Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ индукционных взаимодействий при регенерации планарии Dugesia tigrina

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Усман, Наталья Юрьевна, Москва



Российская Академия Наук Институт биологии развития им. II. К. Кольцова

Усман Наталья Юрьевна

АНАЛИЗ ИНДУКЦИОННЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЛАН АРИИ Ви%е&1а й%гта

Специальность - 03.00.03 молекулярная биология;

03.00.30 биология развития

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук С. А. Лукьянов

Москва, 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 2

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 4

1.1. Регенерация планарии: общие закономерности процесса. Планария, как объект исследования, среди других животных систем 4

1.2. Обобщение экспериментальных данных о регенерации у разных животных 15 Глава 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 41

2.1. РЕЗУЛЬТАТЫ 41

2.1.1. Вступление 41

2.1.2. Модификация стандартного протокола whole-mount in situ гибридизации в связи с собенностями объекта 44

2.1.3. Пространственная организация транскрипции scarf у интактной планарии 46

2.1.4. Изменения в пространственной организации транскрипции scarf при регенерации 49

2.1.5. Местонахождение белка Scarf в тканях интактной планарии 52

2.2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 55 Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 63

3.1. ПРИБОРЫ И МАТЕРИАЛЫ 63

3.1.1. Оборудование 63

3.1.2. Реактивы 63

3.1.3. Растворы 65

3.2. МЕТОДЫ 66

3.2.1. Whole-mount in situ гибридизация 66

3.2.2. Иммуногистохимическая идентификация бежа Scarf 69 ВЫВОДЫ 71 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 72 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 81

ВВЕДЕНИЕ

Вопрос о том, как происходит реализация плана строения организма, представляет собой одну из наиболее значительных проблем современной биологии. Процесс формирования морфологического паттерна пристально изучают на разнообразных моделях. Среди них планария представляет собой особый случай. В отличие от многих других моделей изучения морфогенеза (нематод, рыб, млекопитающих, насекомых), в жизненном цикле этого червя нет стадии, которой ограничивались бы основные события формирования плана строения тела. В зависимости от условий среды обитания, она увеличивается или сокращается в объёме и длине, и всегда «готова восстановить себя» даже из небольшого фрагмента тела.

Можно сказать, что механизм организации плана строения тела у пла-нарии всегда находится в состоянии активности. Молекулярные принципы устройства этого механизма, однако, не раскрыты. Одним из путей к их пониманию является идентификация и сравнительный анализ дифференциальной экспрессии нуклеотидных последовательностей.

Данная работа представляет собой исследование экспрессии одного гена планарии Dugesia tigrina. Этот ген, scarf, исходно характеризовался дифференциальным распределением мРНК и локальным снижением её обилия в некоторых случаях регенерации. Цель данной работы - выявление регуля-торных механизмов, лежащих в основе паггернинга экспрессии scarf. Для достижения цели была поставлена задача проанализировать пространственную организацию экспрессии scarf у интактной планарии и её динамику при регенерации. Самостоятельной задачей являлась разработка методики такого анализа.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что смежные области тела планарии на клеточно-тканевом уровне связаны локальными взаимодействиями, которые координируют экспрессию гена scarf. Такие индукционные взаимодействия Moiyr играть организующую роль в морфогенезе. Можно предполагать, что у интактного животного они стабилизируют разметку тела, а при регенерации - принимают участие как в сохранении целостности организма, так и в образовании новых морфологических структур.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Регенерация планарии: общие закономерности процесса. Ппа-нария, как объект исследования, среди других животных систем, способных к самовосстановлению.

Планария Dugesia tigrina (G.) (Plathelminthes, Turbellaria, Tricladida) (Рис. la) обитает в пресных водоемах. Она представляет собой мягкотелый билатерально-симметричный организм, уплощенный в спинно-брюшном (СБ) направлении. Вдоль передне-задней (ПЗ) оси последовательно располагаются: голова с глазами и треугольными боковыми выростами (т.н. «уши», лат. auriculae), «туловище» с хорошо заметной глоткой посередине, суженный хвостовой отдел.

С точки зрения зоологии, планария - трехлистковый, ацеломический, несегментированный организм. Снаружи тело покрывает однослойный эпидермис: на спинной стороне он столбчатый и пигментированный, на брюшной стороне его клетки несут реснички. Под эпидермисом находятся слои продольных и кольцевых мышц, образующие кожно-мускульный мешок. Посередине тела на брюшной стороне находится ротовое отверстие, оно ведет через глотку в слепо замкнутый кишечник (одна ветвь направлена от глотки вперед две другие - назад). Плотная масса ткани, под названием паренхима, заполняет пространство между кожно-мускульным мешком и кишкой. В нее погружены выделительные канальцы (иротонефридии), дорсо-вентральные пучки мышц (благодаря им тело уплощено), а также элементы нервной ткани.

Центральная нервная система планарии - это крупный ганглий в голове (т.н. мозг) с комплексом сенсорных органов. Назад от него тянутся продольные нервные стволы, из которых два самых мощных проходят близко к брюшной поверхности. Нервные стволы соединены поперечными комиссурами, кроме того есть еще подкожное и глоточное нервные сплетения.

В соответствии с воззрениями Ромеро и Бахуньи, в организме планарии сосуществуют две клеточные популяции. К одной из них относятся морфологически идентифицируемые мультипотентные клетки - необласты. На их долю приходится 20-30 % общего числа клеток. Необласты являются стволовыми клетками: они могут делиться (так поддерживается их численность) и дифференцироваться. Посредством дифференцировки необласт необратимо переходит в состав другой клеточной популяции. Она включает в себя все остальные, функциональные, клетки организма, которые не способны ни делиться, ни изменять тип дифференцировки. Этой популяции свойственна высокая «текучесть»: ее клетки недолговечны, и их замена потомками необ-ластов происходит непрерывно в течение жизни особи.

Для вида D. tigrina характерна высокая вариабельность размеров тела: длина произвольно взятой особи (в физиологически растянутом состоянии) может быть как 5мм так и 15 мм. Более того, длина одной и той же особи в разные моменты времени может принимать столь же разные значения: голодающая планария существенно уменьшается в размере, сохраняя при этом пропорции тела, а если кормление возобновить, вырастает снова. На самом деле, это свойство планарии не уникально среди беспозвоночных; например, оно в высшей степени присуще гидре (Hydra sp.: Coelenterata, Hydrozoa, Hydrida). Если рассматривать это явление на клеточном уровне, динамика

Рис. 1а. Внешний вид живой особи планарии 1)гщема щг та. Увеличено в 10 раз. (Из Вауипа е1 а!, 1989.)

Рис. I б. Бесполое размножение планарии посредством деления.

размера организма тесно связана с интенсивностями пролиферации и гибели клеток. На общий баланс этих двух процессов влияют наличие пищи, температура среды, сам размер тела, в сочетании с генетическими характеристиками индивида [Romero and Baguña, 1991; Bagufta, 1998].

Существует paca D. tigrina, размножающаяся бесполым способом. В определенной зоне тела животного происходит поперечное деление, после чего каждый фрагмент восстанавливает недостающую часть (Рис. 16). Искусственно произведенное деление (разрезание) имеет идентичные последствия. Если произвольным образом разрезать планарию на несколько частей, то каждый из фрагментов даст начало целой новой особи. Описаны случаи восстановления целого организма планарии из 1/300 части или всего лишь из 10000 клеток [Montgomery and Coward, 1974; Bagufta, 1998]. Такая феноменальная способность к репаративной регенерации (присущая и некоторым другим турбелляриям) сделала планарию классическим объектом исследования этого явления.

Некоторые определения. Регенерация - это восстановление утраченной части тела живой особи.

В ходе нормального существования любого животного организма некоторые его составляющие постоянно изнашиваются (верхний слой эпидермиса, клетки крови) или отбрасываются (перья у птиц, рога у оленей), и заменяются новыми. Образование заново таких структур называют физиологической регенерацией.

Репаративной регенерацией называют замену частей тела, утраченных особью в результате случайных повреждений, экспериментальных вмеша-

тельств или самопроизвольной фрагментации при бесполом размножении. При такой регенерации неизбежно происходит пространственная реорганизация анатомических структур и тканей [Хадорн и Венер, 1989].

В последующем изложении термин «регенерация» будет означать «ре-паративная регенерация». Паттернинг (англ. patterning) - это последовательность морфогенетических событий в организме, приводящая к реализации некоторого пространственного плана (паттерна). Регенерант - это биологический объект, претерпевающий регенерацию.

Эпиморфоз и морфаллаксис. Морфогенетические процессы, имеющие место при регенерации, выражаются в последовательной смене промежуточных морфологических состояний регенеранта в целом. Разные системы демонстрируют две основных стратегии, или два типа, регенерации -эпиморфоз и морфаллаксис [Wolpert et at, 1998].

Термин «морфаллаксис» обозначает регенерацию, при которой не имеет места существенный прирост числа и размеров клеток. Отсутствие части тела восполняется путем перераспределения клеточного материала регенеранта. Это приводит к появлению особи нормальных (исходных) пропорций, но меньшего размера. Типичный случай морфаллаксиса представляет собой регенерация гидры: высокая доза радиоактивного излучения полностью блокирует деление клеток, что не препятствует регенерации [Hicklin and Wolpert, 1973].

Напротив, при регенерации типа «эпиморфоз» восстановительному процессу предшествует или сопутствует накопление обособленной клеточной

массы в результате эмиссии недифференцированных клеток из «старой» ткани. Образуется временная анатомическая структура - бластема. Она преобразуется в те отделы тела, которые были утрачены при повреждении. Пример эпиморфоза - регенерация конечности у тритона.

Регенерацию планарии нельзя отнести всецело к одному из этих двух типов. Ей присущи характерные черты как эпиморфоза, так и морфаллаксиса. После хирургического повреждения тела планарии рана затягивается благодаря наползанию окружающей эктодермы. Под образовавшийся раневой эпителий из подлежащей ему паренхимы устремляются недифференцированные клетки. В области раны появляется скопление этих клеток, которое продолжает увеличиваться. Это бластема; ее образование является признаком эпиморфоза. Однако в ходе регенерации не только бластема, но и сохраняющая целостность «старая» ткань претерпевает морфогенетическое преобразование, что характерно для морфаллаксиса. В зависимости от массовой доли тела, которую составлял исходный фрагмент, в регенерационном процессе доминируют черты эпиморфоза или морфаллаксиса. Если, например, тело планарии А поперечно рассечь на расстоянии, равном 1/10 длины тела, от заднего конца, то на раневых поверхностях обоих фрагментов образуются бластемы одинаковых размеров. У большего фрагмента бластема превращается в терминальную (хвостовую) часть, а сам он морфологически не меняется -т.е. происходит эпиморфоз. У меньшего фрагмента из бластемы образуются только терминальные (головные) структуры, а все остальные отделы тела оформляются в пределах сильно вытягивающегося в длину и истончающегося исходного фрагмента, так что в результате получается планария нормальных пропорций, но примерно в десять раз меньше, чем была планария А (Рис. 2а).

Рис. 2а. Эпиморфоз и морфаллаксис (по Brondsted, 1969).

Ъ - бластемы.

Рис. 26. Сохранение полярности (по Brondsted, 1969). Пояснения в тексте.

X

У

редко

'Janus head" "Janus tail'

V

обычно

Рис. 2в (по Brondsted, 1969).

Сохранение полярности. Если планарию поперечными разрезами поделить на три фрагмента (головной, средний, хвостовой), то на каждой из четырех раневых поверхностей образуется бластема. При этом бластемы р и s всегда дают начало хвостовым структурам, a q и г - головным (Рис.2б). Таким образом, у фрагмента тела планарии в процессе восстановления паттерна фиксированы продольная ось тела и ПЗ ориентация этой оси. Можно сказать, что регенерант сохраняет свою первоначальную полярность. Однако, из поперечно высеченных коротких фрагментов тела планарии, ширина которых превышает длину, нередко развиваются уродцы с нарушенной полярностью тела - например, описанные Морганом "Janus heads" и "Janus tails" (Рис.2в) [Brandsted, 1969].

Основные морфогенетические события и их характерные времена. В течение первых 10 минут после перерезки тела планарии рана сжимается посредством сокращения мышц кожно-мускульного мешка. Еще через полчаса окружающий рану старый эпидермис, растягиваясь, наползает на нее. Под образовавшимся раневым эпителием начинается агрегация необластов, они укладываются в несколько слоев клеток. Это скопление увеличивается, на вторые сутки после операции о нем говорят как о регенерационной бластеме. Она легко идентифицируется визуально, поскольку, в отличие от остальной ткани, не пигментирована. Зона тела планарии, смежная с бластемой и сравнимая с ней по размеру, называется постбластемой. В ней интенсивно пролиферируют необласты. Они мигрируют в бластему, и она продолжает увеличиваться в размере. В самой бластеме клетки не делятся. На 4 - 6 сутки регенерации в бластеме и постбластеме, которые можно рассматривать как

единый морфогенетический блок, происходит закладка новых структур. Фронт их дифференцировки распространяется от периферии тела к центру (дисто-проксимально). Полностью восстановление морфологического паттерна и обретение нормальных пропорций тела завершается через 2-3 недели после операции [Baguña, 1998].

История изучения регенерации планарии. Само явление было письменно констатировано более двух веков назад (Pallas, 1774). Дугез (Duges, 1828) впервые описал заживление раны и образование бластемы, продемонстрировал влияние температурных условий на темпы регенерации. Он заметил, что кусочки тела планарии, лишенные нервов, не регенерируют и выдвинул предположение об основополагающей роли нервной ткани в организации пат-тернинга у регенерирующей планарии.

Рэндольф (Randolf, 1897) провела сравнительные исследования регенерации у планарий из разных систематических групп. Она описала веретеновидные базофильные клетки в паренхиме, которые мигрировали в область раны чтобы построить бластему, и назвала эти клетки необластами.

В начале этого столетия доминирующими личностями в изучении планарии были Морган и Чайлд. Оба стремились понять, каким образом у регенеранта поддерживается ПЗ полярность, и сформулировать принципы паттернинга. Надо сказать, что с тех пор постановка этих научных вопросов не менялась, и они по сей день являются основными в исследовании регенерации планарии.

Морган установил ряд важных фактов (Morgan, 1898). Во-первых, он показал, что ничтожно малые фрагменты тела планарии, вплоть до 1/300 час-

ти, способны восстанавливаться в целую особь. Вместе с тем, при поперечном разрезании планарии выше уровня глаз, меньший фрагмент не регенерирует вовсе, хотя его величина может составлять до 1/10 тела. Морган ввел понятия эпиморфоза и морфаллаксиса и показал, что регенерация планарии представляет собой сочетание того и другого; также он описал морфологические аномалии, связанные с нарушением полярности при регенерации (см. соответствующие разделы этой главы). Однако Моргану не удалось обобщить свои наблюдения в форме законов, которым подчиняется ход морфогенеза. Он полагал, что «факторы», входящие в состав старой ткани, инструктируют тотипотентные клетки восстанавливать недостающую часть организма; и что полярность тела планарии определяется специфическим распределением набора «факторов» вдоль ПЗ оси. Несколько лет спустя Чайлд (Child, 1911) применил собственную теорию метаболических градиентов к объяснению морфогенеза при регенерации. Он постулировал существование в организме планарии первичного ПЗ градиента интенсивности метаболизма (в частности, окислительных процессов в клетках). При этом полярность тела интерпретировалась как следствие количественной, а не качественной, как в модели Моргана, пространственной неоднородности. Чайлд особо подчеркивал, что передняя область, т.е. голова, обладает свойствами организатора по отношению к остальным зонам регенерата.

Впоследствии попытки экспериментально «материализовать» гипотетические «факторы» или градиенты метаболических активностей, постулированные Морганом и Чайлдом, оказались безуспешными. Самые обстоятельные работы в этой связи принадлежат французским исследователям во главе с Вольфом (Wolff, 1962 и др.). Они проводили систематический

анализ отклонений от нормального хода регенерации после обработки регенерантов �