Анализ функциональной активности внутригенных промоторов E. coli с потенциальной возможностью инициировать транскрипцию, сонаправленную с синтезом мРНК

Шавкунов, Константин Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ функциональной активности внутригенных промоторов E. coli с потенциальной возможностью инициировать транскрипцию, сонаправленную с синтезом мРНК
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ функциональной активности внутригенных промоторов E. coli с потенциальной возможностью инициировать транскрипцию, сонаправленную с синтезом мРНК"

00347Э582

На правах рукописи -

ШАВКУНОВ КОНСТАНТИН СЕРГЕЕВИЧ

АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ВНУТРИГЕННЫХ ПРОМОТОРОВ Е.соИ С ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ ВОЗМОЖНОСТЬЮ ИНИЦИИРОВАТЬ ТРАНСКРИПЦИЮ, СОНАПРАВЛЕННУЮ С СИНТЕЗОМ мРНК

03.00.03 - Молекулярная биология

1 5 ОКТ 2009

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 2009

003479582

Работа выполнена в лаборатории функциональной геномики и клеточного стресса Учреждения Российской академии наук Института биофизики клетки РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Озолинь Ольга Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

Железная Людмила Алексеевна кандидат физико-математических наук, Макеев Всеволод Юрьевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится «29» октября 2009 года в «15:30» часов на заседании диссертационного совета Д 002.038.01 в ИБК РАН по адресу: 142290 г. Пущино Московской области, Институтская ул. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, г. Пущино.

Автореферат разослан «29» сентября 2009 г.

Ученый секретарь /

диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Геномные исследования последних лет привели к существенной коррекции и даже пересмотру концепций, формулирующих общепринятые представления о механизмах генной экспрессии. Наиболее значимым, по-видимому, является обнаружение транскрипции практически во всех локусах генома, включая интроны и межгенные пространства у эукариот. Причем в кодирующих последовательностях многих генов зарегистрирован синтез РНК, перекрывающихся как в смысловом, так и в антисмысловом направлениях, а рядом с активными промоторами обнаружена дивергентная транскрипция, приводящая к появлению коротких нестабильных РНК с практически неизученными свойствами [Seila et al., 2008; Не et al., 2008]. Пока не известно, являются ли короткие РНК, комплементарные матричной нити, результатом процессинга мРНК или результатом независимого синтеза, но их последовательности соответствуют кодирующим последовательностям, расположенным на расстоянии 50 н.п. от инициирующего кодона. В клетках кишечной палочки также обнаружено несколько коротких РНК, комплементарных матричной нити генов [Vogel et al., 2003]. Таким образом, явление параллельной транскрипции, сопровождающееся появлением различного рода нетранслируемых РЖ в клетке уже не вызывает больших сомнений, но биологическая роль синтезируемых РНК-продуктов пока мало понятна и требует детального исследования.

Наиболее доступным способом обнаружения мест синтеза дополнительных РНК-продуктов из кодирующих последовательностей генов может быть поиск по сигналам транскрипции. С использованием компьютерного алгоритма PlatProm, помимо ожидаемых промоторов, расположенных перед известными генами или в межгенных участках, в геноме кишечной палочки были предсказаны промоторы, находящиеся внутри кодирующих последовательностей. Часть из них имели ориентацию, совпадающую с направлением синтеза соответствующей мРНК. Это предполагало возможность альтернативной транскрипции с образованием либо укороченных по 5'-концу мРНК, способных служить матрицами для синтеза белка, либо нетранслируемых РНК с непонятной пока функцией.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было изучение возможности сонаправленного с основной транскрипцией синтеза РНК-продуктов с кодирующей части бактериальных генов Escherichia coli К12. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1) Выбор репрезентативных внутригенных промоторов, перспективных для экспериментального исследования;

2) Изучение функциональной активности выбранных промоторов in vitro и

in vivo.

Научная новизна

Впервые исследована транскрипционная активность для 8 внутригенных участков в геноме Escherichia col i К12 и установлено, что предсказанные в них промоторы способны взаимодействовать с РНК-полимеразой in vitro. Впервые показана возможность синтеза РНК из кодирующей области генов tyrR и htgA in vitro и in vivo. В геноме E.coli К12 впервые выявлено 78 участков с высокой плотностью потенциальных стартов для синтеза «сонаправленных» и антисмысловых продуктов («промоторные островки»). На примере одного из таких участков, ассоциированного с геном appY, изучена их способность продуктивно взаимодействовать с РНК-полимеразой. Локализован промотор гена appY и установлено, что соседний участок генома, содержащий дополнительные внутригенные промоторы, снижает эффективность начавшейся на нем транскрипции.

Научно-практическая ценность

Максимально полная информация о спектре синтезируемых в бактериальных клетках макромолекул крайне важна для модельной реконструкции функциональных взаимоотношений в биологических объектах. Полученные результаты, акцентируя внимание на возможности параллельной транскрипции в бактериальном геноме, свидетельствуют о необходимости детального изучения закономерностей этого процесса. Несомненную научную ценность имеют новые элементы, выявленные в нуклеотидной последовательности бактериального генома («промоторные островки»), а также результаты сравнительного анализа их функциональных свойств со свойствами обычных промоторов. Низкая способность этих элементов инициировать синтез РНК, при эффективном взаимодействии с РНК-полимеразой, предполагает существование в геноме специальных мест для непродуктивного связывания фермента.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на XVIII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2006), XX Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), XIX зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007), международной конференции «Геномы-2008: Функциональная геномика микроорганизмов» (Париж, Франция, 2008), III конгрессе Европейских микробиологических обществ (Гётеборг, Швеция, 2009) и XXXIV конгрессе Европейских биохимических обществ (Прага, Чехия, 2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 7 статей в реферируемых журналах и сборниках.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, 2 приложений и списка цитируемой литературы, включающего 225 источников. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы. В работе использован стандартные лабораторные штаммы Escherichia coli К-12 [GenBank accession number: U00096.2; Blattner et al., 1997] и Escherichia coli omnimax («Invitrogen», США).

Выделение ДНК из клеток E.coli осуществляли по стандартной методике с использованием кислого фенола.

Амплификация фрагментов ДНК. Препаративный синтез промотор-содержащих фрагментов ДНК и количественную ПЦР с использованием кДНК проводили в термоциклере ДТ-322 («ДНК Технология», Москва) в режиме: денатурация при 94°С - 2 мин; затем 30-32 цикла: денатурация 94°С - 30 сек., отжиг праймеров 58-59°С - 30 сек., синтез цепи 70°С - 30-40 сек. Использовалась Taq-полимераза производства «Evrogen» (Москва).

Мечение олигодезоксинуклеотидов проводили присоединением у-фосфата [у-32Р]ЛТР к 5'-концу праймера с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 согласно протоколу фирмы-производителя («Fermentas», Литва).

РНК из клеток E.coli выделяли по методике, предложенной Фавре-Бонте и сотрудниками [Favre-Bonte et al., 1999]. Полученный препарат обрабатывали ДНКазой I (Qiagen, Германия).

Обратная транскрипция. Синтез кДНК проводили с использованием обратной транскриптазы RevertAid M-MuLV («Fermentas», Литва) и гено-специфического праймера в соответствии с рекомендациями производителя.

Электрофоретическую подвижность полимераза-промоторных комплексов в геле (gel-shift) исследовали согласно рекомендациям [Laniel et al., 2001]. Фермент инкубировали с промоторной ДНК в условиях 2, 4 и 8-кратного избытка по отношению к фрагменту в транскрипционном буфере (50 мМ Трис-HCl (pH 8.0), 10 мМ MgCl2, 0.1 мМ ЭДТА, 0.1 мМ ДТТ, 50 мМ NaCl, 250 мкг/мл БСА). К пробам добавляли гепарин до конечной концентрации 20 мкг/мл, после чего комплексы и свободную ДНК разделяли электрофоретически в предварительно прогретом до 37°С 4% полиакриламидном геле.

Матричную активность промоторов оценивали методом однократной инициации транскрипции in vitro (single-round). Комплексы формировали в стандартных условиях, используя 8-10-кратный избыток РНК-полимеразы по отношению к ДНК, после чего добавляли смесь гепарина, [a-32P]UTP, а также немеченые субстраты (конечная концентрация UTP - 50 мкМ, остальных субстратов - по 160 мкМ). Через 20 минут синтеза при 37°С реакцию

-3-

останавливали добавлением (40 мкл) буфера, содержащего 40 мМ ЭДТА и 500 мкг/мл тРНК. Продукты осаждали и разделяли электрофоретически в денатурирующих условиях. После экспонирования с рентгеновской пленкой (210 дней) проводили радиоавтографическую визуализацию.

Секвенирование фрагментов по гуанинам проводили по стандартной методике, приведенной в [Maxam and Gilbert, 1977].

Футпринтинг KMn04 in vitro использовался для локализации сайтов взаимодействия РНК-полимеразы и промоторов. Комплексы фермента (2-, 4- и 8-кратный избыток по отношению к ДНК) с фрагментами ДНК, меченными по 5'-концу [у-32Р], формировали в транскрипционном буфере (см. выше). Модификацию КМпС>4 (концентрация в пробе 10 мМ) проводили в течение 30 сек., затем реакцию останавливали равным объемом смеси 0.1 М ДТТ и 0.6 М CH3COONa. Продукты после осаждения растворяли в 10% пиперидине, инкубировали 20 минут при 98°С, добавляли LiCl до конечной концентрации 0.5 М, переосаждали и анализировали, как описано выше.

Встраивание промотор-содержащих фрагментов в плазмиду рЕТ28Ь-EGFP и анализ уровня экспрессии репортерного белка. Исследуемые фрагменты ДНК были амплифицированы с праймерами, имеющими на 5'-конце специфические линкеры для клонирования. Эти ампликоны и плазмида pET28b-EGFP, содержащая беспромоторный ген gfp, подвергались рестрикции BglII и Xbal («Fermentas», Литва) и, после электрофоретической очистки, лигированию в течение 10-12 часов при 4°С Т4 ДНК лигазой («Fermentas», Литва). Бактериальные клетки трансформировали плазмидами, содержащими исследуемый промотор или без него, согласно стандартному протоколу с использованием СаСЬ, и рассевали на чашки Петри со средой LB + 60 мкг/мл канамицина. Флуоресценцию GFP в колониях анализировали на флуоресцентном микроскопе Leica при длинах волн возбуждения/эмиссии 480/510 нм, в монохромном режиме или с использованием светофильтра. Полученные данные обрабатывали с помощью программы Leica Application Suite. Контрольными были колонии клеток, трансформированные рЕТ28Ь-EGFP, содержащей беспромоторный ген gfp.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор репрезентативных «сонаправленных» промоторов, перспективных для экспериментального тестирования.

Всего с помощью PlatProm было обнаружено 711 генов, внутри которых предсказаны «сонаправленные» промоторы. При этом учитывались только такие сигналы, скор которых превышал 7.4 (р<0.00004). Поскольку большинство генов, содержащих «сонаправленные» промоторы, экспрессируются моноцистронно или находятся в конце оперонов, можно было предположить, что некоторые внутригенные промоторы нужны для транскрипции неизвестных пока генов в межгенных областях или для интенсификации экспрессии нижележащих генов сходной ориентации. Но средняя длина межгенных участков, фланкирующих 3'-

конец таких генов, несколько короче (119пн), чем в среднем по геному (148пн), что снижает вероятность обнаружения в них новых генов. Для оценки реалистичности второго предположения была учтена ориентация соседних генов, расположенных по ходу транскрипции с предполагаемого внутригенного промотора. В 302 случаях она оказалась одинаковой с предыдущим геном, что допускает возможность транскрипции нижележащего гена с удаленного промотора. Внутренние сигналы транскрипции в остальных генах (409) могут отвечать за синтез РНК, кодирующих укороченные белковые продукты, или нетранслируемых РНК.

Поэтому на следующем этапе был осуществлен поиск открытых рамок считывания за анализируемыми промоторами. Для этого была использована сетевая программа ORF Finder (www.ncbi.nlm.nih.gov). Учитывались все обнаруженные ORF Finder открытые рамки считывания. Из 409 исследуемых участков более короткие по отношению к основному гену ОРС были найдены внутри 305 генов. Среди них 175 предположительно имеют сайты для связывания с рибосомами (Shine-Dalgarno). Таким образом, по крайней мере, 45% «сонаправленных» промоторов потенциально могут контролировать синтез альтернативных белковых продуктов, но для 22% такая возможность, по-видимому, полностью исключена.

При выборе промоторов для экспериментальной проверки учитывали:

• Биологическую роль кодируемого геном белка (в первую очередь выбор шел среди регуляторных белков).

• Расстояние потенциальной стартовой точки от начала гена. (Промоторы, расположенные вблизи ATG кодонов считали вспомогательными для нормальной транскрипции).

• Ориентацию соседнего гена.

• Кодирующий потенциал новой РНК (Поиск альтернативных рамок считывания осуществляли с использованием ORF Finder (NCBI), а места связывания рибосомы определяли по наличию консенсусного элемента (AGGAGGT) в пределах 25 нуклеотидов от ATG-кодона.

В результате, для первоочередного анализа были отобраны промоторы, предсказанные внутри 5 генов, кодирующих белки-регуляторы транскрипции (Таблица 1). В геноме E.coli все они расположены перед генами, транскрибируемыми в обратном направлении, что исключает возможность участия внутригенных промоторов в экспрессии соседних генов. Дополнительно было выбрано два внутригенных промотора, о взаимодействии которых с РНК-полимеразой свидетельствовали данные, полученные методом ChIP-on-chip [Herring C.D., et al., 2005; Reppas N., et al„ 2006] (см. Рис. IB). Эти промоторы находятся внутри генов pyrG и yejO, кодирующих СТР-синтетазу и предполагаемый мембранный белок.

Локус гена appY был выбран, потому что он, также как 77 аналогичных участков бактериального генома имеет исключительно высокую плотность потенциальных мест инициации транскрипции. Мы называли такие области «промоторные островки» (ПО), чтобы отличить от кластеров потенциальных

стартовых точек, обнаруживаемых компьютерными программами рядом с обычными промоторами. Во всех ПО предсказываются потенциальные точки старта как для «сонаправленной», так и для антисмысловой транскрипции, но их активность и функциональное значение пока совершенно не исследованы.

Таблица I. Внутригенные «сонаправленные» промоторы, отобранные для экспериментального анализа.

Ген Длина гена (п.н.) Скор внутриген- ного промотора Координаты гена и внутригенного промотора, имеющего максимальный скор Расстояние стартовой точки от начала гена Наличие ОРС за внутри-генным промотором Наличие и контекст сайта связывания рибосомы

Гены регулято рных белков

агсА 716 8.364 4637613-4638329 4638236 (-)* 93 22 (603)" AGATGGC

ЫгА 965 7.737 4171105-4172070 4171573 (+) 468 - -

fucR 731 7.974 2937390-2938121 2938030 (+) 640 - -

htgA 590 8.657 10724-11314 11102 (+) 378 2(213) 79 (153) -

tyrR 1541 8.324 1384744-1386285 1385248 (+) 504 37 (1002) CGGTGGT

Гены, отобранные после анализа данных ChIP-on-chip

pyrG 1637 9.263 2906051-2907688 2906901 (-) 787 93 (759) 475(174) 661 (153) ATGCTGT

yejO 3790 9.672 2284412-2288202 2286340 (-) 1860 795 (306) 1176(105) 1557(141) 2100(213) 2605 (126) GGGCGCT CGGCGGT AGGCTGT

Промоторный островок

appY 749 16.284 582904-583653 582922 (+) 18 337 (396) 182(102) :

в скобках указано направление транскрипции («+» или «-» нить, соответственно) указано расстояние (п.н.) от предсказанной точки инициации транскрипции и длина обнаруженной ОРС (в скобках)

Проверка функциональной активности выбранных промоторов in vitro

Фрагменты, содержащие внутригенные «сонаправленные» промоторы, были амплифицированы в ПЦР с использованием специфических праймеров.

Принципиальная способность предсказанных промоторов к взаимодействию с РНК-полимеразой была проверена методом задержки ДНК-белковых комплексов в геле (gel-shift), пример которого приведен на рисунке 1. Доля ассоциированного с ферментом фрагмента гена yejO, содержащего «сонаправленный» промотор Р2 и антисмысловой РЗ, составила ~70%. При этом образовывалось 3 типа комплексов, один из которых демонстрировал

явную зависимость от концентрации фермента. Такая картина взаимодействия может объясняться одновременным связыванием полимеразы с промоторами Р2 и РЗ.

В целом, полученные этим методом результаты свидетельствуют о способности всех исследованных промотор-содержащих фрагментов ДНК формировать комплексы с РНК-полимеразой in vitro (см. также Рис. 4, 7, 11 и Таблица 2), но эффективность связывания отличалась и была минимальной в случае промоторов из генов tyrR и arc А.

-1000 -500 О 500 1000 1500 2000 2500 ЗООО 3500 Координаты относительно старта транскрипцииyejO (0)

Рис. 1. [А]: Предсказанные стартовые точки транскрипции (вертикальные столбики) вблизи гена yejO. Указано расположение праймеров для ПЦР (F1 и R1). |В): Эффективность связывания РНК-полимеразы in vivo [Herring et al., 2005]. [С]: Результат задержки комплексов в геле для фрагмента F1-R1.

Для точной локализации мест взаимодействия фермента с промоторами использовали футпринтинг комплексов перманганатом калия, который выявляет типичную для «открытых» комплексов локальную денатурацию двойной спирали ДНК. На рисунке 2А показаны результаты такого эксперимента для фрагмента ДНК из гена arcA, который плохо взаимодействовал с ферментом. На расстоянии 50-55п.н. от меченого праймера обнаружили очень слабую модификацию двух тиминов. Они входят в область предполагаемого плавления двойной спирали на предсказанном промоторе, но такая реактивность не является показателем эффективного образования «открытого» комплекса. В реакции однократной инициации транскрипции с данного промотора синтез РНК-продукта также не зарегистрирован (рис. 2В). Таким образом, все эксперименты свидетельствуют о плохой способности

«сонаправленного» промотора из гена агсА формировать транскрипционные комплексы in vitro.

В гене pyrG модификация перманганатом калия выявила формирование двух открытых комплексов, один из которых точно соответствует промотору Р2, предсказанному со скором 9.3 и отстоящему от начала гена на 786п.н.

I 127 I- 119

\ ® 255 Рис. 2. [А]: Футпринтинг

gto 233 перманганатом калия комплексов,

f щ . 211 формируемых РНК-полимеразой с

Ж 1®2 «сонаправленным» промотором из гена

«а 170 агсА. G - продукты секвенирования

jSy '160 соответствующего фрагмента ДНК. На

f. 148 выноске отмечены тимины в области локального плавления ДНК. Фигурной стрелкой отмечен предсказанный старт

I транскрипции.

I- 106

I [В]: Тестирование внутреннего

1_ 90 промотора из агсА на способность к

I синтезу РНК in vitro. M - продукты

1-81/82 гуанин-специфического

секвенирования ДНК. Стрелка

1-70 указывает ожидаемое место миграции

1-65 РНК. |- 61

I- 55

Единственный РНК-продукт, зарегистрированный в реакции однократной инициации транскрипции (~120нт) по длине соответствует промотору Р2. В районе второго открытого комплекса PlatProm предсказывает антисмысловой промотор со скором 3.7, но in vitro образование РНК ожидаемой длины с него не наблюдалось.

С фрагментом из гена yejO РНК-полимераза формировала только один комплекс. Позиции модифицированных тиминов идеально соотносятся с расположением предсказанного промотора, а в реакции однократной инициации транскрипции был зарегистрирован продукт, по размеру соответствующий его стартовой точке. Все это дает основания считать, что в кодирующей последовательности yejO возможен синтез укороченной РНК.

Аналогичные результаты были получены для «сонаправленных» промоторов в генах birA и fucR. В целом, следует отметить, что эффективность образования открытых комплексов сильно отличалась для разных промоторов и была минимальной в случае «сонаправленного» промотора из гена агсА. При этом

77/7872/73-

54 -

51 -

45/4641/42 -

днк ♦ +

РНК полимераза - 4х

116/117-

способность к продуктивной инициации была зарегистрирована не для всех промоторов, формирующих открытые комплексы с ферментом (Таблица 2).

В yejo

-164-165

-151

-144

-t2S

-117

- 103

- 83-50 -86 -83

-72 - 66-67 -62

Рис. 3. Футпринтинг перманганатом калия и синтез РНК in vitro для «сонаправленных» промоторов в pyrG (А] и yejO [BJ. G - продукты секвенирования соответствующих фрагментов ДНК. На выносках отмечены

тимины,

модифицированные в участках локального плавления ДНК.

Фигурными стрелками отмечены предсказанные старты транскрипции.

Анализ активности «сонаправленных» промоторов из гена htsA

Как и ожидалось, промоторы, для которых было зарегистрировано взаимодействие с РНК-полимеразой in vivo [Herring et al., 2005; Reppas et al., 2006] эффективнее формировали комплексы и in vitro, но для внутригенной области htgA взаимодействия с полимеразой методом ChlP-on-chip зарегистрировано не было.

-200 о 200 400 600 800 1000 1200 1400 Координаты относительно старта транскрипции htgA (0)

ДНК РНКП

Рис. 4. [А]: Предсказанные стартовые точки транскрипции (вертикальные столбики) вблизи гена Ш§А. Указано расположение использованных в работе праймеров. [В]: Результат задержки комплексов в геле для фрагмента ¥2-Ю..

Кодирующая последовательность этого гена, предположительно кодирующего регуляторный белок, полностью перекрывается с геном yaaW, транскрибируемым по противоположной нити. (Рис. 4А). Анализ способности фермента взаимодействовать с внутригенными промоторами in vitro выявил формирование двух комплексов (Рис. 4В), при этом в контакт с РНК-полимеразой вступало около половины присутствующей в пробе ДНК. Единственная область локального плавления на фрагменте соответствует промотору Р1 (Рис. 5А). Открытый комплекс вблизи Р2 и РЗ не обнаружен, что указывает на избирательное связывание РНК-полимеразы с промотором имеющим максимальный показатель промотор-подобия.

In vitro с матрицы F2-R2 шел синтез четырех продуктов (Рис. 5В), самый большой из которых транскрибируется в антисмысловом направлении, так как при смене матрицы размер этого продукта уменьшался. Продукт длиной ~106нт, соответствует транскрипционной вилке Р1, при условии, что синтез начинается в позиции, которая отличается от предсказанной на 9п.н. Открытый комплекс, соответствующий РНК длиной ~126нт, не выявлен, а рассчитанный алгоритмом показатель промотор-подобия в этой области составляет всего 1.9.

Рис. 5. Анализ промоторного участка из гена htgA.

[A]: Футпринтинг перманганатом калия. Звездочками отмечены модифицированные в районе Р1 тимины. Нижняя фигурная стрелка - нуклеотид, комплементарный предсказанному старту, верхняя - нуклеотид, соответствующий старту наблюдаемого продукта.

[B]: Однократная инициация транскрипции in vitro. М -продукты гуанин-специфического секвенирования ДНК.

[C]: Обратная транскрипция от vivo. Стрелки указывают РНК, наблюдаемые in vitro, и кДНК, соответствующие ожидаемым РНК.

В реакции обратной транскрипции с тотальной клеточной РНК зарегистрирована кДНК, имеющая размер точно соответствующий предсказанному, а не смещенному на 9н.п. старту в промоторе Р1. Кроме этого обнаружен продукт, который соответствует предсказанному, но неактивному in vitro промотору Р2. Можно было предположить, что в естественных условиях инициация с Р1 и Р2 регулируется некими факторами, отсутствующими в искусственной реакционной смеси. Поэтому была исследована промоторная

ДНК РНКП

55 —

181159137121111107/10893

8982-

синтез РНК in vitro # «3-М jr^T

обратная Q транскрипция

С С G G G С

Т* А

т*~

G ! Т* i т*

266 255233211192179170160148-

127 119-

90-

706561 -

активность этого участка генома in vivo. Для этого использовали систему репортерной детекции, однако достоверного увеличения уровня экспрессии GFP в клетках, трансформированных плазмидой с промоторной вставкой, по сравнению контрольными клетками не обнаружили.

А контроль В F1-R1

Рис. 6. Колонии клеток, трансформированные плазмидой pET28b-EGFP, содержащей беспро-моторный ген gfp |Al или ген, gfp перед которым был вставлен фрагмент ДНК, содержащий Р1 и Р2 (|В1).

Несмотря на это, полученные данные свидетельствуют о способности Р1 продуктивно взаимодействовать с РНК-полимеразой. Синтезируемый продукт имеет ОРС, которая может играть роль матрицы для синтеза маленького белка, состоящего из 71 аминокислотного остатка. Возможно, этот белок является основным продуктом данного локуса, так как во время проведения этой работы из геномной карты Е.соИ К12 ген htgЛ был удален, как перекрывающийся с более длинной ОРС гена уааШ, хотя в других базах данных он присутствует.

Анализ транскрипционной активности внутренних промоторов в гене 1угЯ

F2F3 ... ÍF4F5 fyrR F® | ; : ycjG

Í 8? R2 R3 i 111

гепарин

ДНК

РНКП

■900 -600 -300 0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000 +* ♦ + раты относительно старта транскрипции tyrR (0)

свободный фрагмент (254 п.н.)

300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000 Координаты относительно старта транскрипции tyrR (0}

Рис. 7. [А]: Предсказанные стартовые точки транскрипции (вертикальные столбики) вблизи гена tyrR. Указано расположение использованных в работе праймеров. [В]: Эффективность связывания РНК-полимеразы in vivo [Herring et al., 2005]. [С]: Результат задержки комплексов в геле для фрагмента F2-R2.

В гене регуляторного белка tyrR предсказано 2 тандемных «сонаправленных» промотора (Рис. 7А). In vivo комплексы с РНК-полимеразой в этом участке не зарегистрированы (Рис. 7В), a in vitro в ассоциации участвовало всего -14% содержащейся в пробе ДНК (Рис. 1С). Тем не менее, футпринтинг перманганатом калия выявил модифицированные тимины вблизи промотора Р2 (Рис. 8А), хотя область локального плавления оказалась смещенной на один виток спирали в транскрибируемую сторону. Повышенная реактивность тиминов, соответствующих положению Р1 не наблюдалась (165-170п.н. от праймера). Синтез РНК in vitro с этого промотора был очень слабым, тем не менее был зарегистрирован продукт длиной ~103нт, синтезирующийся в том же направлении, что tyrR-мРНК, с промотора Р2, и по размеру соответствующий предсказанному старту (Рис. 8В). При этом в обратной транскрипции, наряду с множеством более коротких продуктов, синтезировалась кДНК длиной 88нт (Рис. 8С). Она соответствует области локального плавления, но короче предсказанной и зарегистрированной in vitro РНК. По этим данным исследуемый промотор гораздо активнее in vivo, чем in vitro.

Рис. 8. Анализ промоторного участка в tyrR. |А]: Футпринтинг перманганатом калия. На выноске отмечены модифицированные в районе Р2 тимины. М - продукты гуанин-специфического секвенирования ДНК. [BJ: Однократная инициация транскрипции in vitro. Нижняя фигурная стрелка - нуклеотид, комплементарный старту наблюдаемого продукта, верхняя - нуклеотид, комплементарный предсказанному старту. [С]: Обратная транскрипция in vivo. Стрелки указывают РНК, наблюдаемые in vitro и кДНК, по длине соответствующую предсказанному старту Р2.

Возможность синтеза укороченного по сравнению с 0W?-mPHK транскрипта исследовалась методом количественной ПЦР (ОТ-кПЦР). Для этого использовали две пары праймеров и кДНК, полученную с праймером R2 (Рис. 7А). При этом динамика накопления ПЦР-продуктов, образующихся при

использовании Р5 и Я2, отражает суммарное количество в клетках (угЛ-мРНК и РНК, синтезируемой с Р2, в то время, как накопление ампликонов Р2-Я2 характеризует содержание гугК-мРНК.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что ампликон Р5-Я2 накапливался гораздо быстрее, чем ПЦР-продукт Н2-И2, Это означало, что с промотора Р2 идет синтез РНК, тем более что пара праймеров Р2-Я2 при использовании ДНК в качестве матрицы была более эффективной, чем Р5-112. Если РНК была выделена из клеток, выращенных на богатой среде, накопление короткого продукта, отражающего сумму мРНК и укороченного транскрипта, опережало в среднем на 4.75 цикла накопление ампликона с одной мРНК. Для РНК из клеток, выращенных на синтетической среде М9 разница составила 3.15 циклов. Это указывает на то, что продукция альтернативной РНК может контролироваться регуляторными системами клетки.

а —

в-

Л X X Ф Ü в 3

4751055 ^м

ш &

'rt ß/

Количество циклов амплификации

3.15 ±0.48 <Р / »V .< - У i/g

i • i i I» а :* Л ■:> i': Д » X X и

с-Ч

G—:-V—А

Т—А А—? 10—G—С Т—А С—G С—G G— Т—А А—Т Т—А

А—Т

Количество циклов амплификации

Рис. 9. Тестирование транскрипционной активности внутригенных промоторов методом ОТ-кПЦР. [А] и [В]: Накопление ампликонов с использованием кДНК с тотальной РНК из бактерий, выращенных на LB и М9, соотвественно. [С]: Электрофоретический контроль качества реакции. (D|: Предполагаемая терминаторная шпилька в конце гена tyrR, построенная с помощью программы RNA Structure 4.3 [Mathews et al., 2004].

Чтобы исключить возможность ошибки, могущей возникнуть в силу большой разницы в длинах фрагментов, была проведена серия экспериментов с парой праймеров F4-R2 (Рис. 9А и В) вместо F2-R2 (размеры ампликонов 148 и 254п.н., соответственно). Эффект, наблюдаемый при синтезе с ДНК и кДНК в предыдущей серии экспериментов, полностью воспроизводился.

Укороченный продукт, образующийся с Р2, имеет ОРС, которая предполагает образование белкового продукта длиной 346 аминокислотных остатков, без сдвига рамки кодирования по сравнению с fyrR-мРНК. Эта ОРС заканчивается на терминаторе гена tyrR с координатами в геноме 13862911386326 [Cornish et al., 1986]. Данный участок формирует протяженную шпильку с очень высокой свободной энергией фолдинга -24.7 кКал/М (Рис. 9D). Методом ОТ-кПЦР была проверена возможность прохождения РНК-полимеразой этой области в ходе синтеза РНК. Как и ожидалось, синтез ампликона F6-R4 (Рис. 7А) зарегистрирован не был. Это означает, что синтез альтернативного внутригенного продукта заканчивается там же, где ?угК-мРНК.

Не исключено, что эта РНК кодирует белок, играющий роль самостоятельного регулятора транскрипции, так как у Klebsiella pneumoniae помимо гена, полностью гомологичного tyrR, программой BLAST был обнаружен еще один ген регуляторного белка zraR, который короче tyrR, но имеет протяженный фрагмент, гомологичный РНК транскрибируемой с Р2.

отрТ

tg б о. з

О н 12 * | 15 о 18

е-21

-1000 800 -600 -400 -200 1.0 0,8 ' 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2

-1000 -800 -600 2,5 1 2,0

1.0 0,5 0,0 -0,5

-1000 -800 -600 -400 -200

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Координаты относительно старта транскрипции appY{0)

Рис. 10. [А): Предсказанные стартовые точки транскрипции (вертикальные столбики) вблизи гена appY. Фигурными скобками отмечены предсказанные в этой области «промоторные островки». Указаны использованные в работе праймеры. [В| и [С): Эффективность связывания РНК-полимеразы, определенная методом ChIP-on-chip в работах [Herring et al., 2005] и [Reppas et al., 2006], соответственно.

Исследование функииональной активности промоторов из генетического

локуса appY

В ходе сканирования генома E.coli К12 было обнаружено 78 необычных генетических локусов с исключительно высокой плотностью (>8 на 100 пар

оснований) предсказанных мест инициации транскрипции на протяженных участках (>300 пар оснований), отстоящих друг от друга более чем на ЮОп.н. Все эти участки имеют потенциальные точки старта для дивергентной транскрипции. Мы назвали их «промоторными островками» (ПО). Ассоциированный с геном appY П01 является одним из двух самых протяженных в геноме (Рис. 1 OA).

Было известно, что РНК-полимераза взаимодействует с этой областью генома in vivo (Рис. 10В и С). In vitro также практически весь фрагмент, содержащий межгенные и часть внутригенных промоторов, связывался с РНК полимеразой, образуя два типа комплексов (Рис. 11 А). Причем полное связывание наблюдалось уже в условиях 2-кратного избытка фермента. Эффективность комплексообразования существенно снижалась при использовании фрагмента ДНК (F3-R2), не содержащего межгенных промоторов (Рис. 11В). Это значит, что, по крайней мере, одно из мест связывания РНК-полимеразы расположено между праймерами F2 и F3 (Рис. 10А).

Рис. 11. Задержка ДНК-белковых комплексов в геле для фрагмента F2-R3, захватывающего межгенную область и начало appY ([А]) и F3-R2, без межгенной части ([В]).

Футпринтинг выявил тимины, соответствующие четырем транскрипционным вилкам (Рис. 12А). In vitro образуется два мажорных продукта, один из которых синтезируется с PIV в антисмысловом направлении (Рис. 12С). Синтез РНК длиной ~237нт начинается на Pill, который, вероятнее всего, является собственным промотором appY. Однако в реакции обратной транскрипции ожидаемые кДНК-продукты не были обнаружены ни в одном из 5 экспериментов (см. диссертацию), что указывало на низкий уровень транскрипции гена appY в клетках.

Для проверки этого предположения в плазмиду с беспромоторным репортерным геном было вставлено 4 промотор-содержащих фрагмента, ориентированных относительно гена gfp так же, как в appY. Вставка фрагмента F3-R2, содержащего только внутригенные промоторы, активировала экспрессию gfp в ~6.5 раз по сравнению с контрольными клетками (Рис. 13С).

Это значит, что с внутригенных промоторов в гене аррУ может начинаться синтез РНК-продуктов. Вставка Г'1-К2, включающая плотную область потенциальных стартов перед аррУ и внутригенные промоторы в начале кодирующей области, приводила к 29-кратной активации синтеза ОБР (Рис. 13А).

319 — 270 -236 -200 -176 — 160 — 143 — 126 —

86 — 82 — 75 —

67 — 60 —

51 — 46 —

РНКП

-+23/40 | V

-151/-146 -156/-1S4 II -160

-172

-189/-188 -193 | -195 1

Рис. 12. Проверка функциональной активности промоторов генетического локуса аррУ. [А]: Футпринтинг перманганатом калия. G - продукты секвенирования ДНК-фрагмента F2-R3. Римские цифры - открытые комплексы, арабские цифры справа -положение модифицированных оснований. [В]: Схема расположения открытых комплексов на анализируемом фрагменте. Фигурные стрелки указывают ожидаемое направление транскрипции. Рядом приведены ожидаемые длины РНК до конца фрагмента. Белые стрелки указывают на наличие РНК ожидаемой длины in vitro или in vivo. [С]: Однократная инициация транскрипции in vitro. Стрелками отмечены транскрипты, подвижность которых менялась в зависимости от длины матрицы. Звездочки - неспецифические продукты, образующиеся в результате продуктивного связывания РНК-полимеразы с концами фрагмента.

Для конструкции, содержащей фрагмент F4-R4 из кодирующей части аррУ, практически никакой промоторной активности зарегистрировать не удалось (Рис. 13D); увеличение флуоресценции составило всего 1.2 ± 0.13 раз.

Трансформация клеток плазмидой с укороченной со стороны кодирующей последовательности вставкой (фрагмент F1-R1) вызывала исключительно высокую активацию экспрессии gfp (Рис. 13В). Уровень флуоресценции по сравнению с контрольными клетками возрастал в -87 раз. Это значит, что между праймерами R1 и R2 есть какие-то элементы, препятствующие продуктивной транскрипции.

Рис. 13. Исследование активности промоторов, входящих в П01, ассоциированный с геном appY, с использованием репортерной детекции GFP, методом флуоресцентной микроскопии. [A-DJ: Фотографии анализируемых колоний, трансформированных рЕТ28Ь-EGFP без промоторной вставки (изображения слева), либо содержащей фрагменты анализируемой области (изображения справа).

Эти результаты хорошо согласуются с данными, полученными Isalan с соавторами [2008] которые проанализировали ~600 химерных конструкций, составленных из кодирующих участков генов и их промоторов (в том числе, appY) в разных сочетаниях. Транскрипция почти всех генов усиливалась в том случае, когда они ставились под контроль промотора appY, что указывает на высокий уровень его активности. Однако если кодирующую часть appY присоединяли к различным промоторам, интенсивность транскрипции репортерного гена, расположенного за appY, снижалась практически для всех промоторов. Это свидетельствует в пользу того, что в гене appY есть элементы, препятствующие синтезу РНК, которыми вполне могут быть внутригенные промотор-подобные сайты.

Корреляционный анализ

Поэтому на заключительном этапе были использованы результаты, полученные методом ChIP-on-chip [Herring et al., 2005; Reppas et al., 2006] и данные экспрессионного анализа [Reppas et al., 2006] для того, чтобы понять насколько эффективно взаимодействуют с РНК-полимеразой другие участки генома, имеющие высокую плотность потенциальных промоторов, и насколько типичной для промоторных островков является низкая транскрипционная активность.

В результате сравнительного анализа было установлено, что во взаимодействии с ферментом in vivo участвует 77% предсказанных PlatProm промоторных кластеров или одиночных сайтов (всего 4810). Для оценки степени корреляции между рассчитанными PlatProm скорами и эффективностью связывания с РНК-полимеразой in vivo [Herring et al., 2005; Reppas et al., 2006], коэффициенты промотор-подобия были преобразованы в приемлемый для прямого сравнения показатель вероятности связывания РНК-

полимеразы с конкретным участком генома (Р) (Рис. 14А). При этом учитывалось, что геометрический центр фермента в комплексе с промотором не совпадает со стартовой точкой, длина спейсеров для -10 и -35 консенсусных гексануклеотидов в промоторе может варьировать, а РНК-полимераза в клетке взаимодействует с двухнитевой ДНК (т.е. гибридизационный сигнал может быть получен как от смысловой, так и от матричной нити). Пример такого преобразования для локуса аррУ приведен на рисунке 14В.

зонд 50 нт

фрагмент 5'

ДНК ;: связанный сРНКП

—"+" нить

----"." НИТЬ

Рис. 14. Преобразование показателей промотор-подобия в вероятность связывания РНК-полимеразы Р ([А]) на примере локуса аррУ (средний график на |В]).

Рисунок 15 демонстрирует корреляцию между рассчитанными значениями Р и экспериментально определенными эффективностями взаимодействия (log2(Cy5/Cy3)) в разных участках генома. Коэффициенты линейной корреляции Пирсона для сравниваемых значений оказались равными 0.51 (Rh, Рис. 15А) и 0.38 (Rr, Рис. 15В), соответственно. При этом RH оказалось сравнимым, и даже выше, чем R, рассчитанный для трех повторов биологического эксперимента (R=0.46; 0.48 и 0.52), выполненных одним методом в одной лаборатории. [Herring et al., 2005] (Рис. 15А и В).

Корреляционный график (Рис. 15А) выявил 2106 точек с меньшими, чем ожидалось, сигналами гибридизации (красные точки). Их наличие нельзя объяснить экспериментальными или техническими ошибками, т.к. зонды, представляющие эти же участки генома, гибридизовались с меньшей эффективностью и в другом эксперименте (Рис. 15В). Оказалось, что

практически все зонды, формирующие выступы на графиках, соответствуют участкам с повышенным содержанием потенциальных стартов транскрипции, и все 78 «промоторных островков» представлены в выступающей части графиков. Т.е. РНК-полимераза может узнавать отдельные промоторы внутри ПО с менее предсказуемой эффективностью, чем одиночные промоторы.

400

| 3 200 Л ГО со Q. £ Ф л

81 0 л ц

0 ° "20°

1 ¿

§í -400

-600

R = 0.51

400 200 О -200

375032 зондов -400 (р«10*) - .600

R = 0.38

376263 зондов (рссю-6)

0246 -2 024

Эффективность связывания РНК-лолимеразы in vivo

-1 0 1 2 3 4 5

(Юд2)в

Рис. 15. [А] и [В]: Корреляция между Р и эффективностью связывания РНК-полимеразы, в соответствии с данными ChIP-on-chip [Herring et al., 2005 и Reppas et al., 2006, соответственно]. Выступающие точки на графике [А] отсечены линией, сдвинутой вверх относительно медианы на 1.96 Std. Черные точки на графике [В] соответствуют зондам, представляющим участки генома, способность которых взаимодействовать с РНК-полимеразой была ниже ожидаемой по данным [Reppas et al., 2006]. [С]: Корреляция между связыванием РНК-полимеразы (log2)e и эффективностью транскрипции соседних участков (log2)E для 78 ПО (черные символы) и 181 отдельного промотора (серые символы). Линии отражают регрессию первого порядка.

Для проверки этого предположения была использована выборка одиночных известных промоторов, точно распознаваемых PlatProm (всего 181). Оказалось, что 87% «нормальных» промоторов и 100% «промоторных островков» образовывали комплексы с РНК-полимеразой in vivo. В то же время, синтез РНК на микроматрицах [Reppas et al., 2006] был зарегистрирован для 59% «нормальных» промоторов и только для 13% ПО. На корреляционном графике 15С точки, соответствующие ПО, сосредоточены в нижней части, что свидетельствует об их парадоксально низкой транскрипционной активности. Это наблюдение хорошо согласуется с экспериментальными данными, полученными для островка в appY.

Исходя из имеющихся данных, мы предполагаем, что некоторые сайты образуют комплексы с РНК-полимеразой без инициации синтеза, выполняя

только часть функций, свойственных промоторам. В таком случае, их действительно можно рассматривать в качестве возможных элементов, подавляющих синтез РНК.

По оценкам Huerta и Collado-Vides [2006] ~92% обычных промоторов E.coli локализованы в кластерах дополнительных промотор-подобных сайтов, способствуя их адекватной регуляции. Результаты сканирования PlatProm приблизительно соответствуют такой оценке. Часть ПО тоже находится в межгенных участках и, следовательно, содержит обычные промоторы. В то же время, 23 «островка» (-30%) лежат внутри генов или оперонов, далеко от ожидаемых мест инициации транскрипции. Поскольку в бактериальной хромосоме имеется только 78 мест с необычайно высокой плотностью потенциальных промоторов, их, по-видимому, нельзя рассматривать как типичное явление.

В целом, полученные в этой серии экспериментов данные обращают внимание на необычные функциональные свойства ранее не исследованных областей бактериального генома с высокой плотностью промотор-подобных участков. Их биологическую роль еще предстоит выяснить.

Таблица 2. Сводные данные по результатам анализа активности внутригенных «сонаправленных» промоторов.

Название гена Промотор1 Задержка в геле (gel-shift)2 Футпринтинг перманганатом калия3 Инициация 4 транскрипции m vi/ro Комплексы с РНК-полимеразой in v/vo5 Дс

arcA P(0 + (1) + - +/-

birA P1/P2 (с) P3/P4 (a) + (3) + -177 нт -/-

fucR Pl(c) P3(a) + (2) + -117 нт -/-

pyrG P1/P2/P3 (c) + (1) + —120 нт +/+

yejO P2(c) P3(a) + (3) + -140 нт +/+

htgA P1/P2 (c) + (2) + 106 нт -/- Обрати Ю

tyrR P1/P2 (c) + (2) + -103 нт -/- Обрати Коли1 to

appY 5'-конец (с/а) 3'-конец (с/а) + + н/а -137 нт н/а + + Обрати to

1 — Приведено название гена, содержащего анализируемые промоторы.

2 - В скобках указано количество зарегистрированных гепарин-устойчивых комплексов.

3 - «+» и «-» отражают соответствие наблюдаемых комплексов ожидаемым.

4 - Указана длина наблюдаемых продуктов, соответствующих ожидаемым.

5 - Согласно данным [Herring C.D., et al., 2005 и Reppas N., et al., 2006]

выводы

1. Кодирующие последовательности генов birA,fucR, htgA, pyrG, tyrRviyejO содержат промоторы, способные взаимодействовать с РНК-полимеразой с формированием открытых комплексов и инициацией синтеза РНК in vitro.

2. С промотора, расположенного в гене tyrR, в клетках идет синтез укороченной РНК, которая содержит еще одну рамку считывания и сайт связывания рибосомы, т.е. может быть матрицей для синтеза белкового продукта длиной 346 аминокислотных остатков.

3. В геноме E.coli впервые выявлено 78 областей с высокой плотностью промотор-подобных сайтов, и изучены свойства области, ассоциированной с геном appY. Установлено, что in vitro РНК-полимераза формирует несколько продуктивных комплексов с перекрывающимися промоторами и может синтезировать РНК, как в смысловом, так и в антисмысловом направлении. В то же время, in vivo синтез appY-ыРИК был ниже уровня достоверной регистрации, что свидетельствует о наличии регуляторного механизма, ограничивающего продуктивную элонгацию.

4. С использованием системы репортерной детекции установлено, что фрагмент гена appY, содержащий активные внутригенные промоторы, подавляет, а не стимулирует транскрипцию репортерного гена, инициированную на межгенном промоторе. Свидетельствуя против аддитивности актов инициации транскрипции на соседних промоторах, это указывает на возможную регуляторную роль внутригенных сигналов транскрипции.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1. Озолинь О.Н., Шавкунов К С.. Тутукина М.Н. Регуляторы генной экспрессии у бактерий: белковые факторы транскрипции и нетранслируемые РНК Н Вестник биотехнологии - 2005 - Т. 1, № 1 - с. 56-65.

2. Brok-Volchanski AS, Masulis IS, Shavkunov KS. Lukyanov VI, Purtov YuA, Kostyanicina EG, Deev AA, Ozoline ON. Predicting sRNA genes in the genome of E.coli by the promoter-search algorithm PlatProm // Bioinformatics of Genome Regulation and Structure II (ed. Kolchanov N, Hofestaedt R and Milanesi L) - 2006 - pp. 11-20.

3. Тутукина M.H., Шавкунов K.C.. Масулис И.С., Озолинь О.Н. Картирование промоторов для антисмысловой транскрипции в генах регуляторных белков Escherichia coli // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. -Вып.8 - Воронеж - 2006 - с. 201-206.

4. KS Shavkunov. IS Masulis, YuG Matushkin, ON Ozoline. Alternative transcription within prokaiyotic genes predicted by promoter-search software // Bioinformatics on Genome Regulation and Structure (ed. Kolchanov N, Hofestaedt R and Milanesi L) - 2006 - I, pp. 188-192.

5. MN Tutukina, KS Shavkunov. IS Masulis, ON Ozoline. Intragenic promoter-like sites in the genome of Escherichia coli. Discovery and functional implication // J. of Bioinformatics and Computational Biology - 2007 - pp. 549-560.

6. VI Lukyanov, MN Tutukina, KS Shavkunov. IS Masulis, ON Ozoline. Deciphering antisense regulation in bacteria // J. of Biomolecular Structure and Dynamics - 2007 - Vol. 24, № 6 - pp. 740-742.

7. K.S. Shavkunov. I.S. Masulis, M.N. Tutukina, A.A. Deev, O.N. Ozoline. Gains and unexpected lessons from genome-scale promoter mapping // Nucleic Acids Res. - 2009 -Vol. 37, № 15-pp. 4919-4931.

Тезисы докладов

1. Шавкунов K.C. Идентификация промоторов, способных контролировать синтез укороченных РНК-продуктов в бактериальных генах // Материалы XVIII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» — Москва — 2006 — с. 64.

2. Тутукина М.Н., Шавкунов К.С.. Масулис И.С., Озолинь О.Н. Транскрипционный профиль генетического локуса E.coli, содержащего ген sapA И Материалы X международной конференции «Биология - наука XXI века» - Пущино - 2006 - с. 55.

3. Тутукина М.Н., Шавкунов К.С.. Масулис КС., Озолинь О.Н. Поиск промоторов для антисмысловой транскрипции в генах регуляторных белков E.coli II Материалы X международной конференции «Биология - наука XXI века» - Пущино - 2006 - с. 56.

4. Шавкунов К.С. Поиск мест связывания РНК-полимеразы in silico и in vivo. Сравнительный анализ // Материалы XIX зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» -Москва-2007-с. 8.

5. IS Masulis, MN Tutukina, KS Shavkunov. VI Lukyanov, ON Ozoline. RNA polymerase resident sites in bacterial genomes: multiple occurrence and putative function // Proceedings of the 3rd International Moscow Conference on Computational Molecular Biology - 2007 -pp. 199-201.

6. Shavkunov KS. Masulis IS, Ozoline ON. Intragenic promoter within Escherichia coli tyrR gene. Prediction and experimental verification // Proceedings of «Genomes 2008 Functional genomics of microorganisms» - Paris, France - 2008 - p. 196.

7. Shavkunov KS. Ozoline ON. E.coli genomic region with high potentiality to initiate RNA synthesis and low transcription output // Proceedings of 3rd FEMS Congress - Gothenburg, Sweden-2009-p. 200.

8. Tutukina MN, Shavkunov KS. Ashikhmina AA, Masulis IS, Ozoline ON. Promoter mapping: in silico, in vitro and in vivo // FEBS J. - 2009 - Vol.276 - p. 10.

Подписано в печать:

28.09.2009

Заказ № 2599 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шавкунов, Константин Сергеевич

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. МНОГООБРАЗИЕ ФУНКЦИЙ, ВЫПОЛНЯЕМЫХ РНК. РЕГУЛЯТОРНЫЕ РНК

Обзор литературы)

1.1. Избыточность транскрипции и возможность альтернативного кодирования

1.2. Многообразие функций, выполняемых РНК

1.3. Нетранслируемые РНК как новый тип регуляторов генной экспрессии

1.3.1. РНК-интерференция. Двухцепочечные РНК, как клеточный регулятор 11 Малые интерферирующие РНК (siRNA) 11 МикроРНК 15 РНК, взаимодействующие с регуляторными белками группы Piwi (piPHK) 17 Повтор-ассоциированные малые интерферирующие РНК

1.3.2. Антисмысловые РНК

1.3.3. Рибопереключатели

1.4. РНК-регуляторы прокариот

1.5. Белковые факторы транскрипции прокариот 33 Hfg как глобальный фактор регуляиии транскрипции

1.6. Методы поиска генов, кодирующих нетранслируемые РНК

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы

2.2. Получение радиоактивно меченых олигодезоксинуклеотидов

2.3. Выделение ДНК из клеток E.coli с использованием кислого фенола

2.4. Амплификация индивидуальных фрагментов ДНК (полимеразная цепная реакция, ПЦР)

2.5. Фракционирование ДНК методом электрофореза в полиакриламидном геле

2.6. Выделение фрагментов ДНК из полиакриламидного геля

2.7. Оценка эффективности комплексообразвания промотор содержащих участков генома с РНК-полимеразой методом задержки ДНК-белковых комплексов при ПААГ-электрофорезе (gel-shift)

2.8. Тестирование матричной активности промоторов методом однократной инициации транскрипции in vitro (single-round)

2.9. Выделение суммарной фракции клеточной РНК

2.10. Определение нуклеотидной последовательности ДНК-фрагментов по Максаму-Джилберту

2.11. Исследование комплексов промоторов и РНК-полимеразы методом футпринтинга KMn04 in vitro

2.12. Исследование транскрипционной активности предсказанных PlatProm промоторов методом обратной транскрипции in vivo

2.13. Рестрикция ДНК-фрагментов и плазмиды для лигирования

2.14. Лигирование фрагментов ДНК, содержащих исследуемые промоторы, в плазмиду pET28b-EGFP

2.15. Приготовление компетентных клеток и трансформация

2.16. Анализ активности промоторов с использованием системы репортерной детекции методом флуоресцентной микроскопии

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выбор репрезентативных «сонаправленных» промоторов, перспективных для экспериментального тестирования

3.2. Проверка функциональной активности выбранных промоторов in vitro 66 Исследование транскрипционной компетентности предсказанных промоторов 74 Анализ транскрипционной активности внутренних промоторов в гене htgA 80 Анализ транскрипционной активности внутренних промоторов в гене tyrR

3.3. Исследование функциональной активности промоторов из генетического локуса гена appY

3.4. Сравнительный анализ активности «промоторных островков» и «нормальных» промоторов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ функциональной активности внутригенных промоторов E. coli с потенциальной возможностью инициировать транскрипцию, сонаправленную с синтезом мРНК"

Хорошо известно, что содержащаяся в геномной ДНК информация отражает не только генетический потенциал биологического объекта (закодированные аминокислотные последовательности белков, рРНК, тРНК, характер протекающих в клетках метаболических процессов), но и определяет взаимосвязь генной экспрессии с функционирующими регуляторными системами. Расшифровка нуклеотидных последовательностей геномов многих прокариотических и эукариотических организмов изменила стратегию биологических исследований и стимулировала развитие экспериментальных и информационных подходов, направленных на структурную аннотацию наследственного материала и реконструкцию функциональных взаимоотношений в живой клетке. Несмотря на большое количество имеющихся сведений об особенностях метаболизма бактерий, полноценное моделирование клеточной системы с учетом вклада всех типов участвующих молекул пока невозможно даже для такого хорошо исследованного микроорганизма, как кишечная палочка (Escherichia coli). Тем не менее, относительно точная реконструкция совместной работы отдельных генных ансамблей уже довольно давно проводится как для прокариот, так и для высших организмов. Накопление и систематизация фактической информации способствует постепенному заполнению все большего числа белых пятен и открывает возможность управления целыми каскадами биохимических реакций. Необходимым условием успешного воссоздания такой сложной многокомпонентной системы, как клетка, является максимально точная идентификация всех генов в геноме и наличие как можно более полной информации о способе регуляции их экспрессии.

Исследования последних лет привели к существенной коррекции и даже пересмотру концепций, формулирующих общепринятые представления о механизмах генной экспрессии. Наиболее значимым, по-видимому, является обнаружение транскрипции практически во всех локусах генома, включая интроны и межгенные пространства у эукариот. Причем в кодирующих последовательностях многих генов зарегистрирован синтез РНК, перекрывающихся как в смысловом, так и в антисмысловом направлениях, а рядом с активными промоторами обнаружена дивергентная транскрипция, приводящая к появлению коротких нестабильных РНК с практически неизученными свойствами [Seila et al., 2008; Не et al., 2008]. Пока не известно, являются ли короткие РНК, комплементарные матричной нити, результатом процессинга мРНК или результатом независимого синтеза, но их последовательности соответствуют кодирующим последовательностям, расположенным на расстоянии 50 пар нуклеотидов п.н.) от инициирующего кодоиа. В клетках кишечной палочки также обнаружено несколько коротких РНК, комплементарных матричной нити генов [Vogel et al., 2003]. Таким образом, явление параллельной транскрипции уже не вызывает больших сомнений, но биологическая роль синтезируемых РНК-продуктов пока мало понятна и требует детального исследования.

Современные методы аннотации расшифрованных последовательностей с высокой точностью распознают гены, кодирующие аминокислотные последовательности белков. Различные подходы основываются на таких характеристических особенностях, как нуклеотидный состав кодирующих участков, триплетность кода, взаимное расположение инициирующих и терминирующих кодонов, наличие модулей взаимодействия с рибосомами (последовательность Shine-Dalgarno). Кроме этого учитываются данные об N-концевых последовательностях клеточных белков, наличие гомологии с известными генами в других бактериях, эффективность экспрессии, а также любая другая доступная информация. Такие методы хорошо приспособлены для обнаружения большинства белок-кодирующих генов, но недостаточно эффективны для поиска генов, кодирующих короткие пептиды или молекулы малых нетранслируемых РНК. При идентификации генов рибосомных и транспортных РНК используются компьютерные программы, учитывающие высокую эволюционную консервативность соответствующих участков ДНК, а также их способность формировать типичную трехмерную структуру. Наиболее сложным является системный поиск генов малых нетранслируемых РНК, исследование которых в 2002 году отнесено журналом Science к одному из приоритетных направлений молекулярной биологии. Трудность их целенаправленной идентификации de novo обусловлена не только разнообразием выполняемых функций, но и отсутствием явных особенностей в кодирующей последовательности и пространственной структуре. В то же время, учитывая высокую значимость малых РНК в клетке, необходимость разработки алгоритмов для их выявления не вызывает сомнения.

В настоящее время наиболее доступным способом обнаружения малых нетранслируемых РНК является поиск по сигналам транскрипции. В лаборатории Функциональной геномики и клеточного стресса Института биофизики клетки РАН была разработана программа для предсказательного поиска бактериальных промоторов PlatProm [Brok-Volchanski et al., 2006]. Данный компьютерный алгоритм моделирует структуру промоторов за счет комплексного учета особенностей их нуклеотидной последовательности и структурной организации. Его высокая чувствительность и специфичность позволяют не только обнаруживать известные регуляторные сайты транскрипции, но и предсказывать положение точек старта синтеза РНК в масштабах целого генома. Сканирование генома E.coli с помощью этой программы позволило предсказать промоторы для многих генов, что облегчает их экспериментальное картирование. Компьютерный поиск выявил возможные места синтеза новых РНК-продуктов в межгенных участках. Некоторые из них могут кодировать короткие полипептиды или новые регуляторные РНК. Наряду с этим было обнаружено довольно много потенциальных мест инициации транскрипции, расположенных внутри кодирующих участков генов. Большая часть таких необычных промоторов имеет антисмысловую ориентацию, что предполагает возможность синтеза с них РНК-продуктов, комплементарных мРНК. Наиболее удивительным было обнаружение внутригенных сигналов транскрипции со смысловой ориентацией. Активность таких промоторов предполагает возможность параллельной транскрипции бактериальных генов с образованием либо укороченных мРНК, способных служить матрицами для синтеза белка, либо нетранслируемых РНК с непонятной пока функцией. Основной целью данной работы была проверка функциональной активности именно таких промоторов.

Исследованию вопроса о возможности и целесообразности параллельной транскрипции посвящена первая часть обзора литературных данных. Кроме того, обзор призван дать представление о многообразие функций, выполняемых известными на данный момент нетранслируемыми РНК, о современной методологии их целенаправленного поиска и роли в регуляции генной экспрессии.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шавкунов, Константин Сергеевич

выводы

1. Кодирующие последовательности генов birA,fucR, htgA, pyrG, tyrR и yejO содержат внутренние промоторы, способные взаимодействовать с РНК-полимеразой с формированием открытых комплексов и инициацией синтеза РНК in vitro.

3. В геноме E.coli впервые выявлено 78 областей с высокой плотностью промотор-подобных сайтов и изучены свойства области, ассоциированной с геном appY. Установлено, что in vitro РНК-полимераза формирует несколько продуктивных комплексов с перекрывающимися промоторами и может синтезировать РНК, как в смысловом, так и в антисмысловом направлении. В то же время, in vivo синтез oppF-мРНК оказался ниже уровня достоверной регистрации, что свидетельствует о наличии регуляторного механизма, ограничивающего продуктивную элонгацию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной целью данной работы было изучение возможности синтеза дополнительных РНК из кодирующих последовательностей генов, т.е. возможности альтернативного кодирования одной и той же последовательностью гена нескольких РНК-продуктов. В качестве первичных индикаторов потенциальных мест альтернативного синтеза РНК были использованы внутригенные «сонаправленные» промоторы, предсказанные компьютерной программой PlatProm. На основании предварительного теоретического анализа для экспериментальной проверки были выбраны промоторы, находящиеся в восьми генах. Шесть из них кодируют регуляторы транскрипции агсА, birA,fucR, htgA, tyrR, appY, а два - белки общего метаболизмаpyrG и yejO. Во всех случаях для тестирования были использованы промотор-содержащие фрагменты ДНК, амплифицированные в ПЦР с одной или несколькими парами праймеров в зависимости от необходимой длины матрицы. В гене appY было исследовано две разные области. Суммарные данные приведены в Таблице 3.

Восемь из 9 фрагментов ДНК, содержащих предсказанные промоторы, взаимодействовали с РНК-полимеразой и формировали с ней, по крайней мере, один транскрипционно-компетентный открытый промоторный комплекс, но эффективность взаимодействия существенно различалась. Так, например, промотор в гене агсА хуже всего связывался с РНК-полимеразой и не проявил никакой матричной активности, хотя имеет высокий показатель промотор-подобия. Еще более удивительной была полная неспособность взаимодействовать с ферментом кластера промотор-подобных участков, находящегося в конце гена appY. Пока у нас нет объяснения этому факту.

Транскрипционно компетентные комплексы были зарегистрированы для промоторов из генов appY (начало гена), pyrG и yejO, которые по данным ChIP-on-chip эффективно взаимодействуют с РНК-полимеразой in vivo, и для промоторов из пяти остальных генов, где такое взаимодействие зарегистрировано не было, что, безусловно, указывает на целесообразность и информативность предварительного компьютерного поиска, хотя координаты стартовых точек транскрипции, предсказанных PlatProm, нуждаются в экспериментальном подтверждении. Семь из 8 зарегистрированных футпринтингом перманганатом калия локально-денатурированных участков в точности соответствовали предсказанному старту, но синтезируемые in vitro продукты не всегда имели ожидаемый размер.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шавкунов, Константин Сергеевич, Пущино

1. Ahlquist P. (2002) RNA-dependent RNA polymerases, viruses, and RNA silencing // Science, 296 (5571), pp. 1270-1273.

2. Aiba H. (2007) Mechanism of RNA silencing by Hfq-binding small RNAs // Curr. Opin. Microbiol., 10 (2), pp. 134-139.

3. Akhtar S., Kole R. and Juliano R.L. (1991) Stability of antisense DNA oligodeoxynucleotide analogs in cellular extracts and sera // Life Sei., 49, pp. 1793 -1801.

4. Altuvia S. (2007) Identification of bacterial small non-coding RNAs: Experimental approaches // Curr. Opin. Microbiol., 10, pp. 257-261.

5. Ambros V. (2001) MicroRNAs: tiny regulators with great potential // Cell, 107, pp. 823826.

6. Anantharaman V., Koonin E. and Aravind L. (2002) Comparative genomics and evolution of proteins involved in RNA metabolism // Nucleic Acids Res., 30 (7), pp. 1427-1464.

7. Andersson A.F. and Banfield J.F. (2008) Virus population dynamics and acquired virus resistance in natural microbial communities II Science, 320 (5879), pp. 1047-1050.

8. Aravin A.A., Lagos-Quintana M., Yalcin A., Zavolan M., Marks D., Snyder В., Gaasterland Т., Meyer J. and Tuschl T. (2003) The small RNA profile during Drosophila melanogaster development // Dev. Cell, 5, pp. 337-350.

9. Aravin A. and Tuschl T. (2005). Identification and characterization of small RNAs involved in RNA silencing // FEBS, 579, pp. 5830-5840.

10. Aravin A.A., Sachidanandam R., Bourc'his D., Schaefer C., Pezic D., Toth K.F., Bestor T. and Hannon G.J. (2008) A piRNA pathway primed by individual transposons is linked to de novo DNA methylation in mice // Molecular Cell, 31 (6), pp. 785-799.

11. Argaman L., Hershberg R., Vogel J., Bejerano G., Wagner E.G.H., Margalit H. and Altuvia S. (2001) Novel small RNA-encoding genes in the intergenic regions of Escherichia coli II Current Biology, 11 (12), pp. 941-950.

12. Avner P. and Heard E. (2001) X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation I I Nature Rev. Genet., 2, pp. 59-61.

13. Azam T.A., Iwata A., Nishimura A., Ueda S. and Ishihama A. (1999) Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid // J. Bacterio!., 181, pp. 6361-6370.

14. Babitzke P. and Romeo T. (2007) CsrB sRNA family: sequestration of RNA-binding regulatory proteins // Curr. Opin. Microbiol., 10, pp. 156-163.

15. Babu M.M., Luscombe N.M., Aravind L., Gerstein M. and Teichmann S.A. (2004) Structure and evolution of transcriptional regulatory networks // Curr. Opin. Struct. Biol., 14(3), pp. 283-291.

16. Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richards M., Boyaval P., Moineau S., Romero D.A. and Horvath P. (2007) CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes // Science, 315 (5819), pp. 1709-1712.

17. Bartel D.P. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function // Cell, 116, pp. 281-297.

18. Baulcombe D. (2007) Molecular biology. Amplified silencing // Science, 315 (5809), pp. 199-200.

19. Bejerano-Sagie M. and Xavier K.B. (2007) The role of small RNAs in quorum sensing // Curr. Opin. Microbiol., 10 (2), pp. 189-198.

20. Belgnaoui S.M., Gosden R.G., Semmes O.J. and Haoudi A. (2006) Human LINE-I retrotransposon induces DNA damage and apoptosis in cancer cells // Cancer Cell International, 6, p. 13.

21. Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M., Hannon G.J. (2001) Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference // Nature, 409 (6818), pp. 363-366.

22. BioSpace Exiqon A/S To Acquire Oncotech. (2007) The transaction will create a world leader in molecular diagnostic products based on miRNA // Press release.

23. Bohmert K., Camus I., Bellini C., Bouchez D., Caboche M. and Benning C. (1998) AGOl defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development // EMBO Journal, 17, pp. 170-180.

24. Bouvier M., Sharma C.M., Mika F., Nierhaus K.H. and Vogel J. (2008) Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation // Mol. Cell., 32 (6), pp. 827-837.

25. Brantl S. and Wagner E.G. (2002) An antisense RNA-mediated transcriptional Attenuation mechanism functions in Escherichia coli II Journal of Bacteriology, 184 (10), pp. 27402747.

26. Brantl S. (2007) Regulatory mechanisms employed by cis-encoded antisense RNAs // Curr. Opin. Microbiol., 10 (2), pp. 102-109.

27. Brennecke J., Aravin A., Stark A., Dus M., Kellis M., Sachidanandam R. and Hannon G.2007) Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila // Cell, 128 (6), pp. 1089-1103.

28. Brennecke J., Malone C.D., Aravin A.A., Sachidanandam R., Stark A. and Hannon G.J.2008) An epigenetic role for maternally inherited piRNAs in transposon silencing // Science, 322 (5906), pp. 1387-1392.

29. Brouns S.J.J., Jore M.M., Lundgren M., Westra E.R., Slijkhuis R.J.H., Snijders A.P.L., Dickman M.J., Makarova K.S., Koonin E.V. and Van der Oost J. (2008) Small CRISPR RNAs Guide Antiviral Defense in Prokaryotes II Science, 321, pp. 960-964.

30. Brown S. and Fournier M.J. (1984) The 4.5 S RNA gene of Escherichia coli is essential for cell growth 11 Journal of Molecular Biology, 178 (3), pp. 533-550.

31. Brown P.O. and Botstein D. (1999) Exploring the new world of the genome with DNA microarrays II Nat. Genet., 21, p. 33.

32. Carrington J. and Ambros V. (2003). Role of microRNAs in plant and animal development. Science, 301 (5631), pp. 336-338.

33. Carter R.J., Dubchak I. and Holbrook S.R. (2001) A computational approach to identify genes for functional RNAs in genomic sequences // Nucleic Acids Res., 19, pp. 3928-3938.

34. Cerutti H. and Casas-Mollano J. (2006) On the origin and functions of RNA-mediated silencing: from protists to man // Curr. Genet., 50 (2), pp. 81—99.

35. Chapman E.J. and Carrington J.C. (2007) Specialization and evolution of endogenous small RNA pathways // Nature Reviews Genetics, 8, pp. 884-896.

36. Check E. (2007) RNA interference: hitting the on switch // Nature, 448, pp. 855- 858.

37. Chen S., Lesnik E.A., Hall T.A., Sampath R„ Griffey R.H., Ecker D.J. and Blyn L.B. (2002) A bioinformatics based approach to discover small RNA genes in the Escherichia coli genome // BioSystems, 65, pp. 157-177.

38. Collins J.A., Imov I., Baker S. and Winkler W.C. (2007) Mechanism of mRNA destabilization by the glmS ribozyme // Genes Dev., 21, pp. 3356-3368.

39. Core L.J., Waterfall J.J. and Lis J.T. (2008) Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters // Science, 322, pp. 1845-1848.

40. Cornish E.C., Argyropoulos V.P., Pittard J. and Davidson B.E. (1986) Structure of the Escherichia coli K12 regulatory gene tyrR II Journal Biol. Chem., 261 (1), pp. 403-410.

41. Cutrona G., Carpaneto E.M., Ulivi M., Roncella S., Landt O., Ferrarini M. and Boffa, L.C. (2000) Effects in live cells of a c-myc anti-gene PNA linked to a nuclear localization signal IINat. Biotechnol., 18, pp. 300-303.

42. Denli A.M., Tops B.B., Plasterk R.H., Ketting R.F. and Hannon G.J. (2004) Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex // Nature, 432 (7014), pp. 231-235.

43. Dias N. and Stein C.A. (2002) Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms // Molecular cancer therapeutics, 1, pp. 347-355.

44. Djupedal I. and Ekwall K. (2009) Epigenetics: heterochromatin meets RNAi // Cell Res., 19(3), pp. 282-295.

45. Dorner S., Eulalio A., Huntzinger E. and Izaurralde E. (2007) Symposium on MicroRNAs and siRNAs: biological functions and mechanisms // EMBO, 8, pp. 723-729.

46. Eddy S.R. (1999) Noncoding RNA genes // Current Opinion in Genetics and Development, 9, pp. 695-699.

47. Eder P.S., DeVine R.J., Dagle J.M. and Walder J.A. (1991) Substrate specificity and kinetics of degradation of antisense oligonucleotides by a 3' exonuclease in plasma // Antisense Res. Dev., 1, pp. 141-151.

48. Eulalio A., Huntzinger E., Nishihara T., Rehwinkel J., Fauser M. and Izaurralde E. (2009) Deadenylation is a widespread effect of miRNA regulation // RNA, 15 (1), pp. 21-32.

49. Faehnle C.R. and Joshua-Tor L. (2007) Argonautes confront new small RNAs // Curr. Opin. Chem. Biol., 11 (5), pp. 569-577.

50. Fahey M.E., Moore T.F. and Higgins D.G. (2002) Overlapping antisense transcription in the human genome // Comp. Fund. Genomics, 3, pp. 244-253.

51. Favre-Bonte S., Joly B. and Forestier Ch. (1999) Consequences of reduction of Klebsiella pneumoniae capsule expression on interactions of this bacterium with epithelial cells // Infection and Immunity, 67, pp. 554-561.

52. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E. and Mello C.C. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans II Nature, 391, pp. 806-811.

53. Fozo E.M., Hemm M.R. and Storz G. (2008) Small toxic proteins and the antisense RNAs that repress them // Microbiol. Mol. Biol. Rev., 72 (4), pp. 579-589.

54. Frank D.N. and Pace N.R. (1998) Ribonuclease P: unity and diversity in a tRNA processing ribozyme // Annual Review of Biochemistry, 67, pp. 153-180.

55. Fritz J., Girardin S. and Philpott D. (2006) Innate immune defense through RNA interference // Sei STKE, 2006 (339), doi: 10.1126/stke.3392006pe27.

56. Gibbs W.W. (2003) The Unseen Genome: gems among the junk // Scientific American, 289 (5), pp. 46-53.

57. Gilbert W. (1986) The RNA World // Nature, 319, p. 618.

58. Giles R.V., Spiller D.G., Clark R.E. and Tidd D.M. (1999) Antisense morpholino oligonucleotide analog induces missplicing of C-myc mRNA // Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 9, pp. 213-220.

59. Girard A., Sachidanandam R., Hannon G.J. and Carmell M.A. (2006) A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins II Nature, 442 (7099), pp. 199-202.

60. Görke B. and Vogel J. (2008) Noncoding RNA control of the making and breaking of sugars // Genes Dev., 22, pp. 2914-2925.

61. Gottesman S. (2005) Micros for microbes: non-coding regulatory RNAs in bacteria // Trends Genet., 21 (7), pp. 399-404.

62. Gourse R.L., Ross W. and Rutherford S.T. (2006) General pathway for turning on promoters transcribed by RNA polymerases containing alternative sigma factors // J. Bacteriol., 188 (13), pp. 4589-4591.

63. Gregory R., Chendrimada T., Cooch N., Shiekhattar R. (2005) Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing // Cell, 123 (4), pp. 631-640.

64. Gregory R.I., Chendrimada T.P. and Shiekhattar R. (2006) MicroRNA biogenesis: isolation and characterization of the microprocessor complex II Methods Mol. Biol., 342, pp. 33-47.

65. Gruber T.M. and Gross C.A. (2003) Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space I I Annual Rev. Microbiol., 57, pp. 441-466.

66. Grundy F.J. and Henkin T.M. (2006) From ribosome to riboswitch: control of gene expression in bacteria by RNA structural rearrangements // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 41, pp. 329-338.

67. Guerrier-Takada C., Gardiner K., Marsh T., Pace N. and Altman S. (1983) The RNA moiety of Ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme // Cell, 35, (3, Pt. 2), pp. 849-857.

68. Hammer B.K. and Bassler B.L. (2007) Regulatory small RNAs circumvent the conventional quorum sensing pathway in>pandemic Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104 (27), pp. 11145-11149.

69. Hammond S.M., Bernstein E., Beach D. and Hannon G.J. (2000) An RNA-directed nuclease mediates posttranscriptional gene silencing in Drosophila cells // Nature, 404, pp.293-296.

70. Han J., Lee Y., Yeom K.H., Nam J.W., Heo I., Rhee J.K., Sohn S.Y., Cho Y., Zhang B.T. and Kim, V.N. (2006) Molecular basis for the recognition of primary microRNAs by the Drosha-DGCR8 complex // Cell, 125 (5), pp. 887-901.

71. He Y., Vogelstein V.E., Papadopoulos N. and Kinzler K.W. (2008) The antisense transcriptomes of human cells II Science, 322, pp. 1855-1857.

72. Hengge R. (2008) The two-component network and the general stress sigma factor RpoS (sigma S) in Escherichia coli II Adv. Exp. Med. Biol., 631, pp. 40-53.

73. Hertz G.Z. and Stormo G.D. (1996) Escherichia coli promoter sequences: analysis and prediction // Methods Enzymol., 273, pp. 30-42.

74. Hock J. and Meister G. (2008) The Argonaute protein family // Genome Biology, 9 (2), doi: 10.1186/gb-2008-9-2-210.

75. Hong S., Lessner F.H., Mahen E.M. and Keiler K.C. (2007) Proteomic identification of tmRNA substrates // PNAS, 104, pp. 17128-17133.

76. Huerta A.M. and Collado-Vides J. (2003) Sigma70 promoters in Escherichia coli: specific transcription in dense regions of overlapping promoter-like signals // J. Mol. Biol., 333, pp. 261-278.

77. Huerta A., Francino M.P., Morett E. and Collado-Vides J. (2006) Selection for unequal densities of a70 promoter-like signals in different regions of large bacterial genomes // PLoS Genetics, 2, pp. 1740-1750.

78. Isalan M., Lemerle C., Michalodimitrakis K., Horn C., Beltrao P., Raineri E., Garriga-Canut M. and Serrano L. (2008) Evolvability and hierarchy in rewired bacterial gene networks // Nature, 452, pp. 840-845.

79. Ishihama A. (1990) Molecular assembly and functional modulation of Escherichia coli polymerase // Adv. Biophys., 26, pp. 19-31.

80. Izant J. and Weintraub H. (1984) Inhibition of thymidine kinase gene expression by antisense RNA: a molecular approach to genetic analysis // Cell, 36, pp.1007-1015.

81. Jagath J.R., Matassova N.B., de Leeuw E., Warnecke J.M., Lentzen G., Rodnina M.V., Luirink J. and Wintermeyer W. (2001) Important role of the tetraloop region of 4.5S RNA in SRP binding to its receptor FtsY // RNA, 7 (2), pp. 293-301.

82. Janowski B.A., Younger S.T., Hardy D.B., Ram R., Huffman K.E. and Corey D.R. (2007) Activating gene expression in mammalian cells with promoter-targeted duplex RNAs // Nat. Chem. Biol., 3 (3), pp. 166-173.

83. Jensen C.G. and Pedersen S. (1994) Concentrations of 4.5S RNA and Ffh protein in Escherichia coli'. the stability of Ffh protein is dependent on the concentration of 4.5S RNA // Journal of Bacteriology, 176 (23), pp. 7148-7154.

84. Jensen K.K., Orum H., Nielsen P.E. and Norden B. (1997) Kinetics for hybridization of peptide nucleic acids (PNA) with DNA and RNA studied with the BIAcore technique. Biochemistry, 36, pp. 5072-5077.

85. Johansen J., Rasmussen A.A., Overgaard M. and Valentin-Hansen P. (2006) Conserved small non-coding RNAs that belong to the sigmaE regulon: role in down-regulation of outer membrane proteins H J. Mol. Biol., 364 (1), pp. 1-8.

86. Jones-Rhoades M., Bartel D., Bartel B. (2006) MicroRNAs and their regulatory roles in plants II Annual. Rev. Plant Biol., 57, pp. 19-53.

87. Katiyar-Agarwal S., Morgan R., Dahlbeck D., Borsani O., Villegas A., Zhu J., Staskawicz B. and Jin H. (2006) A pathogen-inducible endogenous siRNA in plant immunity // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 103 (47), pp. 18002-18007.

88. Kawamoto H., Koide Y., Morita T. and Aiba H. (2006) Base-pairing requirement for RNA silencing by a bacterial small RNA and acceleration of duplex formation by Hfq // Mol. Microbiol., 61 (4), pp. 1013-1022.

89. Kawano M., Reynolds A.A., Miranda-Rios J. and Storz G. (2005) Detection of 5'- and 3'-UTR-derived small RNAs and cis-encoded antisense RNAs in Escherichia coli II Nucl. Acids Res., 33, pp. 1040-1050.

90. Kawano M., Aravind L. and Storz G. (2007) An antisense RNA controls synthesis of an SOS-induced toxin evolved from an antitoxin // Mol. Microbiol., 64 (3), pp. 738-754.

91. Klattenhoff C. and Theurkauf W. (2008) Biogenesis and germline functions of piRNAs // Development, 135 (1), pp. 3-9.

92. Krichevsky A.M., King K.S., Donahue C.P., Khrapko K. and Kosik K.S. (2003) A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development // RNA, 9, pp. 1274-1281.

93. Kurihara Y. and Watanabe Y. (2004) Arabidopsis micro-RNA biogenesis through Dicerlike 1 protein functions II Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 101, pp. 12753-12758.

94. Landt S.G., Abeliuk E., McGrath P.T., Lesley J.A., McAdams H.H. and Shapiro L. (2008) Small non-coding RNAs in Caulobacter crescentus II Mol. Microbiol., 68, pp. 600-614.

95. Lapouge K., Schubert M., Allain F.H. and Haas D. (2008) Gac/Rsm signal transduction pathway of gamma-proteobacteria: From RNA recognition to regulation of social behaviour // Mol. Microbiol., 61, pp. 241-253.

96. Lee R.C., Feinbaum R.L. and Ambros V. (1993) The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 II Cell, 75 (5), pp. 843-854.

97. Lee Y., Ahn C„ Han J., Choi H., Kim J., Yim J., Lee J., Provost P., Radmark O., Kim S. and Kim V.N. (2003) The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing // Nature, 425 (6956), pp. 415-419.

98. Li L.C., Okino S.T., Zhao H., Pookot D., Place R.F., Urakami S., Enokida H. and Dahiya R. (2006) Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 (46), pp. 17337-17342.

99. Li X., Hirano R., Tagami H. and Aiba H. (2006) Protein tagging at rare codons is caused by tmRNA action at the 3' end of nonstop mRNA generated in response to ribosome stalling // RNA, 12, pp. 248-255.

100. Lin H., Yin H., Beyret E., Findley S. and Deng W. (2008) The role of the piRNA pathway in stem cell self-renewal // Dev. Biology, 319 (2), doi:10.1016/j.ydbio.2008.05.048.

101. Lingel A, Simon B, Izaurralde E, Sattler M. (2003) Structure and nucleic-acid binding of the Drosophila Argonaute 2 PAZ domain // Nature, 426 (6965), pp. 465-469.

102. Liu X., Fortin K. and Mourelatos Z. (2008) MicroRNAs: biogenesis and molecular functions // Brain Pathol., 18 (1), pp. 113-121.

103. Livny J. and Waldor M.K. (2007). Identification of small RNAs in diverse bacterial species // Curr. Opin. Microbiol., 10, pp. 96-101.

104. Livny J., Teonadi H., Livny M. and Waldor M.K. (2008) High-throughput, kingdom-wide prediction and annotation of bacterial non-coding RNAs // PLoSONE, 3, e3197.

105. Lucchetti-Miganeh C., Burrowes E., Baysse C. and Ermel G. (2008) The post-transcriptional regulator CsrA plays a central role in the adaptation of bacterial pathogens to different stages of infection in animal hosts // Microbiology, 154, pp. 16-29.

106. Malone C.D. and Hannon G.J. (2009) Small RNAs as Guardians of the Genome // Cell, 136 (4), pp. 656-668.

107. Mandal M. and Breaker R.R. (2004) Gene regulation by riboswitches // Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5, pp. 451-463.

108. Maries-Wright J. and Lewis R.J. Stress responses of bacteria // Curr. Opin. Struct. Biol., 17 (6), pp. 755-760.

109. Marraffini L.A. and Sontheimer E.J. (2008) CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA // Science, 322 (5909), pp. 1843-1845.

110. Masse E. and Gottesman S. (2002) A small RNA regulates the expression of genes involved in iron metabolism in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 99 (7), pp. 4620-4625.

111. Maxam A.M. and Gilbert W. (1977) A new method of sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, pp. 560-564.

112. McClintock B. (1951) Chromosome organization and genie expression // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 16, pp. 13-47.

113. Mehta P., Richards J. and Karzai A.W. (2006) tmRNA determinants required for facilitating nonstop mRNA decay // RNA, 12, pp. 2187-2198.

114. Mizuno T., Chou M.Y. and Inouye M. (1984) A unique mechanism regulating gene expression: translational inhibition by a complementary RNA transcript (micRNA) // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, pp. 1966-1970.

115. Moll I., Leitsch D., Steinhauser T. and Bläsi U. (2003) RNA chaperone activity of the Sm-like Hfq protein // EMBO Reports, 4, pp. 284-289.

116. M0ller T., Franch T., H0ijup P., Keene D.R., Bächinger H.P., Brennan R.G. and ValentinHansen P. (2002) Hfq: a bacterial Sm-like protein that mediates RNA-RNA interaction // Mol. Cell, 9, pp. 23-30.

117. Montange R.K. and Batey R.T. (2008) Riboswitches: Emerging themes in RNA structure and function // Annu. Rev. Biophys., 37, pp. 117-133.

118. Moore S.D. and Sauer R.T. (2005) Ribosome rescue: tmRNA tagging activity and capacity in Escherichia coli II Molecular Microbiology, 58, pp. 456-466.

119. Morita T., Mochizuki Y. and Aiba H. (2006) Translational repression is sufficient for gene silencing by bacterial small noncoding RNAs in the absence of mRNA destruction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 103 (13), pp. 4858-4863.

120. Moxon S., Jing R., Szittya G., Schwach F., Rusholme Pilcher R.L., Moulton V. and Dalmay T. (2008) Deep sequencing of tomato short RNAs identifies microRNAs targeting genes involved in fruit ripening // Genome Res., 18 (10), pp. 1602-1609.

121. Nakamura K., Fujii Y., Shibata T., Yamane K. (1999) Depletion of Escherichia coli 4.5S RNA leads to an increase in the amount of protein elongation factor EF-G associated with ribosomes // European Journal of Biochemistry, 259, pp. 543-550.

122. Nakayashiki H., Kadotani N. and Mayama S. (2006) Evolution and diversification of RNA silencing proteins in fungi // J. Mol. Evol., 63 (1), pp. 127—135.

123. Napoli C., Lemieux C. and Jorgensen R. (1990). Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans // Plant Cell, 2 (4), pp. 279-289.

124. Nekrutenko A. and Li W.H. (2001) Transposable elements are found in a large number of human protein-coding genes // Trends Genet., 17(11), pp. 619-621.

125. Novick R.P. and Geisinger E. (2008) Quorum sensing in staphylococci // Annu. Rev. Genet., 42, pp. 541-564.

126. Nudler E. and Mironov A.S. (2004) The riboswitch control of bacterial metabolism // Trends Biochem. Sci., 29, pp. 11-17.

127. Obbard D., Jiggins F., Halligan D. and Little T. (2006) Natural selection drives extremely rapid evolution in antiviral RNAi genes // Curr. Biol., 16 (6), pp. 580-585.

128. O'Donnell K.A., Wentzel E.A., Zeller K.I., Dang C.V. and Mendell J.T. (2005) c-Myc-regulated microRNAs modulate E2F1 expression II Nature, 435 (7043), pp. 839-843.

129. O'Donnell K.A. and Boeke J.D. (2007) Mighty Piwis defend the germline against genome intruders, Cell, 129 (1), pp. 37-44.

130. Opdyke J.A., Kang J.G. and Storz G. (2004) GadY, a small-RNA regulator of acid response genes in Escherichia coli II J. Bacteriol., 186 (20), pp. 6698-6705.

131. Pak J. and Fire A. (2007). Distinct populations of primary and secondary effectors during RNAi in C. elegans II Science, 315 (5809), pp. 241-244.

132. Pardue M.L. and DeBaryshe P.G. (1999) Telomeres and telomerase: more than the end of the line // Chromosoma, 108 (2), pp. 73-82.

133. Pecota D.C., Osapay G., Selsted M.E. and Wood T.K. (2003) Antimicrobial properties of the Escherichia coli R1 plasmid host killing peptide // J. Biotechnol., 100 (1), pp. 1-12.

134. Pichon C. and Felden B. (2008) Small RNA gene identification and mRNA target predictions in bacteria // Bioinformatics, 24 (24), pp. 2807-2813.

135. Plath K., Mlynarczyk-Evans S., Nusinow D.A. and Panning B. (2002) Xist RNA and the mechanism ofX chromosome inactivation //Annu. Rev. Genet., 36, pp. 233-278.

136. Pourcel C., Salvignol G. and Vergnaud G. (2005) CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies // Microbiology, 151, pp. 653-663.

137. Preall J.B., He Z., Gorra J.M. and Sontheimer E.J. (2006) Short interfering RNA strand selection is independent of dsRNA processing polarity during RNAi in Drosophila // Curr. Biol., 16 (5), pp. 530-535.

138. Pruss G.J. and Drlica K. (1989) DNA supercoiling and prokaryotic transcription // Cell, 56, pp. 521-523.

139. Rivas E., Klein R.J., Jones T.A. and Eddy S.R. (2001) Computational identification of noncoding RNAs in E.coli by comparative genomics // Current Biology, 11, pp. 13691373.

140. Robinson K., McGuire A.M., Church G.M. (1998) A comprehensive library of DNA-binding site matrices for 55 proteins applied to the complete Escherichia coli K-12 genome II J. Mol. Biol., 284, pp. 241-254.

141. Romano N. and Macino G. (1992). Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences // Mol. Microbiol., 6 (22), pp. 3343-3353.

142. Ross W., Gosink K.K., Salomon J., Igarashi K., Zou C., Ishihama A., Severinov K. and Gourse R.L. (1993) A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the alpha subunit of RNA polymerase II Science, 262, pp. 1407-1413.

143. Rougeulle C. and Heard E. (2002) Antisense RNA in imprinting: spreading silence through air II Trends Genet., 18, pp. 434-437.

144. Ruby J.G., Jan C., Player C., Axtell M.J., Lee W., Nusbaum C., Ge Hi and Bartel D.P. (2006) Large-scale sequencing reveals 21U-RNAs and additional microRNAs and endogenous siRNAs in C. elegans II127 (6), pp. 1193-1207.

145. Saetrom P., Sneve R., Kristiansen K.I., Snove Jr.O., Grunfeld T., Rognes T. and Seeberg E. (2005) Predicting non-coding RNA genes in Escherichia coli with boosted genetic programming //Nucl. Acids Res., 33, pp. 3263-3270.

146. Saraiya A.A. and Wang C.C. (2008) snoRNA, a novel precursor of microRNA in Giardia lamblia IIPLoSPathog., 4 (11), el000224.

147. Seila A.C., Calabrese J.M., Levine S.S., Yeo G.W., Rahl P.B., Flynn R.A., Young R.A. and Sharp P.A. (2008) Divergent transcription from active promoters // Science, 322, pp. 18491851.

148. Selinger D.W., Saxena R.M., Cheung K.J., Church G.M. and Rosenow C. (2003) Global RNA half-life analysis in E.coli reveals positional patterns of transcript degradation // Genome Research, 13, pp. 216-223.

149. Sen G.L., Wehrman T.S. and Blau H.M. (2005) mRNA translation is not a prerequisite for small interfering RNA-mediated mRNA cleavage // Differentiation, 73 (6), pp. 287-293.

150. Seto A.G., Kingston R.E. and Lau N.C. (2007) The coming of age for Piwi proteins // Molecular Cell, 26 (5), pp. 603-609.

151. Sharma C.M., Darfeuille F., Plantinga T.H. and Vogel J. (2007) A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites // Genes Dev., 21 (21), pp. 2804-2817.

152. Shimada T., Fujita N., Maeda M. and Ishihama A. (2005) Systematic search for the Cra-binding promoters using genomic SELEX system // Genes to Cells, 10, pp. 907-918.

153. Simons R.W. and Kleckner N. (1983) Translational control of IS10 transposition // Cell, 34, pp. 683-691.

154. Skorski T., Perrotti D., Nieborowska-Skorska M., Gryaznov S. and Calabretta B. (1997) Antileukemia effect of c-myc N3'->P5' phosphoramidate antisense oligonucleotides in vivo HProc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, pp. 3966-3971.

155. Slotkin R.K. and Martienssen R. (2007) Transposable elements and the epigenetic regulation of the genome // Nat. Rev. Genet., 8 (4), pp. 272-285.

156. Soper T.J. and Woodson S.A. (2008) The rpoS mRNA leader recruits Hfq to facilitate annealing with DsrA sRNA. RNA, 14(9): 1907-1917.

157. Sorek R., Kunin V. and Hugenholtz P. (2008) CRISPR a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea // Nat. Rev. Microbiol., 6, pp. 181-186.

158. Stark A., Bushati N., Jan C.H., Kheradpour P., Hodges E., Brennecke J., Bartel D.P., Cohen S.M. and Kellis M. (2008) A single Hox locus in Drosophila produces functional microRNAs from opposite DNA strands // Genes Dev., 22 (1), pp. 8-13.

159. Storz G. (2002) An expanding universe of noncoding RNAs I I Science, 296, pp. 12601263.

160. Storz G., Opdyke J.A. and Zhang A. (2004) Controlling mRNA stability and translation with small, noncoding RNAs // Current Opinion in Microbiology, 7. pp. 140-144.

161. Sun X., Zhulin I. and Wartell R.M. (2002) Predicted structure and phyletic distribution of the RNA-binding protein Hfq // Nucl. Acids Res., 30, pp. 3662-3671.

162. Takada K., Hanawa K., Lee S.G., Himeno H. and Muto A. (2002) The structure and function of tmRNA // Nucleic Acids Symp., 2, pp. 65-66.

163. Tan Y., Zhang B., Wu T., Skogerb0 G., Zhu X., Guo X., He S. and Chen R. (2009) Transcriptional inhibiton of Hoxd4 expression by miRNA-lOa in human breast cancer cells UBMCMol. Biol., 10, doi:10.1186/1471-2199-10-12.

164. Tjaden B., Saxena R.M., Stolyar S., Haynor D.R., Kolker E. and Rosenow C. (2002) Transcriptome analysis of Escherichia coli using high-density oligonucleotide probe assays // Nucl. Acids Res., 30 (17), pp. 3732-3738.

165. Tjaden B., Goodwin S.S., Opdyke J.A., Guillier M., Fu D.X., Gottesman S. and Storz G. (2006) Target prediction for small, noncoding RNAs in bacteria // Nucleic Acids Res., 34 (9), pp. 2791-2802.

166. Tjaden B. (2008) TargetRNA: a tool for predicting targets of small RNA action in bacteria 11 Nucl. Acids Res., 36 (Web Server issue), W109-W113, doi:10.1093/nar/gkn264.

167. Tomizawa J., Itoh T., Selzer G. and Som T. (1981). Inhibition of ColEl RNA primer formation by a plasmid-specifed small RNA // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, pp. 14211425.

168. Trotochaud A.E. and Wassarman K.M. (2005) A highly conserved 6S RNA structure is required for regulation of transcription // Nat. Struct. Mol. Biol., 12, pp. 313-319.

169. Tsai H.Y., Masquida B„ Biswas R., Westhof E. and Gopalan V. (2003) Molecular modeling of the three-dimensional structure of the bacterial RNase P holoenzyme // J. Mol. Biol., 325 (4), pp. 661-675.

170. Tsui H.C., Leung H.C. and Winkler M.E. (1994). Characterization of broadly pleiotropic phenotypes caused by an hfq insertion mutation in Escherichia coli K-12 // Molecular microbiology, 13 (1), pp. 35—49.

171. Tuschl T., Zamore P.D., Lehmann R., Bartel D.P. and Sharp P.A. (1999) Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro II Genes Dev., 13 (24), pp. 3191-3197.

172. Tuschl T. (2003) Functional genomics: RNA sets the standard II Nature, 421, pp. 220-221.

173. Unoson C. and Wagner E.G. (2008) A small SOS-induced toxin is targeted against the inner membrane in Escherichia coli II Mol. Microbiol., 70 (1), pp. 258-270.

174. Updegrove T., Wilf N., Sun X. and Warteil R.M. (2008) Effect of Hfq on RprA-rpoS mRNA pairing: Hfq-RNA binding and the influence of the 5' rpoS mRNA leader region // Biochemistry, 47 (43), pp. 11184-11195.

175. Urban J.H. and Vogel J. (2008) Two seemingly homologous noncoding RNAs act hierarchically to activate glmS mRNA translation II PLoSBiol., 6 (3), e64.

176. Vecerek B., Moll I. and Bläsi U. (2007) Control of Fur synthesis by the non-coding RNA RyhB and iron-responsive decoding // EMBO J., 26 (4), pp. 965-975.

177. Venkova-Canova T., Srivastava P. and Chattoraj D.K. (2006) Transcriptional inactivation of a regulatory site for replication of Vibrio cholerae chromosome II // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 103 (32), pp. 12051-12056.

178. Vogel J. and Wagner E.G. (2007) Target identification of small noncoding RNAs in bacteria// Curr. Opin. Microbiol, 10 (3), pp. 262-270.

179. Volpe T.A., Kidner C., Hall I.M., Teng G., Grewal S.I. and Martienssen R.A. (2002) Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi // Science, 297, pp. 1833-1837.

180. Wagner E.G. and Flärdh K. (2002) Antisense RNAs everywhere? // Trends Genet., 18 (5), pp. 223-226.

181. Wang X.J., Reyes J.L., Chua N.H. and Gaasterland T. (2004) Prediction and identification of Arabidopsis thaliana microRNAs and their mRNA targets // Genome Biol, 5 (9), R65.

182. Wang H. and Benham C.J. (2006) Promoter prediction and annotation of microbial genomes based on DNA sequence and structural responses to superhelical stress // BMC Bioinformatics, 7, pp. 248-263.

183. Wassarman K.M., Zhang A. and Storz G. (1999) Small RNAs in Escherichia coli H Trends Microbiol., 1, pp. 37-45.

184. Wassarman K.M. and Storz G. (2000) 6S RNA regulates E. coli RNA polymerase activity II Cell, 101, pp. 613-623.

185. Wassarman K.M., Repoila F., Rosenow C., Storz G. and Gottesman S. (2001) Identification of novel small RNAs using comparative genomics and microarrays // Genes and Development, 15, pp. 1637-1651.

186. Wassarman K.M. and Saecker R.M. (2006) Synthesis-mediated release of a small RNA inhibitor of RNA polymerase II Science, 314, pp. 1601-1603.

187. Waters L.S. and Storz G. (2009) Regulatory RNAs in bacteria // Cell, 136, pp. 615-628.

188. Werner A., Carlile M. and Swan D. (2009) What do natural antisense transcripts regulate? //RNA Biol., 6 (1), pp. 43-48.

189. Wickstrom E. (1986) Oligodeoxynucleotide stability in subcellular extracts and culture media II J. Biochem. Biophys. Methods, 13, pp. 97-102.

190. Windbichler N., von Pelchrzim F., Mayer O., Csaszar E. and Schroeder R. (2008) Isolation of small RNA-binding proteins from E. coli: evidence for frequent interaction of RNAs with RNA polymerase // RNA Biol., 5 (1), pp. 30-40.

191. Yeom K.H., Lee Y., Han J., Suh M.R. and Kim V.N. (2006) Characterization of DGCR8/Pasha, the essential cofactor for Drosha in primary miRNA processing // Nucl. Acids Res., 34 (16), pp. 4622-4629.

192. Zaychikov E., Denissova L., Meier Т., Gotte M. and Heumann H. (1997) Influence of Mg2+ and Temperature on Formation of the Transcription Bubble // J. Biol. Chem., 272, pp. 2259-2267.

193. Zeng, Y. and Cullen, B.R. (2005) Efficient processing of primary microRNA hairpins by Drosha requires flanking non-structured RNA sequences // J. Biol. Chem., 280, pp. 2759527603.

194. Zhang A., Wassarman K.M., Ortega J., Steven A.C. and Storz G. (2002) The Sm-like Hfq protein increases OxyS RNA interaction with target mRNAs // Mol. Cell, 9, pp. 11-22.

195. Zhang A., Wassarman K., Rosenow C., Tjaden B.C., Storz G. and Gottesman S. (2003) Global analysis of small RNA and mRNA targets of Hfq // Molecular Microbiology, 50, pp. 1111-1124.

196. Zwieb C., Wower I. and Wower J. (1999) Comparative sequence analysis of tmRNA // Nucl. Acids Res., 27, pp. 2063-2071.

197. Григорович С. (2003) Малые РНК в большой науке // Научная Сеть.

198. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование // Москва, «Мир», с. 479.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Шавкунов, Константин Сергеевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Анализ функциональной активности внутригенных промоторов E. coli с потенциальной возможностью инициировать транскрипцию, сонаправленную с синтезом мРНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы