Алленоксидсинтаза CYP74C3 томата

Топоркова, Яна Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Алленоксидсинтаза CYP74C3 томата
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Алленоксидсинтаза CYP74C3 томата"

003408126

На правах рукописи

Топоркова Яна Юрьевна

АЛЛЕНОКСИДСИНТАЗА С\'Р74СЗ ТОМАТА: КАТАЛИЗ И ИЗМЕНЕНИЕ ЕГО ПРИРОДЫ СЛИТ-НАПРАВЛЕННЫМ МУТАГЕНЕЗОМ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о ДЕК 2009

Казань-2009

003488126

Работа выполнена в лаборатории оксилипинов Учреждения Российской академии наук Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН

Научный руководитель:

академик РАН, доктор химических наук, Гречкин Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Хохлова Людмила Петровна

кандидат биологических наук Цыдендамбаев Владимир Дылыкович

Ведущая организация: Институт экологии Волжского бассейна

Российской академии наук (г. Тольятти)

Защита состоится 24 декабря 2009 гадав 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 002.005.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении РАН Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН по адресу: 4201 И, г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, а/я № 30, тел/факс (843)2927347

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан «23» ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Б. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и се актуальность. В онтогенезе растений и формировании у них ответа на стрессовые факторы важная роль принадлежит ферментам липоксигеназной сигнальной системы: цитохромам Р450 семейства СУР74 и линоксигепазам. Результатом работы этой системы является образование окисленных производных жирных кислот - оксилшшнов. Оксилипины относятся к одной из основных групп биоактивных соединений, образующихся в различных организмах в результате окислительного метаболизма полиненасьнцснных жирных кислот [ИоЪ е1 а!., 2002; БШтре, Решяпег, 2006]. В настоящее время имеется достаточно информации, чтобы считать липоксигеназпый путь превращения мембранных липидов самостоятельной сигнальной системой [Тарчевский, 2001].

Основное внимание исследователями уделяется изучению продуктов превращения 13-гидроперекисей жирных кислот, к которым относятся жасмоновая кислота и ее производные. Меньше известно о биосинтезе и функциях других членов семейства оксилипинов у растений.

Первую реакцию в пути биосинтеза жасмоиовой кислоты, а именно синтез окиси аллена, катализируют алленоксидсинтазы (ЛОС). Все апленоксидсиитазы катализируют образование окисей аллена из гидроперекисей жирных кислот: 13-изомеры являются субстратами для алленоксидсинтаз подсемейства СУР74А, 9-изомеры - для алленоксидсинтаз СУР74С. Время полужизни окисей аллена составляет 30 секунд при 0°С, поэтому в качестве продуктов алленоксидсиптазной реакции регистрируются продукты их дальнейших превращений, включающие а- и у-кетолы, образующиеся в результате спонтанного гидролиза, а также циклопентеноны - продукты циклизации окисей аллена, протекающей либо под действием фермента аллсноксидщдашы, либо спонтанно. Спонтанный гидролиз идет гораздо интенсивнее, чем спонтанная циклизация, в результате чего циклопентеноны в качестве окончательного продукта реакции, катализируемой алленоксидсинтазами подсемейства СУР74А, регистрируются в следовых количествах. В отличие от этого, среди продуктов реакций, катализируемых алленоксидсинтазами подсемейства СУР74С, в частности ЬеАОЭЗ, наблюдается значительное количество циклопентенонов. Этот факт до сих пор не имеет объяснения. Физиологическая роль многих продуктов ЬеАОБЗ также до настоящего времени остается неизвестной. Кроме того, не изучены каталитические свойства данного фермента. Особый интерес представляет филогенез ЬеАОБЗ, поскольку се первичная структура обнаруживает большую гомологию с некоторыми гидропероксидлиазами (ГПЛ) и дивинилэфирсинтазами (ДЭС), чем с 13-АОС других растений. Имеются основания полагать, что изучение данного белка может дать ключ к пониманию эволюции семейства СУР74 в целом.

Цель и задачи исследования. Целью наших исследований было выявление особенностей каталитического действия фермента подсемейства СУР74С цитохромов Р450 алленоксидсинтазы ЬеАОЭЗ (СУР74СЗ) томата (ЬусореЫсоп езси1епШт) дикого типа и его мушггных форм и сравнение их с особенностями каталитического действия других (классических) представителей подсемейства СУР74С -гидропероксидлиаз. Были поставлены следующие задачи:

1. Получение рекомбинантной алленоксидсинтазы ЬеАОБЗ (СУР74СЗ) и выяснение особенностей механизма катализа в сравнении с алленоксидсинтазами подсемейства СУР74А.

2. Выявление консервативных особенностей строения каталитически важных доменов различных ферментов семейства СУР74.

3. Выбор участков для модификаций полипептидной цепи и получение мутантных форм ЬсАОБЗ с единичными заменами аминокислот с помощью сайт-направленного мутагенеза. Сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.

4. Получение мутантных форм классического представителя подсемейства СУР74С гидропероксидлиазы МШРЬ люцерны {Medicago ¡птсаШ1а) с единичными заменами аминокислот с помощью сайт-направленного мутагенеза. Сравнение особенностей каталитического действия мутантных форм ЬеАСШ и МШРЬ.

Научная новизна работы. Впервые показано, что фермент ЬеАОБЗ, принадлежащий подсемейству СУР74С цитохромов Р450, является мультифункциональным и катализирует не только синтез, но также гидролиз и циклизацию окиси аллена, в отличии от большинства алленоксидсгоггаз (СУР74А), катализирующих синтез окисей аллена, но не участвующих в их дальнейших превращениях. Показано, что продуктами ЬеАОвЗ являются: образующийся стереоспецифически (95)-а-кегол и рацемическая смесь г/нс-10-оксо-11-фитоеновой кислоты (^ис-Ю-ОФЕК).

Проведен сравнительный анализ первичных последовательностей ферментов -представителей семейства СУР74; выявлены гипотетические первичные детерминанты катализа - сайты, находящиеся в каталитически важных доменах, имеющих закрепленпые последовательности у ферментов с разным типом катализа (алленоксидсинтазы, гидропероксидлиазы и дивинилэфирсинтазы).

На основании сравнения первичных и третичных структур монооксигеназ Р450 и ферментов семейства СУР74 выбраны сайты для предполагаемых направленных модификаций представителей подсемейства СУР74С: алленоксидсинтазы ЬеАОБЗ томата и гидропероксидлиазы МШРЬ люцерны, проведен сайт-направленный мутагенез по выявленным гипотетическим сайтам - детерминантам катализа СУР74 -соответствующих генов, изучены каталитические свойства мутантных форм.

Впервые показано изменение механизма каталитического действия ферментов семейства СУР74 в результате замены отдельных аминокислот, входящих в состав

доменов, находящихся в активном центре вблизи гема. Мутантные формы ЬеЛСКЗ обладают гидропероксидлиазной (изомеразной) активностью, тогда как алленоксидсинтазная (дегидразная) активность снижена, либо полностью отсутствует. Среди продуктов реакций, катализируемых мутантными формами МШРЬ, обнаруживаются новые продукты в результате нарушений п ферментативном катализе.

Впервые проведено направленное превращение ферментов СУР74 в результате замены отдельных аминокислот, которое может служить подтверждением дивергенции генов СУР74 в ходе их эволюции от единого гипотетического предка с гидропероксидлиазпой активностью, существовавшего у примитивных аэробов.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные вносят вклад в понимание функционирования одной из ключевых сигнальных систем растения, способствующей его адаптации к неблагоприятным для роста условиям. Изучены механизмы образования продуктов функционирования липоксигеназной сигнальной системы - окешшпинов, участвующих в процессах онтогенеза растений, таких как созревание плодов, прорастание семян, образование пыльцы, развитие цветков, корней и других органов, а также в формировании ответа на стрессовые факторы.

Разработаны системы получения и очистки препаративных количеств ферментов семейства СУР74. Использование технологии рекомбинантных ДНК и различных систем экспрессии дает возможность получения рекомбинантных белков данного класса для последующего возможного использования в промышленности, поскольку количество многих белков часто ограничено низкой доступностью в природе.

Возможность направленных превращений ферментов открывает новые способы модификации их каталитических свойств. Качественное изменение ферментативного катализа при сайт-направленном мутагенезе представляет потенциальный интерес для практического использования в области биоинженерии с целью получения ферментов с заданными свойствами.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологического и биотехнологического профилей, занимающихся получением рекомбинантных ферментов, исследованием взаимосвязи структуры и функций белков, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии в ВУЗах.

- к пониманию молекулярных механизмов действия», № 09-04-00915-а «Ферменты CYP74: контроль биосинтеза регуляторных оксилипинов у растений», № 09-04-12222-офи м «Семейство генов CYP74 Zea mays: структура, экспрессия, роль в липоксигеназном сигнальном каскаде», а также грантом ведущей научной школы академика И.А. Тарчевского НШ № 5492.2008.4 «Сигнальные системы клеток -медиаторы, протеом». Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 10-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); на 2-ом Международном симпозиуме «Сигнальные системы растительных клеток: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006); на Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2006), на Конференции «Современные достижения в биохимии и клеточной биологии растительных липидов» (CHIA, Солт-Лейк-Сити, 2007); па 12-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); на I Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2008» (Казань, 2008); на Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на Международном симпозиуме «Растительные липиды и оксилипины» (Казань, 2008); на Межвузовской конференции по совремешюй биологии (Казань, 2008); на 2-ом Международном семинаре по липидным медиаторам (Испания, Вальядолид, 2008); на Международном симпозиуме «Регуляторные оксилипины» (Швейцария, Лозанна, 2009); на 34-ом конгрессе FEBS «Life's Molecular Interactions» (Чехия, Прага, 2009); на Международной конференции «Симбиоз-2009: Биология - расширение границ» (Казань, 2009); на П Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); на Всероссийской конференции «Устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды» (Иркутск, 2009); на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), а также на итоговой конференции Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2009). Работа является призером Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа, из них две статьи в зарубежных рецензируемых изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 172 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. В работе представлено 3 таблицы, 5 схем и 41 рисунок. Список литературы включает 213 источников, в том числе, 203 - иностранных.

1. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Система экспрессии целевого фермента. Для клонирования и экспрессии рекомбинантного гена алленоксидсинтазы leAOS3 томата использовали вектор рЕТ-23Ь, хозяином которого служили штаммы Е. coli NovaBlae и Rosetta-gam¡Tuner(DE3)pLysS (Novagen, США).

Культуры клеток Е. coli выращивали в питательных средах: SOB [Гловер, 1988], SOC [Гловер, 1988], Luria-Bertani [Гловер, 1988], М9 [Маниатис и др., 1984].

Для трансформации Е. coli получали компетентные клетки с использованием хлорида рубидия [Гловер, 1988]. Индукцию экспрессии и наработку рекомбинантных белков бактериальными продуцентами проводили по стандартным методикам, [http://mvw.mcrckbiosciences.co.uk/docs/docs/PROT/TB055.pdf] с некоторыми модификациями. В питательную среду добавляли предшественник гема - 6-аминолевулиновую кислоту. Клеточные лизаты получали механическим разрушением с использованием аппарата French Press Cell Disrupter (Thermo Scientific, США).

1.2. Выделение плазмиднон ДНК. Плазмидную ДНК выделяли с помощью коммерческого набора GeneElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, Germany) или ультрацентрифугированием [http://www.molbiol.ru/protocol/04_04.html] в градиенте CsCl с помощью ультрацентрифуги Optima Max-E (Beckman Coulter, США). Концентрацию ДНК определяли с помощью спектрофотометра NanodroplOOO (Thermo Scientific, США). Качественные характеристики ДНК получали по результатам электрофореза в агарозных гелях (1,5-2%) [Маниатис и др., 1984], регистрируемых с помощью системы Gel-Doc (Bio-Rad, США) и программы Quantity One (Bio-Rad, США).

Для амплификации фрагментов гена leAOS3 и наработки рекомбинантных плазмид, содержащих точечные мутации в генах leA0S3 и mtHPL, были сконструированы и синтезированы специфичные праймеры (НПО «Синтол»). Сайт-направленный мутагенез проводили с помощью коммерческого набора QuickChange (Invitrogene, США). Иолимеразную цепную реакцию проводили с помощью амплификатора DNAEngine (Bio-Rad, США). Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили с помощью ДНК-анализатора 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems, США).

1.3. Получение рекомбинантных ферментов. Рекомбинантные ферменты очищали с помощью металлоаффишгой хроматографии на колонках Bio-Scaîe Mini Profinity IMAC в хроматографической системе BioLogic LP (Bio-Rad, США) по протоколу производителя с некоторыми модификациями. Концентрацию белка измеряли по флуоресценции со специфическими красителями на флуориметре Qubit (Invitrogene, США).

Электрофорез белков проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) с ДДС-Na по Лэмли [Остерман, 1981], с использованием прибора PowerPac Universal MiniProtcan (Bio-Rad, США) по прилагаемой инструкции. Белки окрашивапи Coomassie R250.

Препараты нативных алленоксидсинтаз льна и кукурузы получали из ацетонового порошка семян [Grechkin et а!., 1991].

1.4. Получение субстратов для исследования каталитического действия целевых ферментов. Гидроперекиси жирных кислот получали инкубацией линолевой и а-линоленовой кислот с соевой и томатной липоксигеназами. Полученные в результате реакции гидроперекиси очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В работе были использованы готовые колонки для ВЭЖХ с обращенной фазой Nucleosil 5 ODS (250x4.6 мм) (Macherey-Nagel, Германия), для ВЭЖХ с нормальной фазой Separon SIX (150x3.2 мм; 5 мкм) (TESSEK Ltd, Чехия), а также колонки для хирально-фазовой ВЭЖХ Chiralcel OD-H и Chiralcel ОВ-Н (Daicel Chemical Industries, Ltd., Япония).

15. Условия инкубации субстратов с целевыми ферментами. Эксперименты но исследованию особенностей катализа проводили по следующей схеме: (1) инкубация рекомбинантного фермента с гидроперекисью; (2) быстрая экстракция холодным гсксаном; (3) этерификация продуктов диазометаном; (4) упаривание растворителя в вакууме; (5) нерерастворение в метаноле и выдерживание в течение 30 мин при 23°С; (6) триметилсилирование. Для сравнения каталитического действия ферментов дикого типа и их мутантных форм использовали аналогичную схему, за исключением того, что перед метилированием продукты восстанавливали NaBH4 или NaB2H4 и гидрировали над платиной. Очистку продуктов проводили с помощью ВЭЖХ. Анализ очищенных продуктов проводили газовой хромато-масс-спектрометрией (ГХ-МС) с помощью масс-спектрометра QP5050A, соединенного с газовым хроматографом GC-17A (Shimadzu, Япония).

1.6. Повторность опытов. Данные представлены в виде средних значений из не менее 4 измерений в независимых биологических повторносгях. Статистический анализ данных проводили с применением стандартных математических методов (расчет среднеквадратического отклонения, сравнение средних по критерию Стьюдепта).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Получение рекомбинантного фермента LeAOS3

В данных исследованиях был использован рекомбинантный фермент LeAOS3. Для его наработки нами был получен бактериальный продуцент с помощью трансформации клеток Е. coli штамма Rosetta-gamiTuner(DE3)pLysS (Novagen, США) рекомбинантной плазмидой pET23bAOS3. Плазмида была любезно предоставлена доктором А. Хоу из Мичиганского университета. Клоны продуцента, лизаты которых обладали достаточно высокой специфической алленоксидсинтазной активностью, использовали в препаративных экспериментах. Дополнительная последовательность из шести гистидинов, добавленная к С-концу целевого белка, позволила нам провести процедуру металлоаффинной очистки, в результате чего были получены препараты

LcA0S3 в концентрации 2,5 - 3 мг/мл. Высокая степень очистки была подтверждена с помощью электрофореза белков в ИАЛГ с ДЦС-Na.

2.2. Продукты превращения 9-гидроисрскиси лкнолевой кислоты (9-ГПОД) под действием LeAOS3

Большинство растительных алленоксидсинтаз (АОС), принадлежащих подсемейству CYP74A цигохромов Р450 [Tijet, Brash, 2002], катализируют синтез окиси аллепа, но не участвуют в их циклизации. Окиси аллена, продуцируемые из линолевой кислоты, претерпевают спонтанный гидролиз, но не способны циклизоваться [Grechkin, 1994; Grechkin et al, 2000]. Недавно обнаруженные АОС картофеля и томата (CYP74C) представляют собой исключения. Среди продуктов реакции, катализируемой этими ферментами, наблюдается значительное количество циклопентенона 10-оксо-11-фитоеновой кислоты (Ю-ОФЕК) наряду с (12Z)-9-гидрокси-Ю-оксо-12-октадеценовой кислотой (а-кетолом) [Hamberg, 2000; Itoh et al.,

Для выявления зависимости профиля продуктов реакции от концентрации LeAOS3 9-ГПОД (100 мкг) инкубировали с различными количествами LeAOS3 при О'С в течение 10 секунд, и продукты анализировали с помощью ГХ-МС в виде метиловых эфиров триметилсилил-производных (ТМС-производных).

Поскольку ожидаемым первичным продуктом катализа LeAOS3 является нестабильная окись аллена (12Z)-9,10-эпоксиоктадека-10,12-диеновая кислота (9,Ю-ЭОД), продукты инкубации после быстрой экстракции подвергали метанолизу. Эта стадия позволяла регистрировать наличие окиси аллена, эффективно превращая 9,Ю-ЭОД в рацемический метоксикетон [Hamberg,

Hughes, 1989].

При инкубации субстрата с 0.5 мкг LeAOS3 (Рис. 1А) основным улавливаемым продуктом был мстоксикстон (Рис. 2Б), соответствующий окиси аллена 9ДО-ЭОД. Кроме того, среди продуктов

метоксикетон.

2002].

«исКЮФЕК I МК транс-Ю-ОФЕК \

Mz ^

152- .

а-кетап д /

ццс-Ю-ОФЕк] транс-Ю-ОФЕК \ А

а-кетол ^

mix

152.__-А

201--—

16.0 t (мин)-

цис-Ю-ОФЕК транс-IQ-ОФЕК I

т/г 152^

а-кетол 1

ZZZ

15.0 16.0

t (мин)-?>■

Рис. 1. Хроматограмма продуктов реакции 9-ГПОД с LcAOS3 в концентрациях: А - 0.5 мкг, Б - 2 мкг, В - 5 мкг, Г - 40 мкг. Ю-ОФЕК - 10-оксо-11-фитоеновая кислота, МК -

67 82

jlULUJ

50 100

152:

♦H!

152

123

Аж.

Лт^^^^СООМе

277

ЛГ

зоз

150

171/2 ■

250

300

201

137

95109

163

реакции присутствовал а-кетол - продукт гидролиза 9,Ю-ЭОД - и соединения, определенные как транс- и цкс-Ю-ОФЕК (Рис. I).

В результате инкубации 9-ГГГОД в тех же условиях с большими концентрациями ЬеА083 (2, 5 или 40 мкг) профили продуктов значительно менялись (Рис. 1Б-Г)-Выход продукта метанолиза, соответствующего остаточной окиси аллена, постепенно

снижался, тогда как

циклопентенонов и а-кетола увеличивался. После инкубации с наибольшим количеством ЬеЛОБЗ продукт метанолиза не выявлялся (Рис. 1Г). Это означает, что вся 9-ГПОД полностью превратилась через 9,Ю-ЭОД в а-кетол (Рис. 2В) и циклопептеноп (Рис. 2А) за 20 секунд при 0°С. Таким образом, наблюдаемая скорость превращения 9,Ю-ЭОД в присутствии ЬеАОБЗ значительно вьппе, чем ожидаемая скорость спонтанного распада окиси аллена (время полужизни 30 секунд при 0°С).

Получение циклопентенона в качестве продукта реакции было подтверждено также с помощью ядерно- магнитного резонанса.

Следует отметить, что у-кетол, об образовании которого в реакции, катализируемой ЬеАОвЗ, сообщалось ранее [ЙоЬ е/ а1, 2002], не был обнаружен нами ни в одном из многочисленных экспериментов с ЬеАОБЗ.

0 1 оме

277 309 340

1С0

¡259

150

200

250

300

351

т!2 ■

о ; otms 73 VHk^^-vCOOM' 253

155

.|ЦД.| I V

383

\ М+ 367 ) 398

100

200 mtz

400

Рис. 2. Масс-спектры продуктов реакции 9-ГПОД с разными концентрациями LeAOS3: А - метиловый эфир рацемического цые-циклопентенона; Б -продукт метанолиза окиси аллена; В - а-кегтол в виде метилового эфира ТМС-производного.

23. Анализ энантиомерного состава «(ио10-оксо-11-фитоеновой кислоты

Данные анализа энантиомерного состава показали, что продукт реакции LeAOS3 являлся полностью рацемическим и состоял из равных частей (9Л,13Л) и (95,135) энантиомеров. Оба энантиомера давали одинаковые пики с максимумом поглощения при 215 нм.

2.4. Анализ энантиомерного состава анализ а-кетола и метоксикетона

После инкубации 9-ГПОД с LeAOS3 а-кетол выделяли и очищали с помощью нормально-фазовой ВЭЖХ, и анализировали его энантиомерный состав с помощью

хиралыю-фазовой ВЭЖХ. а-Кетол, синтезированный ЬеАОБЗ, был представлен преимущественно (9 К) энантиомером (92%). В то же время, га-кетол, синтезированный кукурузным ферментом ¿тАОЗ (СУР74А), являлся в значительной мере рацемическим; (9Я) и (95) энантиомеры присутствовали в соотношении 62:38. Избирательное образование (9/?)-а-кетола в присутствии ЬеАОЭЗ означает, что окись аллена - первичный продукт этих ферментов - гидролизуется, в основном, по 8^2 механизму. В отличие от гидролиза, метанолиз окиси аллена не является стереоспецифическим. Соотношения (9К) и (95) энантиомеров продукта метанолиза и а-кетола, полученного в результате действия аллеиоксидсинтазы кукурузы, были практически одинаковыми.

2.5. Превращение 13-гидроперекнсц линолевой кислоты (13-ГПОД) под действием ЬеАОвЗ

т!г

152*

253'

шраие-ЮОФЕК i К

а-кетол цис-Ю-ОФЕК Ч

... .

15.0

16.0 ((мин) —

17.0

Ус

18.0

т/г

238.

270'

цис-12-ОФЕК 1

15.0

16.0 ((мин) —

17.0

18.0

т/г 238n^ _ 270— -

15.0

16.0 ((мин) —

17.0

На основании данных литературы субстратами ЬеЛОЯЗ могут быть как 9-, так и 13-гидроперекиси линолевой кислота. При инкубации ЬеАОБЗ с 13-ГПОД (Рис. 3), окончательным продуктом реакции был, в основном, а-кетол (Рис. ЗБ). Выход циклопентенона относительно а-кстола был примерно в 10 раз меньше, чем в случае превращения 9-ГПОД (Рис. ЗА). Основным изомером циклопентенона, полученным из 13-ГПОД (Рис. ЗБ), являлась цис-12-оксофитоеновая кислота (цис-

12-ОФЕК). В результате инкубации

13-ГПОД с АОС льна (СУР74А) образования циклопентснонов не происходило (Рис. ЗВ).

Рис. 3. Хроматограмма продуктов реакции 9-ГПОД (А) и 13-ГПОД (Б) с LeAOS3 и 13-ГПОД с АОС льна (В).

2.6. Образование окиси аллена под действием ZmAOS кукурузы (CYP74A) и ее дальнейшее превращение после добавления LeAOS3 in situ

Для дополнительного подтверждения превращения 9-ЭОД в циклопентснон и а-кетол в результате каталитического действия LeAOS3 после инкубации 9-ГПОД (100 мкг) с кукурузной алленоксидсинтазой ZmAOS (CYP74A) в течение 10 секунд в реакционную смесь добавляли LeAOS3 и инкубировали в течение дополнительных 10

m/z 152^.

201--

259—"

«ис-Ю-ОФЕК а-кетоп Mctokchkctohi

16.0 f (midi)-

1 Метоксикетон

секунд. Окись аллена - 9,Ю-ЭОД - являлась основным продуктом, образуемым под действием ZmAOS (Рис. 4Г)- За 10 секунд происходило практически полное превращение 9-ГПОД. Инкубация после добавления LeAOS3 приводила к превращению окиси аллена в Ю-ОФЕК и а-кетол (Рис. 4А). В двух контрольных экспериментах - с кипяченым ферментом LeAOS3 и белковым препаратом клеток Е. coli, несущих вектор рЕТ23Ь без рекомбинантного гена - окись аллена оставалась не превращенной (Рис. 4Б и В, соответственно).

2.7. Предположительная схема механизма реакции, катализируемой LeAOS3

Полученные данные позволили нам предположить, что LeAOS3 является мультифункциональным ферментом, который катализирует три превращения (Схема 1). Продуктом первой реакции является короткоживущая окись аллена - 9,Ю-ЭОД (Схема 1, реакция 1), -синтезируемая и высвобождаемая из каталитического центра LeAOS3. Затем LeAOS3 вновь захватывает 9ДО-ЭОД для катализа двух последующих конкурирующих превращений, а именно гидролиза и циклизации (Схема 1, реакции 2 и 3, соответственно). Гидролиз, но не циклизация, протекает стереоспецифически. Окончательными продуктами LeAOS3 являются (9й)-а-кетол и рацемическая цис- Ю-ОФЕК.

m/z

152___

201-259 —-

16.0 f (мин)—

а-кетол

I Метоксикетон

т/г 152 201 — -259--

а-кетол

15.0

16.0 <(мин)-

Шетоксикетон

т/2 132

201--

259*—"

а-кетоп \

15.0 16.0

((мин)-

Рис. 4. Хроматограмма продуктов реакции 9-ГПОД с ZmAOS и: А - активной LeAOS3, Б - кипяченой LeAOS3, В -белковым препаратом клеток Е. coli, несущих вектор без вставки. Г -Хроматограмма продуктов реакции 9-ГПОД с ZmAOS.

рацемическая смесь

иис-Ю-ОФЕК

MUI.- lu-uwcn

Схема 1. Механизм реакции с участием LeAOS3.

2.8. Выбор сайтов для мутагенеза в первичной последовательности LeAOS3

В настоящее время клонирован ряд генов CYP74 [Grechkin, 2002; Stumpe, Fcussner, 2006], изучены свойства некоторых рекомбинантных белков. Показано, что все нитохромы Р450 имеют определенные консервативные домены, в частности, несколько «субстрат-узнагощих сайтов» [Goloh, 1992]. Некоторые из этих сайтов формируют стенки полости цитохромов Р450 и участвуют в катализе; один из них входит в состав I-снирали (в LeAOS3 соответствует участку 282-315). Однако конкретные аминокислотные остатки, участвующие в катализе, до сих пор не были определены. Мы полагаем, что к ним относятся шесть аминокислотных остатков в центре I-спирали (мы назвали их «центральный домен I-спирали», 1HCD), соответствующие участку 293-298 LcAOS3 (мотив AGFNSY). Выбор этого участка был основан на результатах сопоставления первичных последовательностей ферментов CYP74, проведенного с помощью программы Vector NT1 (Invitrogene, CHIA), и наложения третичных структур монооксигеназы цитохрома Р450 2с8 человека и алленоксидсинтазы Arabidopsis thaliana, проведенного с помощью программы VMD 1.8.6 [Humphrey ei al., 1996]. Абсолютно консервативный и необходимый для катализа монооксигеназной реакции треонин кислород-связывающего домена цитохрома 2с8 соответствует консервативному для всех ферментов семейства CYP74 аспарагину центрального домена 1-спирали алленоксидсинтазы Arabidopsis.

Практически все ферменты суперсемейства Р450 являются монооксигеназами, и для них характерно использование двух субстратов: непосредственно окисляемого соединения и молекулярного кислорода. Уникальным свойством ферментов семейства CYP74 является отсутствие необходимости во втором субстрате, а именно молекулярном кислороде. В реакции участвует кислород гидропероксигруппы окисленной жирной кислоты. Соответственно, 1HCD ферментов CYP74, соответствующий «кислород-связывающему» домену цитохромов Р450, который находится в непосредственной близости к гему, является вырожденным. С противоположной стороны к гему примыкает другой консервативный для всех цитохромов Р450 домен, названный ERR-триада (в LeAOS3 соответствует аминокислотным остаткам 354-370). Исходя из сопоставления первичных последовательностей мы предположили, что функция некоторых аминокислотных остатков, входящих в состав этих доменов, заключается в непосредственном участии в катализе ферментов CYP74.

Для проверки данной гипотезы мы провели замены аминокислот, входящих в состав IHCD и ERR-триады кДНК алленоксидсинтазы LeAOS3 (CYP74C3) томата, получили и проанализировали следующие мугантные формы LeAOS3: F295I, S297A, K302S, D359R и T366Y.

Мугантные формы рекомбинантной плазмиды были получены в ПЦР со специфичными праймерами, содержащими предполагаемые мутации. Натичие

мутаций в последовательностях генов было подтверждено определением первичной структуры соответствующего участка плазмиды.

Полученные плазмиды с модифицированными генами кАОБЗ использовали для получения мутантных форм рекомбинантных ферментов с помощью тех же процедур, что были использованы для получения фермента дикого типа.

2.9. Анализ продуктов 1>еА083 дикого типа и се мутантных форм

При инкубации ЬеАОБЗ

s-okcû-9:o »25» LeAOS3 дикого типа

(Ме эфир) \

пЛ

яй 5Й 2S9—--

7л

а-кегсп (МеЯМС)

158-'

5.0

'10.0 ' iis Й I7i sic

Время улавливания, мин

9-оксо-9Л (Me эфир]

пЛ

269-— 1И-"

UAOS3 мутантная форма F2S5I

а-кетол не выявляется

■ SJ)

.1 I I ï'j'iV

7S"

10.0 1*5. Время улавливания, мин

20.0

9-оксо-9:0 (Me эфир)

яй 253-

»58-

LeAOS3 мутантная форма S237A

а-кетол (МИТМС)

JL.

SJJ

7£

10.0

,11 il! | .Д. lis

16.0 ' 175

jp 9-о>ссо-9:С (Me эфир)

Время улавливания, мин LeAOS3 мутантная форма K3Q2S

20.0

168— 25«—

а-кетол (МеЯМС)

10Л 115 '11о .....17.Б

Время улавливания, мин

9-оксо-9;0 LeAOS3 мутантная форма T3S6Y (Ме эфир) а-кетол

(МеЯМС)

158*. 258"

rttrfiy

Ю.0 ïis 16.0 17.6 Время улавливания, мин

Рис. 5. Хроматограмма продуктов инкубации мутантных форм ЬеАОЭЗ с 9-ГПОД. 9-оксо-9:0 - 9-оксононановая кислота.

дикого типа с 9-ГПОД, основным продуктом был а-кетол, выявленный в виде метилового эфира ТМС-производного (Рис. 5А). Этот продукт образуется в результате гидролиза окиси аллена. Наряду с продуктами АОС было выявлено ничтожно малое количество 9-оксононановой кислоты в виде метилового эфира (Рис. 5А) -продукта, характерного для ГПЛ, - что означает, что ЬеАОЭЗ дикого типа продуцирует 9-оксононановую кислоту в качестве минорного продукта Тем не менее, продукты АОС являлись преимущественными. Дивиниловые эфиры обнаружены не были.

Мугантные формы ЬеАОБЗ также инкубировали с 9-ГПОД, и продукты реакции анализировали в виде метиловых эфиров ТМС-производных. Было показано, что все полученные нами мутантные формы ГеАОБЗ сохранили способность утилизировать 9-ГПОД.

Однако, наряду с продуктами, характерными для реакции LeAOS3, появились продукты, характерные для ГОЛ, а именно 9-оксононановая кислота (Рис. 5Б-Д). Мутантные формы F295I (Рис. 5Б), S297A (Рис. 5В), K302S (Рис. 5Г) и T366Y (Рис. 5Д) проявляли 13, 52, 36 и 72%, соответственно, тотальной активности LeAOS3 дикого типа. Анализ продуктов, формируемых этими мутантами, продемонстрировал кардинальные изменения в типе катализа. Все четыре мутанта проявляли активность гидропероксидлиазы (изомеразы), тогда как алленоксидсинтазная (дегидразная) активность была сильно снижена (S297A, K302S и T366Y) или отсутствовала (F2951).

С другой стороны, замена аспарапшовой кислоты на аргинин в ERR-триаде (D359R) не привела к изменениям в характере катализа.

Результаты настоящей работы демонстрируют, что первичные последовательности IHCD и ERR-трнады определяют тип катализа CYP74. IHCD и ERR-триаду можно использовать в качестве «отпечатков пальцев» CYP74, позволяя, как правило,

предсказывать тип катализа по первичной последовательности.

типа и се мутантных форм.

Полученные данные указывают на то, что все ферменты CYP74 контролируют гемолитическую перегруппировку с промежуточными продуктами — алкоксирадикалом и эпоксиаллильным радикалом (Схема 2) [Grcchkin, 2002; Grechkin, Hamberg, 2004; Grechkin et al., 2006]. Результаты сайт-направленного мутагенеза свидетельствуют, что эпоксиаллильный радикал является ключевой точкой катализа ферментов CYP74 (Схема 2). В зависимости от первичных последовательностей 1HCD и ERR-триады, эпоксиаллильный радикал либо теряет атом водорода с образованием окиси аллена, либо подвергается перегруппировке в радикал винилового эфира, который затем рекомбинирует с гидроксильным радикалом с образованием полуацегаля - первичного продукта ГПЛ (Схема 2).

2.10.Выбор сайтов для мутагенеза в первичной последовательности MtHPL к сравнительный анализ результатов сайт-направленного мутагенеза LeAOS3 и MtHPL

К настоящему времени все более вероятным становится предположение о том, что предковый фермент CYP74 мог обладать активностью гидропероксидлиазы

о-он

Fe Fe—ОН

(95)-ГПОД алкоксирадикал

I >— Fe-0

F295I, S297 A jr

K302S, T365Y эпоксиаллильный радикал

г"

ОН Полуацеталь (Спонтанно) ; Э-оксононановая кислота + (32)-ноненаль

—он

H2o-v|

Окись аллена (Спонтанно) Ct-кетол

Схема 2. Механизм реакции LeAOS3 дикого

(Гипотеза 1). Последующая дупликация генов привела к возможности появления новых функций в результате различных процессов, одним из которых является случайный точечный мутагенез, и, как следствие, появлению существующего разнообразия ферментов CYP74.

Альтернативой гипотезе 1 является предположение о том, что гипотетический предковый фермент CYP74 обладал некой иной активностью, нежели алленоксидсинтазная, гидропероксидлиазная или дивинилэфирсинтазная, а все ныне существующие ферменты произошли от этого гипотетического предка в результате процессов, аналогичных указанным в гипотезе 1 (Гипотеза 2).

К настоящему времени определены два сайта, необходимые для формирования типа катализа. Первый был определен в работе американских исследователей под руководством Рамана; ему соответствует Phel37 в последовательности алленоксидсинтазы Arabidopsis thaliana [Lee et al., 2008]. Второй сайт был определен в ходе настоящей работы по сайт-направленному мутагенезу LeAOS3. Он входит в состав последовательности 1HCD, и в LeAOS3 ему соответствует Phe295. Все обнаруженные па данный момент АОС содержат в обоих сайтах фенилаланин. ГПЛ содержат фенилаланин в домене IHCD и лейцин или изолейцин в сайте, определенном Раманом с сотр. [Lee et al, 2008]. ДЭС содержат лейцин или изолейцин в обоих сайтах.

Для получения дополнительных данных о существовании зависимости между первичной последовательностью IHCD и определенным типом катализа, а также с целью поиска фактов в пользу гипотезы 1 или 2 мы нроаншшзировали действие мутантных форм гидропероксидлиазы MtHPL люцерны (Medicago truncatula): F284I и N285T, полученных нами в результате сайт-направленного мутагенеза, а также F287V, N285A и G288I, любезно предоставленных доктором Ричардом Хыозом из Великобритании. В качестве субстрата для MtHPL мы использовали 13-гидроперекись а-линоленовой кислоты (13-ГПОТ).

Все мутаптпые формы сохранили способность утилизировать 13-ГПОТ. Помимо основного продукта реакции 12-оксо-(9/)-дсщеценовой кислоты (12-ОДДК) выявлялись дополнительные продукты, а именно (9Z, 1 !£)-13-оксотридецсновая (13-ОТДК) и (9Z)-11-оксоундеценовая (11-ОУДК) кислоты. Относительное количество этих новых продуктов в некоторых случаях превышало количество специфического продукта (Рис. 6Б-Е). В результате каталитического действия MtHPL дикого типа 11-ОУДК практически не выявлялась в качестве продукта реакции (Рис. 6А). Содержание 13-ОТДК среди продуктов реакции, кататизируемой ферментом дикого типа, было выше 11-ОУДК, но гораздо ниже осповного продукта (Рис. 6А).

Ранее некоторые исследователи сообщали, что аспарагин IHCD CYP74 (Asn285 в MtHPL) является абсолютно консервативным, и любая мутация этого сайта полностью уничтожит любую специфическую активность фермента CYP74 [Lee et ai, 2008]. Для проверки этого мы проанализировали мутантную форму MtHPL с заменой

N285A. Этот мутант оказался неспособным катализировать какое-либо превращение 13-ГПОТ (Рис. 6Г). Однако, проанализировав и сопоставив первичные последовательности IHCD CYP74, содержащиеся в геномных, транскриптомных или белковых базах данных, мы выявили несколько ферментов с нативной заменой в данном сайте (ГПЛ Helianthus annuus, Helianthus argophyllus, Glycine max и др.). В большинстве случаев аспарагин замещен на серии или треонин. Нами была получена мутантная форма MtHPL с заменой N285T. Этот фермент обладал низкой степенью специфической активности гидропероксидлиазы (Рис. 6Д), что является доказательством неабсолютной консервативности данного сайта.

Ю 1Ю1

„.8М

V MUOilWJ

MtHPL дикого типа

12-ОН.12Ю

(Ме/ТМС)

11-ОН-11:0 (Мс/ТМС) ■ ' fij1 '" '»V 1 1 >.ij 1

' ilia/1

* м!и

13-OH-13:0 (Me/TMC)

SI 7 . ........ Г I

1LM 1Й iiM

ii«E MtHPL мутантая форма N2S5T I д

MLN№N) 13-ОН-13:ОЙ

11-ОН-11:0 12-ОН-12:0 (Ме/ТМС)

(Ме/ТМС) (Ме/ТМС)

.-.....^Вз,......._Л.._ {у , /. It..

t.M

■ТШГШГ

; uj«otoo) h Я1К ItO)

b'sp

MtHPL мутантная форма

11-OH-11:0 (MefTMC)

12-OH-12:0 (Me/TMC)

F2S7V

13-OH-13:0 (Me/TMC)

1 iiii ' ' ii!» ' ' i 171 " ' uub

Рис. б. Хроматограмма продуктов инкубации 13-ГПОТ с MtHPL дикого типа (А) и ее мутантными формами: F2841 (Б), G288I (В), N285A (Г), N285T (Д) и F287V (Е).

Появление 13-океотридеценовой и 11-океоундененовой кислот свидетельствует о нарушениях в ферментативном катализе. Эти соединения являются результатом спонтанного а или p-разрезания (Схема 3). В обоих вариантах происходит задержка катализа после перегруппировки эпоксиаллильного радикала. В случае образования 13-ОТДК происходит разрыв С13-С14 связи. В случае образования 11-ОУДК, как мы предполагаем, происходит окисление эпоксиаллильного радикала с последующим разрывом С11-С12 связи.

Анализируя полученные данные, можно предположить следующее: если верна гипотеза 2, то замена F284I приведет к появлению дивиниловых эфиров в качестве продуктов реакции, поскольку оба сайта, необходимые для формирования типа катализа, содержат в данном случае изолейцины, как и типичные дивиниэфир-синтазы. Этого следует ожидать по аналогии с мутантной формой алленоксидсинтазы Arabidopsis thaliana F137L, полученной Раманом с сотр. [Lee ei al., 2008], в которой сайты, которые необходимы для формирования типа катализа, и продукты реакции соответствуют таковым у ГПЛ. Однако, если верна гипотеза 1, мы с большой долей вероятности не должны обнаружить дивиниловые эфиры в качестве продуктов реакции, катализируемой мутантной формой MtHPL F284I, так как для формирования дивинилэфирсинтазной активности в таком случае одной точечной мутации не достаточно.

Гидропероксидлиазная активность мутантной формы F284I была сильно снижена, и среди продуктов реакции дивиниловых эфиров обнаружено не было (Рис. 6Б), что подтверждает гипотезу 1. Данные, полученные в экспериментах с другими мутаптными формами MtHPL N285T, F287V, N285A, G288I (Рис. 6В-Е), также подтверждают эту гипотезу. У всех модифицированных ферментов наблюдалось появление новых продуктов, однако не вследствие приобретения новой специфической активности, а в результате нарушения в ферментативном катализе. Мутация N285A привела к потере активности (Рис. 6Г), что подтверждает важную роль аспарагина

(9Z.11£)-13-оксотридеценовая кислота Í

он Полуацеталь | (Спонтанно)

(92И1-оксоундеценовая кислота

(92)-12-оксододеценовэя кислота

Схема 3. Предполагаемые механизмы реакций, катализируемых МИП^ дикого типа и мутаптными формами Б2841, N2851, Р287У, Ы285А, 02881.

а этом сайте для катализа CYP74.

Полученные нами результаты по сайт-направленному мутагенезу LeAOS3 также частично подтверждают гипотезу 1. Все мутации F295I, S297A, K302S и T366Y привели к появлению активности ГПЛ, но не ДЭС, как можно было ожидать в случае мутантов F295I и D359R, исходя из сопоставления первичных последовательностей. Видимо, для превращения АОС и ДЭС точечной мутации не достаточно. В отличие от этого, для превращения АОС в ГГ1Л нужна замена в любом каталитически важном сайте.

Мы предполагаем, что гидропероксидлиазная реакция по механизму является базовой, а алленоксидсинтазная и дивиниэфирсинтазная реакции формируются в процессе видоизменения этой базовой реакции из-за дополнительного влияния боковых групп определенных аминокислот. Результатом мутаций является устранение этого влияния в той или иной степени и, как следствие, возвращение к базовому типу катализа (ГПЛ).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Большинство растительных алленоксидсинтаз, принадлежащих подсемейству CYP74A цитохромов Р450 [Tijet, Brash, 2002], катализируют синтез окисей аллена, но не участвуют в их циклизации. Окиси аллена, образуемые в результате каталитического действия алленоксидсинтаз подсемейства CYP74A, претерпевают спонтанный гидролиз и, в гораздо меньшей степени, спонтанную циклизацию. Недавно обнаруженные АОС картофеля и томата подсемейства CYP74C представляют собой исключения. Среди продуктов реакции, катализируемой этими ферментами, наблюдается значительное количество циклопентенонов наряду с а-кетолом [Hamberg, 2000; Itoh et al„ 2002].

В полном согласии с данными литературы [Hamberg, 2000; Itoh et al., 2002], первичным продуктом, продуцируемым и высвобождаемым из каталитического центра LeAOS3, являлась короткоживущая окись аллена. Таким образом, синтез окиси аллена является общей функцией АОС как подсемейства CYP74A, так и CYP74C.

В то же время, характер дальнейших превращений окиси аллена в присутствии LeAOS3 сильно различается по нескольким аспектам. Во-первых, время полужизни окиси аллена строго зависит от концентрации LeAOS3. Чем выше концентрация LeAOS3, тем меньше время полужизни 9,Ю-ЭОД. Во-вторых, 9,Ю-ЭОД сразу превращается в Ю-ОФЕК и а-кегол. Когда концентрация LeAOS3 достигает значения насыщения, происходит полное превращение 9-ГПОД через 9ДО-ЭОД в Ю-ОФЕК и u-кетол за 20 секунд при 0°С, pH 7.0. В-третьих, а-кетол образуется стереоспецифически (9R). Окончательными продуктами LeAOS3 являются (9R)-a-кетол и рацемическая ;/ие-10-оксо-11-фитоеновая кислота (Схема 4, путь А).

Этот путь метаболизма жириых кислот характерен не только для томата. В нашей лаборатории были проведены эксперименты по скринингу липоксигеназного каскада у растений и выявлено, что аналогичные пути превращения гидроперекисей жирных кислот в циклопентеноны и кетолы под действием алленоксидсинтаз характерны для ряда растений, в том числе имбиря, ландыша и подсолнечника.

Биологическое значение описанного пути превращения жирных кислот еще предстоит выяснить. Возможно, эти соединения образуются в результате действия каскадов, альтернативных образованию жасмоновой кислоты.

Практически все ферменты суперсемейства Р450 являются монооксигеназами, и для них характерно использование двух субстратов: непосредственно окисляемого соединения и молекулярного кислорода. Уникальным свойством ферментов семейства СУР74 является отсутствие необходимости во втором субстрате, а именно молекулярном кислороде. В реакции участвует кислород гидропероксигруппы окисленной жирной кислоты. Соответственно, центральный домен 1-спирали ферментов СУР74 является вырожденным. Аминокислотные остатки, участвующие в связывании и активации кислорода и переносе электронов у монооксигеназ, отсутствуют в последовательностях СУР74. Мы предположили, что функция центрального домена 1-спирали у СУР74 заключается во взаимодействии с гидроперекисной группировкой субстрата и непосредственном участии в реакциях, катализируемых ферментами СУР74. Кроме того, исходя из сопоставления первичных последовательностей и расположения другого консервативного домена ферментов СУР74 - ЕЮ1-триады - относительно гема, мы предположили, что некоторые аминокислотные остатки, входящие в его состав, также могут принимать участие в катализе специфических реакций.

Полученные нами данные демонстрируют превращение ферментов СУР74 в результате сайт-направленного мутагенеза (Схема 4). Четыре единичные мутации ЬеАОЗЗ (СУР74СЗ) Р2951, К3025, Т366У и Б297А превратили АОС (дегидразу) (Схема 4, путь А) в ГПЛ (изомеразу) (Схема 4, путь Б). Мутантные формы сохранили способность утилизировать 9-ГПОД. Однако, наряду с продуктами, характерными для реакции ЬеАОвЗ, появились продукты, характерные для ГПЛ, а именно 9-оксононановая кислота (Схема 4, путь Б). Если в случае замен К3028, Т366У и Б297А синтезировались продукты как алленоксидсинтазной, так и гидропероксидлиазной реакций, то в случае замены фенилаланина на изолейцин (Р2951) продуктов алленоксидсинтазной реакции практически не наблюдалось. Это свидетельствует о роли данных консервативных аминокислот в специфической функции фермента. С другой стороны, замена аспарагиновой кислоты на аргинин (035911) в ГИК-триаде не привела к изменениям в механизме катализа.

Результаты данной работы по сайт-направленному мутагенезу ЬсАОБЗ и МШРЬ частично подтверждают гипотезу о том, что предковый фермент СУР74 мог функционировать в качестве ГПЛ.

К настоящему времени определены два сайта, необходимые для формирования типа катализа. Первый был выявлен в работе Рамана с сотр. [Lee et al., 2008], второй -в результате настоящей работы. Алленоксидсингазы содержат фснилаланин в обоих сайтах. Гидропероксидлиазы содержат фенилаланин в домене IHCD и лейцин или изолейцин в сайте, определенном Рамапом с сотр. [Lee et al., 2008]. Дивинилэфирсинтазы содержат лейцин или изолейцин в обоих сайтах.

Поскольку ни одна из единичных мутаций в каталитически важных сайтах MtHPL, определенных ранее в экспериментах с LeAOS3, не привела к появлению нового каталитического механизма, характерного для семейства CYP74, тогда как четыре из пяти мутаций в LeAOS3 превратили данный фермент из дегидразы в изомеразу (частично или полностью), можно предположить, что гидронероксидлиазиая реакция по механизму является базовой, а алленоксидсиптазная и дивиниэфирсинтазная реакции формируются в процессе видоизменения этой базовой реакции из-за дополнительного влияния боковых групп определенных аминокислот.

ПГ4

(ЭД)-а-кетол

(9Z,11Е)-13-оксотридеценовая кислота

R'Окись аллена (Э.Ю-ЭОД)

| LeAOS3 [ wt

¿r"+ ¿;

Рацемическая цшг-10-ОФЕК

Элоксиаллильный радикал

LeAOS3 F2S5I, S297A K302S, T366Y

MtHPL F284I, F287V N285A, N285T 02881 Г Окисление

онс

(92)-11-оксоундеценовая кислота

|(Спонтанно)

Альдегид Альдокислота

Схема 4. Механизмы реакций, катализируемых ферментами СУР74 дикого типа и их мутаптными формами. А - механизм реакции, катализируемой LeAOSЗ дикого типа (тип катализа - дегидратация); Б - механизм реакции, катализируемой мутаптными формами LeAOSЗ и дикого типа (тип катализа - изомеризация);

В и Г - механизмы реакций, катализируемых мутаптными формами МШРЕ (нарушение ферментативного катализа). К=(СН2)7С02Ме; Я'=(СН2)4Мс для ЬсАОБЗ и Я- СН2СН=СНСН2Ме; 11'=(СН2)7С02Ме для МШРк

Результатом мутаций является устранение этого влияния в той или иной степени и, как следствие, возвращение к базовому типу катализа (ГПЛ). Все мутации LeAOS3 F295I, S297A, K302S и T366Y привели к появлению гидропероксидлиазной, но не дивинилэфирсинтазной, активности, как можно было ожидать в случае мутантов F295I и D359R. По-видимому, для превращения АОС в ДЭС не достаточно точечной мутации. В отличие от этого, превращение АОС в ГПЛ происходит при замене в любом каталитически важном сайте.

Результаты экспериментов по сайт-направленному мутагенезу свидетельствуют о принципиальной роли I-спирали и ERR-триады в структуре и каталитическом действии ферментов семейства CYP74. Насколько нам известно, до нашей работы [Toporkova et al., 2008] и выполненной независимо работы [Lee et al., 2008], в литературе не было описанных примеров принципиального изменения механизма катализа в результате сайт-направленного мутагенеза. Результаты экспериментов по мутагенезу открывают возможности для целенаправленного изменения каталитического действия ферментов CYP74 (Схема 4). Полученные нами данные подтверждают эволюционное происхождение существующего разнообразия семейства CYP74 ог единого предкового гена в результате дупликации и единичных мутаций.

ВЫВОДЫ

1. В отличие от алленоксидсинтаз подсемейства CYP74A, фермент LeAOS3, принадлежащий подсемейству CYP74C, является мультифункциональным и катализирует не только синтез, по также гидролиз и циклизацию окиси аллена.

2. Гидролиз окиси аллена под действием LeAOS3 протекает стереоспецифически, приводя к образованию (9Л)-а-кетола, тогда как циклизация приводит к образованию рацемической смеси г/ис-Ю-ОФЕК.

3. Методами биоинформатики выявлены гипотетические сайты, определяющие механизм каталитического действия ферментов CYP74. С помощью сайт-направленного мутагенеза проведены единичные замены аминокислот в LeAOS3: мутации F295I, K302S, и S297A в центре I-спирали и T366Y и D359R в ERR-триаде. В центре I-сиирали MtHPL с помощью сайт-направленного мутагенеза проведены замены F284I и N285T.

4. Мутации кардинально изменили механизм каталитического действия LeAOS3. Полученные мугантные формы проявляют активность гидропероксидлиазы (изомеразы), тогда как алленоксидсинтазная (дегидразная) активность либо сильно снижена (K302S, T366Y и S297A), либо полностью отсутствует (F295I).

5. Результаты экспериментов по сайт-направленному мутагенезу свидетельствуют, что эпоксиаллильный радик&т - центральный промежуточный интермедиат катализа ферментов CYP74 - либо теряет один атом водорода, приводя к образованию окиси аллена (фермент дикого типа), либо подвергается

перегруппировке в изомерный радикал, который рекомбипирует с гидроксильным радикалом с образованием нолуацеталя - первичного продукта ГПЛ (мутантные формы F295I, K302S, Т366У и S297A).

6. Помимо основного продукта (97)-12-оксододе ценовой кислоты в реакциях, катализируемых мутантными формами MtHPL, появляются (9Z,11£)-13-оксотридекадиеновая и (9Z)-11-оксоундецеиовая кислоты — продукты гемолитической фрагментации углеродного остова.

7. Консервативный аспарагин в центре I-спирали не является абсолютно необходимым для каталитической активности ферментов CYP74. Мутантная форма MtHPL N285T сохраняет остаточную активность гидропероксидлиазы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Топоркова, Я.Ю. Экспрессия и функциональная характеристика рскомбинаитнон алленоксидсинтазы томата / Я.Ю. Топоркова, И.Р. Чечеткин, Ю.В. I оголев // Сб. тезисов / Изд-во Путинского НЦ РАН. - Пущино, 2006. - С. 96-97.

2. Новый путь биосинтеза оксилипинов-циклопентенонов в растениях / А.Н. Гречкин, Л.Ш. Мухтарова, A.B. Огородникова, Ю.В. Гоголев, Я.Ю. Топоркова // Тез. докл. / Изд-во «ФизтехПрссс» КФТИ КазНЦ РАН. - Казань, 2006. - С. 32.

3. Экспрессия и функциональная характеристика рекомбинаптной алленоксидсинтазы томата / Я.Ю. Топоркова, Е.В. Осипова, И.Р. Чечеткин, Ю.В. Гоголев // Сб. тезисов / Москва, Пущино-на-Оке, 2006. - С. 92.

4. Получение и характеризация мутантных форм алленоксидсинтазы 3 томата / Я.Ю. Топоркова, И.Р. Чечеткин, Л.Ш. Мухтарова, Ф.К. Мухитова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин//Сб. тезисов / Изд-во Пущинского 1Щ. - Пущино, 2008.- С. 110-111.

5. Характеризация диких и мутантных форм некоторых ферментов подсемейства CYP74C цитохромов Р450 / Я.Ю. Топоркова, Н.В. Ланцова, И.Р. Чечеткин, Л.Ш. Мухтарова, Ф.К. Мухитова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Сб. научных трудов / Изд-во КГУ. - Казань, 2008. - С. 32-34.

6. Топоркова, Я.Ю. Изменение каталитических свойств LeAOS3 томата {Licopersicon esculentum) в результате замены отдельных аминокислот / Я.Ю. Топоркова, А.Н. Гречкин // Тезисы / Москва, Пущино, 2008-С. 177-178.

7. Бифункциональная (алленоксидсинтазная и алленоксидциклазная) ферментативная активность CYP74C3 из томатов / А.Н. Гречкин, Л.Ш. Мухтарова, Я.Ю. Топоркова, Ф.К. Мухитова // Сб. трудов / Изд-во Л рта. - Новосибирск, 2008.-С. 34.

8. Получение и характеризация мутантных форм некоторых ферментов подсемейства CYP74C цитохромов Р450 / Я.Ю. Топоркова, Н.В. Ланцова, И.Р. Чечеткин, Л.Ш. Мухтарова, Ф.К. Мухитова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Сб. трудов / Изд-во Арта. - Новосибирск, 2008. - С. 45.

9. The alteration of LeAOS3 catalysis type by site-directed mutagenesis / A.M. Husainov, Ya.Yu Toporkova, L.Sh. Mukhtarova, Yu.V. Gogolev, A.N. Grechkin // Abstracts / Изд-во КГУ. - Kazan, 2008. - P. 41.

10. Producing and characterization of tomato allene oxide synthase 3 LeAOS3 / E.V. Sofronova, Ya.Yu Toporkova, L.Sh. Mukhtarova, Yu.V. Gogolev, A.N. Grechkin // Abstracts / Изд-во КГУ. - Kazan, 2008. - P. 45.

11.Tomato CYP74C3 is a multifunctional enzyme not only synthesizing allene oxide but also catalyzing its hydrolysis and cyclization / A.N. Grechkin, L.S. Muchtarova, L.R. Latypova, Y.V. Gogolev, Y.Y. Toporkova, M. Hamberg H Chembiochcm. - 2008. - V. 9.-P. 2498-2505.

12. Determinants governing the CYP74 catalysis: conversion of allene oxide synthase into hydroperoxide lyase by site-directed mutagenesis / Y.Y. Toporkova, Y.V. Gogolev, L.S. Muchtarova, A.N. Grechkin // FEBS Letters. - 2008. - V. 582. - P. 3423-3428.

13. Alteration of catalytic properties of tomato allene oxide synthase LeAOS3 and alfalfa hydroperoxide lyase MtHPL / Ya.Yu. Toporkova, L.Sh. Muchtarova, Yu.V. Gogolev, A.N. Grechkin // Abstracts / Изд-во КГУ. - Kazan, 2009 - P. 69-70.

14.Софронова, E.B. Получение и очистка гидропероксидлиазы MtHPL Medicago truncatula / E.B. Софронова, Я.Ю. Топоркова, Ю.В. Гоголев // Материалы конгресса / РИО ПГУ. - Пермь, 2009. - С. 244.

15. Изменение каталитических свойств в результате сайт-направленного мутагенеза алленоксидсинтазы LeAOS3 томата / Я.Ю. Топоркова, Л.Ш. Мухтарова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Материалы конгресса / РИО ПГУ. - Перш, 2009. - С. 252.

16. Characterization of tomato allene oxide synthase LeAOS3 catalysis and its alteration by site-directed mutagenesis / Y.Y. Toporkova, Y.V. Gogolev, L.S. Mukhtarova, A.N. Grechkin // Abstract Book / Wiley-Blackwell, FEBS. - Prague, 2009.-P. 14.

17. Alteration of LeAOS3 (CYP74C3) catalysis by site-directed mutagenesis / Ya.Yu. Toporkova, I.R. Chechetkin, L.Sh. Mukhtarova, F.K. Mukhitova, Yu.V. Gogolev, A.N. Grechkin // Abstracts / Изд-во КГУ. - Kazan, 2008. - P. 64.

18. Recombinant enzymes: applications in studies of the plant lipoxygenase cascade / Yu.V. Gogolev, E.V. Osipova, Ya.Yu Toporkova, A.N. Grechkin II Abstracts / Изд-во КГУ. -Kazan, 2008.-P. 19.

19. Enzymes of CYP74 family in oxylipin biosynthesis: new products and new insights into the mechanism of catalysis / A.N. Grechkin, Ya.Yu Toporkova, E.V. Osipova, N.V. Lantsova, A.V. Ogorodnikova // Abstracts / Изд-во КГУ. - Kazan, 2008. - P. 20.

20. Получение и характеристика диких и мутантных форм алленоксидсинтазы LeAOS3 томата и гидропероксидлиазы MtHPL люцерны/ Я.Ю. Топоркова, Л.Ш. Мухтарова, Ю.В. Гоголев, A.I1. Гречкин // Материалы конференции / НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2009. - С. 471-473.

21. Изменение каталитических свойств в результате сайт-направленного мутагенеза алленоксидсинтазы LeAOS3 томата и гидропероксидлиазы MtHPL люцерны/ Я.Ю. Топоркова, Л.Ш. Мухтарова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Тезисы докладов / Изд-во «ФизтехПресс» КФТИ КазНЦ РАН. - Казань, 2009. - С. 364.

Подписано в печать 19.11.09г. Форм. бум. 60x80 1/16. Печ. л.1,75.

Тираж 150. Заказ № 222. Отпечатано с готового оригинал - макета в ООО «Вестфалика» г. Казань, ул. Б. Красная, 67. Тел.: 250-30-42

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Топоркова, Яна Юрьевна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Метаболизм оксилипинов.

1.2. Общая характеристика цитохромов Р450.

1.3. Общая характеристика ферментов семейства CYP цитохромов Р450.

1.3.1. Субстратная специфичность ферментов семейства СУР74.

1.3.2. Распространение и внутриклеточная локализация CYP74.

1.4. Алленоксидсинтаза.

1.5. Общая характеристика LeAOS3.

1.5.1. Предполагаемое функциональное значение LeAOS3.

1.6. Физиологическое значение продуктов реакций, катализируемых ферментами CYP74.

1.7. Независимые исследования взаимосвязи структуры и функций ферментов CYP74.

1.8. Ферменты семейства CYP74 вне царства растений.

1.9. Постановка цели исследования.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы и векторы.

2.1.1. Характеристика штаммов.

2.1.2. Характеристика вектора рЕТ23.

2.1.3. Хранение штаммов Е. coli и рекомбинантных плазмид.

2.2. Питательные среды.

2.3. Приготовление компетентных клеток Е. coli.

2.4. Трансформация компетентных клеток Е. coli.

2.5. Индукция синтеза рекомбинантных белков.

2.6. Выделение и очистка рекомбинантного белка.

2.7. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле.

2.8. Выделение и очистка препаративных количеств плазмидной ДНК.

2.9. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле.

2.10. Амплификация фрагментов целевых генов с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР).

2.11. Сайт-направленный мутагенез.

2.12. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.13. Реактивы и материалы для исследований катализа рекомбинантных ферментов.

2.14. Получение гидроперекисей жирных кислот.

2.15. Инкубация рекомбинантного фермента LeAOS с 9-гидроперекисью линолевой кислоты.

2.16. Получение алленоксидсинтаз из семян кукурузы и льна.

2.17. Микропрепаративные инкубации.

2.18. Анализ энантиомерного состава продуктов реакций, катализируемых LeAOS3.

2.19. Инкубации ферментов LeAOS3 и MtHPL дикого типа и их мутантных форм с гидроперекисями жирных кислот.

2.20. Анализ продуктов реакций, катализируемых CYP74, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2.20.1. Хроматография на обращенной фазе.

2.20.2. Хроматография на нормальной фазе.

2.20.3. Анализ энантиомеров с помощью хроматографии на хиральной фазе.

2.21. Спектральные исследования.

2.22. Методы биоинформатики анализа структуры CYP74.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Клонирование и экспрессия рекомбинантного гена leAOS3.

3.2. Получение очищенного рекомбинантного фермента LeAOS3.

3.3. Продукты превращения 9-гидроперекиси линолевой кислоты под действием LeAOS3.

3.4. Анализ энантиомерного состава цис-10-оксо-11 -фитоеновой кислоты.

3.5. Анализ энантиомерного состава а-кетола и метоксикетона.

3.6. Превращение 13-гидроперекиси линолевой кислоты под действием LeAOS3.

3.7. Метанол из окисей аллена, синтезированных в результате инкубации 13-гидроперекисей с LeAOS3 (CYP74C) и

ZmAOS кукурузы CYP74A).

3.8. Образование окиси аллена под действием

АОС кукурузы (CYP74A) и ее дальнейшее превращение после добавления LeAOS3 in situ.

3.9. Предположительная схема механизма реакции, катализируемой LeAOS3.

3.10. Исследование взаимосвязи между структурой и функцией ферментов методом сайт-направленного мутагенеза.

3.11. Определение положения IHCD в первичной последовательности CYP74.

3.12. Выбор сайтов для мутирования в LeAOS3.

3.13. Анализ продуктов LeAOS3 дикого типа и ее мутантных форм.

3.14. Выбор сайтов для мутагенеза в первичной последовательности MtHPL и сравнительный анализ результатов сайт-направленного мутагенеза LeAOS3 и MtHPL.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Алленоксидсинтаза CYP74C3 томата"

Постановка проблемы и ее актуальность. В онтогенезе растений и формировании у них ответа на стрессовые факторы важная роль принадлежит ферментам липоксигеназной сигнальной системы: цитохромам Р450 семейства CYP74 и липоксигеназам. Результатом работы этой системы является образование окисленных производных жирных кислот - оксилипинов. Ок-силипины относятся к одной из основных групп биоактивных соединений, образующихся в различных организмах в результате окислительного метаболизма полиненасыщенных жирных кислот [Itoh et al., 2002; Stumpe, Feussner, 2006]. В настоящее время имеется достаточно информации, чтобы считать липоксигеназный путь превращения мембранных липидов самостоятельной сигнальной системой [Тарчевский, 2001].

Основное внимание исследователями уделяется изучению продуктов превращения 13-гидроперекисей жирных кислот, к которым относятся жас-моновая кислота и ее производные. Меньше известно о биосинтезе и функциях других членов семейства оксилипинов у растений.

Первую реакцию в пути биосинтеза жасмоновой кислоты, а именно синтез окиси аллена, катализируют алленоксидсинтазы (АОС). Все алленок-сидсинтазы катализируют образование окисей аллена из гидроперекисей жирных кислот: 13-изомеры являются субстратами для алленоксидсинтаз подсемейства CYP74A, 9-изомеры — для алленоксидсинтаз CYP74C. Время полужизни окисей аллена составляет 30 секунд при 0°С, поэтому в качестве продуктов алленоксидсинтазной реакции регистрируются продукты их дальнейших превращений, включающие а- и у-кетолы, образующиеся в результате спонтанного гидролиза, а также циклопентеноны — продукты циклизации окисей аллена, протекающей либо под действием фермента алленоксидцик-лазы, либо спонтанно. Спонтанный гидролиз идет гораздо интенсивнее, чем спонтанная циклизация, в результате чего циклопентеноны в качестве окончательного продукта реакции, катализируемой алленоксидсинтазами подсемейства CYP74A, регистрируются в следовых количествах. В отличие от этого, среди продуктов реакций, катализируемых алленоксидсинтазами подсемейства CYP74C, в частности LeAOS3, наблюдается значительное количество циклопентенонов. Этот факт до сих пор не имеет объяснения. Физиологическая роль многих продуктов LeAOS3 также до настоящего времени остается неизвестной. Кроме того, не изучены каталитические свойства данного фермента. Особый интерес представляет филогенез LeAOS3, поскольку ее первичная структура обнаруживает большую гомологию с некоторыми гид-ропероксидлиазами (ГПЛ) и дивинилэфирсинтазами (ДЭС), чем с 13-АОС других растений. Имеются основания полагать, что изучение данного белка может дать ключ к пониманию эволюции семейства CYP74 в целом.

Цель и задачи исследования. Целью наших исследований было выявление особенностей каталитического действия фермента подсемейства CYP74C цитохромов Р450 алленоксидсинтазы LeAOS3 (CYP74C3) томата (Lycopersicon esculentum) дикого типа и его мутантных форм и сравнение их с особенностями каталитического действия других (классических) представителей подсемейства CYP74C — гидропероксидлиаз. Были поставлены следующие задачи:

1. Получение рекомбинантной алленоксидсинтазы LeAOS3 (CYP74C3) и выяснение особенностей механизма катализа в сравнении с алленоксидсинтазами подсемейства CYP74A.

2. Выявление консервативных особенностей строения каталитически важных доменов различных ферментов семейства CYP74.

3. Выбор участков для модификаций полипептидной цепи и получение мутантных форм LeAOS3 с единичными заменами аминокислот с помощью сайт-направленного мутагенеза. Сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.

4. Получение мутантных форм классического представителя подсемейства CYP74C гидропероксидлиазы MtHPL люцерны (Medicago truncatula) с единичными заменами аминокислот с помощью сайт-направленного мутагснеза. Сравнение особенностей каталитического действия мутантных форм LeAOS3 и MtHPL.

Научная новизна работы. Впервые показано, что фермент LeAOS3, принадлежащий подсемейству CYP74C цитохромов Р450, является мульти-функциональным и катализирует не только синтез, но также гидролиз и циклизацию окиси аллена, в отличии от большинства алленоксидсинтаз (CYP74A), катализирующих синтез окисей аллена, но не участвующих в их дальнейших превращениях. Показано, что продуктами LeAOS3 являются: образующийся стереоспецифически (9£)-а-кетол и рацемическая смесь цис-Ю-оксо-11-фитоеновой кислоты (^ис-Ю-ОФЕК).

Проведен сравнительный анализ первичных последовательностей ферментов — представителей семейства CYP74; выявлены гипотетические первичные детерминанты катализа - сайты, находящиеся в каталитически важных доменах, имеющих закрепленные последовательности у ферментов с разным типом катализа (алленоксидсинтазы, гидропероксидлиазы и дивини-лэфирсинтазы).

На основании сравнения первичных и третичных структур моноокси-геназ Р450 и ферментов семейства CYP74 выбраны сайты для предполагаемых направленных модификаций представителей подсемейства CYP74C: алленоксидсинтазы LeAOS3 томата и гидропероксидлиазы MtHPL люцерны, проведен сайт-направленный мутагенез по выявленным гипотетическим сайтам — детерминантам катализа CYP74 - соответствующих генов, изучены каталитические свойства мутантных форм.

Впервые показано изменение механизма каталитического действия ферментов семейства CYP74 в результате замены отдельных аминокислот, входящих в состав доменов, находящихся в активном центре вблизи гема. Мутантные формы LeAOS3 обладают гидропероксидлиазной (изомеразной) активностью, тогда как алленоксидсинтазная (дегидразная) активность снижена, либо полностью отсутствует. Среди продуктов реакций, катализируемых мутантными формами MtHPL, обнаруживаются новые продукты в результате нарушений в ферментативном катализе.

Впервые проведено направленное превращение ферментов CYP74 в результате замены отдельных аминокислот, которое может служить подтверждением дивергенции генов CYP74 в ходе их эволюции от единого гипотетического предка с гидропероксидлиазной активностью, существовавшего у примитивных аэробов.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные вносят вклад в понимание функционирования одной из ключевых сигнальных систем растения, способствующей его адаптации к неблагоприятным для роста условиям. Изучены механизмы образования продуктов функционирования липоксигеназной сигнальной системы - оксилипинов, участвующих в процессах онтогенеза растений, таких как созревание плодов, прорастание семян, образование пыльцы, развитие цветков, корней и других органов, а также в формировании ответа на стрессовые факторы.

Разработаны системы получения и очистки препаративных количеств ферментов семейства CYP74. Использование технологии рекомбинантных ДНК и различных систем экспрессии дает возможность получения рекомбинантных белков CYP74 для последующего возможного использования в промышленности, которое ограничено низкой доступностью ферментов данного класса из природных источников.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 2006 по 2009 гг. в соответствии с планом научных исследований Учреждения РАН КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы и цитохромы семейства CYP74: структура и роль в катализе биосинтеза оксилипинов — эндогенных биорегуляторов растений» (гос. регистрационный номер: 01200901959). Исследования автора, как исполнителя по данной тематике, частично поддержаны грантами РФФИ № 06-04-48430-а «Липоксигеназы растений. От первичного строения — к пониманию молекулярных механизмов действия», № 09-04-00915-а «Ферменты CYP74: контроль биосинтеза регуляторных оксилипинов у растений», № 09-04-12222-офим «Семейство генов CYP74 Zea mays: структура, экспрессия, роль в липоксигеназном сигнальном каскаде», а также грантом ведущей научной школы академика И.А. Тарчевского НШ № 5492.2008.4 «Сигнальные системы клеток — медиаторы, протеом». Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Положения, выносимые на защиту:

1. В отличие от алленоксидсинтаз подсемейства CYP74A, фермент подсемейства CYP74C LeAOS3, является мультифункциональным. LeAOS3 катализирует не только синтез, но также гидролиз и циклизацию окиси аллена.

2. Первичный продукт LeAOS3 — окись аллена - после высвобождения из активного центра вновь захватывается ферментом, катализирующим ее вторичные превращения, а именно гидролиз и циклизацию с образованием 9(R)-а-кетола и рацемической ^wc-10-оксофитоеновой кислоты, соответственно.

3. Результаты экспериментов по сайт-направленному мутагенезу свидетельствуют о принципиальной роли центрального домена I-спирали и ERR-триады в формировании определенного типа катализа ферментов семейства CYP74. Все ферменты CYP74 относятся к близкородственной филогенетической группе, несмотря на широкий спектр каталитических функций.

2008); на Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); па Международном симпозиуме «Растительные липиды и оксилипины» (Казань, 2008); на Межвузовской конференции по современной биологии (Казань, 2008); на

2-ом Международном семинаре по липидным медиаторам (Испания, Валья-долид, 2008); на Международном симпозиуме «Регуляторные оксилипины» (Швейцария, Лозанна, 2009); на 34-ом конгрессе FEBS «Life's Molecular Interactions» (Чехия, Прага, 2009); на Международной конференции «Симби

03-2009: Биология - расширение границ» (Казань, 2009); на II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); на Всероссийской конференции «Устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды» (Иркутск,

2009); на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), а также на итоговой конференции Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2009). Работа является призером Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008). По результатам работы опубликовано две статьи в зарубежных рецензируемых изданиях.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Топоркова, Яна Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. В отличие от алленоксидсинтаз подсемейства CYP74A, фермент LeAOS3, принадлежащий подсемейству CYP74C, является мульти-функциональным и катализирует не только синтез, но также гидролиз и циклизацию окиси аллена.

2. Гидролиз окиси аллена под действием LeAOS3 протекает стереоспеци-фически, приводя к образованию (9^?)-ос-кетола, тогда как циклизация приводит к образованию рацемической смеси г/ио10-0ФЕК.

3. Методами биоинформатики выявлены гипотетические сайты, определяющие механизм каталитического действия ферментов CYP74. С помощью сайт-направленного мутагенеза проведены единичные замены аминокислот в LeAOS3: мутации F295I, K302S, и S297A в центре I-спирали и T366Y и D359R в ERR-триаде. В центре I-спирали MtHPL с помощью сайт-направленного мутагенеза проведены замены F284I и N285T.

4. Мутации кардинально изменили механизм каталитического действия LeAOS3. Полученные мутантные формы проявляют активность гидропероксидлиазы (изомеразы), тогда как алленоксидсинтазная (дегидраз-ная) активность либо сильно снижена (K302S, T366Y и S297A), либо полностью отсутствует (F295I).

5. Результаты экспериментов по сайт-направленному мутагенезу свидетельствуют, что эпоксиаллильный радикал - центральный промежуточный интермедиат катализа ферментов CYP74 — либо теряет один атом водорода, приводя к образованию окиси аллена (фермент дикого типа), либо подвергается перегруппировке в изомерный радикал, который рекомбинирует с гидроксильным радикалом с образованием полу-ацеталя - первичного продукта ГПЛ (мутантные формы F295I, K302S, T366Y и S297A).

6. Помимо основного продукта (9Z)-12-оксододеценовой кислоты в реакциях, катализируемых мутантными формами MtHPL, появляются

9ZJ 1£)-13-оксотридекадиеновая и (9Z)-11-оксоундеценовая кислоты — продукты гомолитической фрагментации углеродного остова. 7. Консервативный аспарагин в центре I-спирали не является абсолютно необходимым для каталитической активности ферментов CYP74. Му-тантная форма MtHPL N285T сохраняет остаточную активность гидро-пероксидлиазы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В полном согласии с данными литературы [Hamberg, 2000; Itoh et al, 2002], первичным продуктом, продуцируемым и высвобождаемым из каталитического центра LeAOS3, являлась короткоживущая окись аллена. Таким образом, синтез окиси аллена является общей функцией АОС как подсемейства CYP74A, так и CYP74C.

В то же время, характер дальнейших превращений окиси аллена в присутствии LeAOS3 сильно различается по нескольким аспектам. Во-первых, время полужизни окиси аллена строго зависит от концентрации LeAOS3. Чем выше концентрация LeAOS3, тем меньше время полужизни 9ДО-ЭОД. Во-вторых, 9ДО-ЭОД сразу превращается в Ю-ОФЕК и а-кетол. Когда концентрация LeAOS3 достигает значения насыщения, происходит полное превращение 9-ГПОД через 9ДО-ЭОД в Ю-ОФЕК и а-кетол за 20 секунд при 0°С, рН 7.0. В-третьих, а-кетол образуется стереоспецифически (9К). Окончательными продуктами LeAOS3 являются (9Я)-а-кетол и рацемическая цис-Ю-оксо-11-фитоеновая кислота (Схема 5, путь А). о—он он

9/?)-а-кетол LeAOS3 I wt он с" оон

9Z,11£)-13-okcotph декад неновая кислота t

В)

LeAOS3 wt

Окись аллена (9,Ю-ЭОД)

I LeAOS3 | wt

Рацемическая цис-Ю-ОФЕК

MtHPL F284I, F287V N285A, N285T G288I

Г) Окисление

Эпоксиалл ильный радикал

LeAOS3 F295I, S297A K302S, T366Y

MtHPL wt

Б) онс'

-соон

92)-11-оксоундеценовая кислота он Полуацеталь

Спонтанно) онс.

Альдегид

Альдокислота

Схема 5. Механизмы реакций, катализируемых ферментами CYP74 дикого типа и их мутантными формами. В результате единичных замен аминокислот произошли изменения типа катализа как LeAOS3, так и MtHPL. А -механизм реакции, катализируемой LeAOS3 дикого типа (тип катализа — дегидратация); Б — механизм реакции, катализируемой мутантными формами LeAOS3 и MtHPL дикого типа (тип катализа — изомеризация); В и Г - механизмы реакций, катализируемых мутантными формами MtHPL (нарушение ферментативного катализа). R=(CH2)7C02Me; R'=(CH2)4Me для LeAOS3. и R=CH2CH=CHCH2Me; R'=(CH2)7C02Me для MtHPL.

Мутантные формы сохранили способность утилизировать 9-ГПОД. Однако, наряду с продуктами, характерными для реакции LeAOS3, появились продукты, характерные для ГПЛ, а именно 9-оксононановая кислота (Схема 5, путь Б). Если в случае замен K302S, T366Y и S297A синтезировались продукты как алленоксидсинтазной, так и гидропероксидлиазной реакций, то в случае замены фенилаланина на изолейцин (F295I) продуктов алленоксидсинтазной реакции практически не наблюдалось. Это свидетельствует о роли данных консервативных аминокислот в специфической функции фермента. С другой стороны, замена аспарагиновой кислоты на аргинин (D359R) в ERR-триаде не привела к изменениям в механизме катализа.

Результаты данной работы по сайт-направленному мутагенезу LeAOS3 и MtHPL частично подтверждают гипотезу о том, что предковый фермент CYP74 мог функционировать в качестве ГПЛ.

К настоящему времени определены два сайта, необходимые для формирования типа катализа. Первый был выявлен в работе Рамана с сотр. [Lee et al., 2008], второй - в результате настоящей работы. Алленоксидсинтазы содержат фенилаланин в обоих сайтах. Гидропероксидлиазы содержат фени-лаланин в домене IHCD и лейцин или изолейцин в сайте, определенном Ра-маном с сотр. [Lee et al., 2008]. Дивинилэфирсинтазы содержат лейцин или изолейцин в обоих сайтах.

Поскольку ни одна из единичных мутаций в каталитически важных сайтах MtHPL, определенных ранее в экспериментах с LeAOS3, не привела к появлению нового каталитического механизма, характерного для семейства CYP74, тогда как четыре из пяти мутаций в LeAOS3 превратили данный фермент из дегидразы в изомеразу (частично или полностью), можно предположить, что гидропероксидлиазная реакция по механизму является базовой, а алленоксидсинтазная и дивинилэфирсинтазная реакции формируются в процессе видоизменения этой базовой реакции из-за дополнительного влияния боковых групп определенных аминокислот.

Этот путь метаболизма жирных кислот характерен не только для томата. В нашей лаборатории были проведены эксперименты по скринингу ли-поксигеназного каскада у растений и выявлено, что аналогичные пути превращения гидроперекисей жирных кислот в циклопентеноны и кетолы под действием алленоксидсинтаз характерны для ряда растений, в том числе имбиря, ландыша и подсолнечника.

Практически все ферменты суперсемейства Р450 являются моноокси-геназами, и для них характерно использование двух субстратов: непосредственно окисляемого соединения и молекулярного кислорода. Уникальным свойством ферментов семейства CYP74 является отсутствие необходимости во втором субстрате, а именно молекулярном кислороде. В реакции участвует кислород гидропероксигруппы окисленной жирной кислоты. Соответственно, центральный домен I-спирали ферментов CYP74 является вырожденным. Аминокислотные остатки, участвующие в связывании и активации кислорода и переносе электронов у монооксигеназ, отсутствуют в последовательностях CYP74. Мы предположили, что функция центрального домена I-спирали у CYP74 заключается во взаимодействии с гидроперекисной группировкой субстрата и непосредственном участии в реакциях, катализируемых ферментами CYP74. Кроме того, исходя из сопоставления первичных последовательностей и расположения другого консервативного домена ферментов CYP74 - ERR-триады — относительно гема, мы предположили, что некоторые аминокислотные остатки, входящие в его состав, также могут принимать участие в катализе специфических реакций.

Полученные нами данные демонстрируют превращение ферментов CYP74 в результате сайт-направленного мутагенеза (Схема 5). Четыре единичные мутации LeAOS3 (CYP74C3) F295I, K302S, T366Y и S297A превратили АОС (дегидразу) (Схема 5, путь А) в ГПЛ (изомеразу) (Схема 5, путь Б).

147

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Топоркова, Яна Юрьевна, Казань

1. Георгиев, Г.П. Метод быстрого выделения высокополимерной дезокси-рибонуклеиновой кислоты / Г.П. Георгиев // Биохимия. — 1959. — Т. 24. — Н. З.-С. 472-480.

2. Гловер, Д. Клонирование ДНК. Методы / Д. Гловер.— М.: Мир, 1988. -538 с.

3. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук. -М.: Мир, 1984. 480 с.

4. Остерман, JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) / Л.А. Остерман. -М.: Наука, 1981.-288 с.

5. Тарчевский, И.А. Метаболизм растений при стрессе (избранные труды) / И.А. Тарчевский. К.: Фэн, 2001. - 448 с.

6. Baldwin, SJ. Ketoconazole and sulphaphenazole as the respective selective inhibitors of P4503A and 2C9 / S.J. Baldwin, J.C. Bloomer, G.J. Smith, A.D. Ayrton, S.E. Clarke, R.J. Chenery // Xenobiotica. 1995. - V. 25. - P. 261270.

7. Bell, C.D. The age of the angiosperms: a molecular timescale without a clock / C.D. Bell, D.E. Soltis, P.S. Soltis // Evolution. 2005. - V. 59. - P. 12451258.

8. Black, S.D. P-450 cytochromes: structure and function / S.D. Black, M.J. Coon // Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 1987. - V. 60 - P. 35-87.

9. Blee, E. Envelope membranes from spinach chloroplasts are a site of metabolism of fatty acid hydroperoxides / E. Blee, J. Joyard // Plant Physiol. — 1996. -V. 102.-P. 821-828.

10. Blee, E. Phytooxylipins and plant defense reactions / Prog. Lipid Res. — 1998. -V. 37.-P. 33-72.

11. Blee, E. Impact of phyto-oxylipins in plant defense / Trends Plant Sci. 2002. -V. 7.-P. 315-322.

12. Bouarab, K. The innate immunity of a marine red alga involves oxylipins from both the eicosanoid and octadecanoid pathways. / K. Bouarab, F. Adas, E. Gaquerel, B. Kloareg, J.-P. Salau, P. Potin // Plant Physiol. 2004. - V. 135.-N. 3.-P. 1838-1848.

13. Brash, A.R. Isolation and characterization of natural allene oxides: Unstable intermediates in the metabolism of lipid hydroperoxides / A.R. Brash, S.W. Baertschi, C.D. Ingram, T.M. Harris // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. -V. 85.-P. 3382-3386.

14. Caldelari, D. A rapid assay for the coupled cell free generation of oxylipins / D. Caldelari, E.E. Farmer // Phytochemistry. 1998. - V. 47. - P. 599-604.

15. Chehab, E.W. Rice hydroperoxide lyases with unique expression patterns generate distinct aldehyde signatures in Arabidopsis / E.W. Chehab, G. Raman, J.W. Walley, J.V. Perea, G. Bame et al. // Plant Physiol. 2006. - V. 141.-P. 121-134.

16. Conconi, A. Intracellular levels of free linolenic and linoleic acids increase in tomato leaves in response to wounding / A. Conconi, M. Miquel, J.A. Browse, C.A. Ryan // Plant Physiol. 1996. - V. 111. - P. 797-803.

17. Creelman, R.A. Biosynthesis and action of jasmonates in plants / R.A. Creel-man, J.E. Mullet // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. - V. 48.-P. 355-381.

18. Dathe, W. Endogenous plant hormones of the broad bean, Vicia faba L. (-)-Jasmonic acid, a plant growth inhibitor in pericarp / W. Dathe, H. Ronsch, A. Preiss, W. Schade, G. Sembdner, K. Schreiber // Planta. 1981. - V. 153 - P. 530-535.

19. Demole, E. Isolement et de. Termination de la structure du jasmonate de methyle, constituant odorant characteristique de Г essence de jasmin / E. Demole, E. Lederer, D. Mercier // Helv. Chim. Acta. 1962. - V. 45. - P. 675-685.

20. Denisov, I.G. Structure and chemistry of cytochrome P450 / I.G. Denisov, T.M. Makris, S.G. Sligar, I. Schlichting // Chem. Rev. 2005. - V. 105. - P. 2253-2277.

21. Edwards, RJ. Identification and location of alpha-helices in mammalian cytochromes P450 / R.J. Edwards, B.P. Murray, A.R. Boobis, D.S. Davies // Biochemistry. 1989. - V. 28. - P. 3762-3770.

22. Farmer, E.E. Interplant communication: Airborne methyl jasmonate induces synthesis of proteinase inhibitors in plant leaves / E.E. Farmer, C.A. Ryan // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87.-P. 7713-7716.

23. Farmer, E.E. Regulation of expression of proteinase inhibitor genes by methyl jasmonate and jasmonic acid / E.E. Farmer, R.R. Johnson, C.A. Ryan // Plant Physiol. 1991.-V. 98.-P. 995-1002.

24. Farmer, E.E. Octadecanoid-derived signals in plants / E.E. Fanner, C.A. Ryan // Trends Cell Biol. 1992. - V. 2. - P. 236-241.

25. Fauconnier, M.-L. Purification and characterization of tomato leaf (Lycoper-sicon esculentum Mill.) hydroperoxide lyase / M.-L. Fauconnier, A.G. Perez, C. Sanz, M. Marlier // J. Agric. Food Chem. 1997. - V. 45. - P. 4232-4236.

26. Feng, P. Specificity of flax hydroperoxide isomerase / P. Feng, D.C. Zimmerman//Lipids. 1979.-V. 14.-P. 710-713.

27. Feussner, I. The lipoxygenase pathway / I. Feussner, C. Wasternack // Annu Rev Plant Biol. 2002. - V. 53. - P. 275-297.

28. Gardner, H.W. Sequential enzymes of linoleic acid oxidation in com germ: Lipoxygenase and linoleate hydroperoxide isomerase / J. Lipid Res. — 1970. -V. 11. — P.311-321.

29. Gardner, H.W. Decomposition of linoleic acid hydroperoxides. Enzymic reactions compared with nonenzymic / J. Agric. Food Chem. — 1975. — V. 23. — P. 129-136.

30. Gardner, H.W. Recent investigations into the lipoxygenase pathway of plants / Biochem. Biophys. Acta. 1991. - V. 1084. - P. 221-239.

31. Gobel, C. Oxylipin profiling reveals the preferential stimulation of the 9-lipoxygenase pathway in elicitor-treated potato cells / C. Gobel, I. Feussner,

32. A. Schmidt, D. Scheel, J. Sanchez-Serrano et al. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276.-P. 6267-6273.

33. Gobel, C. Lipid peroxidation during the hypersensitive response in potato in the absence of 9-lipoxygenases / C. Gobel, I. Feussner, S. Rosahl // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 52834-52840.

34. Gotoh, O. Structural characteristics of cytochrome P-450. Possible location of the heme-binding cysteine in determined amino-acid sequences / O. Gotoh, Y. Tagashira, T. Iizuka, Y. Fujii-Kuriyama // J. Biochem. (Tokyo). — 1983. V. 93.-P. 807-817.

35. Gotoh, O. Possible steroid binding site common to adrenal cytochrome P-450scc and prostatic steroid binding protein / O. Gotoh, Y. Tagashira, K. Mo-rohashi, Y. Fujii-Kuriyama // FEBS Lett. 1985. - V. 188. - P. 8-10.

36. Gotoh, O. Evolution, structure and gene regulation of cytochrome P-450 / O. Gotoh, Y. Fujii-Kuriyama // Frontiers in Biotransformation / K. Ruckpaul, H. Rein. Berlin: Akademie-Verlag, 1989.-V. l.-P. 195-243.

37. Gotoh, O. Substrate recognition sites in cytochrome P450 Family 2 (CYP2) proteins inferred from comparative analyses of amino acid and coding nucleotide sequences / The Journal of biological chemistry. 1992. - V. 267. - P. 83-90.

38. Goulitquer, S. Release of volatile aldehydes by the brown algal kelp Lami-naria digitata in response to both biotic and abiotic stress / S. Goulitquer, A. Ritter, F. Thomas, C. Ferec, J.P. Salaun, P. Potin // Chembiochem. 2009. -V. 10(6).-P. 977-82.

39. Grechkin, A.N. Cyclization of natural allene oxide fatty acids. The anchimeric assistance of P,y-double bond beside the oxirane and the reaction mechanism / Biochim Biophys Acta. 1994. - V. 1213. - P. 199-206.

40. Grechkin, A.N. The lipoxygenase pathway in garlic (Allium sativum L.) bulbs: detection of the novel divinyl ether oxylipins / A.N. Grechkin, F.N. Fazliev, L.S. Mukhtarova // FEBS Letters. 1995. - V. 371. - P. 159-162.

41. Grechkin, A.N. On the mechanism of biosynthesis of divinyl ether oxylipins by enzyme from garlic bulbs / A.N. Grechkin, A.V. Ilyasov, M. Hamberg // Eur J Biochem. 1997. - V. 245. - P. 137-142.

42. Grechkin, A.N. Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway / Prog. Lipid Res. 1998. - V. 37. - P. 317-352.

43. Grechkin, A. N. Formation of cyclopentenones from all-(E) hydroperoxides of linoleic acid via allene oxides. New insight into the mechanism of cycliza-tion / A. N. Grechkin, M. Hamberg // FEBS Lett. 2000. - V. 466 - P. 6366.

44. Grechkin, A.N. The lipoxygenase pathway in tulip (Tulipa gesneriana): detection of the ketol route / A.N. Grechkin, L.S. Mukhtarova, M.Hamberg // Biochem. J. 2000. - V. 352. - P. 501-509.

45. Grechkin, A.N. Hydroperoxide lyase and divinyl ether synthase / Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2002. - V. 68-69 - P. 457-470.

46. Grechkin, A.N. Biocatalysis by the plant lipoxygenase pathway hydroperox-ide-metabolizing enzymes / A.N. Grechkin, H.W. Gardner // Lipid Biotechnology / T.M. Kuo, H.W. Gardner. NY: Marcel Dekker, 2002. - P. 183-201.

47. Grechkin, A.N. The "heterolytic hydroperoxide lyase" is an isomerase producing a short-lived fatty acid hemiacetal / A.N. Grechkin, M. Hamberg // Bi-ochim Biophys Acta. 2004. - V. 1636. - P. 47-58.

48. Grechkin, A.N. Detection of a pathway from linoleate to a novel cyclopente-none: cw-12-oxo-10-phytoenoic acid in sunflower roots / A.N. Grechkin,

49. A.V. Ogorodnikova, O.I. Gnezdilov, L.S. Mukhtarova // ChemBioChem. — 2007. V. 8. - P. 2275-2280.

50. Green, M.T. Oxoiron(IV) in chloroperoxidase compound II is basic: implications for P450 chemistry / M.T. Green, J.H. Dawson, H.B. Gray // Science. — 2004. V. 304. - P. 1653-1656.

51. Gundlach, H. Jasmonic acid as a signal transducer in elicitor-induced plant cell cultures / H. Gundlach, M J. Muller, T.M. Kutchan, M.H. Zenk // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 2389-2393.

52. Hamberg, M. Mechanism of corn hydroperoxide isomerase: detection of 12,13(5)-oxido-9(Z),l 1-octadecadienoic acid / Biochim. Biophys. Acta. — 1987.-V. 920.-P. 76-84.

53. Hamberg, M. Biosynthesis of 12-oxo-10,15(Z)-phytodienoic acid: identification of an allene oxide cyclase / Biochem Biophys Res Comm. 1988. - V. 156.-P. 543-550.

54. Hamberg, M. Fatty acid allene oxides. III. Albumin-induced cyclization of 12,13(5)-epoxy-9(Z),l 1 -octadecadienoic acid / M. Hamberg, M.A. Hughes // Lipids. 1988. - V. 23. - P. 469-475.

55. Hamberg, M. Absolute configuration of 12-oxo-10,15(Z)-phytodienoic acid / M. Hamberg, O. Miersch, G. Sembdner // Lipids. 1988. - V. 23. - P. 521524.

56. Hamberg, M. Biosynthesis and conversions of fatty acid allene oxides / M. Hamberg, M.A. Hughes // Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukotriene Res. 1989. — V. 19.-P. 64-69.

57. Hamberg, M. Allene oxide cyclase: a new enzyme in plant lipid metabolism / M. Hamberg, P. Fahlstadius // Arch. Biochem. Biophys. 1990. - V. 276. -P. 518-526.

58. Hamberg, M. Oxylipin pathway to jasmonates: biochemistry and biological significance / M. Hamberg, H.W. Gardner // Biochim. Biophys. Acta. — 1992. -V. 1165.-P. 1-18.

59. Hamberg, M. A pathway for biosynthesis of divinyl ether fatty acids in green leaves/Lipids. 1998.-V. 33.-P. 1061-1071.

60. Hamberg, M. New cyclopentenone fatty acids formed from linoleic and lino-lenic acids in potato / Lipids. 2000. - V. 35. - P. 353-363.

61. Hasemann, C.A. Structure and function of cytochromes P450: a comparative analysis of thee crystal structures / C.A. Hasemann, R.G. Kurumbail, S.S. Boddupalli, J.A. Peterson, J. Deisenhofer // Structure. 1995. - V. 3. - P. 4162.

62. Hatanaka, A. The biogeneration of green odour by green leaves / Phytochem-istry. 1993. — Y. 34.-P. 1201-1218.

63. Hess, B.A. Mechanism of the rearrangement of vinyl allene oxide to 2-cyclopenten-l-one / B.A. Hess, L. Smentek, A.R. Brash, J.K. Cha // J. Am. Chem. Soc. 1999. - V. 121.-P. 5603-5604.

64. Hofmann, E. The crystal structure of Arabidopsis thaliana allene oxide cyclase: insights into the oxylipin cyclization reaction / E. Hofmann, Ph. Zerbe, F. Schaller//The Plant Cell. -2006. V. 18.-P. 3201-3217.

65. Howe, G.A. Cytochrome P450-dependent metabolism of oxylipins in tomato. Cloning and expression of allene oxide synthase and fatty acid hydroperoxide lyase / G.A. Howe, G.I. Lee, A. Itoh, L. Li, A.E. DeRocher // Plant Physiol. -2000.-Y. 123.-P. 711-724.

66. Howe, G.A. Oxylipin metabolism in response to stress / G.A. Howe, A.L. Schilmiller // Curr Opin Plant Biol. 2002. - V. 5. - P. 230-236.

67. Humphrey, W.F. VMD Visual Molecular Dynamics / W.F. Humphrey, A. Dalke, K. Schulten // J. Mol. Graphics. - 1996. - V. 14. - P. 33-38.

68. Imai, Y. Characterization of rabbit liver cytochrome P-450 (laurate omega-1 hydroxylase) synthesized in transformed yeast cells / J. Biochem. (Tokyo). -1988.-V. 103.-P. 143-148.

69. Itoh, A. Molecular cloning of a divinyl ether synthase: identification as a CYP74 cytochrome P450 / A. Itoh, G.A. Howe // J Biol Chem. 2001. - V. 276.-P. 3620-3627.

70. Itoh, A. Identification of a jasmonate-regulated allene oxide synthase that metabolizes 9-hydroperoxides of linoleic and linolenic acids / A. Itoh, A.L. Schilmiller, B.C. McCaig, G.A. Howe // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 46051-46058.

71. Jones, D.T. Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices / J. Mol. Biol. 1999. - V. 292.-P. 195-202.

72. Joo, H. Laboratory evolution of peroxide-mediated cytochrome P450 hy-droxylation / H. Joo, Z. Lin, F.H. Arnold // Nature. 1999. - V. 399 - P. 670673.

73. Kahn, R. Function and evolution of plant cytochrome P450 / R. Kahn, F. Durst // Recent Adv. Phytochem. 2000. - V. 34. - P. 151-189.

74. Kalb, V.F. Proteins from eight eukaryotic cytochrome P-450 families share a segmented region of sequence similarity / V.F. Kalb, J.C. Loper // Proc Natl Acad Sci USA 1988. - V. 85 - P. 7221-7225.

75. Kandzia, R. On the specificity of lipid hydroperoxide fragmentation by fatty acid hydroperoxide lyase from Arabidopsis thaliana / R. Kandzia, M. Stumpe, E. Berndt, M. Szalata, K. Matsui, I. Feussner // J Plant Physiol. 2003. - V. 160.-P. 803-809.

76. Kim, S.J. An efficient cyclopentenone formation via an allene oxide / S.J. Kim, J.K. Cha//Tetrahedron Lett. 1988. - V. 29.-P. 5613-5616.

77. Koda, Y. Possible involvement of jasmonic acid in various morphogenic events / Physiol. Plant. 1997. - V. 100. - P. 639-646.

78. Kolomiets, M.Y. A leaf lipoxygenase of potato induced specifically by pathogen infection / M.V. Kolomiets, H. Chen, R.J. Gladon, E.J. Braun, D.J. Han-napel//Plant Physiol.-2000.-V. 124. P. 1121-1130.

79. Kolomiets, M.V. Lipoxygenase is involved in the control of potato tuber development / M.V. Kolomiets, D.J. Hannapel, H. Chen, M. Tymeson, R.J. Gladon//Plant Cell-2001.-V. 13-P. 613-626.

80. Kramell, R. Amino acid conjugates of jasmonic acid induce jasmonate-responsive gene expression in barley (Hordeum vulgare L.) leaves / R. Kramell, O. Miersch, B. Hause, B. Ortel, B. Parthier, B. Wasternack // FEBS Lett. 1997.-V. 414.-P. 197-202.

81. Kronbach, T. Hybrid cytochromes P-450 identify a substrate binding domain in P-450IIC5 and P-450IIC4 / T. Kronbach, T.M. Larabee, E.F. Johnson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 8262-8265.

82. Kubigsteltig, I. Structure and regulation of the Arabidopsis thaliana allene oxide synthase gene /1. Kubigsteltig, D. Laudert, E.W. Weiler // Planta 1999. -V. 208.-P. 463-471.

83. Lambert, C. ESyPred3D: prediction of proteins 3D structures / C. Lambert, N. Leonard, X. De Bolle, E. Depiereux // Bioinformatics. 2002. - V. 18. - P. 1250-1256.

84. Lau, S.M. Low carbon monoxide affinity allene oxide synthase is the predominant cytochrome P450 in many plant tissues / S.M. Lau, P.A. Harder, D.P. O'Keefe //Biochemistry. 1993. -V. 32(8). - P. 1945-1950.

85. Laudert, D. Allene oxide synthase: a major control point in Arabidopsis thaliana octadecanoid signalling / D. Laudert, E.W. Weiler // Plant J. 1998. -V. 15.-P. 675-684.

86. Laudert, D. Transgenic Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana plants overexpressing allene oxide synthase / D. Laudert, F. Schaller, E.W. Weiler // Planta 2000. - V. 211. — P. 163-165.

87. Laughton, C.A. A molecular model for the enzyme cytochrome P450(17 alpha), a major target for the chemotherapy of prostatic cancer / C.A. Laughton, S. Neidle, M.J. Zvelebil, M.J. Sternberg // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. — V. 171.-P. 1160-1167.

88. Lee, D.-S. Structural insights into the evolutionary paths of oxylipin biosynthesis enzymes / D.-S. Lee, P. Nioche, M. Hamberg, C.S. Raman // Nature. -2008. V. 455. - P. 363-370.

89. Lindberg, R.L. Alteration of mouse cytochrome P450coh substrate specificity by mutation of a single amino-acid residue / R.L. Lindberg, M. Negishi // Nature 1989. - V. 339. - P. 632-634.

90. Mansuy, D. The great diversity of reactions catalyzed by cytochrome P450 / Сотр. Biochem. Physiol. Part. C. 1998. - V. 121. - P. 5-14.

91. Martinis, S.A. A conserved residue of cytochrome P-450 is involved in heme-oxygen stability and activation / S.A. Martinis, W.M. Atkins, P.S. Stayton, S.G. Sligar // J. Am. Chem. Soc. 1989. - V. 111. - P. 9252-9253.

92. Mast, N. Expression of human cytochrome P450 46A1 in Escherichia coli: effects of N- and C-terminal modifications / N. Mast, U. Andersson, K. Na-kayama, I. Bjorkhem, I.A. Pikulevaa // Arch. Biochem. Biophys. — 2004. — V. 428.-P. 99-108.

93. Matoba, T. Contribution of hydroperoxide lyase activity to n-hexanal formation in soybean / T. Matoba, H. Hidaka, K. Kitamura, N. Kaizuma, M. Kito // J. Agric. Food Chem. 1985. - V. 33. - P. 856-858.

94. Matsui, K. Fatty acid hydroperoxide cleaving enzyme, hydroperoxide lyase, from tea leaves / K. Matsui, H. Toyota, T. Kajiwara, T. Kakuno, A. Hatanaka //Phytochemistry. 1991.-V. 30.-P. 2109-2113.

95. Matsui, K. Bell pepper fruit fatty acid hydroperoxide lyase is a cytochrome P450 (CYP74B) / K. Matsui, M. Shibutani, T. Hase, T. Kajiwara // FEBS Lett. 1996. - V. 394. - P. 21-24.

96. Matsui, K. Fatty acid 9- and 13-hydroperoxide lyases from cucumber / K. Matsui, C. Ujita, S. Fujimoto, J. Wilkinson, B. Hiatt et al. II FEBS Lett. -2000b.-V. 481.-P. 183-188.

97. Maucher, H. Allene oxide synthases of barley (Hordeum vulgare cv. Salome): tissue specific regulation in seedling development / H. Maucher, B. Hause, I. Feussner, J. Ziegler, C. Wastemack // Plant J. 2000. - V. 21. - P. 199-213.

98. McConn, M. The critical requirement for linolenic acid is pollen development, not photosynthesis, in an Arabidopsis mutant / M. McConn, J. Browse //Plant Cell. 1996.-V. 8.-P. 403-416.

99. McGuffin, L.J. The PSIPRED protein structure prediction server / L.J. McGuffin, K. Bryson, D.T. Jones // Bioinformatics. 2000. - V. 16. - P. 404405.

100. McLean, K.J. Biodiversity of cytochrome P450 redox systems / K.J. McLean, M. Sabri, K.R. Marshall, R.J. Lawson, D.G. Lewis et al. II Biochemical Society Transactions. 2005. - V. 33.-P. 796-801.

101. Meyer, A. Occurrence of the plant growth regulator jasmonic acid in plants / A. Meyer, O. Miersch, C. Biittner, W. Dathe, G. Sembdner // J. Plant Growth Regul. 1984. - V. 3. - P. 1-8.

102. Mita, G. Molecular cloning and characterization of an almond 9-hydroperoxide lyase, a new CYP74 targeted to lipid bodies / G. Mita, A. Quarta, P. Fasano, A. de Paolis, G.P. Di Sansebastiano et al. // J Exp. Bot. -2005. V. 56. - P. 2321-2333.

103. Mueller, M.J. Signaling in the elicitation process is mediated through the oc-tadecanoid pathway leading to jasmonic acid / M.J. Mueller, W. Brodschelm, E. Spannagl, M.H. Zenk // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 7490-7494.

104. Nagano, S. Crystallographic study on the dioxygen complex of wild-type and mutant cytochrome P450cam / S. Nagano, T.L. Poulos // J. Biol. Chem. — 2005. V. 280. - P. 31659-31663.

105. Narvaez-Vasquez, J. Positional specificity of a phospholipase A2 activity induced by wounding, systemin, and oligosaccharide elicitors in tomato leaves / J. Narvaez-Vasquez, J. Florin-Christensen, C.A. Ryan // Plant Cell. 1999. -V. 11.-P. 2249-2260.

106. Nelson, D.R. Evolution of cytochrome P-450 proteins / D.R. Nelson, H.W. Strobel // Mol. Biol. Euol. 1987. - V. 4. - P. 572-593.

107. Nelson, D.R. On the membrane topology of vertebrate cytochrome P-450 proteins / D.R. Nelson, H.W. Strobel // J. Biol. Chem. 1988. - V. 263. - P. 6038-6050.

108. Nelson, D.R. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature / D.R. Nelson, L. Koymans, T. Kamataki, J.J. Stegeman, R. Feyereisen et al. II Pharmacogenetics. — 1996. V. 6. - P. 1-42.

109. Nelson, D.R. Cytochrome P450 and the individuality of species / Arch. Bio-chem. Biophys. 1999. - V. 369. - P. 1-10.

110. Noordermeer, M.A. Oxygenation of (3Z)-alkenal to 4-hydroxy-(2E)-alkenals in plant extracts: a non-enzymatic process / M.A. Noordermeer, 1. Feussner, A. Kolbe, G.A. Veldink, J.F. Vliegenthart // Biochem Biophys Res Commun.- 2000. V. 277. - P. 112-116.

111. Noordermeer, M.A. Fatty acid hydroperoxide lyase: a plant cytochrome P450 enzyme involved in wound healing and pest resistance / M.A. Noordermeer, G.A. Veldink, J.F. Vliegenthart // ChemBioChem. 2001. - V. 2. - P. 494504.

112. Ogliaro, F. The 'push' effect of the thiolate ligand in cytochrome P450: a theoretical gauging / F. Ogliaro, S.P. de Visser, S. Shaik // J. Inorg. Biochem.- 2002. — V. 91. -P. 554-567.

113. Oh, K. Design and synthesis of novel imidazole derivatives as potent inhibitors of allene oxide synthase (CYP74) / K. Oh, N. Murofushi // Bioorganic and Medicinal chemistry. 2002. - V. 10. - P. 3707-3711.

114. Oldham, M.L. The structure of coral allene oxide synthase reveals a catalase adapted for metabolism of a fatty acid hydroperoxide / M.L. Oldham, A.R. Brash, M.E. Newcomer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102(2) -P. 297-302.

115. Omura, Т. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. evidence for its hemoprotein nature / T. Omura, R. Sato // J. Biol. Chem. 1964. -V. 239.-P. 2370-2378.

116. Ortiz de Montellano, P.R. Inhibition of cytochrome P450 enzymes / P.R. Ortiz de Montellano, M.A. Correia // Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry (2nd ed.) / P.R. Ortiz de montellano. NY: Plenum Press, 1995. - P. 305-364.

117. Partridge, M. Roles of a membrane-bound caleosin and putative peroxygenase in biotic and abiotic stress responses in Arabidopsis / M. Partridge, D.J. Murphy // Plant Physiology and Biochemistry. 2009. - V. 47. - I. 9. - P. 796806.

118. Pena-Cortes, H. Aspirin prevents wound-induced gene-expression in tomato leaves by blocking jasmonic acid biosynthesis / H. Pena-Cortes, T. Albrecht, S. Prat, E.W. Weiler, L. Willmitzer//Planta. 1993. - V. 191. - P. 123-128.

119. Picado-Leonard, J. Homologous sequences in steroidogenic enzymes, steroid receptors and a steroid binding protein suggest a consensus steroid-bindingsequence / J. Picado-Leonard, W.L. Miller // Mol. Endocrinol. 1988. - V. 2. -P. 1145-1150.

120. Podust, L.M. Crystal structure of cytochrome P450 14a-sterol demethylase (CYP51) from Mycobacterium tuberculosis in complex with azole inhibitors / L.M. Podust, T.L. Poulos, M.R. Waterman // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. -V. 98.-P. 3068-3073.

121. Pompon, D. Protein engineering by cDNA recombination in yeasts: shuffling of mammalian cytochrome P-450 functions / D. Pompon, A. Nicolas // Gene (Amst.). 1989. - V. 83. - P. 15-24.

122. Poulos, T.L. The 2.6-A crystal structure of Pseudomonas putida cytochrome P-450 / T.L. Poulos, B.C. Finzel, I.C. Gunsalus, G.C. Wagner, J. Kraut // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 16122-16130.

123. Poulos, T.L. High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam / T.L. Poulos, B.C. Finzel, A.J. Howard // J. Mol. Biol. 1987. - V. 195. - P. 687700.

124. Poulos, T.L. Structures of cytochrome P450 enzymes / T.L. Poulos, E.F. Johnson // Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry (3d ed.) / P.R. Ortiz de montellano NY: Plenum Press, 2005 - P. 87-114.

125. Prost, I. Evaluation of the antimicrobial activities of plant oxylipins supports their involvement in defense against pathogens /1. Prost, S. Dhondt, G. Rothe, J. Vicente, MJ. Rodriguez et al. II Plant Physiol. 2005. - V. 139. - P. 19021913.

126. Quackenbush, J. Microarray data normalization and transformation / Nature Genetics Supp. 2002. - V. 32. - P. 496-501.

127. Reymond, P. Jasmonate and salicylate as global signals for defense gene expression / P. Reymond, E.E. Farmer // Curr. Opin. Plant Biol. — 1998. — V. 1. p. 404-411.

128. Rensing, S.A. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants / S.A. Rensing, D. Lang, A.D. Zimmer, A. Terry, A. Salamov et al. II Science. 2008. - V. 319. - P. 64-69.

129. Rosahl, S. Oxylipins / S. Rosahl, I. Feussner // Plant lipids: biology, utilization and manipulation / J. Murphy. Boca Raton: CRC Press LLC, 2000. - P. 329-354.

130. Rowland, P. Crystal structure of human cytochrome P450 2D6 / P. Rowland, F.E. Blaney, M.G. Smyth, J.J. Jones, Y.R. Leydon et al. II The Journal of Biological Chemistry. 2006. - V. 281.-P. 7614-7622.

131. Sakaki, T. Expression in Saccharomyces cerevisiae of chimeric cytochrome P450 cDNAs constructed from cDNAs for rat cytochrome P450c and P450d / T. Sakaki, M. Shibata, Y. Yabusaki, H. Ohkawa // DNA and Cell Biology. -1987.-V. 6.-P. 31-39.

132. Saniewski, M. Relationship between stimulatory effect of methyl jasmonate on ethylene production and content in tomatoes / M. Saniewski, J. Czapski, J. Nowacki // Biol Plant. 1987a. - Y. 29. - P. 17-21.

133. Saniewski, M. The effect of methyl jasmonate on ethylene and 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid production in apple fruits / M. Saniewski, J. Czapski, J. Nowacki, E. Lange // Biol Plant. 1987b. - V. 29. - P. 199-203.

134. Schalk, M. A single amino acid substitution (F363I) converts the regiochem-istry of the spearmint (2)-limonene hydroxylase from a C6- to a C3hydroxylase / M. Schalk, R. Croteau // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. -V. 97.-P. 11948-11953.

135. Schaller, F. Enzymes of octadecanoid biosynthesis in plants. 12-oxo-phytodienoate 10,11-reductase / F. Schaller, E.W. Weiler // Eur. J. Biochem. 1997a. - V. 245. - P. 294-299.

136. Schlichting, I. The catalytic pathway of cytochrome P450cam at atomic resolution / I. Schlichting, J. Berendzen, K. Chu, A.M. Stock, S.A. Maves et al. И Science. 2000. - V. 287. - P. 1615-1622.

137. Schoch, G.A. Structure of human microsomal cytochrome P450 2C8. Evidence for a peripheral fatty acid binding site / G.A. Schoch, J.K. Yano, M.R. Wester, K.J. Griffin, C.D. Stout, E.F. Johnson // J. Biol. Chem. 2003. - V. 279.-P. 9497-9503.

138. Schreier, P. Separation, partial purification, and characterization of a fatty acid hydroperoxide cleaving enzyme from apple and tomato fruits / P. Schreier, G. Lorenz, // Z. Naturforsch. 1982. - V. 37 C. - P. 165-173.

139. Shibata, Y. Purification and properties of fatty acid hydroperoxide lyase from green bell pepper fruits / Y. Shibata, K. Matsui, T. Kajiwara, A. Hatanaka // Plant Cell Physiol. 1995. - V. 36. - P. 147-156.

140. Sivasankar, S. Expression of allene oxide synthase determines defense gene activation in tomato / S. Sivasankar, B. Sheldrick, S.J. Rothstein // Plant Physiol. 2000.-V. 122.-P. 1335-1342.

141. Song, W.C. Purification of an allene oxide synthase and identification of the enzyme as a cytochrome P-450 / W.C. Song, A.R. Brash // Science — 1991. -V. 253.-P. 781-784.

142. Song, W.C. Formation of epoxyalcohols by a purified allene oxide synthase. Implications for the mechanism of allene oxide synthesis / W.C. Song, S.W. Baertschi, W.E. Boeglin, T.M. Harris, A.R. Brash // J Biol Chem. 1993a. -V. 268.-P. 6293-6298.

143. Song, W.C. Molecular cloning of an allene oxide synthase — a cytochrome-P450 specialized for the metabolism of fatty acid hydroperoxides / W.C. Song, C.D. Funk, A.R. Brash // Proc. Natl Acad Sci USA. 1993b. - V. 90. -P.8519-8523.

144. Stenzel, I. Jasmonate biosynthesis and the allene oxide cyclase family of Arabidopsis thaliana / I. Stenzel, B. Hause, O. Miersch, T. Kurz, H. Maucher et al. II Plant Mol. Biol. 2003. - V. 51. - P. 895-911.

145. Stintzi, A. Plant defense in the absence of jasmonic acid: The role of cyclo-pentenones / A. Stintzi, H. Weber, P. Reymond, J. Browse, E.E. Farmer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2001. V. 98.-P. 12837-12842.

146. Stumpe, M. A pathogen-inducible divinyl ether synthase (CYP74D) from eli-citor-treated potato suspension cells / M. Stumpe, R. Kandzia, C. Gobel, S. Rosahl, I. Feussner // FEBS Lett. 2001. - V. 507. - P. 371 -376.

147. Stumpe, M. Formation of oxylipins by CYP74 enzymes / M. Stumpe, I. Feussner // Phytochemistry Review. 2006. - V. 5. - P. 347-357.

148. Stumpe, M. Biosynthesis of C9-aldehydes in the moss Physcomitrella patens / M. Stumpe, J. Bode, C. Gobel, T. Wichard, A. Schaaf et al. II Biochim Biophys Acta. 2006a. - V. 1761.-P. 301-312.

149. Ueda, J. Isolation and identification of a senescence-promoting substance from wormwood {Artemisia absinthium L.) / J. Ueda, J. Kato // Plant Physiol. 1980. - V. 66. - P. 246-249.

150. Uno, T. Identification of regions functioning in substrate interaction of rabbit liver cytochrome P-450 (laurate (omega-l)-hydroxylase) / T. Uno, Y. Imai // J. Biochem. (Tokyo) 1989. - V. 106. - P. 569-574.

151. Tijet, N. Allene oxide synthases and allene oxides / N. Tijet, A.R. Brash // Prostaglandins Lipid Mediators. 2002. - V. 68-69. - P. 423-431.

152. Tuck, S.F. The cytochrome P450 1A2 active site: topology and perturbations caused by glutamic acid-318 and threonine-319 mutations / S.F. Tuck, K. Hi-roya, T. Shimizu, M. Hatano, P.R. Ortiz de Montellano // Biochemistry. -1993. V. 32. - P. 2548-2553.

153. Turner, J.G. The jasmonate signal pathway / J.G. Turner, C. Ellis, A. Devoto // Plant Cell. 2002. - V. 14.-P. 153-164.

154. Veldink, G.A. Plant lipoxygenases / G.A. Veldink, J.F.G. Vliegenthart, J. Boldingh//Prog. Chem. Fats Other Lipids. 1977. - V. 15.-P. 131-166.

155. Vick, B.A. Lipoxygenase and hydroperoxide lyase in germinating watermelon seedlings / B.A. Vick, D.C. Zimmerman // Plant Physiol. 1976. - V. 57. - P. 780-788.

156. Vick, B.A. Thermal alteration of a cyclic fatty acid produced by a flaxseed extract / B.A. Vick, D.C. Zimmerman, D. Weisleder // Lipids. 1979. - V. 14.-P. 734-740.

157. Vick, B.A. Formation of 12-18-0.oxo-c/s-10, cis-\5-phytodienoic acid from 13[18-0]hydroperoxylinolenic acid by hydroperoxide cyclase / B.A. Vick, P. Feng, D.C. Zimmerman // Lipids. 1980. - V. 15. - P. 468-471.

158. Vick, B.A. Lipoxygenase, hydroperoxide isomerase and hydroperoxide cyclase in young cotton seedlings / B.A. Vick, D.C. Zimmerman // Plant Physiol. 1981.-V. 67.-P. 92-97.

159. Vick, B.A. Biosynthesis of jasmonic acid by several plant species / B.A. Vick, D.C. Zimmerman//Plant Physiol. 1984. - V. 75.-P. 458-461.

160. Vick, B.A. Pathways of fatty acid hydroperoxide metabolism in spinach leaf chloroplasts / B.A. Vick, D.C. Zimmerman // Plant Physiol. 1987. - V. 85. -P. 1073-1078.

161. Vidi, P.A. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles / P.A. Vidi, M. Kan-wischer, S. Baginsky, J.R. Austin, G. Csucs et al. II J. Biol. Chem. — 2006. — V. 281.-P. 11225-11234.

162. Weber, H. Divinyl ether fatty acid synthesis in late blightdiseased potato leaves / H. Weber, A. Chetelat, D. Caldelari, E.E. Farmer // Plant Cell. -1999.-V. 11. — P.485-493.

163. Weichert, H. Metabolic profiling of oxylipins upon salicylate treatment in barley leaves—preferential induction of the reductase pathway by salicylate(l)

164. H. Weichert, I. Stenzel, E. Berndt, C. Wasternack, I. Feussner // FEBS Lett. 1999.-V. 464.-P. 133-137.

165. Werck-Reichhart, D. Cytochromes P450: a success story / D. Werck-Reichhart, R. Feyereisen // Genome Biol. 2000. - V. 1. - P. 1 -7.

166. Werck-Reichhart, D. Cytochromes P450 for engineering herbicide tolerance / D. Werck-Reichhart, A. Hehn, L. Didierjean // Trends Plant Sci. 2000. - V. 5.-P. 116-123.

167. Werck-Reichhart, D. Cytochromes P450 / D. Werck-Reichhart, S. Bak, S. Pa-quette // The Arabidopsis Book / C.R. Somerville, E.M. Meyerowitz. Rock-ville, MD: American Society of Plant Biologists, 2002. - P. 1-28.

168. Williams, P.A. Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase: structural adaptations for membrane binding and functional diversity / P.A. Williams, J. Cosme, V. Sridhar, E.F. Johnson, D.E. McRee // Mol. Cell. -2000a.-V. 5.-P. 121-131.

169. Williams, M. Lipoxygenase pathway in olive callus cultures (Olea europaea) / M. Williams, J.J. Salas, J. Sanchez, J.L. Harwood // Phytochemistry. — 2000b.-V. 53.-P. 13-19.

170. Xu, Y. Upregulation of a tonoplast-localized cytochrome P450 during petal senescence in Petunia inflata / Y. Xu, H. Ishida, D. Reisen, M.R. Hanson // BMC Plant Biol. 2006. - V. 6. - P. 8.

171. Yokoyama, M. Stress-induced factor involved in flower formation of Lemna is an a-ketol derivative of linolenic acid / M. Yokoyama, S. Yamaguchi, S. Inomata, K. Komatsu, S. Yoshida et al. II Plant Cell Physiol. 2000. - V. 41. -P. 110-113.

172. Ziegler, J. Purification and characterization of allene oxide cyclase from dry com seeds / J. Ziegler, M. Hamberg, O. Miersh, B. Parthier // Plant Physiol. -1997.-V. 114.-P. 565-573.

173. Ziegler, J. On the specificity of allene oxide cyclase / J. Ziegler, C. Waster-nack, M. Hamberg//Lipids. 1999.-V. 34.-P. 1005-1015.

174. Ziegler, J. Molecular cloning of allene oxide cyclase. The enzyme establishing the stereochemistry of octadecanoids and jasmonates / J. Ziegler, I. Sten-zel, B. Hause, H. Maucher, M. Hamberg et al. II J. Biol. Chem. 2000. - V. 275.-P. 19132-19138.efi

Информация о работе

Топоркова, Яна Юрьевна
кандидата биологических наук
Казань, 2009
ВАК 03.00.12

Диссертация

Алленоксидсинтаза CYP74C3 томата - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Алленоксидсинтаза CYP74C3 томата ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Алленоксидсинтаза CYP74C3 томата"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Топоркова, Яна Юрьевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Алленоксидсинтаза CYP74C3 томата"

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Топоркова, Яна Юрьевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Топоркова, Яна Юрьевна, Казань

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Алленоксидсинтаза CYP74C3 томата
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений