные участки. Логично предположить, что две формы единиц транскрипции, различающиеся по характеру МНазной протекции, отражают два функциональных состояния, в которых могут быть представлены to и tat гены в этой ткани (компетентном к транскрипции и транскрибируемом).

Мы исследовали фрагментацию МНазой кодирующей области гена to в ядрах

печени однодневных крыс (12-16 часов постнатального развития), где все его копии

находятся в одном, компетентном к транскрипции состоянии.

Рис.4. Фрагментация хроматина кодирующей области гена to в ядрах клеток печеки « мозга новорожденных крыс при возрастании концентрации МНазы. 1-4 - ДНК из ядер клеток печени, обработанных МНазой при 20, 40, 80 и 120 А2И едЛмг ДНК; 5 - ДНК исходных ядер; 6 - 8 - ДНК из ядер клеток мозга, обработанных МНазой при 40, 80 и 120 А26о едЛмг. М - Маркер: ДНК фага X, рестрицировакная Hindin и EcoRI. Остальные обозначения как на рис. 1.

Как видно из представленных данных (рис. 4, дор. 1 - 4), в МНазных гидролизатах ядер клеток печени новорожденных крыс не выявляется фракция субфрагментов кодирующих областей. Вся ДНК to гена представлена фрагментами одной длины, соответствующей полноразмерным единицам транскрипции to. Таким образом, резистентность к МНазе на всём протяжении единиц транскрипции to наблюдается только в ядрах печени в раннем постнатальном развитии, где все их копии находятся в состоянии компетентности к транскрипции.

Фрагментация ДНК кодирующей области to и tat генов ДПКазой I и ДНКазой II в составе ядер клеток печени и мозга крыс. Как видно из рис. 5, протяжённые МИазорезистентные зоны кодирующей области to чувствительны к ДНКазе I (рис. 5, Б,

сравн. дор. 1 и 2): под действием этого фермента в концентрации 120 Kunits/1 мгДНК (KU)

(которая соответсвует 12 Агбо ед. МНазы) практически вся ío-ДНК переваривается до

кислоторастворимых или негибридизующихся продуктов (рис. 5, Б, дор.1). Остаточная

(выявляющаяся при длительной экспозиции рентгеновской плёнки) фракция представлена

монотонно убывающими по длине фрагментами - от 2000 п.н. до 800 п.н. (рис.5, В, дор.1).

Как и в случае с МНазой, при интенсивном переваривании ДНКазой I не образуется

фрагментов /о-ДНК, соответствующих коровым частицам или хроматосомам - конечным

продуктам нуклеолитического распада нуклеосомных цепей (рис.5, Б, В, дор.1).

Рис.5. Сравнение характера фрагментации ДНК общего хроматина а хроматина кодирующей области гена to в ядрах клеток печени крыс ДНКазой I и МНазой при концентрациях, обеспечивающих лимит в переваривании ДНК в составе ядер.

Б, В - автографы с электрофореграчмы после гибридизации с зондом ТО 1, 1 час (Б) и 4 часа (В) экспозиции рентгеновской плёнки. 1 - ДНК из ядер, инкубированных с ДНКазой I при концентрации 120 KU; 2 - из ядер, инкубированных с МНазой при концентрации 120 Аги едУ1мг ДНК; М - фрагменты рестрикции HmdIII/EcoRI >.ДНК. Остальные обозначения как на рис.1.

На рис.6, представлены данные по фрагментации гена tat ДНКазами I и II. При 160 KU ДНКазы I расщепление ДНК происходит практически в каждом межнуклеосомном линкере репрессированного хроматина (рис.6, А, дор. 1), фрагменты мононуклеосомной длины сохраняются при увеличении концентрации ДНКазы I до 480 KU (А, дор. 2, 3). При этом кодирующая область tat гена в том же диапазоне концентраций ДНКазы I переваривается до кислоторастворимого материала (Б, дор. 1 - 3).

Рис.6. Сравнение характера фрагментации ДНК общего хроматина и хроматпна кодирующей области гена tat в ядрах клеток печени крыс ДНКазой I в ДНКазой П при концентрациях,

обеспечивающих лимит в переваривания ДНК в составе ядер. 1 - 3 - ДНК из ядер, инкубированных с ДНКазой I при концентрации 160, 320 и 480 KU, соответственно; 4 - 6 - из ядер, инкубированных с ДНКазой П при концентрации 1200, 2400 и 3600 KU, соответственно; 7 - из ядер, инкубированных без ДНКазы. М - Маркер:1 kb Ladder ("Fermentas")- Остальные обозначения как на рис. 1.

А Б В А

1 2 М 1 2М I 2М М

Продуктами конечной стадии переваривания хроматина ДНКазой П является серия олигонуклеосомных фрагментов ДНК (рис. 6, А, дор., 4-6). По характеру фрагментации кодирующей области дерепрессированного в печени ¿н/-гена ДНКаза II оказалась сходной с МНазой (Б, дор. 4-6). /в/-ДНК оказалась представленной в гидролизатах протяжёнными фрагментами - от 1000 до около 10 ООО п.н. (рис.6, Б, дор. 4-6). Последние близки к длине единицы транскрипции (я/ (11000 п.н.).

Динамику переваривания ДНК общего хроматина и кодирующей области 1о и Са( генов в ядрах клеток печени и мозга крыс при возрастании концентрации ДНКазы I от 5 до 320 КИ иллюстрируют данные, представленные на рис. 7. В интервале концентрации ДНКазы I от 5 до 160 Ки совпадение однонитевых разрывов (ников) на комлементарных цепях ДНК (расщепление двойной спирали) является редким событием. Концентрация 160 Ки оказывается критической. Общий хроматин переваривается до мононуклеосом (рис. 10, А, дор. 8), что свидетельствует о появлении двунитевых разрывов ДНК практически в каждом межнуклеосомном линкере.

А В А в Рис.7. Фрагменты генов /о

■ ЩШШШВШ Я ИНЯЯИНДИИ и продуцируемые в

ядра* клеток печени крыс

«*-.шЕ~~М1~~.....пПГ^^^ИТИ^Иц ДНКазой I в диапазоне

>" ^ - \ ' „Шж концентраций фермента

.:'■ ;;; - || от 5 до 320ки.

4 И Б, В - автографы с

Д| электрофореграммы после I !) ! ! ()ни м т ) ! I ; ни гибридизации с зондом ТО! и ТАТ1, соответственно.

1 - ДНК из исходных ядер; 2 - из ядер, инкубированых без ДНКазы; 3 - 9 - из ядер, инкубированных с ДНКазой I при концентрации 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 Ки, соответственно. Остальные обозначения как на рис. 1.

Стрелки обозначают позиции в геле фрагментов /о-ДНК (Б) и ¿яГ-ДНК (В) на дорожке 6.

Фрагментация ДНК кодирующих областей to и tat генов в ядрах клеток печени при возрастании концентрации ДНКазы I сходна по своей динамике с распадом общей ДНК (рис. 7, Б, В). Однако фрагменты каждой стадии их переваривания концентрируются в узких зонах геля (рис. 7, Б, В). При 80 KU ДНКазы I длина фрагментов to и tat генов снижается до величины их единиц транскрипции (около 20000 и 10000 п.н., соответственно (рис. 13, Б, В, дор. 6, выделены пунктиром, стрелки). При дальнейшем увеличении концентрации фермента ДНК как to, так и tat генов переваривается до коротких кислоторастворимых продуктов (Б, В, дор. 8, 9). В ядрах мозга (в репрессированном состоянии) конечным продуктом переваривания ДНКазой I гена to является мононуклеосомная ДНК, не отличающаяся по размерам от ДНК нуклеосом, образующихся из общего хроматина.

Условия селективной экстракции фрагментов активных генов после МНазной фрагментации хроматина. Получение фракции активного хроматина в виде протяжённых фрагментов, адекватно отражающих его состав и структуру, остаётся актуальной задачей. Сохранение в гидролизатах МНазы и ДНКазы II полноразмерных единиц транскрипции дерепрессированных генов и юс крупных сегментов при условиях, когда репрессированный хроматин распадается на моно- и динуклеосомы, является предпосылкой для их разделения. Мы использовали метод селективной экстракции фракций хроматина раствором, который был эффективен в выделении фрагментов активных генов после ультразвуковой фрагментации ядер [Прияткина, Кузнецова, 1992, Прияткина и др., 1997].

При обработке ядер МНазой при низких концентрациях обнаруживаются три субфракции фрагментов гена ¡о (рис. 3). Как видно из рис. 8, Б, в среду инкубации выходит минорная фракция /о-генных фрагментов с длиной ДНК от 200 до 1500 п.н. Высокополимерные фрагменты генов 1о не экстрагируются из осадка раствором безыонной сахарозы, содержащим 1 мМ ЭДТА и 1 мМ ЭГТА (Б, дор. 82). В экстракте ПФР (А, дор. Эз) и конечном ядерном остатке (А, дор. Оз) превалируют высокополимерные ДНК. Обе фракции эффективно гибридизуются с ДНК кодирующей области гена /о (с зондом ТО 1), но включают различные классы фрагментов (о исходного гидролизата: Бз - преимущественно полноразмерные единицы транскрипции, Оз - их сегменты гетерогенной дайны (рис. 8, Б, дор. Бз, Оз).

Рвс.8. Блот-гибрндизация ДНК из фракций фрагментов хроматина печени крыс с зондом ТО X.

1 - ДНК исходных ядер; 2 - из ядер обработанных МНазой (40 Аг® ед./ 1 мг); Я! — ДНК из фрагментов хроматина, растворяющихся в среде инкубации с МНазой; О) - из фрагментов хроматина, нерастворимых в среде инкубации с МНазой; вз - из фрагментов хроматина, экстрагируемых из осадка 0( раствором изотонической сахарозы; — из фрагментов хроматина, экстрагируемых раствором ПФР; Оз -из фрагментов хроматина, остающихся в осадке после экстракции ПФР; М - Маркер: ДНК фага X, рестрицированная Нт<Щ1, в качестве положительного контроля гибридизации добавлено около 1 пкг немеченой ТО 1-ДНК.

По данным дот-гибридизации (рис. 9), степень обогащения го-ДНК фракции, растворяющейся в среде инкубации с МНазой, не превышает пятикратную (дор. Бь). Хроматин, экстрагируемый ПФР и остающийся в конечном осадке, обогащен в высокой степени (не менее чем в 50 раз) Го-ДНК в сравнении с суммарным хроматином (дор. 8з, Оз). Анализ полипептидных спектров показал, что фракции вз и Оз содержат неэквимолярные количества четырёх коровьи гистонов.

Рис.9. Дот-гибридвзация ДНК из фракций фрагментов хроматина печени крыс с зондам TOI. ДНКсу» - Суммарная ДНК из ядер, обработанных МНазой (40 А2м ед./ 1 мг); S, -ДНК из фрагментов хроматина, растворяющихся в среде инкубации с МНазой; О) - из фрагментов хроматина, нерастворимых в среде инкубации с МНазой; S3 - из фрагментов хроматина, экстрагируемых раствором ПФР; Оз -из фрагментов хроматина, остающихся в осадке после экстракции ПФР; Pi - ДНК плазмиды рТО(Е-3.3).

Приведена серия двукратных разведений, верхняя точка соответствует 300 нг ДНК.

Таким образом, полученные нами для to и tat генов и ряд других данных [Foe, 1978; Cohen, Sfefffery, 1985; Huang et.al., 1986; Schwabish, Struhl, 2004; Zhao et.al., 2005] указывают на то, что преобразование (ремоделирование) нуклеосомной структуры на всём протяжении кодирующих областей при активации генов может предшествовать инициации транскрипции. В этой от vivo ремоделированной форме повторяющиеся структурные единицы хроматина не подразделяются на "коровую" и линкерную области, различающиеся по доступности ДНК к нуклеазам: вся внутринуклеосомная ДНК доступна для расщепления ДНКазой I, но не содержит регулярных сайтов, доступных для ДНКазы П и МНазы, соответствующих межнуклеосомным линкерам.

Три нуклеазы различаются по механизму нуклеолитического действия [Sollner-Webb et.al., 1978; Drew, 1984]. ДНКаза I вводит однонятевые надрезы, расщепление двойной спирали ДНК является результатом совпадений их позиций на комплементарных цепях. МНаза осуществляет симметричные двуцепочечные разрывы. ДНКаза II имеет промежуточные свойства; в суперскрученной ДНК делает однонитевые разрывы, в релаксированяой - однонитевые и двунитевые с равной вероятностью.

По данным ковалентного связывания гистонов с ДНК с разрывом полинуюгеотидной цепи [Mirzabekov et.al., 1983] половина двойной спирали ДНК (4-5 фосфодиэфирных связей на виток) экранирована гистонами в компактных нуклеосомных частицах. Высокая вероятность двунитевых разрывов ДНК в хроматине дерепрессированкых генов (распада до кислоторастворимых продуктов) при действии ДНКазы I свидетельствует о полном или частичном освобождении фосфодиэфирных связей, блокированных гистонами в компактных частицах. Однако при этом освобождении на всём протяжении структурных единиц хроматина возникают

стерические препятствия для действия МНазы - одновременного разрыва двух фосфодиэфирных связей, противолежащих на двойной спирали.

Наблюдаемый характер фрагмнтации дерепрессированных to и tat генов тремя нуклеазами позволяет предположить, что переход хроматина в активную конформацию сопряжён с дехомпактизацией титанового октамера (расхождением а-спиральных складок), возможно, с его преобразованием в линейную двуцепочечную структуру, перекрывающую всю нуклеосомную ДНК и сохраняющую с ней тесный контакт, который может прерываться в центрах транскрипции. Однако это предположение требует экспериментального подтверждения.

ВЫВОДЫ

1. При обработке ядер клеток печени крыс ДНКазой I, ДНКазой II и МНазой в широком диапазоне концентраций практически не образуется фрагментов ДНК to и tat генов, дерепрессированных в этой ткани, с длиной мономеров или олигомеров нуклеосомного повтора, продуктов нуклеазного распада репрессированного хроматина.

2. При кратковременном действии МНазы в насыщающей концентрации в ядрах печени общий (репрессированный) хроматин фрагментируется до моно- и динуклеосом. ДНК кодирующих областей to и tat генов сохраняется в гидролизатах в виде протяжённых (от 1500 п.н.) фрагментов, значительная часть которых соответствует длине их единиц транскрипции (19000 и 11000 п.н., соответственно). Максимальные по длине фрагменты включают полноразмерные единицы транскрипции.

3. При обработке ядер печени новорождённых крыс МНазой в широком диапазоне концентраций ДНК кодирующей области гена to, все кошш которого находятся в компетентном к транскрипции состоянии, оказывается представленной фрагментами одной длины (около 20000 п.н.), соответствующей величине его кодирующей области.

4. При достижении лимита в переваривании общей ДНК в ядрах печени ДНКазой I, вся to- и toí-ДНК переходит в кислоторастворимую форму. Фрагментация to и tat генов ДНКазой И, соответствует характеру их фрагментации МНазой.

5. В репрессированном состоянии (в ядрах клеток мозга) кодирующая область гена to фрагментируется ДНКазой I и МНазой как общий хроматин, с нуклеосомной периодичностью в распределении разрывов ДНК.

6. Фрагменты хроматина кодирующей области гена to, сохраняющиеся в гидролизатах ядер печени крыс после интенсивного переваривания МНазой, осаждаются в инкубационной среде. Их эффективная экстракция ПФР (0,05 М трис-HCl с pH 8,0, содержащий 40 мМ тетрапирофосфата натрия и 5 мМ MgClj), наблюдается после

обработки осадка раствором с низкой ионной силой (0,25 М раствор сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА).

7. Хроматин, экстрагируемый ПФР (S3) и остающийся в конечном осадке (Оз), обогащены в высокой степени (не менее чем в 50 раз) to-ДНК, в сравнении с суммарным хроматином.

8. Выходящая в ПФР и остающаяся в осадке фракции хроматина включают различные классы фрагментов гена to исходного гидролязата: S3 - преимущественно полноразмерные единицы транскрипции, Оз - их сегменты гетерогенной длины.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. T.N. Priyatkina, N.E. Voinova, E.Y. Pavlova, M.M. Naumova, I.N. Sokólov. Changes in the nuclease chromatin fragmentation patterns under gene activation might be a consequence of nucleosome linearisation // International Symposium Biological mobility: new trend in research. - Pushchino. - 2001. - P. 122-124.

2. Пртткина Т.Н., Наумова M.M., Павлова ЕЮ. Получение двух субфракций активного хроматина печени после фрагментации ДНК в составе ядер микрококковой нуклеазой // XVIII съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. Тезисы докладов. Казань. 2001. С.411.

3. Прияткина Т.Н., Павлова Е.Ю.. Воинова Н.Е., Копытова Д.В., Садовникова А.О., Богданов АЛ. Изменение нуклеосомной структуры хроматина на протяженных участках кодирующих областей предшествует транскрипции // 2-ая конф. Московского Общества генетиков и селекционеров им. Н. И. ВАВИЛОВА. -Москва.-2003.-С.322.

4. Павлова Е.Ю. Получение фракций активного хроматина после фрагментации ДНК в составе ядер ДНКазой II // 8-ая Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Сборник тезисов. - 2004. - С.24.

5. Прияткина Т.Н., Копытова Д.В. Садовникова А.О., Павлова Е.Ю. Структурные переходы нуклеосомы при активации и транскрипции генов // 2004. В сб. "Биохимические и молекулярно-биолошческие основы биологических функций". Издательство СПбГУ. Вып. 37, С. 227-240.

6. Прияткина Т.Н., Воинова Н.Е., Павлова Е.Ю. Ремоделирование нуклеосомной структуры хроматина кодирующих областей предшествует индукции транскрипции генов // III Съезд биофизиков России. Тезисы докладов. Воронеж. 2004.Т.1 С.161-163.

7. Павлова Е.Ю.. Жебрун ДА-., Соколов И.Н., Прияткина Т.Н. Получение двух субфракций протфженных фрагментов активных генов после фрагментации ДНК в

составе ядер микрококковой нуклеазой // XV Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра». Тезисы докладов и сообщений. Цитология. 2005. Т.47Да 9. С.822.

8. Прияткина Т.Н., Павлова ЕЮ.. Жебрун Д.А. Сравнение характера фрагментации микрококковсй нуклеазой кодирующих областей генов ^г-аминотрансферазы и frp-оксигеназы (генов tat и to) в активном, компетентном к транскрипции и репрессированном состояниях // XV Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра». Тезисы докладов и сообщений. Цитология. 2005. Т.47,№ 9. С.828.

9. Павлова Е.Ю. Анализ характера фрагментации ДНК в хроматине активных генов ДНКазой I, ДНКазой II и микрококковой нуклеазой // Девятая Всеросс. Медико-биолог. конф. молодых исследователей «Человек и его здоровье». С,-Петербург.2006. C.250-25I.

10. Павлова Е.Ю.. Соколов И.Н., Прияткина Т.Н. Кодирующая область гена триптофандиоксигеназы (to) в дерепрессированном состоянии не организовала в нуклеосомную структуру // IV съезд Всеросс. Общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск. 2008. С. 108.

11. Павлова Е Ю.. Прияткина Т.Н. Преобразование (ремоделирование) нуклеосомной структуры хроматина при дерепресспи генов // Вестник. СПбГУ. 2008. Сер.З. Вып.2. С.34-55.

Подписано в печать 23.12.08. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 0,93. Тираж 75. Заказ № 89

Типография Издательства СПбГУ. 190066, Санкт-Петербург, Средний пр., 41

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Павлова, Евгения Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи.

1.3. Основные положения, выносимые на защиту.

1.4. Научная новизна.

1.5. Теоретическое и практическое значение работы.

1.6. Финансовая поддержка.

1.7. Апробация диссертации.

1.8. Публикации.

1.9. Объем и структура диссертации.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Нуклеосомная организация хроматина.

2.2. АТФ-зависимые ремоделирующие комплексы.

2.3. Посттрансляционные модификации гистоновых молекул, связанные с процессом транскрипции.

2.4. Стадия элонгации транскрипции, факторы элонгации.

2.5. Организация хроматина кодирующих областей деренрессированных генов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ нуклеазной фрагментации хроматина кодирующих областей генов триптофандиоксигеназы (to) и тирозинаминотрансферазы (tat) в различных функциональных состояниях"

1.1. Актуальность проблемы

С развитием нуклеосомной концепции стали известны основные принципы упаковки ДНК в хроматине [Hewish, Burgoyne, 1973; Kornberg, 1974; Mirzabekov et.al., 1983; Arents, Moudrianakis, 1993, 1995; Kornberg, Lorch, 1999; Ong et.al., 2007]. Механизмы обратных процессов - декомпактизации нуклеосомных цепей для реализации ее матричных функций, остаются до конца не выясненными. В исследовании характера преобразования (ремоделирования) нуклеосом для транскрипции перспективным подходом является анализ нуклеазной фрагментации хроматина в составе ядер, позволяющий установить изменения в ДНК-гистоновых взаимодействиях. Регулярное чередование свободных и прочно связанных с гистонами участков ДНК в структурных единицах компактного (репрессированного) хроматина (нуклеосомах) определяет 200-п.н. (пар нуклеотидов)-периодичность в распределении разрывов ДНК и достижение лимита реакции при переваривании свободных линкеров и выщеплении мононуклеосомных фрагментов [Hewish, Burgoyne, 1973; Noll, Kornberg, 1977; Drew, 1984; Wolffe, 1998].

Первым биохимическим показателем преобразования нуклеосомной структуры хроматина при дерепрессии генов явились данные о доступности внутрикоровой ДНК для ДНКазы I. При действии этого фермента не наблюдается образования мононуклеосом, вся ДНК кодирующих областей активных генов переваривается до кислоторастворимого материала [Weintraub, Groudine, 1976; Garel, Axel, 1978; Bloom, Anderson, 1978]. С использованием нового подхода для высокоточного анализа ДНК-гистоновой ассоциации in vivo, включающего иммунопреципитацию фрагментов хроматина tag-мечеными гистонами и сканирование преципитата на содержание ген-специфических сегментов [Lee et.al., 2004], было показано, что как промоторная ДНК, так и ДНК единиц транскрипции многих активных генов не связана с гистонами [Boeger et.al., 2003; Schwabish, Struhl, 2004; Lee et.al., 2004; Zhao et.al., 2005]. О декомпактизации нуклеосом в участках транскрипции свидетельствуют и данные ультраструктурного анализа 70-х — 80-х годов [Hamkalo et.al., 1974; Franke et.al., 1978; Foe, 1978; McKnight et.al., 1978; Spring, Franke, 1981; Sheer, 1987]. Однако в хроматиновой оси транскрибируемых участков иммунохимическими методами выявляются все коровые гистоны [McKnight et.al., 1978]. Более того, ДНК кодирующих областей активных и компетентных к транскрипции генов, полностью расщепляемая ДНКазой I до кислоторастворимых продуктов, резистентна к действию микрококковой нуклеазы (МНазы) [Weintraub, Groudine, 1976; Bloom, Anderson, 1978; Garel, Axel, 1978]. По вопросу о том, соответствует ли характер протекции нуклеосомному типу организации хроматина, данные противоречивы [Simpson, 1991; Clark, 1995; Wolffe, 1998].

В первых исследованиях, проведённых на глобиновых и овальбуминовых [Weintraub, Groudine, 1976; Garel, Axel, 1978; Bloom, Anderson, 1978], а также р-РНК генах [Mathis, Gorovsky, 1976; Reeves, 1976; Piper et.al. 1976; Matsui, Busch, 1977] с использованием ещё техники гибридизации в растворе, не было обнаружено различий между активным и репрессированным их состояниями по скорости переваривания ДНК МНазой и её распределению в спектре фрагментов, кратных структурной единице. В ряде работ отмечался более быстрый распад части активного хроматина до моно- и коротких олигонуклеосом [Bellard et.al., 1978; Постников и др., 1989; Nacheva et.al., 1989].

В последующих анализах при визуализации МНазных фрагментов большого числа активных генов методом блот-гибридизации были получены крайне пртиворечивые результаты [Cohen, Sheffery, 1985; Clark, 1995]. Так, существуют данные, подтверждающие как неизменность позиций нуклеосом и длины нуклеосомного повтора (по тесту МНазной чувствительности) в хроматине кодирующих областей при активации гена [Gottesfeld, Melton, 1978; Baer, Rhodes, 1983; Huang et.al., 1986; Boeger et al„ 2003], так и его удлинении или укорочении [Clark, 1995], существование нескольких фаз нуклеосомного устройства на экспрессируемой ДНК [Samal et al., 1981; Szent-Györgyi et.al., 1987; Simpson, 1991,]. Обнаружены нарушения нуклеосомной повторяемости МНазных разрывов [Simpson, 1991; Herrera et.al., 1997], а также продукция фрагментов монотонно убывающих по длине [Ness et.al.,1983; Widmer et.al., 1984; Rose, Garrard, 1984; Cohen, Sheffery, 1985; Strätling et.al., 1986; Conconi et.al., 1989; Perez-Ortin et al., 1987; Conconi, Ryan, 1993; Cavalli, Thoma, 1993].

Из всей совокупности данных следует, что значительная часть ДНК генов, программированных на экспрессию в специализированных клетках, устойчива к действию МНазы. Однако противоречивость результатов не позволяет придти к определенному заключению о характере распределения МНазочувствительных сайтов в их кодирующих областях. Кроме того, использование различных нуклеаз (ДНКазы I и МНазы) в анализе структуры активного хроматина привело к взаимоисключающим суждениям.

В качестве причин неоднозначности результатов рассматривают множественность состояний, в которых могут быть представлены индивидуальные гены и их участки в клеточной популяции [Toussaint et.al., 2005]. Одновременное присутствие в однотипных клетках репрессированной, компетентной и транскрибируемой форм показано для некоторых повторяющихся генных кластеров [Foe et.al., 1978; Conconi et.al., 1989; Dammann et.al., 1995; Fahy et.al., 2005; Toussaint et.al., 2005]. Того же можно ожидать для уникальных генов, индуцируемых к транскрипции от репрессированного состояния в интерфазе. Действие внутриядерных нуклеаз и протеаз во время инкубации ядер и потеря нативной конформации хроматина при накоплении одно- и двунитевых разрывов ДНК [Caplan et.al., 1987] создают дополнительные трудности в оценке наблюдаемых характеров его фрагментации экзогенными ферментами. Противоречивость данных по организации структурных единиц хроматина (нуклеосом) на различных ступенях активации гена не позволяет придти к определенному заключению о механизмах эукариотической транскрипции.

Удобной моделью для сравнения характера нуклеазной фрагментации в составе ядер активного и репрессированного хроматина являются гены to и tat [Schmid et al., 1982]. Эти гены представлены одной копией в геноме крыс. Их экспрессия тканеспецифична и две ступени активации разделены во времени. Состояние компетентности к транскрипции устанавливается только в предшественниках гепатоцитов на конечных стадиях эмбриогенеза и сохраняется при последующих клеточных генерациях. Транскрипция индуцируется в раннем постнатальном развитии [Schmid et al., 1982; Becker et.al., 1984; Shinomiya et.al., 1984]. Такая система регуляции to и tat генов исключает присутствие в клетках печени взрослых животных их репрессированных форм.

1.2. Цели и задачи:

Целью данной работы явился сравнительный анализ доступности ДНК в кодирующих областях to и tat генов для фрагментации МНазой, ДНКазой I и ДНКазой II, различающихся по механизму нуклеолитического действия, в активном, компетентном к транскрипции и репрессированном состояниях — в ядрах клеток печени и мозга новорождённых и взрослых крыс.

Для выполнения этой цели решались следующие задачи:

• Получение ДНК-зондов — сегментов кодирующих областей to и tat генов из содержащих их рекомбинантных плазмид. Мечение ДНК-зондов флуоресцирующим агентом при амплификации в системе со случайными праймерами.

• Сравнение длины фрагментов ДНК общего (репрессировнного) и активного {to и tat генов) хроматина, продуцируемых МНазой, ДНКазой I и ДНКазой II в ядрах клеток печени взрослых крыс при различных концентрациях ферментов.

• Сравнение характера фрагментации гена to МНазой и ДНКазой I в репрессированном (в ядрах клеток мозга) и активном (ядрах клеток печени) состояниях.

• Сравнение длины фрагментов гена to, продуцируемых МНазой и ДНКазой I в компетентном к транскрипции (в ядрах клеток печени новорождённых крыс) и репрессированном (в ядрах клеток мозга) состояниях.

• Фракционирование хроматина - разработка условий избирательной экстракции фрагментов активных генов из МНазных гидролизатов ядер клеток печени крыс.

• Анализ длины ДНК и белкового состава фракций фрагментов, выходящих в солевые растворы различного состава.

• Определение степени обогащения полученных фракций ДНК активных генов с использованием методов дот- и блот-гибридизации с сегментом кодирующей области гена to.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлова, Евгения Юрьевна, Санкт-Петербург

1. Павлова Е.Ю. Анализ характера фрагментации ДНК в хроматине активных генов ДНКазой 1. ДНКазой II и микрококковой нуклеазой // Девятая Всеросс. Медико-биолог. конф. молодых исследователей «Человек и его здоровье». С.-Петербург.2006. С.250-251.

2. Павлова Е.Ю., Жебрун Д.А., Прияткина Т.Н. Особенности нуклеазной фрагментации ДНК в хроматине дерепрессированных генов // Вестник. СПбГУ. 2009. Сер.З. Вып.1.

3. Павлова Е.Ю., Прияткина Т.Н. Преобразование (ремоделирование) нуклеосомной структуры хроматина при дерепрессии генов // Вестник. СПбГУ. 2008. Сер.З. Вып.2. С.34-55.

4. Постников Ю.В., Шик В.В., Белявский A.B., Бродолин К.Л., Храпко K.P., Никольская Т.А., Мирзабеков А.Д. Хромосомные белки эритроцитов эмбрионов кур на транскрипционно активных и неактивных генах // Мол. биол. 1989. Т. 23. С. 1682-1691.

5. Прияткина Т.Н., Аридов А.Ф., Кузнецова С.Г., Соколов И.Н. Выделение и характеристика фрагментов хроматина печени, связанных с миозиноподобными белками // Вестник СПбГУ. 1997. вып. 2 (сер. 3), С. 49-55.

6. Прияткина Т.Н., Кузнецова С.Г. Распределение актино- и миозиноподобных белков при фракционировании фрагментов хроматина в солевых растворах // Вестник СПбГУ, 1992. вып.4 (сер.З), С. 51-59.

7. Ченцов Ю.С., Поляков В.Ю. Ультраструктура клеточного ядра // М., 1974.

8. Чихиржина Г.И., Фёдорова С.А., Чесноков И.Н., Романовская Е.В. Ядерные белки, специфически связывающиеся с регулятрной областью гена ТО. Биохимия, 1993. Vol.58. Р. 392-398.

9. Aalfs D.J., Kingston E.R. What does chromatin remodeling mean? // TIBS. 2000. P. 548-555.

10. Adkins M. W., Tyler J. K. Transcriptional activators are dispensable for transcription in the absence of Spt-mediated chromatin reassembly of promoter regions // Mol. Cell. 2006. Vol. 21. P. 405-416.

11. Agalioti Т., Chen G., Thanos D. Deciphering the transcriptional histone acetylation code for a human gene // Cell. 2002. Vol. 111. N 3. P. 381-392.

12. Akey C.W., Luger K. Histone chaperones and nucleosome assembly // Curr. Opin. Gen. and Develop. 2003. Vol.13. P. 6-14.

13. Allfrey V.G., Faulkner R., Mirsky A.E. Acetilation and methylation of histones and their possible role in the regulation of RNA synthesis // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1964. Vol. 51. N5. P. 315-335.

14. Aoyagi S., Wade P.A., Hayes J.J. Nucleosome sliding induced by the xMi-2 complex does not occur exclusively via a simple twist-diffusion mechanism // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 30562-30568.

15. Arents G., Moudrianakis E.N. The histone fold: a ubiquitous architectural motif utilized in DNA compaction and protein dimerization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92. P.11170-11174.

16. Arents G., Moudrianakis E.N. Topography of the histone octamer surface: repiating structural motifs utilized in the docking of nucleosomal DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90. P. 10489-10493.

17. Armstrong J. A. Negotiating the nucleosome: factors that allow RNA polymerase II to elongate through chromatin // Biochem. Cell Biol. 2007. Vol. 85. P. 426-434.

18. Baer B.W., Rhodes D. Eukaryotic RNA polymerase II binds to nucleosome cores from transcribed genes //Nature. 1983. Vol.301. P. 482^188.

19. Bao Y., Shen X. IN080 subfamily of chromatin remodeling complexes // Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 2007. Vol.618. № 1-2. P. 18-29.

20. Becker P. В., Horz W. ATP-dependent nucleosome remodeling // Annu. Rev. Biochem.2002. Vol. 71. P. 247-273.

21. Becker P., Renkawitz R., Schutz G. Tissue-specific DNasel hypersensitive sites in the 5'-flanking sequences of the tryptophan oxygenase and the tyrosine aminotransferase genes // EMBO J. 1984. Vol.3. P. 2015-2020.

22. Bellard M., Gannon F., Chambon P. Nucleosome structure III: the structure and transcriptional activity of the chromatin containing the ovalbumin and globin genes in chick oviduct nuclei // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1978. Vol.42. P. 779791.

23. Belotserkovskaya R., Oh. S., Bondarenko V. A., Orphanides G., Studitsky V.M., Reinberg D. FACT facilitates transcription-dependent nucleosome alteration // Science.2003. Vol. 301. P.1090-1093.

24. Belotserkovskaya R., Reinberg D. Facts about FACT and transcript elongation through chromatin // Curr. Opin. Gen. and Develop. 2004. Vol. 14. N 2. P. 139-146.

25. Bergman L.W., Kramer R.A. Modulation of chromatin structure associated with derepression of the acid phosphatase gene of Saccharomyces cerevisiae II J.Biol.Chem. 1983. Vol.258. P. 7223-7227.

26. Bernardi G. // The Enzymes. 1971. Vol.4. P. 271-287 (цитировано no 56).

27. Bloom K.S., Anderson J.N. Conformations of ovalbumin and globin genes in chromatin during differential gene expression // J. Biol. Chem. 1978. Vol.254. P. 10532-10539.

28. Boeger H., Griesenbeck J., Strattan J.S., Kornberg R.D. Nucleosomes unfold completely at a transcriptionally active promoter // Mol. Cell. 2003. Vol.11. P. 15871598.

29. Briggs S.D., Xiao T., Sun Z. W., Caldwell J. A., Shabanowitz J., Hunt D. F., Allis C. D., Strahl B. D. Gene silensing: trans-histone regulatory pathway in chromatin // Nature. 2002. Vol.418. P. 498.

30. Brownell J. E., Allis C. D. Special HATs for special occasions: linking histone acetilation to chromatin assembly and gene activation // Curr. Opin. Gen. and Dev. 1996. Vol.6. P. 176-184.

31. Bussiek M., Toth K., Brun N., Langowski J. DNA-loop formation on nucleosomes shown by in situ scaning force microscopy of supercoiled DNA // J. Mol. Biol. 2005. Vol. 345. P. 695-706.

32. Cairns B.R., Kim Y.J., Sayre M.N., Laurent B.C., Kornberg R.D. A multi-subunit complex containing the SWI1/ADR6, SWI2/SNF2, SWI3, SNF5, and SNF6 gene products isolated from yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. P. 19501954.

33. Caplan A., Kimura T., Gould H., Allan J. Perturbation of chromatin structure in the region of the adult beta-globin gene in chicken erythrocyte chromatin // J. Mol. Biol. 1987. Vol. 193. P. 57-70.

34. Carrozza M.J., Hassan A.H., Workman J.L. Assay of Activator Recruitment of Chromatin-Modifying Complexes // Methods in Enzymology. 2003. Vol.371. P. 536544.

35. Chambon P. The molecular biology of the eukaryotic genome is coming of age // Cold Spring Harbor Simp. Quant. Biol. 1978. Vol. 42. P. 1209-1234.

36. Clark D.J. Transcription through the nucleosome // in The Nucleus. 1995. Vol.1. JAI Press Inc., Greenwich P. 207-239.

37. Cohen R.B., Shefffery M. Nucleosome disruption precedes transcription and is largely limited to the transcribed domain of globin genes in murine erythroleukemia cells // J.Mol.Biol. 1985. Vol.182. P. 109-129.

38. Conconi A., Widmer R.M., Koller T. Sogo J.M. Two different chromatin structures coexist in ribosomal RNA genes throughout the cell cycle // Cell. 1989. Vol.57. P. 753761.

39. Corden J.L. Tails of RNA polymerase II // Trends. Biochem. Sci. 1990. Vol.15. P. 383387.

40. Cosma M.P., Tanaka T., Nasmyth K. Ordered recruitment of transcription and chromatin remodeling factors to a cell cycle- and developmentally regulated promoter //Cell. 1999. Vol. 97. P. 299-311.

41. Cote J., Peterson C.I., Workman J.L. Perturbation of nucleosome core structure by the SWI/SNF complex persists after its detachment, enhancing subsequent transcription factor binding // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol.9 5. P. 4947-4952.

42. Cote J., Quinn J., Workman J.L., Peterson C.L. The yeast SWI/SNF complex facilitates the binding of GAL4 derivatives to nucleosomal DNA // Science. 1994. Vol.265. P. 53-60.

43. Cousins D.J., Islam S.A., Sanderson M.R., Proykova Y.G., Crane-Robinson C., Staynov D.Z. Redefinition of the cleavage sites of Dnase I on the nucleosome core particle // JMB. 2004. Vol.335. P. 1199-1211.

44. Dammann R., Lucchini R., Koller T., Sogo J.M. Chromatin structures and transcription of rDNA in yeast Saccharomyces cerevisiae // Nucleic. Acids Res. 1993. Vol.21. № 10. P.2331-2338.

45. Dammann R., Lucchini R., Koller T., Sogo J.M. Transcription in the yeast rRNA locus: distribution of the active gene copies and chromatin structure of their flanking regulatory sequences // Mol. Cell. Biol. 1995. Vol.15. P. 5294-5303.

46. Davey C.A., Sargent D.F., Luger K, Maeder A.W., Richmond T.J. Solvent Mediated Interactions in the Structure of the Nucleosome Core Particle at 1.9 A Resolution // J. Mol. Biol. 2002. Vol.319. № 5. P. 1097-1113.

47. Davie I.R., Murphy L.C. Level of ubiquitinated histone H2B in chromatin is coupled to ongoing transcription// Biochem. 1990. Vol. 29. P. 4752-^757.

48. De Bernardin W., Koller Th., Sogo J.M. Structure of in vivo transcribing chromatin as studied in simian virus 40 minichromosomes // J. Mol. Biol. 1986. Vol. 191. № 3. P. 469-482.

49. Drew H.R. Structural specificities of five commonly used DNA nucleases // JMB. 1984. Vol.176. № 4. P. 535-557.

50. Dupraw E.J. Organisation of genetic material in eukariotic chromosomes // J. Cell and Mol. Biol. 1969. P. 515-589.

51. Eisen J. A., Sweder K.S., Hanawalt P. C. Evolution of the SNF2 family of proteins: subfamilies with distinct sequences and functions // Nucl. Ac. Res. 1995. Vol.23. P. 2715-2723.

52. Elgin S.C.R., Cartwright I.L., Fleischmann G., Lowenhaupt K., Keene M.A. Cleavage reagents as probes of DNA sequence organization and chromatin structure: Drosophila melanogaster locus 67B1 // Cold Spr. Harbor.Symp.Quant.Biol. 1983. Vol.47. P. 529538.

53. Engel J.D., Tanimoto K. Looping, linking, and chromatin activity new insights into P-globin locus regulation // Cell. 2000. Vol. 100. P. 499-502.

54. Ezhkova E., Tansey W. P. Proteosomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3 // Mol. Cell. 2004. Vol.13. N 3. P. 435-442.

55. Fahy D., Conconi A., Smerdon M.J. Rapid changes in transcription and chromatin structure of ribosomal genes in yeast during growth phase transitions // Exp. Cell Res. 2005. Vol.305. P. 365-373.

56. Fan H., He Xi, Kingston R. E., Narlikar G. J. Distinct strategies to make nucleosomal DNA accessible//Mol. Cell. 2003. Vol.11. P. 1311-1322.

57. Farkas G., Leibovitch B.A., Elgin S.C.R. Chromatin organization and transcriptional control of gene expression in Drosophila // Gene. 2000. Vol. 253. P. 117-136.

58. Finch J.T., Lutter L.C., Rhodes D., Brown R.S., Rushton B., Levitt M., Klug A. Structure of nucleosome core particle of chromatin // Nature. 1977. Vol. 269. P. 29-36.

59. Fish R.N., Kane C.M. Promoting elongation with transcript cleavege stimulatory factors // Biochim. Biophys. Acta. 2002. Vol. 1577. P. 287-307.

60. Flaus A., Owen-Hughes T. Mechanisms for ATP-dependent chromatin remodeling: farewell to the tuna-can octamer? // Curr. Opin. In Genetic and Devel. 2004. Vol.14. N 2. P. 165-173.

61. Franke W.W., Scheer U., Tredelenburg M., Zentgraf H., Spring H. Morfology of transcriptionally active chromatin // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1978. Vol. 42. P. 755-778.

62. Frohloff F., Fichtner L., Jablonowski D., Breunig K.D., Schaffrath R. Saccharomyces cerevisiae Elongator mutations confer resistance to the Kluyveromyces lactis zymocin // EMBO J. 2001. Vol. 20. P. 1993-2003.

63. Gangaraju V.K., Bartholomew B. Mechanisms of ATP dependent chromatin remodeling // Mut. Res. Fundamental and Mol. Mechanisms of Mutagenesis. 2007. V.618.N LP. 3-17.

64. Garel A., Axel R. The structure of the transcriptionally active ovalbumin genes in chromatin // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1978. Vol.42. P. 701-708.

65. Genealogy A. Chromatin polymorphism and the nucleosome superfamily // Cell Cycle. 2007. Vol.6, P. 2113-2119.

66. Gottesfeld J.M., Melton D.A. The length of nucleosome-associated DNA is the same in both transcribed and nontranscribed regions of chromatin // Nature. 1978. Vol.273. P. 317-319.

67. Gross D.S., Garrard W.T. Poising chromatin for transcription // Trends Biochem.Sci. 1987. Vol.12. P. 293-297.

68. Gross D.S., Garrard W.T. Nuclease hypersensitive sites in chromatin // Ann. Rev. Biochem. 1988. Vol.57. P. 159-197.

69. Grummt I. Regulation of mammalian ribosomal gene transcription by RNA polymerase I // in: K. Moldave (Ed.), Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 1999. vol. 62. Academic Press. San Diego. P. 109^148.

70. Hahn S. Structure and mechanism of the RNA polymerase II transcription machinery // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. Vol.11. P. 394-403.

71. Hamkalo B.A., Miller O.L., Bakken A.H. Ultrastructure of active eucariotic genomes // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1974. Vol.38. P. 915-919.

72. Hartzog G. A., Speer J. L., Lindstrom D. L. Transcript elongation on a nucleoprotein template // Biochim. Biophys. Acta. 2002. Vol.1577. P. 276-286.

73. Hassan A.H., Prochasson P., Neely K. E., Galasinski S.C., Chandy M., Carrozza M. J., Workman J.L. Funktion and selectivity of bromodomains in anchoring chromatin-modifying complexes to promoter nucleosomes // Cell. 2002. Vol.111. P. 369-379.

74. Havas K., Flaus A., Phelan M„ Kingston R., Wade P. A., Lilley D. M. J., Owen-Hughes T. Generation of superhelical torsion by ATP-dependent chromatin remodeling activities // Cell. 2000. Vol. 103. P. 1133-1142.

75. Hebbes T.R., Turner C.H., Thorne A.W. Crane-Robinson C. A minimal epitope antiprotein antibody that recognises a single modified amino acid // Mol. Immunol. 1989. Vol. 26. P. 865-873.

76. Herrera R.E., Nordheim A., Stewart A.F. Chromatin structure analysis of the human c-fos promoter reveals a centrally positioned nucleosome // Chromosoma. 1997. Vol. 106. P. 284—292.

77. Hewish D.R., Burgoyne L.A. Chromatin substructure. The digestion of chromatin DNA at regularly spaced sites by a nuclear deoxyribonuclease // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1973. Vol.52. 504 510.

78. Huang S.Y., Barnard M.B., Xu M., Matsui S.I., Rose S.M, Garrard W.T. The active immunoglobulin kappa chain gene is packaged by non-ubiquitin-conjugated nucleosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. Vol.83. P. 3738-3742.

79. Iizuka M., Smith M.M. Functional consequencrs of histone modifications // Curr. Opin. Gen. and Develop. 2003. Vol.13. P. 154-160.

80. Im H„ Park C., Feng Q., Johnson K.D., Kiekhaefer C.M., Choi K„ Zhang Y., Bresnick E.H. Dynamic regulation of histone H3 methylated at lysine 79 within a tissue-specific chromatin domain// J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 18346-18352.

81. Izban M.G., Luse D.S. Factor-stimulated RNA polymerase II transcribes at phisiological elongation rates on naked DNA but very poorly on chromatin templates // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 13647-13655.

82. Jimeno-Gonzalez S., Gomez-Herraros F., Alepuz P. M., Chaves S. A gene-specific requirement for FACT during transcription is related to the chromatin organization of the transcribed region // Mol. Cell. Biol. 2006. Vol.26. P. 8710-8721.

83. Kaplan C. D., Laprade L., Winston F. Transcription elongation factors repress transcription initiation from cryptic sites // Science. 2003. Vol.301. P. 1096-1099.

84. Karpov V.L., Preobrazhenskaya O.V., Mirzabekov A.D. Chromatin structure of hsp70 genes, activated by heat shock: selective removal of histones from tye coding regions and their absence from the 5' region // Cell. 1984. Vol.36. P. 423-431.

85. Khavari P.A., Peterson C.L., Tamkun J.W., Mendel D.B., Crabtree G. R. BRG1 contains a conserved domain of the SWI2/SNF2 family necessary for normal mitotic growth and transcription//Nature. 1993. Vol.366. P. 170-174.

86. Klug A., Lutter L.C., Rhodes D. Helical periodicity of DNA on and off the nucleosome as probed by nucleosome // Cold Spring Harbor Simp. Quant. Biol. 1983. P. 285-292.

87. Klug A., Rhodes D., Smith J., Finch J.T., Thomas J.O. A low resolution structure for the histone core of the nucleosome //Nature. 1980. Vol. 287. P. 509-515.

88. Kornberg R.D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Chromatin structure is based on a repeating unit of eight histone molecules and about 200 DNA base pairs // Science. 1974. Vol.184. P. 868.

89. Kornberg R.D., Lorch Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome // Cell. 1999. Vol.98. P. 285-294.

90. Kornberg R.D., Thomas J.O. Chromatin structure: oligomers of the histones // Science. 1974. Vol. 184. P. 865-868.

91. Koryakov D.E. Histone modification and regulation of chromatin function // Genetika. 2006. Vol.42. N 9. P. 1170-1185.

92. Kouzarides T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? // EMBO J. 2000. Vol.19, N6. P. 1176-179.

93. Langst G., Bonte E. J., Corona D., Becker P. B. Nucleosome movement by CHRAC and ISWI without disruption or transdisplacement of the histone octamer // Cell. 1999. Vol.97. P. 842-852.

94. Laurent B. C., Tretel I., Carlson M. Functional independence of the yeast SNF2, SNF5, and SNF6 proteins in transcriptional activation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. P. 2687-2691.

95. Laurent B.C., Treich I., Carlson M. Role of yeast SNF and SWI proteins in transcriptional activation // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1993. Vol. 58. P. 257-263.

96. Law A., Hirayoshi K., O'Brien T., Lis J. T. Direct cloning of DNA that interacts in vivo with a specific protein: application to RNA polymerase II and sites of pausing in Drosophila //Nucleic Acids Res. 1998. Vol. 26. P. 919-924.

97. Lee C.K., Shibata Y., Rao B., Strahl B.D., Lieb J.D. Evidence for nucleosome depletion at active regulatory regulation genome wide // Nat. Genet. 2004. Vol.36. P. 900-905.

98. Lee K.M., Sif S., Kingston R.E., Hayes J. J. hSWI/SNF disrupts interactions between the H2A N-terminal tail and nucleosomal DNA // Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 8423-8429.

99. Levy A., Noll M. Chromatin fine structure of active and repressed genes // Nature. 1981. Vol. 289. P. 198-203.

100. Li Y., Takagi Y., Jiang Y., Tokunaga M., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Kornberg R. D. A Multiprotein Complex That Interacts with RNA Polymerase II Elongator//J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 29628-29631.

101. Lo W.S., Duggun L., Emre N.C. Snfl — A histone kinase that work in concert with the histone acetyltransferase GCN5 to regulate transcription // Science. 2001. Vol. 293. P.1142-1146.

102. Lohr D. Chromatin fine structure of actively expressed, single copy yeast gene // Nucleic .Acid Res. 1983. Vol.11. P. 6755-6773.

103. Luger K., Maeder A.W., Richmond R.K., Sargent D.E., Richmond T.J. X-ray structure of nucleosome core particle at 2,8 A resolution // Nature. 1997. Vol. 389. P. 251-259.

104. Luger K., Richmond T.J. The histone tails of the nucleosome // Current Opin. In Genetic and Devel. 1998. Vol. 8. P. 140-146.

105. Marshall N. F., Price D. H. Purification of P-TEFb, a transcription factor required for the transition into productive elongation // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 1233512338.

106. Marzio G., Wagener C., Gutierrez M. I., Cartwright P., Flelin K., Giacca M. E2F family members are differentially regulated by reversible acetylation // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. N 15. P. 10887-10892.

107. Mathis D.J., Gorovsky M.A. Subunit structure of rDNA-containing chromatin // Biochemistry 1976. Vol.15. P. 750-755.

108. Matsui S., Busch H. Isolation and characterization of rDNA-containing chromatin from nucleoli // Exp.Cell Res. 1977. Vol.109. P. 151-161.

109. McKnight S.L., Bustin M., Miller O.L. Electron microscopic analysis of chromosome metabolism in the Drosophila melanogaster embryo // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1978. Vol.42. P. 741-754.

110. Mohrmann L., Verrijzer C.P. Composition and functional specificity of SWI2/SNF2 class chromatin remodeling complexes // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Gene Structure and Expression. 2005. Vol.1681 P. 59-73.

111. Morillon A., Karabetsou N., O'Sullivan J., Kent N., Proudfoot N., Mellor J. Iswl chromatin remodeling ATPase coordinates transcription elongation and termination by RNA polymerase II // Cell. 2003. Vol. 115. P. 425^135.

112. Nacheva G., Goushin D.Y., Karpov V.L., Ebralidse K.K., Preobrazhenskaya O.V., Mirzabekov A.D. Change in the pattern of histone binding to DNA upon transcriptional action // Cell. 1989. Vol. 58. N 1. P. 27-36.

113. Narlikar G. J., Fan H.-Y., Kingston R. E. Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription // Cell. 2002. Vol. 108. P. 476^487.

114. Nedospasov S.A., Georgiev G.P. Non-random cleavage of SV 40 DNA in compact minichromosome and free in solution by micrococcal nuclease. Biochem. Biophys. Res. Communs. 1980. Vol.92, N2. P. 532-539.

115. Neigeborn L., Carlson M. Genes affecting the regulation of SUC2 gene expression by glucose repression in Saccharomyces cerevisiae II Genctics. 1984. Vol. 108. P. 845-858.

116. Ness P J., Labhart P., Banz E., Koller T., Parish R.W. Chromatin structure along the ribosomal DNA of Dictyostelium. Regional differences and changes accompanying cell differentiation // J. Mol. Biol. 1983. Vol.166. P. 361-381.

117. Ng H.H., Robert F., Young R.A., Struhl K. Targeted recruitment of Setl histone metylase by elongating Pol II provides a localized mark and memory of recent transcriptional activity // Mol. Cell. 2003. Vol. 11. P. 709-719.

118. Nickel B.E., Allis D. C., Davie J.R. Ubiquitinated histone H2B is preferentially located in transcriptional active chromatin // Biochemistry. 1989. Vol. 28. N 3. P. 958964.

119. Nicolas E., Roumillac C., Trouche D. Balance between acetylation and methylation of histone H3 lysine 9 on the E2F-responsive dihydrofolate reductase promoter // Mol. Cell. Biol. 2003. Vol. 23. P. 1614-1622.

120. Noll M. Internal structure of the chromatin subunit // Nucl. Ac. Res. 1974. Vol.1. P. 1573-1578.

121. Noll M., Kornberg R.D. Action of micrococcal nuclease on chromatin and the location of histone HI // J. Mol. Biol. 1977. Vol.109. P. 393-404.

122. Ogrizko V.V., Schiltz R.L., Russanova V., Howard B.N., Nakatani Y. The transcriptional coactivators p300 and CBP are histone acetyltransferases // Cell. 1996. Vol. 87. P. 953-959.

123. Okuhara K., Ohta K., Seo H., Shioda M., Yamada T., Tanaka Y., Dohame N., Seyama Y., Shibata T., Murofishi H. A DNA unwinding factor involved in DNA replication in cell-free extracts ofXenopus eggs // Curr. Biol. 1999. Vol. 9. P. 341-350.

124. Olins A.L., Olins D.E. Spheroid chromatin units (n bodies) // Science. 1974. Vol. 183. P. 330-332.

125. Ong M.S., Richmond T.J., Davey C.A. DNA stretching and extreme kinking in the nucleosome core // J. Mol. Biol. 2007. Vol.368. P. 1067-1074.

126. Orphanides G., Reinberg D. A unified theory of gene expression // Cell. 2002. Vol. 22. P. 439-451.

127. Panigrahi A.K., Tomar R.S., Chaturvedi M.M. Mechanism of nucleosome disruption and octamer transfer by the chicken SWI/SNF — like complex // Biochem.Biophis. Research Comm. 2003. Vol.306. P. 72-78.

128. Park Y., Kuroda M.L. Epigenetic aspects of X-chromosome dosage compensation // Science. 2001. Vol. 293. P. 1083-1085.

129. Peng J., Marshall N. F., Price D. H. Identification of a cyclin subunit required for the function of Drosophila P-TEFb // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 13855-13860.

130. Perez-Martin J. Chromatin and transcription in Saccharomyces cerevisiae // FEMS Microbiol. Rev. 1999. Vol. 23. P. 503-523.

131. Peterson C. L. ATP-dependent chromatin remodeling: going mobile // FEBS. 2000. Vol. 476. P. 68-72.

132. Peterson C.L. The SWI/SNF protein machine: helping transcription factors contend with chromatin-mediated repression // Nucleus. 1995. Vol. l.P. 185-206.

133. Peterson C.L., Hercowitz I. Characterization of the yeast SWI1, SWI2, and SWI3 genes, which encode a global activator of transcription // Cell. 1992. Vol. 68. P. 573583.

134. Peterson C.L., Laniel M.-A. Histones and histone modifications // Current Biology. 2004. Vol.14. Issue 14. P. R546-R551.

135. Pfeiffer W., Zachau H.G. Accessibility of expressed and non-expressed genes to a restriction nuclease // Nucleic Acids Res. 1980. Vol.8. P. 4621-4638.

136. Phelan M.L., Schnitzler G.R., Kingston R.E. Octamer transfer and creation of stably remodeled nucleosomes by human SWI-SNF and its isolated ATPases // Mol. Cell Biol. 2000. Vol. 20, N 17. P. 6380-6389.

137. Pokholok D.K., Harbison C.T., Levine S. Genome-wide map of nucleosome acetylation and metylation in Yeast // Cell. 2005. Vol.122. P. 517-527.

138. Pollard K.J., Peterson C.L. Role for ADA/GCN5 products in antagonizing chromatin-mediated transcriptional repression // Mol. Cell. Biol. 1997. Vol. 17. P. 6212-6222.

139. Price D.H. P-TEFb, a Cyclin-Dependent Kinase Controlling Elongation by RNA Polymerase II // Mol. Cell. Biol. 2000. Vol. 20. P. 2629-2634.

140. Reeves R. Nucleosome structure of Xenopus oocyte amplified ribosomal genes // Biochemistry. 1978. Vol.17. № 23. P.4908^916.

141. Reeves R. Ribosomal genes of Xenopus laevis: evidence of nucleosomes in transcriptionally active chromatin // Science 1976. Vol.194. P. 529-532.

142. Reeves R., Jones A. Genomic transcriptional activity and the structure of chromatin//Nature. 1976 Vol.260. P. 495-500.

143. Reik A., Schütz G., Stewart A.F. Glucocorticoids are required for establishment and maintenance of an alteration in chromatin structure: induction leads to a reversible disruption of nucleosomes over an enhancer // EMBO J. 1991. Vol. 10. P. 2569-2576.

144. Reinke H., Gregory P.D., Horz W. A transient histone hyperacetylation signalmarks nucleosomes for remodeling at the PH08 promoter // Mol. Cell. 2001. Vol.7. P. 529-538.

145. Reinke H., Horz W. Histones are first hiperacetilated and then lose contact with the activated PH05 pro moter// Mol. Cell. 2003. Vol.11. P. 1599-1607.

146. Richmond T.J., Finch J.T., Rushton B., Rhodes D., Klug A. Structure of the nucleosome core particle at 7Ä resolution // Nature. 1984. Vol. 311. P. 532-537.

147. Richmond T. J., Searles M. A., Simpson R.T. Cristals of a nucleosomc core particle containing defined sequence DNA // J. Mol. Biol. 1988. Vol. 199. N 1. P. 161-170.

148. Ridsdale J.A., Davie J.R. Chicken erytrocyte polynucleosomes which are soluble at physiological ionic strength and contain linker histones are highly enriched in ß-globin sequences//Nucleic Acids Res. 1987. Vol.15. P. 1081-1096.

149. Ris H., Kubai D. F. Chromosome structure // Ann. Rev. Gent. 1970. Vol. 4. P. 263-294.

150. Rose S.M., Garrard W.T. Differentiation — dependent chromatin alteration precede and accompany transcription of immunoglobulin light chain genes // J. Biol. Chem. 1984. Vol.259. P. 8534-8544.

151. Rosha E., Davie J.R., Van Hold K.E., Weintraub H. Differential salt fractionation of active and inactive genomic domains in chicken erythrocyte // J. Biol. Chem., 1984. Vol.259. P. 8558-8563.

152. Saccani S., Natoli G. Dynamic changes in histone H3 Lys 9 methylation occurring at tightly regulated inducible inflammatory genes // Genes Dev. 2002. Vol. 16. P. 2219-2224.

153. Saha A., Wittmeyer J., Cairns B. R. Chromatin remodeling by RSC involves ATP-dependent DNA translocation // Genes Dev. 2002. Vol.16. P. 2120-2134.

154. Samal B., Worcel A., Louis C., Schedl P. Chromatin structure of the histone genes of£>. Melanogaster II Cell. 1981. Vol.23. P. 401^109.

155. Samkurashvili I., Luse D. S. Structural changes in the RNA polymerase II transcription complex during transition from initiation to elongation // Mol. Cell. Biol. 1998. Vol. 18. P. 5343-5354.

156. Saunders A., Werner J., Andrulis E. D., Nakayama T., Hirose S-., Reinberg D., Lis J. T. Tracking FACT and the RNA polymerase II elongation complex through chromatin in vivo II Science. 2003. Vol.301. P. 1094-1096.

157. Schmid W., Sherer G., Danesch U., Zentgraf H., Matthias P., Strange C.M., Rowekamp W., Schiitz G. Isolation and characterization of the rat tryptophan oxygenase gene IIEMBO J. 1982. Vol.1. P. 1287-1293.

158. Schwabish M.A., Struhl K. Evidence for eviction and rapid deposition of histones upon transcriptional elongation by RNA polymerase II // Mol. Cell Biol. 2004. Vol.24. P. 10111-10117.

159. Seo H., Okuhara K., Kurumizaka H., Yamada T., Shibata T., Ohta K., Akiyama T., Murofushi H. Incorporation of DUF/FACT into chromatin enhances the accessibility of nucleosomal DNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. Vol. 303. P. 8-13.

160. Sheer U. Structure of lampbrush chromosome loops during different states of transcriptional activity as visualized in the presence of physiological salt concentrations //Biol. Cell. 1987. Vol.59. P. 33-42.

161. Shi Y., Whetstine J.R. Dynamic regulation of histone lysine methylation by demethylases. // Mol Cell. 2007. Vol. 25. P. 1-14.

162. Shick V.V., Beljavsky A.V., Bavykin S.G. Primary organization of the nucleosome core particles // J. Mol. Biol. 1980. Vol. 139. P. 491-517.

163. Shilatifard A. Transcriptional elongation control by RNA polymerase II: a new frontier // Biochim. Biophys. Acta. 2004. Vol. 1677. P. 79-86.

164. Shinomiya T., Sherer G., Schmid W., Zentgraf H„ Schiitz G. Isolation and characterization of the rat tyrosine aminotransferase gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. Vol.81. P. 1346-1350.

165. Shopland L. S., Hirayoshi K., Fernandes M., Lis J.T. HSF access to heat shock elements in vivo depends critically on promoter architecture defined by GAGA factor, TFIID, and RNA polymerase II binding sites // Genes Dev. 1995. Vol. 9. P. 27562769.

166. Shure M., Vinograd J. The number of super helical turns in native virion SV-40 DNA and minicol DNA determined by the band couting method // Cell. 1976. Vol.8. P. 215-226.

167. Simchen G., Winston F., Styles C.A., Fink G.R. Ty-mediated gene expression of the LYS2 and HIS4 genes of Saccharomyces cerevisiae is controlled by the same SPT genes // Proc. Natl. Acad. Sci. 1984. Vol. 81. P. 2431-2434.

168. Simpson R.T. //Progress in Nucleic Acid Res. 1991. Vol.40. P. 143-184.

169. Sims R.J., Mandal S.S., Reinberg D. Recent highlights of RNApolymerase-II-mediated transcription // Curr. Opin. in Cell Biol. 2004. Vol. 16, N 3. P. 263-271.

170. Sollner-Webb B., Melchior W.Jr., Felsenfeld G. DNAase I, DNAase II and staphylococcal nuclease cut at different, yet symmetrically located sites in the nucleosome core. Cell, 1978. 14, 611-627.

171. Sollner-Webb B., Mougey E.B. News from the nucleolus: rRNA gene expression // Trends Biochem. Sci. 1991. Vol.16. P. 58-62.

172. Somesh B.P. Multiple mechanisms confining RNA polymerase II ubiquitylation to polymerases undergoing transcriptional arrest // Cell. 2005. Vol. 121. P. 913-923.

173. Spring H., Franke W.W. Transcriptionally active chromatin in loops of lampbrush cchromosomes at physiological salt concentrations as revealed by electron microscopy of sections // Eur. J. of Cell Biol. 1981. Vol.24. P. 298-308.

174. Stern M., Jensen R., Herkowitz I. Five SWI genes are required for expression of the HO genes in yeast // J. Mol. Biol. 1984. Vol. 178. P. 853-868.

175. Sterner D.E., Berger S.L. Acetylation of histones and transcription-related factors // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. Vol. 64. N 2. P. 435^159.

176. Stratling W.H., Dolle A., Sippel A.E. Chromatin structure of the chicken lysozyme gene domain as determined by chromatin fractionation and micrococcal nuclease digestion // Biochemistry. 1986. Vol.25. P. 495-502.

177. Struhl K. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms // Genes Dev. 1998. Vol. 12. P. 599-606.

178. Svejstrup J.Q. Contending with transcriptional arrest during RNAPII transcript elongation // Trends in Biochem. Sci. 2007. Vol. 32. N 4. P. 165-171.

179. Szent-Gyorgyi Ch., Finkelstein D.B., Garrard W.T. Sharp boundaries demarcate the chromatin structure of a yeast heat-shok gene // J. Mol.Biol. 1987. Vol.193. P. 71— 80.

180. Thoma F., Roller T., Klug A. Involment of histone HI in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin // J. Cell Biol. 1979. Vol.83. P. 403-427.

181. Thomas J.O., Kornberg R.D. An octamer of histones in chromatin and free in solution // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. Vol.72, № 7. - P. 2626 - 2630.

182. Thomson S., Clayton A. L., Mahadevan L. C. Independent dynamic regulation of histone phosphorylation and acetylation during immediate-early gene induction // Mol. Cell. 2001. Vol. 8. P. 1231-1241.

183. Toussaint M., Levasseur G., Trembllay M., Paquette M., Concony A. Psoralen photocrosslinking, a tool to study the chromatin structure of RNA polymerase I-transcribed ribosomal genes // Biochem.Cell Biol. 2005. Vol.83. P. 449 459.

184. Travers A. Chromatin modification by DNA tracking // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 13634-13637.

185. Verdone L., Caserta M., Mauro E. D. Role of histone acetylation in the control of gene expression // Biochem. Cell. Biol. 2005. Vol. 83. P. 344-353.

186. Vicent G.P., Nacht A.S., Smith C.L., Peterson C.L., Dmitrov S., Beato M. DNA instructed displacement of histones H2A and H2B at an inducible promoter // Mol. Cell. 2004. Vol. 16. P. 439-452.

187. Vilar J. M. G., Saiz L. DNA looping in gene regulation: from the assembly of macromolecular complexes to the control of transcriptional noise // Curr. Opin. Gen. and Develop. 2005. Vol. 15. P. 136-144.

188. Walter W., Studitsky V.M. Construction, analysis, and transcription of model nucleosomal templates // Methods 2004. Vol.33. P. 18-24.

189. Weeks J. R., Hardin S. E., Shen J., Lee, J. M., Greenleaf A. L. Locus-specific variation in phosphorylation state of RNA polymerase II in vivo: correlations with gene activity and transcript processing // Genes Dev. 1993. Vol. 7. P. 2329—2344.

190. Weintraub H., Groudine M. Chromosomal subunits in active genes have an altered conformation // Science. 1976. Vol.193. P. 846-856.

191. Widmer R.M., Lucchini R., Lezzi M., Meyer B., Sogo J.M., Edstrom J.E., Koller T. Chromatin structure of a hyperactive secretory protein gene (in Balbiany ring 2) of Chironomus//EMBO J., 1984. Vol.3. P. 1635-1641.

192. Williams S.K., Tyler J.K. Transcriptional regulation by chromatin disassembly and reassembly // Current Opinion in Genetics & Development. 2007. Vol.17. P. 8893. 1

193. Winkler G.S., Petrakis T.G., Ethelberg S., Tokunaga M., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Svejstrup J.Q. RNA Polymerase II elongator holoenzyme is composed of two discrete subcomplexes // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 32743-32749.

194. Wolffe A. Chromatin: structure and function // Academic Press, N.Y. 1998. Vol.1. P. 8-10.

195. Woodcock C.L.F., Frado L.Y. Ultrastructure of chromatin subunits during unfolding, histone depletion, and reconstraction // Spring Harbor Simp. Quant. Biol. 1978. Vol. 42. P. 43-55.

196. Yamaguchi Y., Takagi T., Wada T., Yano K., Furuya A., Sugimoto S., Hasegawa J., Handa H. NELF, a multisubunit complex containing RD, cooperates with DISF to repress RNA polymerase II elongation // Cell. 1999. Vol. 97. P. 41-51.

197. Zama M., Olins D.E., Wilkinson-Singley E., Olins A.L. Reversibility of nucleosome conformation perturbed by urea // Biochem. Biophys. Res. Com. 1978. Vol. 85. N 4. P. 1446-1452.

198. Zayets V.W., Bavykin S.G., Karpov V.P. Organization of histone along nucleosome DNA //Nucl. Ac. Res. 1981. Vol. 9. N 5. P. 1053-1067.

199. Zhao J., Herrera-Diaz J., Gross DS. Domain-wide displacement of histones by activated heat shock factor occurs independently of Swi/Snf and is not correlated with RNA polymerase II density // Mol Cell Biol. 2005. Vol.25. P. 8985-8999.

Информация о работе

Павлова, Евгения Юрьевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Анализ нуклеазной фрагментации хроматина кодирующих областей генов триптофандиоксигеназы (to) и тирозинаминотрансферазы (tat) в различных функциональных состояниях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы