Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ аллельных вариантов Waxy-генов и межмикросателлитных маркеров сортов Triticum aestivum L. Среднего и Южного Урала

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ аллельных вариантов Waxy-генов и межмикросателлитных маркеров сортов Triticum aestivum L. Среднего и Южного Урала"

На правах рукописи

БОБОШИНА ИРИНА ВИКТОРОВНА

АНАЛИЗ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ^ЛАТ-ГЕНОВ И МЕЖМИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ СОРТОВ ТШПСиМ АЕБТПЪМ Ь. СРЕДНЕГО И ЮЖНОГО УРАЛА

03.02.07 — генетика

005536652

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

31 (Ж Г 2013

Уфа-2013

005536652

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пермский государственный национальный исследовательский университет (ПГНИУ)

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Боронникова Светлана Витальевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Горбунова Валентина Юрьевна ФГБОУ ВПО Башкирский государственный педагогический университет им. М. Акмуллы, профессор кафедры генетики

доктор биологических наук, профессор

Нецветаев Владимир Павлович

ГНУ Белгородский научно-исследовательский институт

сельского хозяйства РАСХН,

заведующий лабораторией селекции и семеноводства пшеницы

Ведущее учреждение: ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный

университет - МСХА имени К.А.Тимирязева

Защита состоится <3.4 ноября 2013 г. в часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71, с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru

e-mail: moIgen@anrb.ru

Автореферат разослан с2-f октября 2013 г.

Ученый секретарь ^____ /)

диссертационного совета, к.б.н. Бикбулатова С.М.

Актуальность темы. Пшеница мягкая (ТгШсит аезИтт Ь.), под посевами которой занято 216 млн. га, является основной зерновой культурой для 35% населения земного шара (УаэИ, 2007). Возможность улучшения хозяйственно ценных признаков при внутривидовых (межсортовых) скрещиваниях в настоящее время ограничивается тем, что в существующих селекционных программах используются наборы одних и тех же основных элитных сортов (Абугалиева и др., 2012). По этой причине актуальным является исследование генетического разнообразия сортов Т. ае$11уит — задачи, важной для совершенствования селекционной работы за счет использования всего генетического потенциала вида (ЗоГаНап е1 а1., 2009). Для изучения и мониторинга внутривидового генетического разнообразия, как в разных географических регионах, так и в коллекциях, сохраняющих генофонд вида, а также для выявления подлинности сортов и их родословных, все более важной проблемой становится регистрация сорта, его сертификация и защита авторских прав селекционеров (гЬи е! а1., 2011; Новосельская-Драгович и др., 2013).

Молекулярное маркирование сортов пшеницы мягкой в настоящее время осуществляется с использованием различных подходов, среди которых использование мультилокусных ДНК-маркеров (РаБциа1опе е1 а1., 2000; Салина и др., 2008; Tagizad а1., 2010; МПаё е1 а1., 2011; АЬоияес!, 2011; Рипс1а, АЬи, 2013; МкгоГапоуа й а1., 2013) и идентификация аллельных вариантов генов, контролирующих хозяйственно важные признаки (Ыакашига е1 а1., 2002; УапгеШ et а1., 2009; Бако е! а1., 2010; Климушина и др., 2012; Потокина и др., 2012; Абдулина и др., 2013; Чеботарь и др., 2013). Однако анализ аллельных вариантов генов \Ух и межмикросателлитных маркеров сортов пшеницы мягкой, используемых в таких регионах рискованного земледелия Среднего и Южного Урала как Пермский край и Республика Башкортостан, климат которых характеризуется холодной продолжительной и снежной зимой, теплым коротким летом и ярко выраженными температурными инверсиями (Назаров, 2006; Давлетшин, Атнагулов, 2010), ранее не проводился.

Цель исследований - анализ генетического разнообразия, выявление межмикросателлитных маркеров и аллельных вариантов 1¥аху-генов у 41 сорта Т. аеййуит, допущенных к использованию, снятых с испытания и проходящих сортоиспытания в Пермском крае и в Республике Башкортостан.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

3

1) провести анализ полиморфизма межмикросателлитных (ISSR - Inter Simple Sequence Repeats) маркеров у 41 сорта Т. aestivum;

2) определить генетические расстояния между изученными сортами Т. aestivum и их сходство на основании данных межмикросателлитного анализа;

3) выявить полиморфные ISSR-маркеры, их сочетания или сортоспецифичные ISSR-маркеры для каждого сорта Т. aestivum;

4) изучить у 41 сорта Т. aestivum- аллельные варианты генов Waxy, кодирующих гранул-связанную синтазу крахмала и детерминирующих содержание амилозы в зерновке, оценить возможность их использования для ранжирования изучаемых сортов по содержанию амилозы в эндосперме зерновки;

5) определить коэффициенты генетической оригинальности (КТО) используемых сортов Т. aestivum-,

6) разработать подход и провести молекулярно-генетическую идентификацию изучаемых сортов Т. aestivum с использованием ISSR-маркеров и маркеров к генам Waxy.

Научная новизна работы. Проведен молекулярно-генетический анализ 41 сорта Т. aestivum, допущенных к использованию, снятых с испытания и проходящих сортоиспытание в Пермском крае и в Республике Башкортостан; дана оценка генетического сходства сортов пшеницы мягкой с использованием полиморфизма межмикросателлитных маркеров. Получены и систематизированы данные о генетическом разнообразии 41 сорта Т. aestivum, используемых в Пермском крае и в Республике Башкортостан, по аллельным вариантам Waxy-генов, детерминирующих содержание амилозы в зерновке. У трех сортов выявлен полиморфизм по функциональным аллелям гена Wx-Bl. Установлены коэффициенты генетической оригинальности изученных сортов. Впервые разработаны подходы и проведена идентификация 41 сорта Т. aestivum, используемых в Пермском крае и Республике Башкортостан, на основе двух типов молекулярных маркеров - ISSR-маркеров и маркеров к генам Waxy. Полученные результаты наглядно представлены в молекулярно-генетической формуле изученных сортов.

Практическая значимость диссертационной работы заключается в оценке генетического разнообразия 41 сорта Т. aestivum на основании надежной и недорогой методики анализа полиморфизма ISSR-маркеров и распределения аллельных вариантов Waxy-генов, детерминирующих содержание амилозы в

4

зерновке. В зависимости от специфики генетического разнообразия сорта предложены три подхода молекулярно-генетической идентификации изученных сортов. Результаты исследований и практические рекомендации диссертации предлагаются для использования Министерством сельского хозяйства РФ, научными учреждениями, селекционными станциями, высшими учебными заведениям, для разработки программ селекции сортов Т. аев^уит, для генетической идентификации сортов пшеницы мягкой с целью защиты авторских прав селекционеров, включая сертификацию и регистрацию сортов. Информация о степени генетического сходства сортов, полученная по данным межмикросателлитного анализа, облегчит подбор родительских пар при гибридизации с целью получения максимального спектра изменчивости в гибридном потомстве, что позволит повысить эффективность селекционного процесса. Результаты исследований могут быть использованы для оптимизации методов сортовой идентификации и селекции сортов с высокими технологическими свойствами зерна и хорошими хлебопекарными свойствами муки. Результаты работы внедрены в учебный процесс ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» и ФГБОУ ВПО «Пермская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н. Прянишникова», что подтверждено 2 актами внедрения.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена при частичной финансовой поддержке Аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (2010-2011 гг.), НИР «Оценка состояния генофондов и популяционных систем ресурсных видов растений при естественных колебаниях и антропогенной трансформации среды с использованием новых геномных и биоинформационных технологий» государственного задания на оказание услуг Министерства образования и науки РФ (2012-2014 гг.), программы развития ПГНИУ как национального исследовательского университета «Рациональное природопользование: технологии прогнозирования и управления природными и социально-экономическими системами» (2010-2019 гг.).

Личный вклад автора. Автором лично проведены выбор молекулярных маркеров и методов молекулярно-генетического анализа, сбор материала, лабораторные исследования, выполнена обработка, анализ, обобщение и интерпретация результатов, сопоставление их с литературными данными,

5

написание и оформление диссертационной работы. Подготовка публикаций выполнена лично или при активном участии автора.

Апробация работы. Основные результаты и положения работы были представлены и обсуждались на 15 научных и научно-практических конференциях, в их числе 8 международных: «ЕС - Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи» (Уфа, 2010); «Антропогенная трансформация природной среды» (Пермь, 2010); «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Росгов-на-Дону, 2011); «Актуальные проблемы ботаники и экологии» (Киев, 2011); «Биология растений и биотехнология» (Белая Церковь, Украина, 2011); «Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование» (Пермь, 2011); «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва-Звенигород, 2011); «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013); 4 Всероссийских конференциях: «Fundamental Medicine: From Scalpel Toward Genome, Proteome and Lipidome» (Kazan, 2011); «Актуальные проблемы генетики человека, растений и микроорганизмов» (Уфа, 2012); «Актуальность наследия Н.И.Вавилова для развитая биологических и сельскохозяйственных наук» (С.-Петербург, 2012); ««Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии» в рамках фестиваля науки» (Уфа, 2012); 3 Всероссийских с международным участием: «Симбиоз-Россия 2011» (Воронеж, 2011); «Симбиоз-Россия 2012» (Тверь, 2012); «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых журналах из перечня ВАК и 16 публикаций в других журналах и материалах конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 8 рисунков. Список литературы включает 263 источника, в том числе 115 на иностранных языках.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность за семена сортов пшеницы мягкой сотрудникам ГНУ «Пермский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» РАСХН (г. Пермь), Ординского и Березовского ГСУ Пермского края, Абзелиловского и Давлекановского ГСУ Республики Башкортостан и ГНУ «Башкирский научно-исследовательский институт сельского

6

хозяйства» (г. Уфа), к.с-х.н., заведующему лабораторией озимых культур Н.И. Лещенко и заведующему лабораторией яровых культур к.с.-х.н. В.И. Никонову Чишминского селекционного центра БНИИСХ; за информацию по характеристикам сортов - сотруднику Ординского ГСУ Пермского края Т.А. Федосеевой, заведующему отделом селекции ГНУ «Ульяновский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» В.Г. Захарову и научному сотруднику лаборатории селекции яровой пшеницы ГНУ «Воронежский научно-исследовательский институт сельского хозяйства имени В.В. Докучаева» РАСХН А.А. Хорину. Искренняя благодарность за поддержку выражается коллегам по лаборатории.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

Приведено ботаническое описание объекта исследования - Triticum aestivum L. (Флора СССР, 1934; Фляксбергер, 1935; Жуковский, 1971; Тахтаджян, 1987; Дорофеев и др., 1987; Амосова, Бадаева, 2008); рассмотрены вопросы молекулярно-генетического анализа и генетического картирования Т. aestivum (Zietkiewicz et al., 1994; Nakamura et al., 2002; Беккужина, Кочиева, 2005, 2008; Пшеничникова и др., 2006, 2008; Вдовиченко, Глазко, 2007; Петрова и др., 2007; Sofalian et al., 2009; Vanzetti et al., 2009; Saito et al., 2010; Milec et al., 2011; Shcherban et al., 2011; Климушина и др., 2012; Нецветаев и др., 2012; Brenchley et al., 2012; Абдулина и др., 2013). Особое внимание уделено исследованиям по сортовой идентификации Т. aestivum (Созинов, 1985; Chen et al., 1994; Kim, Ward, 2000; Малышев и др., 2006; Кудрявцев, 2007; Панин, 2011а; Панин, 20116).

Регионы и объекты исследований

В качестве объектов исследований избраны сорта пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.), допущенные к использованию, снятые с испытания и проходящие сортоиспытания (табл. 1) в Пермском крае и в Республике Башкортостан, входящих в состав Приволжского федерального округа. Пермский край расположен на западном склоне Уральских гор, в бассейне верхней и средней Камы. Республика Башкортостан занимает большую часть Южного Урала и

прилегающие к нему равнины Башкирского Предуралья и возвышенно-равнинную полосу Башкирского Зауралья.

Таблица 1

Исследованные сорта Т. аехймит

№ п/п Сорт № в Госреестре / год включения Регион допуска

1 Московская 39 9501070/1999 2,3,4,5,7,9

2 Волжская К 9907408/2004 2,3,4,5,7,9,10

3 Иргина 8800359 /1991 1,2,4

4 Ирень 9601678 /1998 1,2,3, 4,9,10,11

5 Стрела исключен -

6 Красноуфимская 100 9908498/2003 2,4,10

7 Свеча 9610100/2006 1,4

8 Горноуральская 9359827/2009 4,10

9 Терция 9300473/1995 9,10,11

10 Экада 70 9553774/2007 4,7,9

11 Экада 109 8953944 / 2013 4, 5, 7, 9

12 Штру 06 на испытании -

13 Штру 05 на испытании -

14 Икар 9900772/2001 4,10

15 Баженка 9154791/2011 4

16 Гамлет на испытании -

17 Диаблон на испытании -

18 Терси на испытании -

19 Уралосибирская 9052749/2012 9,10,11

20 Ярица на испытании -

21 Красноуфимская 110 на испытании -

22 Башкирская 4 исключен -

23 Башкирская 26 9905570/2004 9

24 Башкирская 28 9253353/2010 9

25 Жница исключен -

26 Фотос (линия 40959) исключен -

27 Башкирская 10 9252106/2010 4,9

28 Башкирская 9 исключен • -

29 Лютесценс 9 9003320 /1993 9

30 Сертори на испытании -

31 Черноземноуральская 2 9052688/2013 5

32 Сурская Юбилейная на испытании -

33 Башкирская 24 исключен 9

34 Салават Юлаев 9464124/2008 9

35 Ватан 9253739/2010 9

36 Тулайковская Золотистая 9811632/2006 7,8,9

37 Тулайковская 10 9908226 / 2003 3, 4, 5, 7, 9

Окончание таблицы 1

№ п/п Сорт № в Госреестре / год включения Регион допуска

38 Тюменская 31 на испытании —

39 Ульяновская 100 9052790/2012 7,9

40 ЦХ Кампала на испытании -

41 Сударыня 9052538/2012 2,3,4

Примечание: регионы допуска обозначены в соответствии с Государственным реестром селекционных достижений Российской Федерации. Жирным шрифтом выделены: 4 — Волго-Вятский регион, к которому относится Пермский край, 9 - Уральский регион, к которому относится Республика Башкортостан (Государственный реестр..., 2013).

С 2009 по 2013 годы были проведены исследования 41 сорта Т. aestivum категорий «элита» и «суперэлита», семена которых были получены из ГНУ «Пермский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» РАСХН (г. Пермь), Ординского и Березовского ГСУ Пермского края, Абзелиловского и Давлекановского ГСУ Республики Башкортостан, ГНУ «Башкирский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» (БНИИСХ, г. Уфа) и Чишминского селекционного центра БНИИСХ. Выбор сортов Т. aestivum в качестве объектов исследований из двух субъектов Российской Федерации обоснован возможностью изучения используемых сортов в одном долготном меридиане на протяжении около 1000 км, что предполагает высокое генетическое разнообразие сортов и их адаптацию к различным условиям окружающей среды. Исследования проведены в молекулярно-генетической лаборатории кафедры ботаники и генетики растений биологического факультета и в НИЛ «Молекулярной биологии и генетики» ЕНИ ПГНИУ.

Методы исследований

Для выделения ДНК и проведения молекулярно-генетического анализа, семена сортов Т. aestivum были пророщены в лабораторных условиях (ГОСТ 12038-84). Выделение ДНК из проростков проведено по методике А. Торрес и др. (Torres et al., 1993) с небольшими модификациями. Материал для молекулярно-генетического анализа взят в нескольких повторностях для верификации полученных данных. У каждого изучаемого сорта проанализировано не менее 105 проростков в течение 3-х лет (2010-2012 гг.). Концентрация и спектральная

характеристика ДНК определены на приборе SpectrofotometrTM NanoDrop 2000 («Thermo scientific», США). Для ПЦР-анализа была использована геномная ДНК с концентрацией 10 нг/мкл в ТЕ-буфере. Молекулярно-генетический анализ проведен с использованием ISSR (Inter-Simple-Sequence-Repeats)-MeTOfla (Zietkiewicz et al., 1994). Амплификация ДНК проведена с использованием реакционной смеси типичного для ISSR-метода состава в термоциклерах Gene Amp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США) и MyCycIer («BioRad», США) по стандартной для межмикросателлитного анализа программе (Молекулярная генетика..., 2007). Эффективность выявления полиморфизма ISSR-праймеров рассчитана в соответствии со шкалой 1-5 (Календарь, Боронникова, 2007). Протестированы 23 ISSR-праймера, из которых были отобраны для дальнейшего анализа 5: Ml (AC)8CG, МЗ (АС)8СТ, М27 (GA)8C, Х10 (AGC)6C, XI1 (AGC)6G. При проведении ПЦР температура отжига в зависимости от G/C состава праймеров варьировала от 46°С до 56°С. В качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь вместо ДНК добавлено 5 мкл деионизированной воды. Продукты амплификации разделены электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в 1 X TBE буфере, окрашены бромистым этидием и сфотографированы в проходящем ультрафиолетовом свете в системе гель-документации Gel Doc XR («Bio-Rad», США). Для определения размеров амплифицированных фрагментов использованы маркер дайны фрагментов ДНК (100 bp +1.5 + 3 Kb DNA Ladder, ООО «СибЭнзим-М», Москва) и программа Quantity One («Bio-Rad», США). Для проверки достоверности полученных результатов ПЦР повторены не менее четырех раз. Компьютерный анализ полиморфизма ДНК проведен с помощью общепринятых компьютерных программ (Yeh et al., 1999) с определением доли полиморфных локусов (Williams et al., 1990) при P9¡, абсолютного (n„) и эффективного (ле) числа аллелей (Kimura et al., 1964), ожидаемой гетерозиготности (НЕ) (Nei, 1987). Генетическое расстояние между сортами (£>) определено по формуле М. Нея (Nei, Li, 1979). На основе матриц бинарных признаков были рассчитаны матрицы генетических различий (Nei, 1972). Далее на основании полученной матрицы невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA - unweighed pair-grup method using arithmetic average) при помощи компьютерных программ Treecon 1.3b и POPGENE 1.32 были построены дендрограммы, отражающие степень сходства исследуемых сортов по ISSR-спектрам.

Для молекулярно-генетического анализа содержания амилозы в зерновке пшеницы мягкой избраны три гомеологичных гена Waxy, которые расположены (Chao et al., 1989) в хромосомах 7AS (Wx-Al), 4AL {Wx-Bl) и 7DS (Wx-Dl). Данные гены определяют соотношение амилоза/амилопектин в пшеничном крахмале, что имеет большое значение для технологических свойств крахмала и муки, производимой из зерновок пшеницы мягкой. Для детекции аллельных вариантов Waxy генов амплификация проведена в термоциклерах Ашр PCR System 9700 («Applied Biosystems», США) и MyCycler («BioRad», США) по программам, рекомендованным разработчиками праймеров (Vrinten et al., 1999; Nakamura et al., 2002; Vanzetti et al., 2009). Для идентификации аллельных вариантов Wx генов Т. aestivum и верификации полученных результатов были использованы по две пары праймеров к каждому гену (табл. 2).

Таблица 2

Праймеры для идентификации аллелей Waxy-генов Т. aestivum

Гены Wx Праймеры Последовательности праймеров

Wx-Al AFC AR2 5' -TCGTGTTCGTCGGCGCCG AG ATGG-3' 5'-CCGCGCTTGTAGCAGTGGAAGTACC-3'

Wx-Al b-F-MH Wx-Al b-R-MH 5 '-CCCCA AAGC AA AGCAGGA A AC-3' 5 '-CGGCGTCGGGTCC ATAGATC-3'

Wx-Bl BDFL BRD 5 '-CTGGCCTGCTACCTCA AGAGCAACT-3' 5'-CTGACGTCCATGCCGTTGACGA-3'

Wx-Bl L Wx-Bl R 5 '-CGCAGGGGAAGACGTGGT-3' 5' -CGTTGACGATGCCGGTG ATG-3'

Wx-Dl Wx-Dl-l-F Wx-Dl-1-R 5 '-TAGTGCGTCCAGACTCAC AG-3' 5'-GAGATGGTCAAGAACTGCAT-3'

BDFL DRSL 5' -CTGGCCTGCTACCTCA AGAGCAACT-3' 5'-CTGTTTCACCATGATCGCTCCCCTT-3'

Для детекции аллелей генов Waxy реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 1 х буфер для Тад-ДНК-полимеразы («Силекс», Россия), 1,0 и Тад-ДНК-полимеразы («Силекс», Россия), 200 цМ каждого dNTP («Силекс», Россия), 0,2 цМ каждого праймера и 5 мкл ДНК. Концентрация хлорида магния составляла 2,5 мМ. В качестве внутреннего положительного контроля при выявлении аллелей генов Wx был использован сорт Экада 109, который по состоянию аллельных вариантов №аху-генов ранее был изучен И.Р. Абдулиной и другими (Абдулина и др., 2013). Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2-3%-ном агарозном геле в 1 х ТВЕ-буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в

проходящем ультрафиолетовом свете в системе гель-документации Gel Doc XR («BioRad», США). В качестве маркеров длины фрагментов ДНК использованы маркеры «100 bp + 50 bp DNA Ladder» (ООО «СибЭнзим-М», Россия) и «100 bp GeneRuler» («Fermentas», Литва).

Молекулярно-генетическая идентификация сортов T. aestivum проведена на основании технологии, предложенной C.B. Боронниковой (2008), с учетом полиморфизма ISSR-маркеров и дополнением для сортов Т. aestivum аллельного полиморфизма генов Waxy. Проверка всех выявленных идентификационных молекулярных маркеров у исследованных сортов проведена не менее трех раз. Выявление специфичности ISSR-маркеров сортов Т. aestivum проведено с использованием коэффициента генетической оригинальности - КГО (Потокина, Александрова, 2008). Статистическая обработка данных молекулярно-генетического анализа проведена с использованием стандартных для генетических исследований программ (Yeh et al., 1999) и методов (Животовский, 1991).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ генетического разнообразия сортов Т. aestivum с использованием

ISSR-маркеров

При молекулярно-генетическом анализе 41 сорта Т. aestivum, используемых в Пермском крае и в Республике Башкортостан, выявлен 71 ISSR-маркер. Число амплифицированных фрагментов ДНК варьировало в зависимости от праймера от 11 (праймер XII) до 18 (праймер Х10), а их размеры изменялись от 170 п.н. до 1370 п.н. В среднем при ISSR-анализе полиморфизма ДНК сортов Т. aestivum один праймер инициировал синтез 14,2 фрагментов ДНК (рис. 1).

800 700 600 500 400

Рис. 1. Фрагмент ISSR-спектра сорта Башкирская 4 с праймером Ml; цифрами обозначены номера проб ДНК, M - маркер длины фрагментов ДНК

Доля полиморфных локусов (Р95) у изученных сортов, определенная в результате ПЦР с пятью ISSR-праймерами, в среднем составила 0,873. Абсолютное число аллелей (па) составило 1,001, а эффективное число аллелей (л,.)

равно 1,000. Генетическое расстояние (Л) между изученными сортами Т. аевй-тт варьировало от 0,043 (между сортами Башкирская 24 и Сертори, Икар и Баженка, Ирень и Красноуфимская 100) до 0,736 (между сортами Тулайковская 10 и Красноуфимская 100). Сходство по КБЯ-спектрам изученных сортов Т. аезНуит демонстрирует дендрограмма (рис. 2), которая выявила разделение 41 сорта пшеницы мягкой на шесть основных кластеров. Межсортовые группировки каждой клады поддерживались высокими значениями бутстрепа (от 53 до 98%).

ал 0.2 о;1

-4-1-Щ-

цифрами указаны значения бутстрепа в %

Изученные сорта характеризуются высоким межсортовым полиморфизмом, что объясняется, отчасти, использованием их в 10 из 12 регионах допуска,

выделенных в соответствии с Государственным реестром селекционных достижений РФ (2013). Если в первой (I) и четвертой (VI) подгруппах превалируют сорта, используемые в Пермском крае, а в третьей (III), пятой (V) и шестой (VI) - сорта, используемые в Республике Башкортостан, то вторая подгруппа (II) объединила сорта, используемые и проходящие сортоиспытание в обоих регионах.

Распределение аллельных вариантов Waxy генов у изученных сортов

Т. aestivum

Ген Wx-Al. Для идентификации гена Wx-Al и верификации полученных результатов были использованы две пары праймеров (табл. 2). При использовании в ПЦР праймеров AFC и AR2 при наличии аллеля дикого типа амплифицируются фрагменты размером 389 п.н. (Wx-Ala), а при наличии нуль-аллеля - 370 п.н. (Wx-Alb). При применении этих праймеров у изученных нами сортов Т. aestivum идентифицирован аллель Wx-Ala (рис. 3).

М123 45678

500 389 n.ir—

Рис. 3. Фрагмент электрофореграммы продуктов ПЦР, полученных с праймерами AFC и AR2. Цифрами обозначены пробы ДНК сортов: 1 -Московская 39, 2 - Волжская К, 3 - Иргина, 4 - Ирень, 5 - Стрела, 6 -Красноуфимская 100, 7 - Свеча, 8 - Горноуральская; М - маркер длины фрагментов ДНК; стрелкой указан фрагмент, характерный для аллели Wx-Ala (389 п.н.)

Праймеры Wx-Alb-F-MH и Wx-AlBb-R-MH (табл. 2) амплифицируют фрагмент 671 п.н. у растений, несущих аллель Wx-Ala, и фрагмент 652 п.н. у растений, несущих аллель Wx-Alb. Продукты амплификации аллелей Wx-Ala (671 п.н.) и Wx-Alb (652 п.н.) трудно различимы в геле, поэтому последовательность аллеля Wx-Ala (671 п.н.) разрезалась рестриктазой HindiII на два фрагмента - 495 п.н. и 176 п.н. У последовательности аллеля Wx-Alb рестрикция отсутствует. При использовании в ПЦР праймеров Wx-Alb-F-MH и Wx-AlBb-R-MH у изученных сортов установлен аллель Wx-Ala. Таким образом,

изученный нами 41 сорт Т. аезйуит из Пермского края и Республики Башкортостан несут аллели дикого типа - \Vx-Ala.

Ген И/х-В1. Для идентификации гена Жх-В1 и верификации полученных результатов были также использованы две пары праймеров. Первая пара праймеров ЕШРЬ и ВИЗ (табл. 2), при наличии аллеля дикого типа (Жх-В1а) амплифицировала три фрагмента размером 497 п.н., 455 п.н. и 425 п.н. При наличии нуль-аллеля (Жх-В1Ь) в геле идентифицируются только два фрагмента, а самый легкий фрагмент (425 п.н.) отсутствует. У всех изученных сортов детектирован фрагмент 425 п.н., что указывает на наличие аллеля Жх-В1а (рис. 4).

497 пд.

455

Рис. 4. Фрагмент электрофореграммы продуктов ПЦР, полученных с праймерами BDFL и BRD. Цифрами обозначены пробы ДНК сортов: 1-2 - Ватан, 3-4 - Тулайковская Золотистая, 5-6 - Тулайковская 10, 7-8 - Тюменская 31; М -маркер длины фрагментов ДНК; стрелками указаны детектируемые фрагменты

Вторая пара праймеров Wx-B1L и Wx-B1R амплифицирует в ПЦР фрагмент 461 п.н. у проб ДНК Т. aestivum, несущих аллель Wx-Bla. Отсутствие амплифицированного фрагмента указывает на наличие нуль-аллеля Wx-Blb. Кроме того, при использовании этих праймеров в ПЦР, на геле может быть виден фрагмент немного большей длины по сравнению с аллелем дикого типа (495 п.н.), характерный для функционального аллельного варианта Wx-Ble (Vanzetti et al., 2009). Анализ изученных нами сортов Т. aestivum показал, что 37 сортов являются носителями аллеля Wx-Bla, 3 сорта (Башкирская 4, Башкирская 26 и Башкирская 28) несут функциональный аллель Wx-Ble. На электрофореграмме сорта Ульяновская 100 были видны два фрагмента (рис. 5), длиной 461 п.н. и 491 п.н. Подобный результат был получен И.Р. Абдулиной с соавторами (2013). Они предположили, что наличие двух фрагментов связано с несвойственной в данном случае генерацией аллеля гена Wx-Al длиной 491 п.н.

М 1 2 3 4

Рис. 5. Фрагмент электрофореграммы продуктов ПЦР, полученных с праймерами Wx-B1L и Wx-B1R. Цифрами обозначены пробы ДНК сортов: 1 -Башкирская 4, 2 - Башкирская 26, 3 - Башкирская 28, 4 - Ульяновская 100; М -маркер длины фрагментов ДНК; темной стрелкой указан фрагмент, характерный для Wx-Al аллеля (491 п.н.), светлой стрелкой - фрагмент, характерный для аллеля Wx-Bla (461 п.н.)

Таким образом, изученные нами сорта Т. aestivum характеризуются различными функциональными аллельными вариантами гена Wx-Bl.

Ген Wx-Dl. Для определения аллельного состояния гена Wx-Dl применялись две пары праймеров. При использовании BDFL и DRSL при наличии аллеля дикого типа амплифицировались фрагменты размером 2307 п.н. (Wx-Dlа), а при наличии нуль-аллеля — 1731 п.н., что соответствует аллелю Wx-Dlb (Nakamura et al., 2002). Из изученного нами 41 сорта Т. aestivum у 35 отмечен аллель дикого типа, а у 6-ти сортов (Московская 39, Иргина, Башкирская 10, Лютесценс 9, Башкирская 24 и Салават Юлаев) в геле не выявлено амплифицированных фрагментов ДНК, что может быть вызвано ингибированием ПЦР в отдельных образцах (Nakamura et al, 2002). Вторая пара праймеров Wx-Dl-1-F и Wx-Dl-l-R (Vrinten et al., 1999) у сортов, несущих аллель дикого типа, амплифицирует фрагменты размером 930 п.н. (Wx-Dla), а у сортов, несущих нуль-аллель — 342 п.н. (Wx-Dlb). Было показано, что все исследуемые нами сорта несли аллели Wx-Dla, то есть аллели дикого типа. Таким образом, у изученных нами сортов Т. aestivum, используемых в Пермском крае и в Республике Башкортостан, выявлены аллели дикого типа - Wx-Dla.

Молекулярно-генетическая идентификация сортов Т. aestivum с использованием ISSR-маркеров и маркеров к генам Waxy

Использованные в работе ISSR-праймеры позволили получить для каждого сорта оригинальный спектр ампликонов и показали высокую информативность и стабильность. Нами выявлены семь ISSR-маркеров, характерных для всех 41

исследованных сортов Т. aestivum, и семь ISSR-маркеров, характерных для представителей только одного конкретного сорта, то есть сортоспецифичные. В частности, у сорта Московская 39 выявлен один уникальный ISSR-маркер размером 670xio- Нами идентифицированы маркеры, специфичные для сортов Волжская К (850хи), Фотос (200Хю), Сурская Юбилейная (500Хю), Тулайковская 10 (1350хю), Тюменская 31 (1250Хю) и Сапават Юлаев (610мз).

Установлено, что коэффициент генетической оригинальности выше у сортов, снятых с испытания (КГО=1,514), что свидетельствует о большей доле редких генотипов и их специфичности. У сортов, допущенных к использованию в Пермском крае и в Республике Башкортостан этот показатель равен 0,806 и 1,398 соответственно. У сортов, находящихся на сортоиспытании, КГО составил 1,068. Это обусловлено меньшей долей редких генотипов и свидетельствует о типичности ISSR-спектров сортов Т. aestivum, допущенных к использованию и находящихся на испытании.

Для каждого сорта Т. aestivum был получен индивидуальный спектр ISSR-маркеров, который использован нами при составлении молекулярно-генетических формул. Четко воспроизводимые ISSR-маркеры, выявленные у всех 41 сортов, были названы «видовыми» и обозначены «v» от «vid», так как эти маркеры четко воспроизводятся у всех особей изучаемого вида. Видовые ISSR-маркеры являются мономорфными. Маркеры, которые были выявлены только у некоторых сортов, были обозначены как полиморфные — «р» от «polymorph». Мономорфные маркеры позволили нам определить принадлежность особи к виду, а полиморфные маркеры при их различных сочетаниях - к конкретному сорту. Сортоспецифичные маркеры были обозначены как «us» от «unique + sort» (уникальный сортовой). С использованием установленных специфичных для каждого сорта сочетаний ISSR-маркеров для идентификации сортов были отобраны минимальные наборы маркеров, позволяющие надежно идентифицировать изученные сорта.

Для составления молекулярно-генетических формул 41 сорта Т. aestivum, нами использованы три подхода:

1) Для идентификации сортов пшеницы мягкой с сортоспецифичными маркерами, было отобрано по 4 видовых, 4 полиморфных и 1 сортоспецифичному ISSR-маркеру. Таким образом, были составлены формулы 7 сортов: Фотос, Московская 39, Волжская К, Сурская Юбилейная, Тулайковская 10, Тюменская 31 и Салават Юлаев. Молекулярно-генетическая формула сортов,

17

идентифицированных с помощью первого подхода, показана на примере в таблице 3. У всех 7 сортов Т. аеяНуит этой группы выявлены аллели дикого типа по й^аху-генам, что позволяет прогнозировать нормальный уровень амилозы в крахмале эндосперма зерновок этих сортов.

Таблица 3

Молекулярно-генетическая формула сорта Тулайковская 10 Г. aestivum

Обозначение сорта Тип фрагментов ДНК Молекулярно-генетическая формула

Та_Тул10 vid Та*680хп, Tav460Mi.Tav370xio, Та^Омгт

polymorph Та Тул10р750М1, Та Тул10р1430Мз, Та ТулЮ„320М27,Та Тул10о920Хц

unique + sort Та ТулЮ,L,1350xio

Примечание: Та_ ТулЮ - Т. aestivum сорт Тулайковская 10

2) Для идентификации сортов Т. aestivum, у которых нами был обнаружен молекулярный полиморфизм по аллельному состоянию гена Wx-BI, мы использовали сочетания ISSR-фрагментов и маркеров к Waxy генам. Для сортов Башкирская 4, Башкирская 26 и Башкирская 28 было отобрано по 4 видовых, 3 полиморфных и 1 сортоспецифичному маркеру к гену Wx-BI, к сорту Ульяновская 100 отобрано 4 видовых, 2 полиморфных и 1 сортоспецифичный маркер к гену Wx-BI. Пример молекулярно-генетической формулы сортов, идентифицированных с использованием второго подхода, приведен в таблице 4.

Таблица 4

Молекулярно-генетическая формула сорта Башкирская 4 Т. aestivum

Обозначение сорта Тип фрагментов ДНК Молекулярно-генетическая формула

Та Б4 vid Tav680x, i, Tav460Mi. Tav370xio, Tav240M27

polymorph Та Б4о530мьТа Б4п1770Хю, Ta B4d720m27

unique + sort Та Б4œWxBle

Примечание: Та_Б4 — Т. aestivum сорт Башкирская 4

3) Для идентификации 30 сортов пшеницы мягкой мы использовали сортоспецифичные сочетания видовых и полиморфных КЗИ-фрагментов. Молекулярно-генетическая формула сортов, идентифицированных посредством третьего подхода, представлена в таблице 5. Таким образом, были составлены молекулярно-генетические формулы следующих сортов: Иргина, Ирень, Стрела, Красноуфимская 100, Свеча, Горноуральская, Терция, Экада 70, Экада 109, Штру

06, Штру 05, Икар, Баженка, Гамлет, Диаблон, Терси, Уралосибирская, Ярица, Красноуфимская 110, Жница, Башкирская 10, Башкирская 9, Лютесценс 9, Сертори, Черноземноуральская 2, Башкирская 24, Ватан, Тулайковская Золотистая, ЦХ Кампала, Сударыня.

Таблица 5

Молекулярно-генетическая формула сорта Иргина Т. аевйшт

Обозначение сорта Тип фрагментов ДНК Молекулярно-генетическая формула

ТаИрг У1<1 Та„680х1ь Та„460М1. Тау370Х10, Тау240М27

ро1утогрЬ Та_ ИрГр320м27, Та_ИрГр590хп, Та Ирго920хи, Та Ирго840Хю

Примечание: Та_Ирг— Т. аеятит сорт Иргина

У 30 сортов Т. аеБНуит третьей группы по Шаху-тевязл выявлены аллели дикого типа, что согласуется с наличием нормального уровня амилозы в крахмале эндосперма зерновок этих сортов.

Для апробации разработанных нами подходов идентификации 41 сорта Т. аезНшгп было проведено анонимное тестирование неизвестного сорта пшеницы мягкой. Показано, что можно четко определить тестируемый сорт пшеницы мягкой на основании разработанных нами подходов молекулярно-генетической идентификации.

Таким образом, наши исследования позволили провести молекулярно-генетическую идентификацию допущенных к использованию, снятых с испытания и проходящих сортоиспытание в Пермском крае и в Республике Башкортостан 41 сорта пшеницы мягкой. Полученные сочетания КБЛ-маркеров являются сортоспецифичными, стабильными и воспроизводимыми.

Полученные результаты позволили разработать следующие рекомендации:

1. При сортоиспытании рекомендуется определять генетическое разнообразие сортов с использованием как минимум двух типов молекулярных маркеров: КБИ-маркеров (пригодных для массового анализа) и аллельных вариантов 1Уаху-генов, позволяющих прогнозировать технологические характеристики зерна и хлебопекарные качества муки.

2. Для молекулярно-генетической идентификации изученных сортов Т. аезймит рекомендуется использовать три подхода: первый — на основе видовых и сортоспецифических КвЯ-маркеров; второй — на основе сочетания

полиморфных КЗЯ-маркеров с указанием аллельных вариантов Жаху-генов для прогноза качества хлебопекарной муки, третий - на основе сочетания мономорфных видовых и полиморфных межсортовых 188К-маркеров.

3. С целью исключения гибридизации генетически близких сортов пшеницы мягкой рекомендуется для подбора родительских пар при скрещиваниях использовать сорта Т. аеэНмит, характеризующиеся высокими показателями генетического разнообразия, обладающие различным сочетанием полиморфных КБИ-маркеров, с учетом их типичности и специфичности на основании подсчета коэффициента генетической оригинальности.

ВЫВОДЫ

1. У изученного 41 сорта Т. аезИгит выявлен 71 ШЗЯ-маркер. Исследованные сорта Т. аезймит на основании полиморфизма межмикросателлитных маркеров характеризуются высокими параметрами генетического разнообразия (Р95 =0,873; и, =1,001; л,=1,000).

2. У исследованных сортов Т. аеи'пит установлен широкий диапазон межсортового полиморфизма — генетические расстояния (£>) варьируют от 0,043 (между сортами Башкирская 24 и Сертори, Икар и Баженка, Ирень и Красноуфимская 100) до 0,736 (между сортами Тулайковская 10 и Красноуфимская 100). Изученные сорта формируют на деццрограмме шесть кластеров в соответствии со сходством профилей их 18811-маркеров.

3. Установлены семь мономорфных 18811-маркеров, характерных для всех изученных 41 сорта Т. аевНшт. У 7 сортов выявлены по одному сортоспецифичному для каждого сорта КВЯ-маркеру, а для каждого из остальных 34 сортов пшеницы мягкой установлены уникальные сочетания мономорфных и полиморфных ¡ЗБЯ-маркеров, которые не повторяются ни у одного из изученных сортов.

4. Выявлено, что у всех изученных сортов Т. аея^шт гены Жх-А1 и И/х-й1, связанные с контролем соотношения амилоза/амилопектин в крахмале пшеницы мягкой, характеризуются наличием аллелей дикого типа.

5. Показано, что исследованные сорта Т. аевИхит обладают различными функциональными аллельными вариантами гена 1¥х-В1: 38 сортов являются носителями аплеля 1Ух-В1а; 3 сорта (Башкирская 4, Башкирская 26 и Башкирская

28) несут функциональную аллель Wx-Ble, не приводящую к блокированию синтеза амилозы в крахмале.

6. Обнаружено, что сорта T. aestivum, снятые с испытаний, обладают большей долей редких генотипов (КГО=1,514), то есть характеризуются более высокой степенью специфичности по сравнению с сортами, уже допущенными к использованию в Пермском крае (КГО=0,806) и в Республике Башкортостан (КГО=1,398) и сортами, находящимися на сортоиспытании (КГО=1,Об8).

7. Выявлены идентификационные молекулярные маркеры, разработан подход и проведена идентификация 41 изученного сорта T. aestivum с использованием трех вариантов сочетаний мономорфных, полиморфных и сортоспецифичных ISSR-маркеров и маркеров к Waxy-генам.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Бобошина КВ.. Боронникова C.B. Изучение генетического полиморфизма некоторых сортов Triticum aestivum L. с использованием ISSR-маркеров // Аграрный вестник Урала. 2012. № 5 (97). С. 19-20.

2. Бобошина КВ., Боронникова C.B. Идентификация перспективных для Урала сортов пшеницы мягкой с использованием межмикросателлитного анализа полиморфизма ДНК // Фундаментальные исследования. 2013. № 6 (ч. 1). С. 9297.

3. Бобошина КВ., Боронникова C.B. Аллельные варианты Waxy-генов сортов пшеницы мягкой, возделываемых в Пермском крае и в Республике Башкортостан // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013. Т. 17, № 3. С. 535-540.

Публикации в других изданиях

1. Бобошина КВ., Боронникова C.B., Светлакова Т.Н., Бельтюкова Н.Н. Молекулярно-генетическая идентификация, штрихкодирование и паспортизация растений // Материалы международной конференции с элементами научной школы для молодежи в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы. Уфа, 2010. С. 65-67.

2. Бельтюкова Н.Н., Боронникова C.B., Светлакова Т.Н., Бобошина И.В. Технология оценки состояния популяционных систем и генетических ресурсов редких и практически значимых видов растений // Антропогенная трансформация природной среды: материалы Международной конференции. Пермь, 2010. Т.З. С. 276-279.

3. Boboshina I. V.. Boronnikova S.V., Beltyukova N.N., Svetlakova T.N. Genomic technologies for improving the quality of life / Kazan (Volga Region) Federal University. Pax Grid virtual conferences «Fundamental medicine: from scalpel toward genome, proteome and lipidome». Proceedings of First International Conference Kazan, 25-29 April 2011. P.13.

4. Бобошина КВ.. Боронникова C.B. ISSR-маркирование генома Triticum aestivumL. H Симбиоз Россия 2011: материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов, Воронеж, 23—27 мая 2011 г.: в 2 т. / Воронежский государственный университет, Всероссийская биологическая ассоциация «Симбиоз Россия». — Воронеж: Изд-во Воронежского государственного университета, 2011. С. 205-207.

5. Боронникова C.B., Бельтюкова H.H., Светлакова Т.Н., Бобошина И.В. Анализ полиморфизма ДНК на основе тандемных повторов геномов растений // Материалы IV международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». Ростов-на-Дону, 22-25 сентября 2011 г. Изд-во СКНЦ ВШ ЮФУ, 2011. С. 44-45.

6.Светлакова Т.Н., Бобошина И.В., Бельтюкова H.H., Горохова Т.В., Боронникова C.B. Применение ISSR-маркирования в современных ботанических исследованиях // Материалы международной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы ботаники и экологии» (9-13 августа 2011 года, г. Березно, Ровенская область, Украина). Киев, 2011. С. 201-202.

7.Бобошина КВ., Боронникова C.B. Использование ISSR-метода для выявления генетического полиморфизма сортов Triticum aestivum L. // Материалы первой конференции молодых ученых «Биология растений и биотехнология», г. Белая Церковь, Украина, 2011. С. 58.

Бобошина И.В. Молекулярно-генетический анализ трех сортов Triticum aestivumL. Н Материалы международной научной конференции «Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование». Пермь, 2011. С. 282-285.

9. Боронникова C.B., Бельтюкова H.H., Светлакова Т.Н., Бобошина КВ., Нечаева Ю. С., Кольцов С.А. Анализ полиморфизма ДНК геномных маркеров растений с целью изучения биоразнообразия // Материалы международной научной конференции «Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование». Пермь, 2011. С.288-292.

10.Бобошина КВ.. Боронникова C.B. Анализ полиморфизма ДНК сортов Triticum aestivum L. // Тезисы 2-й Международной школы-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях - 2011». Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН. Москва-Звенигород, 2011. С. 23.

11. Бобошина И.В., Семукова Е.П., Боронникова C.B. Результаты молекулярного маркирования сортов Triticum aestivum L. // Материалы Всероссийской школы-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, растений и микроорганизмов». Уфа, 2012. С. 20-24.

12.Бобошина И.В.. Семукова Е.П., Боронникова C.B. Изучение генетического разнообразия некоторых сортов Triticum aestivum L. на Урале // Материалы научной конференции аспирантов и молодых ученых «Актуальность наследия Н.И. Вавилова для развития биологических и сельскохозяйственных наук». С.-Петербург, 2012. С. 56-61.

13.Бобошина И.В., Семукова Е.П., Лацугин М.С., Боронникова C.B. Молекулярно-генетический анализ практически значимых растений // Тезисы докладов всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии в рамках фестиваля науки». Уфа, 2012. С. 8.

14. Бобошина И.В., Семукова Е.П., Боронникова C.B. Анализ полиморфизма ДНК сортов Triticum aestivum L., районированных в Республике Башкортостан и в Пермском крае // Материалы V Всероссийского с международным участием медико-биологического Конгресса молодых ученых «Симбиоз-Россия Тверь-2012». Тверь, 2012. С. 215-217.

15. Бобошина КВ.. Боронникова C.B. Распределение аллелей гена Wx-Bl в коллекции сортов Triticum aestivum L., перспективных для выращивания на Урале // Сборник тезисов VI Всероссийского с международным участием биологического Конгресса молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013». Иркутск, 2013. С. 264-265.

16. Бобошина И.В., Боронникова C.B. Оценка генетической оригинальности сортов пшеницы мягкой, возделываемых в Пермском крае и в Республике Башкортостан // Материалы V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». Ростов-на-Дону, 2013. С. 427-428.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

КГО — коэффициент генетической оригинальности

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ISSR — Inter-Simple Sequence Repeats PCR

ТЕ - Tris-HCl-EDTA-MilliQ

TBE - Tris-Borate-EDTA

UPGMA — unweighed pair-group method using arithmetic average

Wx - Waxy гены, кодирующие гранул связанную синтазу крахмала

Подписано в печать 17.10.2013 г. Формат 60*84/16 Усл. печ. л. 1,39. Тираж 110 экз. Заказ 270

Типография Пермского государственного национального исследовательского университета. 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бобошина, Ирина Викторовна, Пермь

Федеральное государственное бюджетное общеобразовательное

учреждение высшего профессионального образования "Пермский государственный национальный исследовательский

университет"

УДК 633.11:575.174.015.3 На правах рукописи

п I "5П4 1J.1L 1.1

БОБОШИНА ИРИНА ВИКТОРОВНА

АНАЛИЗ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ^ААТ-ГЕНОВ И МЕЖМИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ СОРТОВ ТШТ1СиМ АЕЗПУиМЪ. СРЕДНЕГО И ЮЖНОГО УРАЛА

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент

Боронникова Светлана Витальевна

ПЕРМЬ-2013

ВВЕДЕНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ

4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................10

1.1. Биологические особенности Triticum aestivum L..................................................10

1.2. Сортовая система Т. aestivum..................................................................................................16

1.3. Молекулярно-генетический анализ Т. aestivum......................................................21

1.4. Молекулярное маркирование сортов пшеницы мягкой..................................27

1.5. Полиморфизм Жаху-г&нов Т. aestivum............................................................................31

1.6. Анализ подходов сортовой идентификации пшеницы мягкой..................35

ГЛАВА 2. РЕГИОНЫ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ............40

2.1. Регионы исследований..................................................................................................................40

2.2. Объекты исследований..................................................................................................................45

2.3. Методы исследований..................................................................................................................48

2.3.1. Проращивание семян в лабораторных условиях и выделение ДНК из проростков..........................................................................48

2.3.2. Анализ полиморфизма ISSR-маркеров......................................................49

2.3.3. Компьютерный анализ данных..........................................................................50

2.3.4. Определение аллельных вариантов Waxy генов у сортов

Т. aestivum..............................................................................................................................52

2.3.5. Разработка молекулярно-генетической идентификации сортов Т. aestivum..........................................................................................................54

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ СОРТОВ

Т. AESTIVUM С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ISSR-МАРКЕРОВ......................................55

3.1. Подбор эффективных ISSR-праймеров для анализа полиморфизма ДНК сортов Т. aestivum................................................................................................................55

3.2. Анализ полиморфизма ISSR-маркеров у сортов Т. aestivum......................57

ГЛАВА 4. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ WAXY

ГЕНОВ У ИЗУЧЕННЫХ СОРТОВ Т. AESTIVUM...........................................................66

4.1. Полиморфизм аллелей гена Wx-Al........................................................................................66

4.2. Аллельные варианты гена Wx-Bl............................................................................................67

4.3. Полиморфизм аллельных вариантов гена Wx-Dl......................................................68

ГЛАВА 5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ СОРТОВ Т. AESTIVUM С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ISSR-МАРКЕРОВ И

МАРКЕРОВ К ГЕНАМ WAXY...........................................................................................................73

5.1. Определение ISSR-маркеров для сортовой идентификации

Т. aestivum................................................................................................................................................................73

5.2. Выявление типичных и специфических ISSR-маркеров сортов

Т. аезйшт..............................................................................................................................................................75

5.3. Молекулярно-генетические формулы сортов Т. аезйуит................................77

5.4. Анонимное тестирование сорта Т. аеБ^ит с использованием полиморфизма 18 8К-маркеров............................................................................................................88

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................................91

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................93

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ..........................................................124

ПРИЛОЖЕНИЕ....................................................................................................................................................126

Приложение 1. Объекты исследований........................................................................................127

Приложение 2. Данные молекулярно-генетического анализа................................151

Приложение 3. Акты внедрения......................................................................................................166

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Пшеница является основной зерновой культурой для 35% населения земного шара, под посевами которой занято 216 млн. га (УазП, 2007). Пшеница мягкая (ТгШсит аезйуит Ь.) представлена большим числом сортов, как созданных научной селекцией, так и местных сортов и линий. Исследование генетического разнообразия сортов Т. аезИмит является важной задачей, так как дает существенную информацию о потенциале сортов для селекционной работы (8о£аИап е1 а1., 2009). Поскольку возможность улучшения хозяйственно ценных признаков при внутривидовых (межсортовых) скрещиваниях имеет определенный предел, так как во многих селекционных программах используются определенные наборы элитных сортов, возможны предпосылки «генетической эрозии» сортов. В связи с этим очевидна необходимость постоянного сортообновления (сортосмены) и наличия дополнительных резервов для генетического улучшения сортов пшеницы мягкой (Абугалиева и др., 2012). Ежегодно селекционными учреждениями создаются и передаются для коммерческого использования сотни новых сортов Т. аезНуит. Только в 2012 г. в Госреестр селекционных достижений, допущенных к использованию в Российской Федерации, занесено 413 сортов мягкой пшеницы (Госреестр..., 2013). С увеличением числа новых подобных или тесно связанных сортов пшеницы и необходимостью изучения и мониторинга внутривидового генетического разнообразия как в разных географических регионах, так и в коллекциях, сохраняющих генофонд вида, а также для выявления подлинности сортов и их родословных, все более важными и сложными становятся регистрация сорта, его сертификация и защита авторских прав селекционеров (X1ш е1 а1., 2011; Новосельская-Драгович и др., 2013).

К настоящему времени установлено, что генетические различия между отдельными организмами наиболее полно представлены на уровне нуклеотидных последовательностей. С помощью современных

молекулярных методов эти различия можно обнаружить и использовать для идентификации отдельных линий, сортов и видов растений. Молекулярное маркирование сортов сортов пшеницы мягкой осуществляется с использованием различных подходов, среди которых использование мультилокусных ДНК-маркеров (Pasqualone et al., 2000; Салина и др., 2008; Tagizad et al., 2010; Milad et al., 2011; Abouzied, 2011; Funda, Ahu, 2013; Mitrofanova et al., 2013) и идентификация аллельных вариантов генов, контролирующих хозяйственно важные признаки (Nakamura et al., 2002; Vanzetti et al., 2009; Saito et al., 2010;-Климушина и др., 2012; Потокина и др., 2012; Абдулина и др., 2013в; Чеботарь и др., 2013). Однако анализ аллельных вариантов генов Waxy и межмикросателлитных маркеров сортов пшеницы мягкой, используемых в таких регионах рискованного земледелия Среднего и Южного Урала как Пермский край и Республика Башкортостан, климат которых характеризуется холодной продолжительной и снежной зимой, теплым коротким летом и ярко выраженными температурными инверсиями (Назаров, 2006; Давлетшин, Атнагулов, 2010; Международные..., 2012), ранее не проводился. Исследования генетической структуры локальных сортов Т. aestivum необходимы для создания генетически обоснованных программ по выявлению генетической изменчивости, ее анализу, в целях дальнейшего сохранения и использования, в том числе для нужд современного агропромышленного комплекса (Пояснительные замечания..., 2009).

Цель исследований - анализ генетического разнообразия, выявление межмикросателлитных маркеров и аллельных вариантов Waxy-генов у 41 сорта Т. aestivum, допущенных к использованию, снятых с испытания и проходящих сортоиспытания в Пермском крае и в Республике Башкортостан.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) провести анализ полиморфизма межмикросателлитных (ISSR - Inter Simple Sequence Repeats) маркеров у 41 сорта Т. aestivum;

2) определить генетические расстояния между изученными сортами Т. aestivum и их сходство на основании данных межмикросателлитного анализа;

3) выявить полиморфные ISSR-маркеры, их сочетания или сортоспецифичные ISSR-маркеры для каждого сорта Т. aestivum;

4) изучить у 41 сорта Т. aestivum аллельные варианты генов Waxy, кодирующих гранул-связанную синтазу крахмала и детерминирующих содержание амилозы в зерновке, оценить возможность их использования для ранжирования изучаемых сортов по содержанию амилозы в- эндосперме зерновки;

5) определить коэффициенты генетической оригинальности (КГО) используемых сортов Т. aestivum;

6) разработать подход и провести молекулярно-генетическую идентификацию изучаемых сортов Т. aestivum с использованием ISSR-маркеров и маркеров к генам Waxy.

Научная новизна работы. Проведен молекулярно-генетический анализ 41 сорта Т. aestivum, допущенных к использованию, снятых с испытания и проходящих сортоиспытание в Пермском крае и в Республике Башкортостан; выполнена оценка генетического сходства сортов пшеницы мягкой с использованием полиморфизма межмикросателлитных маркеров. Получены и систематизированы данные о генетическом разнообразии 41 сорта Т. aestivum, используемых в Пермском крае и в Республике Башкортостан, по аллельным вариантам Waxy-генов, детерминирующих содержание амилозы в зерновке. У трех изученных сортов Т. aestivum выявлен полиморфизм по функциональным аллелям гена Wx-Bl. Установлены коэффициенты генетической оригинальности изученных сортов. Впервые разработаны подходы и проведена идентификация 41 сорта Т. aestivum, используемых в Пермском крае и в Республике Башкортостан, на основе двух типов молекулярных маркеров - ISSR-маркеров и маркеров к

генам Жаху. Полученные результаты наглядно представлены в молекулярно-генетической формуле изученных сортов.

Практическая значимость диссертационной работы заключается в оценке генетического разнообразия 41 сорта Т. аеБНуит на основании надежной и недорогой методики анализа полиморфизма 18811-маркеров и распределения аллельных вариантов РГоху-генов, детерминирующих содержание амилозы в зерновке. В зависимости от специфики генетического разнообразия сорта предложены три подхода молекулярно-генетической идентификации изученных сортов. Результаты исследований и практические рекомендации диссертации предлагаются для использования Министерством сельского хозяйства РФ, научными учреждениями, селекционными станциями, высшими учебными заведениям, для разработки программ селекции сортов Т. аезНуит, для генетической идентификации сортов пшеницы мягкой с целью защиты авторских прав селекционеров, включая сертификацию и регистрацию сортов. Информация о степени генетического сходства сортов, полученная по данным межмикросателлитного анализа, облегчит подбор родительских пар при гибридизации с целью получения максимального спектра изменчивости в гибридном потомстве, что позволит повысить эффективность селекционного процесса. Результаты исследований могут быть использованы для оптимизации методов сортовой идентификации и селекции сортов с высокими технологическими свойствами зерна и хорошими хлебопекарными свойствами муки. Результаты работы внедрены в учебный процесс ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» и ФГБОУ ВПО «Пермская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н. Прянишникова», что подтверждено 2 актами внедрения.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена при частичной финансовой поддержке Аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (2010-2011 гг.), НИР «Оценка состояния генофондов и популяционных систем ресурсных видов растений при естественных

колебаниях и антропогенной трансформации среды с использованием новых геномных и биоинформационных технологий» государственного задания на оказание услуг Министерства образования и науки РФ (2012-2014 гг.), программы развития ПГНИУ как национального исследовательского университета «Рациональное природопользование: технологии прогнозирования и управления природными и социально-экономическими системами» (2010-2019 гг.).

Личный вклад автора. Автором лично проведены выбор молекулярных маркеров и методов молекулярно-генетического анализа, сбор материала, лабораторные исследования; выполнена обработка, анализ, обобщение и интерпретация результатов, сопоставление их с литературными данными, написание и оформление диссертационной работы. Предложен способ молекулярно-генетической идентификации сортов с использованием ISSR-маркеров и маркеров к генам Waxy. Подготовка публикаций выполнена лично или при активном участии автора.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждались на 15 научных и научно-практических конференциях, в их числе 8 международных: «ЕС - Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи» (Уфа, 2010); «Антропогенная трансформация природной среды» (Пермь, 2010); «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2011); «Актуальные проблемы ботаники и экологии» (Киев, 2011); «Биология растений и биотехнология» (Белая Церковь, Украина, 2011); «Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование» (Пермь, 2011); «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва-Звенигород, 2011); «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013); 4 Всероссийских конференциях: «Fundamental Medicine: From Scalpel Toward Genome, Proteome and Lipidome» (Kazan, 2011); «Актуальные проблемы генетики человека, растений и

микроорганизмов» (Уфа, 2012); «Актуальность наследия Н.И.Вавилова для развития биологических и сельскохозяйственных наук» (С.-Петербург, 2012); ««Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии» в рамках фестиваля науки» (Уфа, 2012); 3 Всероссийских с международным участием: «Симбиоз-Россия 2011» (Воронеж, 2011); «Симбиоз-Россия 2012» (Тверь, 2012); «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК и 16 публикаций в других журналах и материалах конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 8 рисунков. Список литературы включает 263 источника, в том числе 115 на иностранных языках.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность за руководство диссертационной работой научному руководителю д.б.н., заведующему кафедрой ботаники и генетики растений ПГНИУ C.B. Боронниковой; за семена сортов пшеницы мягкой сотрудникам ГНУ «Пермский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» РАСХН (г. Пермь), Ординского и Березовского ГСУ Пермского края, Абзелиловского и Давлекановского ГСУ Республики Башкортостан и ГНУ «Башкирский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» (г. Уфа), к.с-х.н., заведующему лабораторией озимых культур Н.И. Лещенко и заведующему лабораторией яровых культур к.с.-х.н. В.И. Никонову Чишминского селекционного центра БНИИСХ; за информацию по характеристикам сортов сотруднику Ординского ГСУ Пермского края Т.А. Федосеевой, заведующему отделом селекции ГНУ «Ульяновский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» В.Г. Захарову и научному сотруднику лаборатории селекции яровой пшеницы ГНУ «Воронежский научно-исследовательский институт сельского хозяйства имени В.В.

Докучаева» РАСХН A.A. Хорину; за поддержку - коллегам по лаборатории.

9

ГЛАВА 1. Обзор литературы 1.1. Биологические особенности Triticum aestivum L.

Пшеница мягкая (Triticum aestivum L.) относится к роду Triticum L. -пшеница, семейство Poaceae Barnhart - злаковые (Тахтаджян, 1987). Семейство Роасеае представлено многолетними или, реже, однолетними либо двулетними травами. Стебли у представителей этого семейства обычно полые в междоузлиях. Листья очередные, двурядные, дифференцированные на длинное и обычно открытое влагалище и на длинную и узкую линейную пластинку. Влагалищно-пластинчатое сочленение имеет язычок, обычно пленчатый, иногда прозрачный или образованный рядом волосков. Очень редко язычок отсутствует. Цветки сильно редуцированные, обоеполые или иногда однополые, собранные в колосовидные либо метельчатые сложные соцветия, состоящие из элементарных соцветий - колосков. Над верхней цветковой чешуей расположены 2-3 пленочки, или лодикулы, представляющие собой маленькие бесцветные образования, основания которых во время цветения набухают и этим вызывают раскрывание цветка; редко лодикулы отсутствуют. Тычинок обычно 3, редко больше или 2. Гинецей из 2-3 плодолистиков с 1-2 рыльцевыми ветвями; завязь верхняя, одногнездная, с одним семязачатком. Плод обычно зерновка, с тонким кожистым перикарпием, плотно облегающим семя и срастающимся с ним. Зерновка то�