Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активные формы кислорода и их источники в программированной гибели клеток растений и цианобактерии Anabaena variabilis

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Активные формы кислорода и их источники в программированной гибели клеток растений и цианобактерии Anabaena variabilis"

На правах рукописи

ШЕСТАК Анна Александровна

АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И ИХ ИСТОЧНИКИ В ПРОГРАММИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ И ДИАНОБАКТЕРИИ ANABAENA VARIABILIS

03 00 25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003175840

Работа выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов биологического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова.

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Самуилов Виталий Дмитриевич

Московский государственный университет им МВ Ломоносова, Москва

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Ягужинский Лев Сергеевич

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им АН Белозерского МГУ, Москва

доктор биологических наук, Доронин Юрий Константинович

Московский государственный университет им М В Ломоносова, Москва

Ведущая организация Институт физиологии растений им К А Тимирязева РАН

Защита состоится «20» ноября 2007 года в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501 001 52 при Московском государственном университете им М В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, д 1, корп. 12, биологический факультет МГУ, ауд М1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им М В Ломоносова

Автореферат разослан «18 » октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.Н. Калистратова

Актуальность темы. Активные формы кислорода (АФК) в клетках растений образуются в электронтранспортных цепях хлоропластов и митохондрий, а также в пероксисомах, аппарате Гольджи, эндоплазматическом ретикулуме АФК обладают высокой окислительной способностью и скоростью взаимодействия Они способны регулировать рост, развитие растений, участвовать в иммунитете, могут быть использованы клеткой при реализации ПКС Источники, механизмы образования АФК и их участие в сигнальных системах являются главными направлениями в этой области исследований В зависимости от концентрации АФК может происходить активация или ингибирование ферментов, задействованных в гибели клеток по типу некроза или апоптоза

Цель работы — исследовать активные формы кислорода и их источники в программируемой гибели клеток из листьев гороха и АпаЪаепа variabilis Задачи работы:

1 Испытать действие соединений, стимулирующих или подавляющих образование АФК, на ядра замыкающих клеток устьиц листьев гороха и нуклеоидов клеток А variabilis

2 Исследовать действие хинакрина (ингибитора флавиновых ферментов) и ингибиторов фотосистемы II фотосинтетической элетронтранспортной цепи на образование АФК в клетках эпидермиса из листьев гороха

3 Исследовать действие ингибитора гликолиза 2-дезоксиппокозы, ингибиторов энергетического обмена митохондрий и разобщителя окислительного и фотосинтетического фосфорилирования на образование АФК и их возможную роль в переходе с одного типа клеточной гибели к другому

4 Исследовать действие ингибитора синтеза белка линкомицияа на клетки A variabilis

Список сокращений и обозначений: БР - бенгальский розовый, БО - бромоксинил, ДГ

- 2-дезоксиглюкоза, HCT - нигросиний тетразолий, ПКС - программируемая клеточная смерть, УК - устьичные клетки, ФС - фотосистема ХКФ - м-хлоркарбонилцианидфенилгидразон, DCMU - 3-(3',4'-Дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина, диурон, DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид, DCF -2',7'-дихлорфлуоресцеин, DCFH-DA - 2',7'-дихлорфлуоресцин диацетат, NAC - N-ацетил-Ь-цистеин, PI - пропидий йодит, TMRE - этиловый эфир тетраметияродамина, Ог

- супероксидный анион-радикал, ОН - гидроксильный радикал, '02 - синглетный кислород

3

ч

Научная новизна работы. Испытано влияние соединений, вызывающих или подавляющих образование АФК на ПКС растений и A variabilis Полученные результаты показали, что О2 Н2О2 и ОН стимулируют ПКС устьичных клеток гороха Предположительно Н2О2 активирует NADPH-оксидазу плазматической мембраны Установлено образование АФК пероксидазой клеточной стенки Фотосенсибилизаторы БР и TMRE, подобно ингибиторам переноса электронов в ФСП диурону и бромоксинилу на свету, приводили к гибели клеток по типу некроза Н2О2 вызывал увеличение содержания АФК в клетках, разрушение нуклеоидов и гибель клеток A variabilis от антибиотика линкомицина, ингибитора синтеза белка у бактерий, клетки A variabilis погибали с признаками автолиза Установлена роль различных компартментов клетки (хлоропластов, митохондрий, плазматической мембраны клеточного ядра и клеточной стенки) в образовании АФК и гибели УК

Практическое значение работы. Полученные данные позволяют расширить представления о роли АФК и механизмах гибели клеток растений и бактерий Испытан ряд гербицидов и цитотоксических агентов на образование АФК в клетках Полученные результаты свидетельствуют о единстве путей ПКС у животных, растений, бактерий и могут быть использованы в клеточной биологии, микробиологии и биотехнологии в связи с работами в области сигнальных систем клеток, фитоиммунитета и лекарственной устойчивости микроорганизмов Данные результаты могут быть использованы в клеточной биологии, микробиологии и биотехнологии

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на международной конференции «Российская биоэнергетика от молекул к клетке» (Москва, 2005), всероссийской научной конференции «Молодые исследователи регионам» (Вологда,

2005), годичном собрании физиологов растений «Физиологические и молекулярно-генетичекие аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2006» (Москва, 2006), I (IX) международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург,

2006), международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (Москва, 2006), международной 14-ой Европейской биоэнергетической конференции (Москва 2006), XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2007» (Москва, 2007), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), международной конференции «Современная физиология растений от молекул до экосистем» (Сыктывкар,

2007), а также на заседаниях кафедры физиологии микроорганизмов МГУ

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на 110 страницах, иллюстрирована 2 таблицами и 24 рисунками Список литературы содержит 205 библиографических названий

Объекты и методы исследования. Исследования проводили на нижнем эпидермисе из листьев гороха (Pisum sativum L) сорта Альфа и листьев кукурузы сахарной (Zea mays saccaraía L) сорт Монарх Растения выращивали методом гидропоники при периодическом освещении (18 ч свет, 6 ч темнота) люминесцентной лампой (интенсивность света ~1000 лк, температура 20-25°С) В экспериментах использовали 8-15-суточные проростки С помощью пинцета пленки эпидермиса отделяли и помещали в полистирольные кул моральные планшеты и инкубировали в дистиллированной воде Клетки цианобактерии A variabilis АТСС 29413 (из коллекции кафедры физиологии микроорганизмов) культивировали в колбах объемом 750 мл, содержащих 200 мл среды, при постоянном освещении люминесцентными лампами (~1400 лк), на минеральной среде BG-11 (Rippka et al, 1979) в периодических условиях, при температуре ~27 °С Перед посевом клеток среду стерилизовали при 0,5 атм в течение 30 мин В экспериментах использовали клетки из 3-5-суточных культур, находящихся в экспоненциальной фазе роста

Инфильтрация и инкубация с реагентами. Для обеспечения быстрого проникновения реагентов в клетки использовали метод вакуум-инфильтрации Пленки эпидермиса инкубировали в растворе реагентов при 1,5-3 мм рт ст в течение 1-2 мин Инкубацию клеток проводили в темноте и на свету (-1000 лк) при 20-25°С

Фиксация объекта, окрашивание и световая микроскопия. По завершении инкубации образцы обрабатывали 5 мин фиксатором Батталья (смесь хлороформа, 96%-ного этанола, ледяной уксусной кислоты и 40%-ного формалина в соотношении 5 5 11) Затем образцы отмывали 96%-ным этанолом 10 мин для удаления фиксатора, инкубировали 5 мин в воде и окрашивали красителем ядер гематоксилином Карацци в течение 20 мин Окрашенные пленки эпидермиса отмывали водопроводной водой и анализировали с помощью светового микроскопа Leitz Diaplan Wetzlar ФРГ Из 300-500 просмотренных клеток определяли долю клеток с разрушенными ядрами (Самуилов и др, 2000)

Флуориметрия. Для регистрации АФК в клетках использовали DCFH-DA Пленки эпидермиса помещали в 50 мкМ раствор DCFH-DA и инкубировали 10 мин в темноте Этот краситель, проникая в клетку, дезацетилируется при участии внутриклеточных эстераз, превращаясь в нефяуоресцирукмций DCFH DCFH в клетках окисляется Н202 с участием

i " i

пероксидазы или неферментативно в присутствии Fe2+, образуя интенсивно флуоресцирующий DCF (LeBel et ai, 1992) DCFH окисляется также ОН, СО3 > NO2 , но не Ог однако, вероятность окисления этими агентами в исследуемых клетках не велика (Wrona et al, 2005) Образцы отмывали 5 мин в темноте, закрепляли силиконом на прозрачную пластинку из полистирола и помещали в кювету под углом 45° к падающему лучу, содержащую буферный раствор 25 мМ HEPES-NaOH, рН 7,2, и 25 мМ KCI Флуоресценцию DCF возбуждали светом с X 485-495 нм и регистрировали при 515-525 нм Для обработки данных, полученных с флуориметра (VersaFluor фирмы Вю-Rad, США), использовали компьютерные программы Read COM Port, Graph 2. Microsoft Excel

Клетки A variabilis дважды отмывали раствором 25 мМ Hepes-NaOH, рН 7,2 и 25 мМ КС1 центрифугированием при 3000 g 5 мин и суспендировали в том же растворе Клетки обрабатывали в темноте 30 мин 50 мкМ DCF-DA между первым и вторым центрифугированием и использовали в экспериментах в течение 2-4 ч после отмывки Клетки хранили в темноте при комнатной температуре Величина D540 суспензии клеток составляла 0,6-0,9

Флуоресцентная микроскопия. Для прижизненного исследования состояния клеток использовали флуоресцирующие красители Для определения состояния ядер использовали 20 мкМ 4',6-диамидино-2-фенюшндол дигидрохлорид (DAPI окрашивание проводили 30 мин), 0,2 мкМ пропидий йодид (PI окрашивание проводили 20 мин), 20 мкМ DCF-DA (10 мин) Клетки A variabilis окрашивали 20 мкМ DAPI в течение 1 ч и 20 мкМ DCF-DA в течение 20 мин в темноте, 2 мкМ PI в течение 1 ч Наблюдения проводили на флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss Axiovert 200М LSM510 (Германия) Для получения фотоснимков использовали встроенную цифровую видеокамеру и компьютерную программу AxiVision

Конфокальная микроскопия. Изучение серийных оптических срезов объектов проводили с помощью микроскопа Carl Zeiss Axiovert 200М (Германия), оборудованного конфокальной сканирующей приставкой Zeiss LSM510Meta Определение энергетического состояния митохондрий в УК эпидермиса из листа гороха проводили с помощью TMRE TMRE является катионом, проникающим через мембраны Внутриклеточные митохондрии генерируют мембранный потенциал со знаком «минус» внутри Накопление проникающего катиона TMRE в митохондриях напрямую свидетельствует об энергизации митохондрий Пленки эпидермиса из листьев гороха окрашивали TMRE в течение 1 ч в темноте, затем отмывали дистиллированной водой Для визуализации красителя использовали гелий-неоновый лазер (Я-возб 543), измерения флуоресценции проводили при 560 - 590 нм Для

регистрации образования АФК пленки эпидермиса и клетки цианобактерии окрашивали 20 мкМ DCF-DA в течение 10 мин в темноте. Флуоресценцию DCF возбуждали при 495 нм (аргоновый лазер) и регистрировали при 523 пм.

Оксиметрин. Выделение и поглощение кислорода измеряли с применением закрытого Pt-электрода Кларка. В ячейку с 25 мМ Hepes-NaOH, pH 7,2, и 25 мМ KCl помещали нарезки листьев гороха с концентрацией хлорофиллов 45-90 мкг/мл и инкубировали на магнитной мешалке. Напряжение на электроде составляло - 0,65 В. Свет от лампы накаливания пропускали через тепловой фильтр - слой воды толщиной 12 см. Интенсивность действующего света составляла ~ 0,1 Вт/см2. Электрический сигнал от электрода Кларка регистрировали на компьютере через аналого-цифровой преобразователь с помощью программы Record 4.

Спектрофотометрия. Концентрацию Н202 измеряли при 240 нм, s = 43, 6 М"1 ' см"1 (Bielski and Allen, 1977) на спектрофотометре Uvidec-4 (Jasco, Япония). Рост цианобактерии при периодическом культивировании определяли по светорассеянию клеточных суспензий при 540 нм на спектрофотометре Uvidec-4 (Jasco, Япония) и с помощью вертикального фотометра Multiscan Plus 314 (Labsystem, США) с интерференционным светофильтром, максимум полосы пропускания - 540 нм. Исследование действия различных соединений в условиях периодического культивирования проводили с применением стандартных стерильных 96-луночных планшетов. Объем клеточной суспензии в лунке составлял 200 мкл.

Результаты исследования и их обсуждение

Флуоресценция DCF в клетках. В замыкающих клетках устьиц как показали опыты с пленками эпидермиса, изолированными из листьев гороха, DCF интенсивно флуоресцирует (рис. 1 A). DCF флуоресцирует клетках A. variabilis, образующих трихомы - клеточные нити (рис. 1 Б).

А Б

Рис. 1. Флуоресценция DCF в клетках: А - флуоресценция DCF в пленке эпидермиса из листа гороха, Б - флуоресценция DCF в клетках Л. variabilis.

Влияние акцепторов электронов на НгОгзависимое образование ИСК. Менадион, восстанавливаясь фотосистемой И, ¿^/-цитохромным комплексом и фотосистемой I хлоропласте®, а также митохондриальными КАОН и сукцинат убихинон-оксидоредуктазой и Ьс,-цитохромным комплексом, окисляется Ог с образованием 02 и Н2О2 Рост выхода флуоресценции ОСЕ в пленках эпидермиса из листьев гороха, индуцированный менадионом, усиливался при последующем добавлении Н2О2 и подавлялся НСТ, окисляющим Ог с образованием формазана и тем самым предотвращающим образование Н2О2 (рис 2, линии 1, 2) Акцепторы электронов М,Н№,Ы'-тетраметил-«-фенилендиамин (ТМФД), 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДФИФ), а также и-бензохинон (БХ) не вызывали образование флуоресцирующего красителя (рис 2, линии 3, 4) Эти соединения, взаимодействующие с ФСИ, ¿(/-цитохромным комплексом и ФС1 хлоропластов, подавляют фотовосстановление КА1)Р+ Они подавляют также восстановление убихинона в митохондриях, взаимодействуя с НАБН убихинон-оксидоредуктазой, сукцинат убихинон-оксидоредуктазой и Ьс1-вдггохромным комплексом дыхательной цепи Восстановленные формы этих соединений не взаимодействуют с кислородом, не вызывают образование Ог и Н2О2, необходимого для окисления ЛСРН Напротив, аскорбат, добавленный вслед за ТМФД, образует электрондонорную пару для ФС1, генерирующей Н2О2 с участием супероксидцисмутазы

Менадион

1 Jx HCT

Менадион 2l

ТМФД

Аскорбат

ДФИФ щ

* | Менадион!1"

Рис. 2. Влияние различных агентов на флуоресценцию DCF в пленках эпидермиса из листьев гороха. Добавки 100 мкМ менадиона, 100 мкМ Н202, 200 мкМ HCT, 100 мкМ ТМФД, 100 мкМ ДФИФ, 5 мМ аскорбата

Действие антиоксид антов на НгОг-зависимую флуоресценцию DCF.

Антиоксидавты NAC и тролокс (водорастворимое производное а-токоферола) подавляли и предотвращали менадион-индуцированное образование DCF в пленках эпидермиса из листьев гороха (рис 3) Они подавляли также CN" -индуцированное разрушение ядер устьичных и эпидермальных клеток (рис 4)

10 мин

Рис. 3. Влияние антиоксидантов на флуоресценцию DCF, индуцированную менадионом. Добавки: 100 мкМ менадиона, 5 мМ NAC, 100 мкМ тролокса, 10 нМ MitoQ, 100 мкМ Н2С>2.

100

80

Q.

CU С

60

з 40

20

0

Устьичные клетки

■ Темнота □ Свет

1

I 1

ж

100

80-1

О.

ш а

I б°-

s

X

(V

§40-а со <0 0-

20

rfl

ж

Эпидермальные клетки

-h

rih

■ь

rh

«/ ^ /

Рис. 4. Влияние NAC, и тролокса на С^-индуцированное разрушение ядер в клетках эпидермиса из листьев гороха. Пленки эпидермиса после инфильтрироции с NAC или тролоксом преинкубировали 15 мин, затем добавляли KCN, вновь проводили инфильтрацию. Разрушение ядер устьичных клеток регистрировали через 20 ч инкубации пленок эпидермиса в темноте или на свету. Разрушение эпидермальных клеток регистрировали через 1 ч инкубации в темноте. Добавки: 2,5 мМ KCN, 5 мМ NAC, 100 мкМ тролокса.

Испытано действие производного убихинона 2,3-диметокси-п-

бензохинонилдецилтрифенилфосфония (MitoQ) на ПКС у растений MitoQ представляет собой убихинон, ковалентно связанный децилтрифенилфосфонием Этот проникающий катион избирательно, по градиенту мембранного потенциала, накапливается в митохондриях На клетках животных показано, что MitoQ реагирует с дыхательной цепью митохондрий, проявляет свойства антиоксиданта и защищает клетки от гибели, вызванной Н202 Восстанавливаясь дыхательной цепью, MitoQ избирательно блокирует окислительное повреждение митохондрий (Kelso et al, 2001) MitoQ подавлял и предотвращал образование DCF, вызванное менадионом, но не Н202 (рис 3)

Влияние ингибитора флавиновых ферментов хинакрина на НгОг-зависимую флуоресценцию DCF. В зависимости от концентрации АФК в клетках происходит активация или ингибирование различных ферментов Хинакрин в испытанных концентрациях не оказывал влияние на дыхание и фотосинтетическое выделение 02 (Самуилов и др, 2006), но подавлял рост флуоресценции, вызванный менадионом и Н202 Добавленная каталаза, не проникающая в клетки, подавляла и предотвращала рост флуоресценции DCF, вызванный добавленным Н202 (рис 5) Эти результата позволяют предположить, что NADPH-оксидаза плазматической мембраны, чувствительная к хинакрину (Van Gestelen et al, 1997), генерирующая 02 и активирующаяся при действии менадиона и Н202, может быть ответственна за рост флуоресценции DCF На клетках животных известен эффект АФК-индуцированного образования АФК (Zorov et al, 2005)

Рис. 5. Влияние хинакрина на флуоресценцию DCF в пленках эпидермиса из листьев гороха Добавки 100 мкМ Н202,2 ед активности/мл каталазы, 50 мкМ хинакрина

Влияние генераторов синглетного кислорода на Н202-зависимую флуоресценцию DCF. Гербициды диурон (3',4'-дихлорофенил)-1,1-диметилмочевина) и бромоксинил (3,5-дибром-4-гидроскибензонитрил), ингибирующие перенос электронов в ФСП, вызывали образование DCF в клетках, устойчивое к добавке каталазы, но чувствительное к HCT (рис

Манадион

S.S 5 мин с -

6) TMRE вызывал образование флуоресцирующего DCF Диурон и бромоксинил индуцируют образованием триплетного хлорофилла в результате рекомбинации зарядов между восстановленным феофитином и реакционным центром Р680, это ведет к образованию [02 (Rutherford et al, 2001) БР и TMRE, фотосенсибилизирующие генерацию синглетного кислорода, предотвращали распад ядер УК, вызванный CN~ БР на свету сам по себе не усиливал флуоресценцию DCF (рис 7 линия 1) Последующая добавка NADH вызывала рост выхода флуоресценции DCF (рис 7, линия 1), что свидетельствует, по-видимому, о функционировании апопластной пероксидазы НСТ подавлял увеличение флуоресценции DCF в ответ на добавку NADH В отсутствие БР NADH не влиял на флуоресценцию DCF и на менадион-индуцированный рост его флуоресценции (рис 7, линии 2, 3)

Ядра устьичных клеток окрашиваются PI при инкубации эпидермиса с БР на свету (данные не представлены) Доля флуоресцирующих ядер в темноте была значительно ниже, чем на свету, и не отличалась от контрольной величины (без добавок) В присутствии KCN, индуктора апоптоза происходил распад ядер, и флуоресцирующие фрагменты ДНК давали свечение объема, ограниченного клеточной стенкой Распад клеточных ядер, вызываемый CN~, на свету предотвращался БР

Рис. 6. Влияние диурона (DCMU) и бромоксинила (БО) на флуоресценцию DCF в клетках эпидермиса из листьев гороха Добавки 10 мкМ диурона, 200 мкМ HCT, 2 ед активности/мл каталазы, 100 мкМ бромоксинила

1 Т нет

-1_MDH^^-'-____

Рис. 7. Влияние БР на флуоресценцию ИСР в клетках эпидермиса из листьев гороха Добавки 20 мкМ БР, 10 мМ КАОН, 200 мкМ НСТ, 50 мкМ хинакрина, 100 мкМ менадиона

Оксиметрические данные показывают, что лреинкубация насечек листьев гороха с БР в течение 1 ч значительно снижала скорость фотосинтетического выделения 02 (рис. 8). Это может быть связано с тем, что '02, генерируемый БР, вызывает расщепление белков Э1 и Р2 фотосистемы II хлоропластов (Окаёа е! а!., 1996), ингибируя фотосинтез, подобно ЭСМи и бромоксинилу. При этом нарушается функция ФСИ хлоропластов, и исчезает ее вклад в ПКС. Блокирование ФСП посредствам бромоксинила или диурона значительно снижало С>Г-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток на свету (рис. 9).

Рве. 8. Действие БР и БО на дыхание и фотосинтетическое выделение 02 насечками листьев (НЛ) гороха. Линия 1 - контроль, линии 2 и 3 - БР, линия 3 - нормирована с линией 1 по скорости дыхания. НЛ в дистил воде без БР (линия 1) или 100 мкМ БР (линия 2) подвергали вакуум-инфильтрации и затем инкубировали 1 ч на белом свету. Вк и Вык - включение и выключение света. Добавки: НЛ массой 20-25 мг/мл, 100 мкМ БО. Скорости поглощения Оз (эндогенное дыхание) и фотосинтетического выделения 02 в контроле составляли 400-800 и 280-320 мкмоль/г НЛ. Добавки: 100 мкМ БО.

Рис. 9. Влияние диурона и бромоксинила на СЪГ-индуциро ванную гибель УК из листьев гороха. Инкубация с КСЫ 20 ч. Добавки: 10 мкМ диурона, 100 мкМ бромоксинила, 200 мкМ НСТ, 2,5 мМ КСИ.

Вклад различных АФК в СРГ -индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе из листьев гороха. Апоптоз устьичных клеток, индуцированный СК* , зависит от АФК (Самуилов и др., 2000). Какова природа АФК? Н202 усиливал СТ^Г-индуцированный апоптоз устьичных клеток в эпидермисе из листьев гороха, регистрируемый по разрушению клеточных ядер. Ещё большее разрушение ядер наблюдалось от комбинации Н202 и ИАОН -субстратов пероксидазы клеточной стенки растений (таблица 1). вызывающей образование 02" и Н202 (Уокога, Уатагаки, 1977; НаШ\уе11, 1978). КАОН сам по себе вызывал некоторое

100-, Устьичные клетки

■ Темнота □ Свет

ёбО

гЬ

.V к<£>

разрушение ядер устьичных клеток Разрушение ядер устьичных клеток при воздействии CN" или CN~ + Н202 полностью снималось HCT Сам по себе HCT не влиял на состояние ядер устьичных клеток Восстановленный HCT накапливался в клетках в виде кристаллов формазана Маннитол использовали в качестве ловушки для ОН Он снижал СЫ~-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток Другой ловушкой для ОН является этиловый спирт Он тоже снижал разрушение ядер, вызванное CN~ БР вызывал небольшое разрушение ядер в темноте, но не на свету БР и TMRE, фотосенсибилизирующие генерацию '02, подавляли цианидное разрушение клеточных ядер на свету Это подавление снималось добавленным NADH, который реагирует с '02 с образованием Ог В темноте БР не оказывал влияние на СКГ-индуцированное разрушение ядер, а на свету предотвращал его Сходный, но менее выраженный эффект на свету оказывал TMRE Предотвращение апоптоза вызванного ОТ в присутствии БР на свету, снималось NADH Таблица 1. Влияние соединений, стимулирующих или подавляющих образование различных

АФК, на состояние устьичных клеток гороха

Тестируемая АФК Добавлен ные реагенты Условия опыта Разрушение ядер УК (%) в присутствии

реагентов KCN или kcn + h2o2* реагентов + KCN

о; нет Темнота, 18 ч Свет, 18 ч 0 0 35,0 ±3,0 68,8 ± 3,9 0 0

нст + н2о2 Темнота, 18 ч Свет, 18 ч 0 0 87,0 ±3,0* 99,0 ±1,0* 0 0

н2о2 н2о2 Темнота, 18 ч Свет, 18 ч 0 0 35,0 ±3 0 68,8 ± 3,9 87,0 ± 3,0 99,0 ± 1,0

н2о2 + NADH Темнота, 20 ч Свет, 20 ч 54,3 ± 8,6 44,2 ±2,9 25,3 ± 1,5 79,0 ±2,0 100 100

он Маннитол Темнота, 20 ч Свет, 20 ч 0 0 42,5 ±3,0 75,7 ± 5,0 14,7 ±2,7 42,0 ±4,5

Этанол Свет, 24 ч 0 81,7 ±4,4 24,5 ±4,9

'о2 БР Темнота, 16 ч Свет, 23 ч 2,8 ± 1,5 0 21,2 ±2,3 94,2 ±4,0 20,6 ±2,8 1,0 ± 1,0

TMRE Свет, 19 ч 0 64,9 ±4,3 41,8 ±6,3

БР + NADH Свет, 23 ч 0 94,2 ±4,0 75,6 ±3,2

NADH Темнота, 20 ч Свет, 20 ч 21.5 ±7,6 23.6 ± 8,6

Действие ингибиторов энергетического обмена на образование АФК. Гибель клеток может быть программируемой (апоптоз, аутофагия) и непрограммируемой (некроз) Форма гибели клеток во многом определяется их энергетическим состоянием Клетка, обедненная АТР, погибает через некроз Апоптоз зависит от АТР Устьичные клетки погибали через апоптоз при действии разобщителя окислительного и фотосинтетического фосфорилирования (Дзюбинская и др, 2006) Ингибирование гликолиза посредством ДГ тоже вызывало апоптоз Опыты с применением PI показали, что комбинация ХКФ и ДГ вызывала нарушение клеточных мембран, некротическую гибель клеток, при этом клеточные ядра УК сохранялись - признак некроза DCMU предотвращал С>Г-индуцированный апоптоз устьичных клеток, но такой эффект снимался разобщителем ХКФ (Дзюбинская и др , 2006) Некоторые из испытанных ингибиторов энергетического обмена (ХКФ, DCMU и особенно БГ), как показывают данные с DCF, увеличивают выход флуоресценции красителя (рис 10) ХКФ, по-видимому, ускоряет гидролиз диацетата DCFH Зависимый от Н2О2 и ХКФ (величина рК составляет 5,95) рост флуоресценции красителя, измеряемый в отсутствие пленок эпидермиса, замедлялся или прекращался при pH 5,0 или 8,0 Действие DCMU связано с генерацией '02 и последующим окислением NAD(P)H (внутриклеточного) с образованием 02 и Н2О2 (Petrat et al, 2003) Ингибирование альтернативной оксидазы митохондрий растений гидроксаматами (БГ) усиливает образование О2 (Camacho et al, 2004) и Н2О2 Согласно предположению изложенному ранее (Самуилов и др, 2002, 2003), апоптоз УК регулируется редокс-состоянием пластохинона на участке о Ъф-цитохромного комплекса хлоропластов Если пластохинон на участке о окислен или вытеснен конкурентным ингибитором, апоптоз УК предотвращается Вызванное ХКФ снятие действия DCMU (рис 11), подавляющего апоптоз устьичных клеток в присутствии С>Г, может быть вызвано изменением редокс-состояния пластохинона стимулируя циклический перенос электронов с участием фотосистемы I и ¿^комплекса, разобщитель влияет на компоненты циклической цепи, переводит пластохинон на участке о в менее окисленное состояние и одновременно подавляя фотосинтетическое и окислительное фосфорилирование (но не субстратное фосфорилирование при гликолизе), включает ПКС Из рис 11 видно также, что комбинация DCMU и антимицина А, ингибирующих фотосинтетический перенос электронов в хлоропластах миксотиазола и бензилгидроксамата, ингибирующих дыхание митохондрий, ингибитора гликолиза ДГ и разобщителя ХКФ в течение 20 ч на свету не вызывает разрушение ядер УК Смесь была дополнена цианидом, чтобы подавить разложение Н2О2 с участием каталазы и пероксидаз

KCN

Рис, 10. Действие ингибиторов энергетического обмена на образование БСР из ИСРН в пленках эпидермиса из листьев гороха Добавки 100 мкМ менадиона, 1мМ Н202, 10 мкМ ХКФ, 2,5 мМ КСМ, 10 мкМ БСМи 10 мМ ДГ, 5 мМ миксотиазола (Микс), 5 мкМ антимицина А (Ант)

А

Jl

У dP .^V^®^

Рис. 11. Разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе из листьев гороха на свету при действии ингибиторов энергетического обмена Пленки эпидермиса после инфильтрации с 10 мкМ ИСМи, 5 мкМ миксотиазола, 5 мкМ антимицина А и 10 мМ ДГ инкубировали 30 мин в темноте, затем, где указано, проводили инфильтрацию с 2,5 мМ КСЫ и инкубировали 20 ч на свету

Влияние CN" на НгОг-зависимое образование DCF: данные флуоресцентной микроскопии. CN~ обладает множественным действием ингибирует гемовую каталазу и пероксидазы, в том числе аскорбатпероксидазу хлоропластов, цигохром с-оксидазу митохондрий, Cu,Zn- супероксиддисмутазу, инактивирует рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазу/оксигеназу, подавляя регенерацию NADP+ из NADPH CN" ингибировал Н2Ог-зависимое образование DCF в клетках листьев гороха После добавления KCN и DCFH-DA, флуоресценция DCF наблюдалась в хлоропластах и вокруг них (локализацию хлоропластов определяли по флуоресценции хлорофилла), а также в области ядра клетки (Bartoli et al, 1977, Patton et al, 1980, Kuroda et al, 2005)

Образование АФК в митохондриях. !)С1' в хлоропластах и клеточных ядрах флуоресцирует и в отсутствие СЬГ (рис. 12, а). При изменении глубины оптического среза хлоропласты становились невидимыми, свечение ОСИ в ядерной зоне усиливалось, появлялись светящиеся сферические структуры (рис. 12, б). Этиловый эфир тетраметилродамина вызывал яркое свечение сферических структур (рис. 12, в, г), которое исчезало при обработке пленок эпидермиса протонофорным соединением ХКФ, снимающим мембранный потенциал -Ду (рис. 12, д). Таким образом, сферические структуры, по данным флуоресценции ОСР генерирующие Н2О2 (рис. 12, а, б), представляют собой митохондрии; снятие Д\|/ разобщителем окислительного фосфорилирования полностью тушит флуоресценцию ТМЯЕ. ТМКЕ не вызывал свечения хлоропластов.

Рис. 12. Флуоресценция DCF, TMRE и хлорофилла (Хл) в устьичных клетках в эпидермисе из листьев гороха: а, б -флуоресценция хлорофилла и DCF; два оптических среза, различающиеся глубиной в 2 мкм; инкубация с 20 мкМ DCF - 5 мин; в, г - флуоресценция хлорофилла в хлоропластах и TMRE в сферических структурах; два оптических среза, различающиеся глубиной в 2 мкм; инкубация с 2 мкМ TMRE - 1 ч; д -протонофор ХКФ подавляет накопление флуоресцирующего TMRE в сферических структурах, и они становятся невидимыми. 1 - изображение в проходящем свете, 2 -флуоресценция хлорофилла в хлоропластах, 3 - флуоресценция DCF или TMRE, 4 -наложение изображений 2 и 3. Стрелкой показана область клеточного ядра. Масштабная линейка - 5 мкм.

Менадион и Н202: действие на рост и иа состояние нуклеоидов A. variabilis.

Флуоресцентная микроскопия показала, что добавление Н202 или вызывает разрушение нуклеоидов в клетках^, variabilis (рис. 13 а,б,в) и лизис клеток цианобактерии (рис.13 г, д). Н202 и менадион вызывали рост выхода флуоресценции DCF (рис. 13 е), который подавлялся антиоксидантами NAC и тролоксом. Н2О2 и менадион укорачивали нити клеток трихома А. variabilis.

-1д[НгОг], М

-1д[Менздион], М

Рис. 13. Действие Н2О2 и менадиона на клетки A. variabilis, а - разрушение нуклеоидов (данные флуоресцентной микроскопии). Инкубация на свету с менадионом и Нг02- 20 ч. ДНК в клетках окрашивали 20 мкМ DAPI (инкубация - 1 ч). Стрелками показаны безнуклеоидные клетки. Маркер - 2 мкм. Добавки: 100 мкМ менадиона, 10 мМ Н2О2; б, в - влияние Н2О2 и менадиона на рост клеток. В контроле (без добавок) по данным спектрофотометрии при 540 нм наблюдался рост клеток. Исходная величина D540 0,46. Представлены данные о величинах D540, через 19 и 41,5 ч инкубации Н2О2 и менадионом; е (1, 2, 3) - влияние антиоксидантов на образование DCF из DCFH, вызванное Н2О2 и менадионом. Добавки: 1 мМ NAC, 100 мкМ тролокса, 100 мкМ менадион; 1 мМ Н2О2.

Влияние ингибитора синтеза белка - линкомицина на клетки A. variabilis.

Общим механизмом ПКС бактерий является автолиз, распад клеток с участием гидролаз пептидогликана (автолизинов) (Самуилов, 2000; Lewis, 2000). Лизис клеток бактерий, вызванный антибиотиками осуществляется по программируемому механизму. При действии антибиотиков (пенициллина, ванкомицина) происходит индукция автолиза. Снижение активности муреиновых гидролаз, напротив, предотвращает автолиз, индуцированный пенициллином (Lewis, 2000; Rice, Bayles, 2003). Линкомицин вызывал гибель клеток A. variabilis с признаками автолиза.

Выводы

1 По флуоресценции дихлорфлуоресцеина (DCF) зарегистрировано образование Н2О2 в пленках эпидермиса из листьев гороха, кукурузы и клетках цианобактерии A variabilis

2 Цианид вызывал апоптозное разрушение ядер замыкающим клеток устьиц в эпидермисе, изолированном из листьев гороха Действие CIST усиливалось Н202 Нитросиний тетразолий, окисляющий 02, предотвращал разрушение ядер УК, вызванное CN~ или CN~ + Н202 Катионное производное убихинона 10-(6'-убихинолил)децилтрифенилфосфоний, избирательно аккумулирующееся в митохондриях, предотвращало CN~ -индуцированное разрушение ядер устьичных клеток и подавляло НгОг-зависимое образование 2',7'-дихлорфлуоресцеина в эпидермисе из листьев гороха, вызванное менадионом Маннитол и этанол, ловушки ОН, уменьшали CN--индуцированный апоптоз Н2О2, ОН, а также ресурсы Ог, используемые для генерации Н2О2, участвуют в СЬГ-ипдуцированном апоптозном распаде ядер устьичных клеток

3 Хинакрин, ингибитор флавиновых ферментов, подавлял флуоресцентный ответ DCF на добавление Н2О2 или менадиона Хинакрин не влиял на дыхание и фотосинтетическое выделение 02 насечками листьев гороха Возможно, NADPH-оксидазы плазматической мембраны в качестве источника АФК в программированной гибели клеток

4 Краситель бенгальский розовый (БР), фотосенсибилирующий образование сингаетного кислорода ('02) в сочетании с NADH, окисляемым 'Ог с образованием 02, на свету вызывал рост выхода флуоресценции DCF чувствительный к НСТ Эти результаты позволяют предполагать о функционировании пероксидазы клеточной стенки в качестве источника активных форм кислорода

5 БР и этиловый эфир тетраметилродамина, ингибиторы фотосистемы II диурон и бромоксинил, фотосенсибилизирующие генерацию синглетного кислорода, подавляли CN" -индуцированное разрушение клеточных ядер на свету Это подавление предотвращалось добавленным NADH, субстратом пероксидазы Инкубация насечек листьев с БР на свету снижала скорость фотосинтетического выделения 02 и создавала проницаемость устьичных клеток для иодистого пропидия Синглетный кислород, генерируемый БР на свету, по-видимому, вызывает некроз устьичных клеток, выводя из строя фотосистему II хлоропластов

6 Н2О2 и менадион вывали увеличение флуоресценции DCF в клетках A variabilis, которые вызывали разрушение нуклеоидов клеток Линкомицин, ингибитор синтеза белка у бактерий, вызвал разрушение клеток A variabilis с признаками автолиза

7 Активные формы кислорода участвуют в программированной гибели клеток растений и разрушении нуклеоидов клеток A variabilis Источниками АФК, в ПКС клеток растений являются флавиновые ферменты плазматической мембраны, хлоропласты, митохондрии, ядро устьичных клеток, а также апопластная пероксидаза

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1 Самуилов В Д, Киселевский Д Б , Синицын С В, Шесгак А А, Лагунова Е М , Несов А В (2006) Н2О2 усиливает CTST -индуцированный апоптоз в листьях гороха Биохимия, 71, с 481-492

2 Дзюбинская Е В , Киселевский Д Б , Лобьппева Н В , Шестак А А, Самуилов В Д (2006) Гибель устьичных клеток в эпидермисе листьев при нарушении энергообеспечения Биохимия, 71, с 1383-1391.

3 Васильев Л А, Воробьев А А, Дзюбинская Е В , Несов А В , Шестак А А, Самуилов В Д (2007) Вызванная CN" гибель клеток в листьях растений Биохимия, 72, с 707-713

4 Шестак А А, Молчанова Д В Флуориметрическое изучение образования АФК в клетках листьев гороха Молодые исследователи - регионам Материалы всероссийской научной конференции студентов и аспирантов Тезисы докладов в 2-х томах - Вологда ВоГТУ, 2005-TI -с 48

5 Шестак А А, Молчанова Д В Образование АФК при воздействии на злектронтранспоргные цепи митохондрий и хлоропластов Тезисы докладов международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия», Вологда, 2005 с 187-188

6 Nesov А V, Kuznetsova J Е , Shestak А А, Kiselevsky D В Reactive oxygen species and their sources in programmed death of pea guard cells Тезисы докладов международной конференции «Российская биоэнергетика от молекул к клетке», Москва, МГУ, 2005 с 54

7 Шестак А А, Булахов А В Флуориметрическое определение образования активных форм кислорода в эпидермальных пленках из листьев гороха Тезисы докладов XIII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2006», Москва, 2006, с 250

8 Киселевский Д Б, Шестак А А, Несов А В, Кузнецова Ю В Влияние ингибиторов флавиновых ферментов и Са2+ на индуцируемую цианидом гибель устьичных клеток гороха Международная научная конференция "Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных экосистемах" 16-19 мая 2006 г, Москва. Сборник тезисов, с 78-79

9 Булахов А В, Молчанова Д В, Шестак А А, Киселевский Д Б Разрушение нуклеоидов в клетках Anacystis mdulans при окислительной обработке Тезисы докладов XIV международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2007», Москва, 2007, с 3-4

10 Киселевский Д Б , Васильев Л А , Дзюбинская Е В , Шестак А А, Самуилов В Д Программируемая гибель клеток растений действие производного убихинона mitoQ, избирательно аккумулируемого митохондриями Тезисы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2007, с 261-264

11 Шесгак А А, Киселевский Д Б , Самуилов В Д Образование синглетного кислорода в фотосистеме II хлоропластов и его участие в программируемой гибели устьичных клеток гороха Материалы докладов международной конференции (в трех частях) Часть 2 «Современная физиология растений от молекул до экосистем», Сыктывкар, 2007, с 434

12 Nesov А V, Shestak A A, Kiselevsky DB, Samuilov VD Effect of qunacnne and diphenylene lodonium, flavin enzymes inhibitors, on programmed cell death of pea guard cells Proceedings of the I (IX) conference of young botanists in Saint-Petersburg St Petersburg, 2006, p 228-229

13 Kuznetsova J E , Shestak A A, Kiselevsky D В , Samuilov VD The role of Ca 2+ m the generation of reactive oxygen species and programmed cell death induced in plants Proceedmgs of the I (IX) conference of young botanists in Saint-Petersburg St Petersburg, 2006, p 226-227

14 Kiselevsky D В , Shestak A A, Smitsyn S V , Nesov A V , Samuilov V D Cyanide-

th

induced apoptosis m pea leafs 14 European Bioenergetics Conference EBEC, Moscow State University, Moscow, 22-27 July 2006 Abstract book, p 499

Подписано в печать 17.10 2007 Формат 60x88 1/16 Объем 1 п л. Тираж 50 экз Заказ № 675 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Шестак, Анна Александровна

Выводы

1. По флуоресценции дихлорфлуоресцеина (DCF) зарегистрировано образование Н2О2 в пленках эпидермиса из листьев гороха, кукурузы и клетках цианобактерии A. variabilis.

2. Цианид вызывал апоптозное разрушение ядер замыкающих клеток устьиц в эпидермисе, изолированном из листьев гороха. Действие CN" усиливалось Н2О2. Нитросиний тетразолий, окисляющий Ог", предотвращал разрушение ядер УК, вызванное CN" или CN~ + Н2О2. Катионное производное убихинона 10-(6'-убихинолил)децилтрифенилфосфоний, избирательно аккумулирующееся в митохондриях, предотвращало CIST -индуцированное разрушение ядер устьичных клеток и подавляло НгОг-зависимое образование 2',7'-дихлорфлуоресцеина в эпидермисе из листьев гороха, вызванное менадионом. Маннитол и этанол, ловушки 'ОН, уменьшали CN" -индуцированный апоптоз. Н2О2, -ОН, а также ресурсы Ог", используемые для генерации Н2О2, участвуют в CNr-индуцированном апоптозном распаде ядер устьичных клеток.

3. Хинакрин, ингибитор флавиновых ферментов, подавлял флуоресцентный ответ DCF на добавление Н2О2 или менадиона. Хинакрин не влиял на дыхание и фотосинтетическое выделение 02 насечками листьев гороха. Возможно, NADPH-оксидаза плазматической мембраны функционирует в качестве источника АФК в программированной гибели клеток.

4. Краситель бенгальский розовый (БР), фотосенсибилирующий образование синглетного кислорода ('02) в сочетании с NADH, окисляемым !0? с образованием Ог", на свету вызывал рост выхода флуоресценции DCF, чувствительный к НСТ. Эти результаты позволяют предполагать

Camacho A., Moreno-Sanchez R., Bernal-Lugo I. (2004) Control of superoxide production in mitochondria from maize mesocotyls. FEBS Lett., 570, 52-56.

Carter, C., and Thornburg, R.W. (2000) Tobacco Nectarin 1: purification and characterisation as a germin-like, manganese superoxide dismutase implicated in the defense of floral reproductive tissues. J. Biol. Chem., 275, 36726-36733.

Carter, C., and Thornburg, R.W. (2004) Is the nectar redox cycle a floral defense against microbial attack? Trends Plant Sci., 9, 320-324.

Chen S., Dickman M.B. (2004) Bcl-2 family members localize to tobacco chloroplasts and inhibit programmed cell death induced by chloroplast-targeted herbicides ,/. Exp. Bot., 55,2617-2623.

Clarke P.G.H. (1990) Developmental cell death: morphological diversity and multiple mechanisms. Anat. Embryol, 181, 195-206.

Clarke PGH (1990) Developmental cell death, morphological diversity and multiple mechanisms. Anat. Embryol., 181, 195-213.

Collazo C., Chacon O., Borras O. (2006) Programmed cell death in plant resembles apoptosis of animals. Biotecnologia Aplicada, 23, 1-10.

Cory S., Adams J. (2002) The Bel 2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nature, 2, 647-656.

Cross, A.R., and Segal, A.W. (2004) The NADPH oxidase of professional phagocytes-prototype of the NOX electron transport chain systems. Biochim. Biophys. Acta, 1657, 1-22.

Curtis, M.J., and Wolpert, T.J. (2002) The oat mitochondrial permeability transition and its implication in victorin binding and induced cell death. Plant J., 29, 295-312.

Casolo V, Petrussa E, Krajnakova J, Macri F and Vianello A. (2005) Involvement of the mitochondrial K+atp channel in H2C>2- or NO-induced programmed death of soybean suspension cell cultures. J. Exp. Bot., 56, 997-1006.

Lambeth, J.D. (2004) NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nature Revs. Immunology, A, 181-188.

LeBel C.P., Ischiropoulos H., Bondy S.C. (1992) Evaluation of the probe 2',7'-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress. Chem. Res. Toxicol, 5, 227-231.

Leist M., Single B., Castoldi A.F., Ktihnle S., Nicotera P. (1997) Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J. Exp. Med., 185, 1481-1486.

Levine A, Tenhaken R, Dixon R, LambC (1994) H2O2 from oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Cell, 79, 583-593.

Lewis K. (2000) Programmed Death in Bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64, 503-514.

Lewis K. (2007) Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Rev. Micr., 5, 48-56.

Li W-G., Miller F.J., Zhang H.J., Spitz D.R., Oberley L.W., Weintraub N.L. (2001) H202-induced O2' production by a non-phagocytic NAD(P)H oxidase causes oxidant injury. J. Biol. Chem., 276, 29251-29256.

Lin J., Wang Y., Wang G. (2006) Salt stress-induced programmed cell death in tobacco protoplasts is mediated by reactive oxygen species and mitochondrial permeability transition pore status. J. of Plant Physiol., 163, 731-739.

Liocher S.I., Fridovich I. (2001) Copper, zinc, superoxide dismutase as a univalent NO" oxidoreductase and as a dichlorofluorescin peroxidase. The Journal of Biology Chemestry, 276, 35253-35257.

Liochev S., Fridovich I. (2004) CO2, not HC03", facilitates oxidations by Cu,Zn superoxide dismutase plus H202. PNAS, 101, 743-744.

Liszkay A, Zalm E, Schopfer P. (2004) Production of reactive oxygen intermediates (O2'» H2O2, and 'OH) by maize roots and their role in wall loosening and elongation growth. Plant Physiol., 136, 3114-3123.

Liszkay, A., Kenk, B., and Schopfer, P. (2003) Evidence for the involvement of cell wall peroxidase in the generation of hydroxyl radicals mediating extension growth. Planta, 217, 658-667.

LiuY., SchiffM., Czymmek K., Talloczy Z., Levine B., Dinesh-Kumar S.P. (2005) Autophagy regulates programmed cell death during the plant innate immune response. Cell, 121(4), 567-577.

Lopez-Huertas E., Corpas F.J., Sandalio L.M., Rio del L.A. (1999) Characterization of membrane polypeptides from pea leaf peroxisomes involved in superoxide radical generation. Biochem .J. 337, 531-536.

Love A.J., Yun B.W., Laval V., Loake G.J., Milner J.J. (2005) Cauliflower mosaic virus, a compatible pathogen of pathways and activates rapid systemic generation of reactive oxygen species. Plant physiology, 139, 935-948.

Marty F. (1999) Plant vacuoles. Plant Cell, 11, 589-599.

Maxwell D.P., Wang Y., Mcintosh L. (1999) The alternative oxidase lowers mitochondrial reactive oxygen production in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 8271-8276.

Mehdy M. C. (1994) Active oxygen species in plant defense against pathogens. Plant Physiol., 105, 467-472.

Mittler R., Lam E. (1995) Identification, characterization and purification of a tobacco endonuclease activity upon hypersensitive response cell death. Plant cell, 7, 1951-1962.

Mittler R., Herr E.H., Orvar B.L. Van Camp W., Willekens H., Inze D., Ellis B.E. (1999) Transgenic tobacco plants with reduced capability to detoxify reactive

Newmeyer, D.D., and Ferguson-Miller, S. (2003) Mitochondria: releasing power for life and unleashing the machineries of death. Cell, 112, 481-490, 2003.

Niemietz C.M., Tyerman S.D. (2002) New potent inhibitors of aquaporins: silver and gold compounds inhibit aquaporins of plant and human origin. FEBS Lett, 531, 443-447.

Ning. S.-B., Guo H.-L., Wang L. and Song Y.-C. (2002) Salt stress induces programmed cell death in prokaryotic organism Anabaena. J. of Applied Microbiology, 93,15-28.

Nishiyama Y., Allakhverdiev S.I., Murata N. (2005) Inhibition of the repair of photosystem II by oxidative stress in cyanobacteria. Photosynth. Res., 84, 1-7.

Nishiyama Y., Allakhverdiev S.I., Murata N. (2006) A new paradigm for the action of reactive oxygen species in the photoinhibition of photosystem II. Biochim. Biophys. Acta, 1757,742-749.

Okada K., Ikeuchi M., Yamamoto N., Ono T., Miyao M. (1996) Selective and specific cleavage of the D1 and D2 proteins of photosystem II by exposure to singlet oxygen: factors responsible for the susceptibility to cleavage of the proteins. Biochim. Biophys. Acta, 1274, 73-79.

Papadakis, A.K., and Roubelakis-Angelakis, K.A. (1999) Reduced activity of antioxidant machinery is correlated with suppression of totipotency in plant protoplasts. Plant Physiol. ,121,197-205.

Pastore D., Trono D., Laus M.N., Fonzo N.D. and Passarella S. (2001) Alternative oxidase in durum wheat mitochondria. Activation by pyruvate, hydroxypyruvate and gluoxylate and physiological role. Plant Cell Physiol, 42, 1373-1382.

Patton, S.E., Rosen, G.M., and Rauckman, E.Y. (1980) Superoxide production by purified hamster hepatic nuclei. Mol. Pharmacol., 18, 588-592.

Riedl S.J. and Salvesen (2007)The apoptosome: signaling platform of cell death. Molecular cell biology, 8, 405-412.

Rippka R., Deruelles J., Waterbury J.B., Herdman M., Stanier R.Y. (1979) Genetic assignments, strain histories and properties of pure culture of cyanobacteria.,/. Gen. Microbiol. Ill, 1-61.

Rodriguez R., Redman R. (2005) Balancing the generation and elimination of reactive oxygen species. PNAS, 102, 3175-3176.

Rutherford A.W. (1989) Photosystem II, the water-splitting enzyme. Trends Biochem Sci., 14, 227-232.

Rutherford A.W., Krieger-Liszkay A. (2001) Herbicide-induced oxidative stress in photosystem II. Trends in biochemical sciences, 26, 648-653.

Sagi M., Flure R. (2006) Production of reactive oxygen species by plant NADPH oxidases. Plant Physiol, 141, 336-340.

Samuilov V.D., Lagunova E.M., Kiselevsky D.B., Dzyubinskaya E.V., Makarova Y.V. and Gusev M.V. (2003) Participation of chloroplasts in plant apoptosis. Biosci. Rep., 23, 103-117.

Sanmartin M., Jaroszewski L., Raikhel N.V., Rojo E. (2005) Caspases. Regulating death sience the origin of life. Plant Physiol., 121, 197-205.

Scandalios J.G. (2005) Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses. Braz. J. Med. Biol. Res., 38, 995-1014.

Siedow J.N. and Umbach A.L. (2000) The mitochondrial cyanide-resistant oxidase structural conservation amid regulatory diversity. Biochim. Biophys. Acta, 1459, 432-439.

Sies H., Menck C. F. (1992) Singlet oxygen induced DNA damage. Mitation Research, 275,367-375.

Simeonova E., Garstka M., Koziol-Lipinska J., Mostowska A. (2004) Monitoring the mitochondrial transmembrane potential with the JC-1 fluorochrome in programmed celldeath during mesophyll leaf senescence. Protoplasma, 223, 143-153.

Skulachev V.P. (2006) Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitoptosis. Apoptosis, 11, 473-485.

Sperandio S., de Belle I., Bredesen D.E. (2000) An alternative, nonapoptotic form of programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 14376-14381.

Sugiyama M., Ito J., Aoyagi S., Fukuda H. (2000) Endonucleases. Plant Mol. Biol., 44, 387-397.

Sun Y.L., Zhu H.Z., Zhou J., Dai Y.R. and Zhai Z.H. (1999 a) Menadion-induce apoptosis and the degradation of lamin-like proteins in tobacco protoplasts. CMLS, Cell. Mol. Life Sci, 55, 310-316.

Sun Y-L., Zhao Y., Hong X., Zhai Z-H (19996) Cytochrome c release and caspase activation during menadione-induced apoptosis in plants. FEBS Letters, 462, 317-321.

Szilard A., Sass L., Hideg E., Vass I. (2005) Photoinactivation of photosystem II by flashing light. Photosynthesis Research, 84, 15-20.

Takabatake R., Ando Y., Seo S„ Katou S., Tsuda S., Ohashi Y., Mitsuhara I. (2007) MAP kinases function downstream of HSP90 and upstream of mitochondria in TMV resistance gene N-mediated hypersensitive cell death. Plant Cell Physiol, 48(3), 498510.

Tefler A. (2002) What is (3-caratene doing in the photosystem II reaction centre? The Royal Society, 357, 1431-1440.

Tenhaken R., Levine A., Brisson L.F., Dixon R.A., Lamb C. (1995) Function of the oxidative burst in hypersensitive disease resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4158-4163.

Thompson A.R., Vierstra R. (2005) Autophagic recycling: lessons from yeast help define the process in plants. Current Opinion in Plant Biology, 8, 165-173.

Thordal-Christensen H., Zhang Z„ Wei Y., Collinge D.B. (1997) Subcellular localization of H2O2 in plants. H2O2 accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley-powdery mildew interaction. The Plant J., 11, 1187-1194.

Tiwari B.S., Belenghi B., Levine A. (2002) Oxidative stress increased respiration and generation of reactive oxygen species, resulting in ATP depletion, opening of mitochondrial permeability transition, and programmed cell death. Plant Physiol., 128, 1271-1281.

Tornroth-Horsefield S., Wang Yi., Hedfalk K., Johanson U., Karlsson M., Tajkhorshid E., Neutze R. and Kjellbom P.(2006) Structural mechanism of plant aquaporin gating. Nature, 439, 688-694.

Torres M.A., Jones J.D.G., Dangl J.L. (2006) Reactive oxygen species signaling in response to pathogens. Plant Physiol., 141, 373-378.

Trebst A., Depka B., Holländer-Czytko H. (2002) A specific role for tocopherol and of chemical singlet oxygen quenchers in the mainteanance of photosystem II structure and function in Chlamidomonas reinhardtii. FEBS Letters, 516, 150-160.

Trotta E., Del Grosso N., Erba M., Melino S„ Cicero D. and Paci M. (2003) HNMR study of [d(GCGATCGC)]2 and its interaction with minor groove binding 4'6 -diamidino-2-phenylin. Eur. JBiochem, 270, 4755-4761.

Umbach A.L., Gonzales-Meler M.A., Sweet C.R., Siedow J.N. (2002)Activation of the plant mitochondrial alternative oxidase: insights from site-directed mutagenesis. Biochim. Biophys. Acta, 1554, 118-128.

Umbach A.L., Ng V.S. and Siedow J.N. (2006) Regulation of plant alternative oxidase activity: a tale of two cysteines. Biochim Biophys. Acta, 1757, 135-142.

Uren A.G., O Rourke K., Aravind L., Pisabarro M.T., Seshagiri S., Koonin E.V., Dixit V.M. (2000) Identification of paracaspases and metacaspases: two ancient families of caspase-like proteins, one of which plays a key role in MALT lymphoma. Mol. Cell, 6, 961-967.

Vacca R.A., de Pinto M.C., Valenti D., Passarella S., Marra E., De Gara L. (2004) Production of reactive oxygen species, alteration of cytosolic ascorbate peroxidase, and impairment of mitochondrial metabolism are early events in heat shock-induced programmed cell death in tobacco bright-yellow 2 cells. Plant Physiol., 134, 1100-1112. van Doom W.G., and Woltering E.J. (2005) Many ways to exit? Cell death categories in plants. Trends in Plant Sci., 10, 117-122. van Glestelen, P., Asard, H., and Caubergs, R.J. (1997) Solubilization and Separation of a Plant Plasma Membrane NADPH-02- Synthase from Other NAD(P)H Oxidoreductases. Plant Physiol., 115, 543-550. van Loo G, Saelens X, van Gurp M, MacFarlane M, Martin SJ, Vandenabeele P. (2002) The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet Cell Death Diffe, 9, 1031-1042.

Vandenabeele P, Berghe T.V., Festjens N. (2006) Caspase inhibitors promote alternative cell death pathways. Sci. STKE, 358.

Varfolomeev E.E., Ashkenazi A. (2004) Tumor necrosis factor: an apoptotic JuNKie? Cell, 116, 491-497.

Veal E.A., Day A.M., Morgan B.A. (2007) Hydrogen peroxide sensing and signaling. Molecular cell, 26, 1-11.

Vianello, A., and Macri, F. (1991) Generation of superoxide anion and hydrogen peroxide at the surface of plant cells. J. Bioenerg. Biomembr., 23, 409-423.

Vranova E, Inze D, Van Breusegem F. (2002) Signal transduction during oxidative stress. J. Exp. Bot., 53, 1227-36.

Wagner D., Przybyla D., Camp R., Kim Ch., Landgraf F., Lee K.P., Wiirsch M., Laloi Ch., Nater M., Hideg E., Apel K. (2004) The genetic basis of singlet oxygen-induced stress responses of Arabidopsis thaliana. Science, 306, 1183-1185.

Wang H., Bostock R.M., Gilchrist D.G. (1996a) Apoptosis: a functional paradigm for programmed plant cell death induced by a host-selective phytotoxin and invoked during development. Plant Cell, 8, 375-391.

Wang M., Oppendijk B., Lu X., Van Duijn B., Schilperoort R.A. (19966) Apoptosis in barley aleurone during germination and its inhibition by abscisic acid. Plant Mol. Biol., 32,1125-1134.

Winyard P.G., Moody C., Jacob C. (2005) Oxidative activation of antioxidant defence. Trends in Biochemical Siences, 30, 453-461.

Wojtaszek P. (1997) Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection. Biochem. J., 322, 681-692.

Wood Z.A., Schroder E., Robin H. J., Poole, L.B. (2003) Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends Biochem. Sci., 28, 32-40.

Wrona M., Patel K., Wardmam P. (2005) Reactivity of 2',7'-dichlorodihydrofluorescein and dihydrorhodamine 123 and their oxidized forms to word carbonate, nitrogen dioxide, and hydroxyl radicals. Free Rad. Biol., 38, 262-270.

Xing B.L. and Zhang L. (2007) Involvement of NADPH oxidase in sulfur dioxide-induced oxidative stress in plant cells. Nat. Prod. Rep., 6, 628-634.

Yaglom J.A. Ekhterae D., Gabai V.L. and Sherman M.Y. (2003) Regulation of necrosis of H9c2 myogenic cells upon transient. J. Biol. Chem., 278, 50483-50496.

Yao N, Eisfelder BJ, Marvin J and Greenberg JT. (2004). The mitochondrion, an organelle commonly involved in programmed cell death in Arabidopsis thaliana. Plant J. 40, 596-610.

Yokota, К., and Yamazaki, I. (1977) Analysis and computer simulation of aerobic oxidation of reduced nicotinamide adenine dinucleotide catalyzed by horseradish peroxidase. Biochemistry, 16, 1913-1920.

Yoshioka M., Uchida S., Mori H., Komayama K., Ohira S., Morita N., Nakanishi Т., Yamamoto Y. (2006) Quality control of photosystem II cleavage of reaction center D1 proteijn in spinach thylakoids by FtsH protease under moderate heat stress. J. Biol. Chem., 281, 21660-21669.

Zorov D.B., Filburn C.R., Klotz L-O., Zweier J.L., Sollott S.J. (2000) Reactive oxygen species (ROS)-induced ROS release: a new phenomen accompanying induction of the mitochondrial permeability transition in cardiac myocytes. J. Exp. Med., 192, 1001-1014.

Zou H., Li Y., Liu X., Wang X. (1999) An APAF-1 cytochrome с multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J. Biol. Chem., 21 A, 1154911556.