Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адаптация трансгенных растений рапса (Brassica napus L.) со встроенным геном транс-фактора Osmyb4 риса к тяжелым металлам

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Адаптация трансгенных растений рапса (Brassica napus L.) со встроенным геном транс-фактора Osmyb4 риса к тяжелым металлам"

На правах рукописи

МУХАММЕД МУКБЕЛЬ МАРЕАЙ

АДАПТАЦИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ РАПСА (Brassica napus L.) СО ВСТРОЕННЫМ ГЕНОМ ТРАНС-ФАКТОРА OsmybA РИСА К ТЯЖЕЛЫМ МЕТАЛЛАМ 03.01.05 — физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 ' ВД izn

Москва-2012

005045159

Работа выполнена в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук и на кафедре ботаники, физиологии растений и агробиотехнологии Российского университета дружбы народов, Москва.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Радцугина Галина Николаевна

Научный консультант:

доктор биологических наук

профессор, чл.-корр. РАН Кузнецов Владимир Васильевич

Официальные оппоненты:

Балнокнн Юрий Владимирович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, лаборатория солевого обмена и солеустойчивости, заведующий лабораторией

Тараканов Иван Германович, доктор биологических наук, профессор, Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К. А. Тимирязева, кафедра физиологии растений, заведующий кафедрой

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Карельского научного центра Российской академии наук

Защита состоится 19 июня 2012 г. в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.210.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276,г. Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (499)977 80 18, e-mail: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государствешюго бюджетного учреждения науки Ипститута физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

Автореферат разослан «18» мая 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного

канд. биол. наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из негативных результатов бурного развития промышленности является загрязнение среды обитания тяжелыми металлами (ТМ), к которым относятся химические элементы, имеющие плотность больше 5 г/см3 и атомную массу более 40 Да (Кузнецов, Дмитриева, 2011). Многие ТМ, такие, например, как медь и цинк, являются эссенциальными элементами, т.е. элементами, которые в низких концентрациях жизненно необходимы для нормального роста и развития организма (Kholodova et al., 2011). Тем не менее, в высоких концентрациях они негативно влияют как на жизнь растений, так и на здоровье человека, накапливаясь в организме и вызывая различные нарушения. Так, высокие концентрации ТМ вызывают ингибирование роста растений и снижение урожая, торможение фотосинтеза и дыхания, нарушение синтеза белка и донорно-акцепторных отношений, инактивацию ключевых ферментов метаболизма, изменение водного и гормонального статуса и даже гибель организма (Титов и др., 2007; Kholodova et al., 2011).

Растения могут адаптироваться к токсическому действию высоких концентраций ТМ. В основе этой адаптации лежит формирование и функционирование как специализированных (хелатирование, секвестрация и компартментация ТМ), так и общих механизмов устойчивости (низкомолекулярные органические стресс-протекторные соединения, защитные макромолекулы и антиоксидантные системы) (Hall, 2002; Clemens, 2006; Кузнецов, 2009). Клетки растений воспринимают действие стрессорных факторов и передают внешний сигнал на особые регуляторные белки, называемые транскрипционными факторами или транс-факторами (Vannini et al., 2006), которые вызывают изменение экспрессии генов и формирование стресс-протекторных систем.

Знание механизмов устойчивости растений к ТМ позволяет получить методами генной инженерии трансгенные растения, обладающие большей устойчивостью к токсическому действию ТМ. Для этой цели можно переносить в сельскозяйственные культуры (1) гены, участвующие в хелатировании ионов (Lefebvre et al., 198; Gasic et al., 2005), (2) гены, продукт которых превращает высокотоксичные формы в менее токсичные (Bizilli, 1999), (3) гены общих механизмов устойчивости или, наконец, (4) гены, кодирующие транс-факторы (Mattana et al., 2005; Latchman, 2007; Гомаа и др., 2012).

Одним из наиболее перспективный биотехнологических путей получения растений, обладающих повышенной устойчивостью к ТМ, является использование генов транс-факторных белков. Транс-факторные белки взаимодействуют с ДНК (либо с другими белками, а затем с ДНК), в результате чего образуется комплекс белок-ДНК, регулирующий экспрессию большого числа генов, в том числе и генов стрессорного ответа (Latchman, 2007). В растениях весьма распространены транскрипционные факторы MYB семейства (Vannini et al., 2006). К этому

семейству относится и используемый в данной работе ген Osmyb4, который был изолирован из генома растений риса (Pandolfi et al., 1997).

Ранее было установлено, что сверхэкспрессия гена Osmyb4 риса в трансгенных растениях А. thaliana приводила к повышению засухо- и холодоустойчивости (Vannini et al., 2004, Mattana et al., 2005), а также сопровождалась повышением устойчивости растений ярового рапса (Brassica napus L.) к низким положительным и отрицательным температурам (Гомаа и др., 2012). При этом было показано, что повышение устойчивости этих трансгенных растений сопровождается интенсивной аккумуляцией совместимых осмолитов, обладающих стресс-протекторным эффектом (пролин, сахара и т.п.), а также низко молекулярных органических соединений с антиоксидантной активностью (Mattana et al., 2005; Гомаа и др., 2012). На этом основании нами было высказано предположение, что трансгенные растения рапса с суперэкспрессией гена Osmyb4 риса могут быть устойчивы не только к засухе и низкотемпературному стрессу, но также и к повреждающему воздействию высоких концентраций ТМ, в частности, солей меди и цинка. Несмотря на то, что получение трансгенных растений рапса с повышенной устойчивостью к ТМ актуально как с теоретической, так и с практической точек зрения, до сих пор оно никем не проводилось.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в том, чтобы выяснить, сопровождается ли суперэкспрессия гена Osmyb4 риса в растениях рапса повышением устойчивости к действию тяжелых металлов и, если сопровождается, то каковы физиологические механизмы этого явления.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

(1) Изучить наследование трансгена Osmyb4 риса в растениях рапса и его экспрессию.

(2) Исследовать влияние высоких концентраций ТМ на некоторые физиологические процессы у трансгенных растений.

(3) Исследовать влияние ТМ на функционирование антиоксидантных систем у трансгенных растений рапса.

(4) Исследовать экспрессию некоторых генов устойчивости растений к ТМ.

Научная новизна работы. Показано, что в процессе генеративного

размножения трансгенных растений рапса ген трансфакторного белка Osmyb4 наследуется и активно экспрессируется в процессе адаптации к тяжелым металлам. Установлено, что экспрессия трансгена Osmyb4 в растениях рапса сопровождается повышением устойчивости к тяжелым металлам, в основе которой лежит снижение интенсивности окислительного стресса в результате аккумуляции низкомолекулярных органических антиоксидантов и увеличение активности антиоксидантных ферментов, с одной стороны, и накопление совместимых осмолитов, с другой. Впервые установлено, что интенсивная экспрессия гена Osmyb4 транс-фактора риса в растениях рапса в ответ на воздействие ТМ сопровождается активацией «работы» генов различных метаболических путей,

обеспечивающих формирование защитных механизмов и повышение устойчивости к повреждающему действию тяжелых металлов.

Практическая ценность работы. Рапс (Brassica napus L.), выбранный в данной работе в качестве объекта исследования, является многоцелевой культурой, поэтому очень важно получить растения, обладающие устойчивостью к действию многих абиотических стрессоров. Созданные и изученные трансгенные растения рапса могут быть использованы в селекционной практике в качестве исходных линий для создания новых сортов растений с повышенной устойчивостью к тяжелым металлам. Данные, полученные в настоящей работе и сделанные на их основе обобщения, могут быть использованы в курсах лекций по стресс-физиологии и трансгенозу для студентов различных учебных заведениях.

Апробация работы. Результаты работы были представлены: на Международной научно-практической конференции преподавателей, молодых ученых и аспирантов аграрных вузов РФ (Москва, 2010); Всероссийском симпозиуме "Растение и стресс" (Москва. 2010), на VII съезде Общества физиологов растений России, на Международной конференции «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011), на II Международной школе-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» Москва-Звенигород, 5-10 декабря 2011. Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов и списка цитированной литературы. Объем работы составляет 130 страниц. В диссертации содержится 20 рисунков, 15 таблиц. Список цитированной литературы содержит 251 источник, в том числе 208 - на иностранных языках.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. Объектом исследования были трансгенные и нетрансформированные растения Brassica napus var. napus ярового рапса сорта Вестар канадской селекции. Трансформированные растения рапса с геном Osmyb4 риса были созданы ранее в ИФР РАН. Полученные через культуру тканей растения размножали черенкованием in vitro на модифицированной среде Мурасиге-Скуга, После укоренения черенков их помещали в условия гидропонной культуры на среду Хогланда-Снайдерс при 24°С в условиях фитотрона с фотопериодом 12/12 день/ночь. Соли меди и цинка вносили в питательную среду в концентрациях: CuS04 - от 25 до 150 мкМ; ZnS04 - от 500 до 5000 мкМ

Методы исследования. Биомассу и содержание воды в растительном материале оценивали, используя гравиметрический метод. Сухую массу определяли после фиксации материала при 90°С и высушивания при 70°С до постоянного веса. Содержание воды (% от сырой массы) рассчитывали, исходя из разности свежей и сухой биомасс.

Содержания меди и цинка в тканях растений проводили по методу мокрого озоления, содержание пигментов определяли по методу Шлык (1971), содержание малонового диальдегида (МДА) определяли по методу Heath and Packer (1968). Содержание свободного пролина - по методу Bates et al. (1973). Активность СОД-по методу Beauchamp, Fridovich (1971), определение активности пероксидазы проводили по методу Ridge, Osborne (1971). Определение растворимых фенольных соединений проводили по методу Фолина-Дениса (Загоскина и др., 2003), содержание флавоноидов - по методу Gage (Gage, Wendei, 1950), содержание антоцианов - по методу Муравьевой (Муравьева и др., 1987), содержание белка - по методу Esen (1978). Тотальную ДНК выделяли методом Fulton (Fulton et al, 1995), обрабатывали ее РНКазой (Serva, Германия) и оценивали качество ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле. Тотальную РНК выделяли фенольным методом по Westhoff et al. (1981). Очистку ДНК от примесей, обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием реактивов фирм «Fermentas» (Литва) и «СибЭнзим» (Россия). Подбор праймеров осуществляли с помощью программ Oligo 6.71. Для ПЦР использовали праймеры, синтезированные фирмой «Литех» (Россия):

Таблица 1

Последовательности праймеров, использованных в полимеразной цепной реакции после обратной транскрипции

Ген Последовательность (5'-3')

туЬ s -CGGGAGGACGGACAACGAG as - GGATGGCGGCGCGACGAAC

nptll s - GTGGAGAGGCTATTCGGCTA as - CCACCATGATATTCGGCAAG3

ZIP4 s - GCTGCTGGTAGTGAAGAGAT as - ATCAGCTGCGATGAGGTCCA

ZIP1 s - GGAAGAACCAAGCTCCTTATCAT as - CAAATCATTCGCCTCTGGAA

PDH s - GAATCGAGTCCTCTCTACCA as - CACCAACTTGAACCCCATAG

P5CS s - AATGCTATCTTACACAAGGTGAT as - ACCATCAGAGAATCTTGTGCT

PCS s - ATCAGACCACCATTGACGACTT as - GAACTCACAAGACGAGGAACATCT

18SrRNA s - GAGTGATGTGCCAGACCTAGGAATT as - ATGCTGATCCGCGATTACTAGC

Примечание: s - прямой праймер; as - обратный праймер.

Все опыты были поставлены в трехкратной биологической повторности. Аналитическая повторность для каждой из них равна 3. Результаты обработаны с использованием пакета программ Windows Exel. Бары показывают относительную ошибку среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Наследование трансгена 0*туЪ4 риса в растениях рапса и его экспрессия при действии ТМ

Семена 2-го поколения трансгенных растений рапса проращивали в стерильных условиях; из семядолей проростков выделяли ДНК. Затем с помощью ПЦР проверяли наличие в проростках трансгенов ОзтуМ и прЛ1. При этом было показано, что из 50 трансгенных растений целевой ген ОятуЬ4 присутствовал в 40 проростках, селективный ген устойчивости к Км прШ - в 35 проростков, тогда как одновременно оба эти трансгена обнаруживались лишь в 25 проростках (табл. 2).

Таблица 2. Наследование трансгенов ОхтуЬ4 и прШ

Число высаженных семян Число исследованных растений Число растений с геном ОятуЬЛ Число растений с геном прШ Число растений с генами ОзтуЪ\ и прЛ\ Число растений, экспрессировав-ших ген 0$туЪ4

50 50 40 35 25 7

В дальнейшем 25 растений, содержавших оба трансгена, были размножены черенкованием и высажены в сосуды с питательным раствором, содержавшие 3000 мкМ 7пБ04 или 50 мкМ Си304. Спустя 15 суток от начала эксперимента из каждого растения была выделена тотальная РНК, которую использовали для проведения ОТ-ПЦР. Проведенный анализ показал, что из 25 полученных нами трансгенных растений, содержавших оба гена ОхтуМ и прЛ\, экспрессия гена ОзтуЬ4 на уровне образования транскриптов наблюдалась только у 7 растений, тогда как у остальных 18 растений ген ОзтуЬ4 не экспрессировался, хотя и присутствовал в геноме (табл. 2, рис. 1 А). Следует особо отметить, что в каждом из растений трансген ОзтуЬ4 избирательно экспрессировался лишь в ответ на действие или 2п804 или Си304. Так, было установлено, что в 5 из 7 растений, способных экспрессировать трансген ОятуЬ4, он активировался в ответ на воздействие 2п804> а у 2-х других растений - в ответ на воздействие Си304

Для дальнейшей работы по исследованию физиологии трансгенных растений рапса со встроенным геном ОвтуЬ4 риса было выбрано по одному растению для изучения действия каждой из исследуемых солей: растение линии №5 - для изучения воздействия 2п804 и растение линии №6 - для изучения влияния Си304.

12345 6789 10 11 12345678

А Б

нкМ о а S0 100 150 ; о 500 uoo зам жоо да»

7дней тнян

15дней Mua.

В Г

Рис. 1. Экспрессия гена ОзтуЪ4 у трансгенных растений рапса в ответ на действие солей тяжелых металлов.

Уровень индивидуальных транскриптов Osmyb4 (А) и R18 (Б) оценивали с помощью ОТ-ПЦР. Из листьев растений, обработанных солями ТМ, выделяли тотальную РНК, на которой синтезировали кДНК и амплифицировали её с помощью ПЦР со специфическими прймерами к генам Osmyb4 и R18. Фрагмент гена R18 использовали в качестве внутреннего контроля (для нормализации результатов).

А - уровни транскриптов Osmyb4 гена в трансгенных растениях: 1, 2, 3, 4, 5 - в условиях действия 3000 мкМ ZnS04; 6, 8 - при действии 50 мкМ CuS04; 7 - вода; 9 - ДНК из ^трансформированного растения; 10 - использованная плазмида; 11 - маркер;

Б - уровни транскриптов гена R18; 1-7 - трансгенные растения; 8 -^трансформированное растение.

В - уровни транскриптов Osmyb4 гена при воздействии на растения C11SO4;

Г - уровни транскриптов Osmyb4 гена при воздействии на растения Z11SO4

Трансгенные растения 2-х отобранных линий №5 и №6 были размножены черенкованием и высажены в сосуды с питательной средой, в которую были добавлены соли CuS04 и ZnS04 в указанных на рис. 1 концентрациях. Через 7 и 15 суток экспонирования из растений выделяли тотальную РНК и оценивали относительное содержания транскриптов гена Osmyb4 (рис. 1В, Г).

Как следует из полученных данных, при низких концентрациях ТМ (25 мкМ для CuS04; 500 и 1000 мкМ - для ZnS04) трансген Osmyb4 не экспрессировался, тогда как при более высоких концентрациях каждой из солей наблюдалась его интенсивная экспрессия. При этом интенсивность экспрессии гена Osmyb4 была значительно выше на 15 сутки экспозиции растений на растворе CuS04 по сравнению с 7 сутками (рис. 1В) При действии ZnS04 в течение 7 суток экспрессия гена наблюдалась лишь для самой высокой из испытанных нами концентраций -5000 мкМ. Причем, уровень транскриптов этого гена повышался лишь через 15 суток воздействия более низких концентраций ZnS04 (2000 и 3000 мкМ) (рис.1Г).

Накопление сырой биомассы и оводнённость растений

Для сравнительной оценки устойчивости трансгенных и ^трансформированных растений изучали их способность выживать и накапливать

биомассу при различных концентрациях ТМ. Отобранные нами линии растений были размножены черенкованием и высажены в сосуды с питательной средой, содержавшей Си804 в концентрациях от 25 до 150 мкМ и 2п804 от 500 до 5000 мкМ. Выживаемость растений и накопление ими биомассы определяли через 15 суток воздействия ТМ (рис. 2).

Из результатов, представленных на рис. 2, прежде всего, видно, что к 15 дню экспозиции при самых высоких из использованных нами концентраций Си804(150 мкм) и Еп804 (5000 мкМ) ^трансформированные растения погибали, тогда как трансгенные оставались живыми. Этот аргумент однозначно свидетельствует о более высокой устойчивости к ТМ трансгенных растений, экспрессирующих ген 0$туЪ4 риса.

800 -700 - -а

600 -500 - _рЕ £

400 -300 200 -100 - 1 2 гг — —Г

О 25 50 ЮО 150 500 1000 2000 3000 5000

Сив04 ЖпвСМ

мкМ

Рис. 2. Накопление биомассы растениями рапса при действии различных концентраций Си804 или ZnSOл

Прирост биомассы рассчитывали в % к массе исходных нетрасформированных и трансгенных растений, которую принимали за 100%.

1 - ^трансформированные растения; 2 - трансгенные растения

Выращивание растений на фоне возрастающих концентраций солей меди и цинка сопровождалось ингибированием роста используемых линий рапса, при этом Си804 ингибировал рост сильнее, чем 2п804 (рис. 2). Существенно, что накопление биомассы трансгенными растениями в присутствии различных концентраций 2п804 было менее выражено, чем нетрансформированными. Подобная же закономерность наблюдается при действии высоких концентраций Си804, что говорит о большей устойчивости к ТМ трансгенных растений.

Одновременно измеряли оводненность листовой ткани как показатель способности растений поддерживать водный статус в неблагоприятных условиях. Полученные результаты (рис. 3) показали, что через 15 дней эксперимента оводненность листьев контрольных растений, росших в стандартных условиях, практически не изменялась, сохраняясь на уровне оводнённости исходных растений (93%). Оводненность опытных растений начинала снижаться на фоне небольших концентраций как Си804 так и гп804. При этом при небольших

концентрациях СиЭОд (до 50 мкМ) и 7,п804 (до 2000 мкМ) оводненность трансгенных и нетрансформированных растений не различалась, тогда как, начиная со 100 мкМ Си804 и 3000 мкМ 7п804, оводненность трансгенных растений была несколько выше (82% воды при действии Си804 и 85% при 7п804), чем у нетрансформированных (содержание воды - 80% для Си804 и 84% для 2п804), что также говорит в пользу их большей устойчивости к ТМ.

С? 100 о^ 2 Л

03 В N 8» О. ш ез о 1 1т 1П

5 5 СивО 0 100 150 500 4 мкМ 1000 20 00 3000 5000 04

Рис. 3. Оводненность растений рапса при действии различных концентраций Си804 или гп804

1 - ^трансформированные растения, 2 - трансгенные растения

Аккумуляция ТМ в листьях растений рапса

Можно было думать, что более высокая устойчивость трансгенных растений к ТМ обусловлена их меньшей способностью аккумулировать ионы меди и цинка в тканях и, как следствие этого, более низким токсическим эффектом ТМ. Для проверки этого предположения исследовали содержание меди и цинка в листьях рапса под влиянием 25-150 мкМ СиЭ04 (рис. 4 А) и 500-5000 мкМ гпЭО,, (рис. 4 Б).

Было установлено, что в растениях, находившихся в течение 15 суток на стандартной питательной среде (контроль), содержавшей 0,25 мкМ СиБ04 и 1 мкМ 7п804, содержание меди не превышало 38 и 39 мкг на грамм сухих тканей листа. При добавлении в питательную среду 25 мкМ Си804 аккумуляция металла в обеих линиях растений по сравнению с контрольными увеличивалась примерно в 1,3 раза. При 50 мкМ Си304 в питательном растворе содержание меди у трансгенных растений в 1,9 раза превышало содержание металла в контрольных растениях, тогда как у нетрансформированных растений - в 1,7 раза. После добавления в питательную среду 100 мкМ Си804 содержание меди выросло в 2,4 раза у нетрансформированных растений и в 2,9 раз у трансгенных растений. При дальнейшем повышении концентрации меди в растворе до 150 мкМ нетрансформированные растения погибали, а у трансгенных растений содержание металла превышало контрольные показатели более, чем в 4,8 раза.

А

Б

г|ТгГ1^1~

О 25 50 100 Си804 (икМ)

к _ I 3

а « N 1

7000 6000 5000 4000 \ 3000

I «2000 а и юоо

§ " о и

-1-2-

гг

Й

500 1000 2000 3000 5000

гп804 (мкМ)

Рис. 4. Содержание меди и цинка в листьях рапса при действии Си§04 или 2п804 Растения выращивали в присутствии Си804(А) или- 7п804 (Б). 1 - ^трансформированные растения, 2 - трансгенные растения

Накопление 2п в тканях было во много раз выше, чем меди. Его содержание в листьях рапса у растений обеих линий, росших в стандартных условиях (контроль) 15 суток, в среднем не превышало 90 - 110 мкг цинка/г сухой массы листа. Аккумуляция металла при внесении в среду 500 мкМ гп804 у всех линий растений превышала контроль примерно в 3 раза; при 1000 мкМ 7,п804 -примерно в 10.5 раз. При дальнейшем повышении концентрации соли в питательном растворе накопление металла у трансгенных растений было значительно выше, чем у нетрансформированных (при 3000 мкМ превышение у трансгенов было в 37 раз. а у нетрансформированных - в 30 раз). При самой высокой испытанной нами концентрации в 5000 мкМ 7п804 в питательном растворе, содержание Ъп в трансгенных растениях составило 6592 мкг на г сухой биомассы листьев. Все это свидетельствует о том, что большая устойчивость трансгенных растений к ТМ не может быть объяснена их меньшим содержанием в тканях, чем у нетрансформированных растений.

Влияние меди и цинка на содержание пигментов

Медь и цинк являются эссенциальными элементами отчасти и потому, что вовлекаются в работу фотосинтетической системы. Однако их повышенные концентрации могут оказывать негативное действие, главным образом, через инициацию образования активных форм кислорода, вызывающих окислительный стресс и нарушающих процесс фотосинтеза.

При изучении влияния Си804 и 7п804 на трансгенные и ^трансформированные растения рапса было обнаружено, что повышение концентрации этих солей в питательном растворе негативно влияло на содержание хлорофилла в листьях рапса. Так, при внесении в питательную среду 25 мкМ Си804 суммарное содержание хлорофилла снижалось на 33% (табл. 3), тогда как на фоне 100 мкМ Си804 составляло лишь 33% от контроля в обеих линиях рапса. Наиболее ярко негативное влияние меди проявляется на уровне хлорофилла в,

Таблица 3. Содержание пигментов в листьях трансгенных и ^трансформированных растений рапса после воздействия солей Си504 или 2п804

Кон центр- солей мкМ Содержание пигментов, мг/ г сырой биомассы

Хл. а Хл. Ь Хл. (а+Ь) Хл. a^ Каротин Ксантофилл

1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2

0 1,12±0,09 1,11±0,1 0,36±0,03 0,36±0,04 1,48 1,47 3,1 3,1 0,42±0,021 0,41±0,02 0,56±0,028 0,56±0,028

Си804

25 0,96±0,06 0,95±0,04 0,19±0,01 0,2±0,02 1,15 1,15 5 4,8 0,38±0,019 0,37±0,018 0,44±0,02 0,44±0,019

50 0,41±0,02 0,39±0,02 0,12±0,01 0,12±0,01 0,53 0,51 3,4 3,3 0,15±0,007 0,16±0,01 0,22±0,012 0,23±0,011

100 0,45±0,03 0,44±0,03 0,12±0,01 0,13±0,01 0,57 0,57 3,8 3,5 0,11±0,005 0,15±0,007 0,18±0,01 0,21±0,01

150 0,36±0,03 0,09±0,01 0,45 4,0 0,07±0,01 0,12±0,08

гпво4

500 0,41±0,02 0,4±0,02 0,14±0,01 0,14±0,02 0,56 0,54 3,7 3,5 0,39±0,02 0,39±0,016 0,51±0,022 0,50±0,021

1000 0,36±0,02 0,35±0,02 0,11±0,02 0,11±0,01 0,47 0,46 3,3 3,2 0,29±0,02 0,31±0,012 0,39±0,02 0,40±0,02

2000 0,27±0,01 0,26±0,01 0,09±0,02 0,1±0,01 0,36 0,36 3,0 2,6 0,15±0,008 0,16±0,007 0,28±0,03 0,29±0,002

3000 0,21±0,01 0,22±0,01 0,04±0,01 0,05±0,01 0,25 0,27 5,3 4,4 0,11±0,005 0,16±0,008 0,22±0,01 0,25±0,015

5000 0,19±0,01 0,05±0,01 0,24 3,8 0,09±0.004 0,13±0,008

1 - ^трансформированные растения, 2 - трансгенные растения

который в условиях стресса разрушается, 'часТичнЬ защищая от деградации хлорофилл о, играющий ключевую роль в фотосинтезе. Содержание каротина и ксантофилла также уменьшалось при увеличении концентрации Си304 в растворе.

Однако значимые различия в содержании пигментов между линиями растений наблюдались только при высоких концентрациях этой соли в растворе. При 100

мкМ СиЭ04 содержание каротина в трансгенных растениях было на 34%, а ксантофилла на 17% больше, чем у ^трансформированных.

Повышенные концентрации гп304 также отрицательно влияли на содержание хлорофилла: на 15-е сутки экспозиции содержание хлорофилла в диапазоне использованных нами концентраций (от 500 до 3000 мкМ) уменьшалось на 62-83% у ^трансформированных растений и на 63-81% у трансгенных растений. Однако достоверных различий в содержании хлорофилла под действием повышенных концентраций ТМ между трансгенными и ^трансформированными растениями не наблюдалось даже при самых высоких концентрациях. Степень разрушения хлорофилла была одинакова у растений обеих линий. Содержание каротина и ксантофилла при повышении количества соли в растворе было одинаково до концентрации гпЭОд 2000 мкМ; при 3000 мкМ у трансгенных растений каротина было на 45%, а ксантофилла на 14% больше, чем у нетрансформированных.

Величина, характеризующая отношение содержания хлорофилла а к хлорофиллу в, в норме колеблется в пределах 2,5-3,0. Превышение данного уровня свидетельствует о деградации хлорофилла в. Согласно полученным нами данным, отношение содержания хлорофиллов а/в при действии 3000 и 5000 мкМ 7пЭ04 в течение 15 дней составляла 5,2 и 5,3, а в трансгенных - 4,4. и 3,8, что свидетельствует о меньшей степени повреждения ТМ фотосинтетического аппарата.

Влияние ТМ на перекисное окисление липидов

Полученные выше данные свидетельствуют о том, что весьма вероятной причиной большей устойчивости трансгенных растений к ТМ является меньшая интенсивность окислительного стресса, который испытывают эти растения на фоне действия ТМ. Об интенсивности протекания процесса перекисного окисления липидов мембран свидетельствует уровень малонового альдегида в тканях растений. Из данных, представленных на рис. 5, видно, что в области низких концентраций обеих солей ТМ, добавленных в питательный раствор, в листовых тканях содержание МДА у трансгенных и нетрансформированных растений практически не отличалось. При дальнейшем повышении концентрации солей в растворе проявлялись различия между линиями растений: в трансгенных растениях МДА накапливается значительно меньше, чем в нетрансформированных. Особенно большая разница обнаружена при воздействии повышенных концентраций Си304,

при которых уровень МДА по сравнению с контролями повышался у трансгенных растений в 10 раз, тогда как у ^трансформированных - почти в 20 раз. При этом влияние обеих солей на накопление МДА в трансгенных растениях было примерно одинаково, хотя и имелось небольшое превышение его аккумуляции под действием Си804. В этом случае содержание МДА составляло 2,6 мкМ на г сырой биомассы, тогда как у трансгенных растений оно равнялось 1,7 мкМ. Для растений, находящихся под воздействием гп804, аккумуляция МДА в трансгенных и нетрансформированных растениях почти не отличалась.

Рис. 5. Накопление МДА в листьях трансгенных и нетрансформированных растений рапса после воздействия солей ТМ. 1 - ^трансформированные растения, 2 - трансгенные растения

Изменение активностей гваякольной пероксидазы и супероксиддисмутазы при ТМ стрессе

Результаты, представленные на рис. 6 и 7, показывают активности некоторых ферментов антиоксидантного комплекса растений.

Уровень активности гваякольной пероксидазы (рис. 6) в трансгенных растениях при действии низких концентраций солей ТМ (25 мкМ СиЯ04 или 500 и 1000 мкМ 2п804) оставался равным активности фермента у растений, росших 15 суток в стандартных условиях. При увеличении концентрации солей в питательном растворе активность фермента снижалась, причем, под действием Сий04 значительно сильнее, чем под действием 2п804. При этом активность пероксидазы у трансгенных растений была выше, чем у нетрансформированных растений

При 50 мкМ Си804 активность фермента у трансгенных растений уменьшалась в 1,4 раза, у нетрансформированных - в 2 раза, а под действием 100 мкМ соли активность падала в 3 раза у трансгенных и почти в 5 раз у нетрансформированных растений.

з п

о

26 £0 100 150 Си804

мкМ

500 1000 2000 3000 5000

гп804

Сульфат цинка влиял на активность пероксидазы в меньшей степени, чем Си804. При 2000 мкМ 2пЭ04 активность фермента оставалась равной в обеих линиях растений, хотя и уменьшалась в 1,4 раза по сравнению с активностью контрольных растений. При увеличении концентрации гп804 до 3000 мкМ отмечалась значительная разница в активности фермента между обеими линиями растений (в 2,7 раза у ^трансформированных растений и в 1,7 раза у трансгенных растений).

,_. 1,4 2 Щ 12. 1 2

я »Si з " , f |

У -5 - -r

= | (2 « О с.

О 8 - -

= ^ 0'4 Е 1 02

< X £ 1 1

0 2S SO 100 CuSOj ISO 500 1000 2000 3000 5000 ZnS04 мкМ

Рис. 6. Влияние солей тяжелых металлов на активность гваяколовой пероксидазы. 1 - ^трансформированные растения; 2 - трансгенные растения

Активность супероксиддисмутазы (СОД) у ^трансформированных растений исходно была выше, чем у трансгенных растений (рис. 7). Увеличение концентрации CuS04 в питательной среде вызывало значительное падение активности СОД у нетрансформированных растений, тогда как у трансгенных растений ее активность вплоть до 100 мкМ оставалась постоянной, снижаясь в 2,1 раза при 150 мкМ.

Рис. 7. Активность супероксиддисмутазы в листьях трансгенных и нетрансформированных растений рапса

1 — ^трансформированные растения; 2 — трансгенные растения

гп804 в концентрациях до 3000 мкМ практически не влиял на активность СОД, которая снижалась при 5000 мкМ в 1,8 раза по сравнению с контрольными растениями, находившимися в стандартных условиях.

Полученные данные свидетельствуют о том, что СОД и пероксидаза могут вовлекаться в снижение уровня АФК в трансгенных растениях рапса на фоне действия, прежде всего, ионов меди, обладающих большей токсичностью по сравнению с ионами цинка.

Аккумуляция пролина в листьях растений рапса

Одной из универсальных защитных реакций растений в ответ на действие абиотических факторов является аккумуляция совместимых осмолитов, в частности, пролина, обладающих осморегуляторным и стресс-протекторным действием.

При изучении накопления пролина в листьях растений рапса под действием повышенных концентраций солей ТМ было установлено, что в контрольных растениях, росших 15 суток в стандартных условиях, уровень свободного пролина в листьях составлял в среднем 13,2 мкмоль/г сырой массы листа у нетрансформированных растений и 13,6 мкмоль/г сырой массы у трансгенных растений (рис. 8).

1Я 450

X 400 -

350 -

300 -

ч

о и 250 ■

г я

а Е 200 ■

а Я V© 150

я 100 -

о о. 50 -

К 0 ■

л

ш

г- П

Ш

25 50 100 150

Си804

мкМ

500 1000 2000 3000 5000

гп804

Рис. 8. Накопление пролина в листьях трансгенных и нетрансформированных растений рапса после воздействия Си804 или 7п804

1 - ^трансформированные растения, 2 - трансгенные растения При действии на растения в течение 15 дней 25 мкМ СиЯО., (рис. 8) содержание пролина увеличивалось по сравнению с контрольными растениями примерно в 3 раза у трансгенной и нетрансформированной линий растений. Значимой разницы в накоплении пролина у обеих линий растений не наблюдали и при концентрации 50 мкМ Си804, поскольку содержание пролина увеличивалось примерно в 10 раз как у одной, так и у другой линии. Существенная разница в накоплении пролина наблюдалась при действии 100 мкМ Си804 (у нетрансформированных растений содержание пролина возрастало в 21,3 раза, а у

трансгенных растений его количество возрастало в 27,8 раз). При повышении концентрации Си304 в растворе до 150 мкМ аккумуляция пролина у трансгенного растения возрастала незначительно, увеличиваясь на 8% от уровня пролина, аккумулировавшегося при 100 мкМ Си304.

Низкие концентрации цинка не оказывали заметного стрессорного влияния на растения рапса (рис. 9), тем не менее, при концентрации 1000 мкМ гп804 содержание пролина увеличивалось примерно в 3 раза. При более высоких концентрациях 2п804 от 2000 до 5000 мкМ происходило увеличение аккумуляции пролина в обеих исследуемых линиях растений (при 2000 мкМ - в 13 раз у трансгенов и в 11 раз - у ^трансформированных растений, при 3000 мкМ - в 15 и в 12 раз соответственно, и при 5000 - в 20 раз у трансгенных растений, по сравнению с контрольными растениями).

Аккумуляция фенолов, флавоноидов и антоцианов под действием солей меди и цинка.

Представленные выше данные по интенсивности окислительного стресса (рис. 5) свидетельствуют о том, что трансгенные растения рапса с геном ОьтуЪ4 риса при воздействии невысоких концентраций солей ТМ (до 50 мкМ для Си804 и до 1000 мкМ для 2пЭ04) характеризуются равной интенсивностью окислительного стресса по сравнению с нетрансформированными растениями, тогда как при повышении концентрации солей ТМ в питательном растворе накопление МДА у ^трансформированных растений увеличивалось и особенно ярко это проявилось при действии СиЭ04. Это позволило предположить, что одной из причин сохранения внутриклеточного статуса трансгенных растений в условиях действия ТМ является аккумуляция соединений с антиоксидантными свойствами, к которым могут быть отнесены, прежде всего, растворимые фенолы и антоцианы.

Результаты, представленные на рис. 9, показывают, что в контрольных растениях, росших 15 суток в стандартных условиях, содержание фенолов составляло 8 мкг/1 г свежей массы для обеих линий растений. При небольшом повышении концентраций солей ТМ в питательном растворе (до 25 мкМ СиЭ04 и до 1000 мкМ 2пЭ04) накопление фенолов было примерно равно у исследуемых линий растений, однако при повышении концентраций солей меди и цинка в растворе количество фенолов в тканях резко увеличивалось, причем у трансгенных растений значительно в большей степени (при 100 мкМ СиЭ04 в 7,2 раза), чем у ^трансформированных (в 5,2 раза). Надо отметить, что дальнейшее увеличение концентрации Си504 не увеличивало накопление общих фенолов в тканях трансгенных растений, тогда как при увеличении концентрации гпЭ04 происходило постоянное увеличение аккумуляции растворимых фенолов в трансгенных растениях (30 мкг/г сырой биомассы при 2000 мкМ соли, 45 мкг/ г сырой биомассы при 3000 мкМ и 66 мкг/ г сырой биомассы при 5000 мкМ 2п804).

г

>■. о

---

_£

а 1 Л

12

п п 1 П 1 1 1

Си804

1000 2000 3000 5000

гпвОд

Рис. 9. Влияние солей меди и цинка на накопление фенольных соединений в листьях трансгенных и ^трансформированных растений рапса

1 - ^трансформированные растения; 2 - трансгенные растения При расчете использовали относительные единицы на основании коэффициента пересчета для рутина.

При добавлении в питательную среду 25 и 50 мкМ Си804 содержание флавоноидов практически не отличалось от контрольного значения (рис. 10). При увеличении концентрации меди в питательном растворе до 100 мкМ в листьях рапса накапливалось в 3 раза больше флавоноидов у ^трансформированных растений, тогда как у трансгенных растений их накапливалось в 4 раза больше. Дальнейшее повышение концентрации ионов меди в растворе не оказывало дополнительного стимулирующего влияния на содержание флавоноидов.

В экспериментах с 500 и 1000 мкМ 7.п504 содержание флавоноидов в обеих линиях растений существенно не отличалось от контрольных. При повышении концентрации цинка от 2000 до 5000 мкМ количество флавоноидов значительно увеличивалось. На 15-й день воздействия гп804 содержание флавоноидов у ^трансформированных растений оказалось в 2 и 3 раза, тогда как у трансгенных -в 2 и 3,5 раза (соответственно для концентраций 2000, 3000 мкМ) выше. При воздействии 5000 мкМ гп504 уровень флавоноидов возрастал почти в 5 раз, и их содержание составляло 32,85 относит, ед. / г сырой массы.

Характер изменения содержания антоцианов в сравниваемых растениях под действием меди и цинка (рис. 11) практически не отличался от изменения содержания фенольных соединений. В ответ на действие ионов меди происходило быстрое накопление антоцианов в листьях всех растений и на 15-е сутки при концентрации 25 мкМ их содержание превышало контрольные значения в 1,9 раза у трансгенных и нетрансформированных растений; при дальнейшем увеличении

25 50 100 150

CuS04

мкМ

500 1000 2000 30005000 ZnS04

Рис. 10. Накопление флавоноидов в листьях трансгенных и нетрансформированных растений рапса после воздействия солей ТМ.

1 - ^трансформированные растения; 2 - трансгенные растения При расчете использовали относительные единицы на основании коэффициента пересчета для рутина.

концентрации CuS04 разница между аккумуляцией антоцианов в двух линиях растений увеличивалась и при 50 мкМ аккумуляция антоцианов была у трансгенов в 1,4 раза, а при 100 мкМ в 2,6 раза больше, чем у нетрансформированных растений. Если сравнивать накопление антоцианов отдельно по каждой линии, то в нетрансформированных растениях при 100 мкМ CuS04 увеличение было в 3 раза выше, чем у растений, росших 15 суток в стандартных условиях, а для трансгенных растений произошло увеличение накопления этих соединений в 7,4 раза. Следует отметить также, что аккумуляция антоцианов в трансгенных растениях происходила аналогично с аккумуляцией фенолов — при достижении максимального значения содержания вещества (при 100 мкМ CuS04) дальнейшее возрастание концентрации CuS04 до 150 мкМ практически не увеличивало содержание антоциана.

При влиянии ZnS04 в концентрациях от 500 до 5000 мкМ содержание антоцианов в растениях изменялось также достаточно сильно, постоянно возрастая в значительно большей степени у трансгенных растений (в 3,7 раза при 2000 мкМ, в 6,8 раза при 3000 мкМ и в 9,3 раза при 5000 мкМ ZnS04)i чем у нетрансформированных (в 2,5 раза при 2000 мкМ и в 3,5 раза при 3000 мкМ).

J

33

С

180 160 140 120 100 80 60 40 20 О

-Т-

i т -1 rf

I г. 1-1 1= 1-

О 2S 50 100 150

CuS04

мкМ

500 1000 2000 3000 5000

ZnS04

Рис. 11. Накопление антоцианов в листьях трансгенных и ^трансформированных растений рапса после воздействия солей ТМ.

1 - ^трансформированные растения; 2 - трансгенные растения При расчете использовали относительные единицы на основании коэффициента пересчета для цианидина

Влияние ТМ на экспрессию генов системы их детоксикации в трансгенных растений

Помимо антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных органических соедиений с антиоксидантными свойствами повышенная устойчивость трансгенных растений рапса к ТМ могла быть вызвана изменением экспрессии генов, вовлеченных в хелатирование ТМ или в регуляцию их внутриклеточного гомеостатирования. Для проверки этого предположения изучали действие повышенных концентраций ТМ на экспрессию (1) двух генов, кодирующих мембранные транспортеры ТМ - Z1P1 и Z1P4, (2) гена фермента фитохелатинсинтазы {PCS), обеспечивающего синтез фитохелатинов, а также генов ферментов синтеза (P5CS) и деградации (PDH) пролина.

С помощью метода ОТ-ПЦР оценивали активность экспрессии этих генов на уровне тотального содержания индивидуальных мРНК через 7 и 15 сут. выращивания растений на средах с повышенным содержанием CuS04 или ZnS04. Опытные образцы в каждой временной точке выравнивались по контрольному показателю. В качестве контроля была выбрана активность данных генов у растений, выращенных на стандартной питательной среде. Пример активности генов ZIP1, ZIP4, PCS, P5CS\ PDH и 18SrRNA представлен на рисунке 12.

Сравнительный анализ полученных результатов показывает, что уровни транскриптов указанных выше генов у трансгенных и нетрансформированных растений принципиально не различались. По-видимому, экспрессия этих генов, продукты которых отвечают за хелатирование ТМ и поддержание внутриклеточных концентраций ионов меди и цинка, не регулируются трансфакторным белком 0SMYB4. Этим белком, очевидно, регулируются гены,

отвечающие за синтез вторичных соединений фенольной природы, обладающих антиоксидантными свойствами и частично обеспечивающих защиту растений от повреждающего действия ТМ.

Влияние CuS04 (50 мкМ) и ZnS04 (3000 мкМ) на экспрессию генов метаболизма пролина, PCS , ZIP1 и ZIP4 в трансгенных растениях рапса

Линия №6 Линия №5

под действием меди под действием цинка

1-к ( ^трансформированные); 2-к ( трансгенное) ; 3-7 дней(нетрансформированные); 4-7 дней ( трансгенное); 5-15 дней( петра[(сформированные); 6-15 дней( трансгенное) м

Рис.12. Электорофореграммы ампликонов, полученных после реакции ОТ-ГТЦР с праймерами к соответствующим генам.

Таблица 4. Биохимические показатели трансгенных растений по сравнению с ^трансформированными растениями.

Показатели Линия 6 (Си) Линия 5 (Zn)

Прирост биомассы 138% +210%

МДА 65% 91%

сод 205% 89%

Гваяк. пероксидаза 177% 145%

Каротин 136% 145%

Ксантофилл 116% 114%

Пролин 134% 125%

Общие фенолы 136% 140%

Флавоноиды 168% 137%

Антоцианы 258% 189%

За 100% принимали значения показателей, полученные для нетрансформированного растения. Растения подвергались 15 дн. воздействию 100 мкМ Си804 или 3000 мкМ гп504. Линия 5 - экспрессия гена ОатуЬ4 под действием гп304; Линия 6 - экспрессия гена ОзтуЬ4 под действием Си304.

Таким образом, совокупность представленных выше результатов позволяет заключить, что экспрессия ОхтуЬ4 гена риса в растениях рапса сопровождается повышением их устойчивости к ТМ. В основе повышенной устойчивости трансгенных растений рапса к ТМ лежит стресс-индуцируемая аккумуляция низкомолекулярных органических соединений фенольной природы (общие фенолы, флавоноиды и антоцины), увеличение содержания пролина, обладающего осморегуляторным и защитным эффектом, а также некоторое увеличение активности антиоксидантных ферментов, особенно в условиях действия на растения сульфата меди как наиболее токсичного ТМ (Табл. 4). Совокупность указанных изменений метаболизма сопровождается снижением интенсивности окислительного стресса, о чем свидетельствует более низкий уровень МДА в трансгенных растениях, а также повышенное содержание некоторых фотосинтетических пигментов, и меньшей степенью повреждения растений высокими концентрациями солей меди и цинка. Это подтверждает идею, согласно которой продукт 0$туЬ4 гена играет особую интегрирующую роль в ответе растений на повреждающее воздействие, координируя экспрессию генов различных метаболических путей, обеспечивающих формирование стресс-защитных механизмов.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в процессе генеративного размножения растений рапса с геном ОьтуЪ4 транс-фактора риса трансген наследуется и экспрессируется. Из 50 анализируемых растений второго поколения 25 растений содержали гены ОзтуЪ4 и прШ, из которых 7 линий экспрессировали этот ген ОхтуЬ4 на фоне высоких концентраций Си804 или 2п804..

2. Сделано заключение, что трансгенные растения рапса обладают повышенной устойчивостью к солям меди и цинка по сравнению с растениями дикого типа. В пользу этого заключения свидетельствует способность трансгенных растений: (а) выживать в течение 15 суток при 150 мкМ СиЭ04 или 5000 мкМ Хп304\ (б) более активно накапливать биомассу при высоких концентрациях ТМ; (в) в большей мере стабилизировать водный статус в экстремальных условиях. При этом трансгенные растения рапса накапливали до 180 мкг меди и до 6500 мкг цинка на 1 грамм сухой массы, что приближает их к группе растений-гипераккумуляторов цинка.

3. Показано, что большая устойчивость трансгенных растений рапса к солям ТМ может быть обусловлена меньшей интенсивностью окислительного стресса, который они испытывали в условиях повреждающего действия Си804 или гп804, о чем свидетельствует меньший уровень МДА у трансгенных растений при высоких концентрациях ТМ по сравнению с ^трансформированными формами.

4. Продемонстрировано, что в ответ на действие высоких концентраций ТМ трансгенные растения рапса интенсивно аккумулировали низкомолекулярные органические антиоксиданты (антоцианы, флавоноиды, сумма фенольных

соединений и, в меньшей степени, пролин), и обнаруживали повышенную активность пероксидазы и СОД. Активация антиоксидантпых ферментов была характерна, прежде всего, для ответа растений на высокие концентрации ионов меди, обладающих большей токсичностью по сравнению с ионами цинка. Совокупность указанных изменений метаболизма приводила к снижению повреждающего действия АФК и выживанию растений в условиях повреждающего действия ТМ.

5. Установлено, что суперэкспрессия гена Osmyb4 риса в растениях рапса не сопровождалась активацией экспрессии генов метаболизма пролина, генов фитохелатинсинтазы и транспортера цинка ZIP4 при действии высоких концентраций ТМ по сравнению с ^трансформированными растениями, а приводила к стимуляцией фенолыюго метаболизма и биосинтезу низкомолекулярпых антиоксидантов.

6. Высказано предположение, что полученные нами растения рапса с геном Osmyb4, имеющие повышенную устойчивость к высоким концентрациям ТМ, могут быть резистентны и к другим повреждающим факторам, поскольку они активно аккумулируют универсальные стресс-протекторные метаболиты с антиоксидантными свойствами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мареай М.М., Ралдугина Г.Н., Холодова В.П. Сравнительный анализ устойчивости двух сортов ярового рапса (Brassica napus L.) к действию к действию высоких концентраций цинка // Вестник Томского государственного университета, 2011. № 4, С.96-100.

2. Мареай М.М., Ралдугина Г.Н., Алобайди Х.Х. Сравнительный анализ устойчивости двух сортов ярового рапса к действию высоких концентраций Си2+ и Zn2+ // Вестник РУДН, 2012.-№ 2. С. 62-68.

3. Мареай Мухаммед М., Холодова В.П., Ралдугина Г.Н. Сравнительный анализ устойчивости двух сортов ярового рапса к действию ионов Си и Т.п. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума "Растение и стресс" Москва. 2010. С.233.

4. Мареай М.М., Ралдугина Г.Н. Анализ устойчивости 2-х сортов ярового рапса (Brassica napus L.) к действию ионов Си и Zn // Тезисы докладов VII съезда Общества физиологов растений России. Международная конференция «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий». Нижний Новгород. 2011. С. 453.

5. М.М. Мареай, Г.А. Шумкова, Н.В. Радионов, Г.Н. Ралдугина. Влияние повышенпых концентраций солей CuS04 и ZnS04 на трансгенные растения рапса (Brassica napus L.) с геном трансфакторного белка OSMYB4 // Тезисы докладов II Международной школы-копферепции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях». Москва-Звенигород 5-10 декабря. 2011. С. 48.

Подписано в печать:

16.05.2012

Заказ № 7366 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мухаммед Мукбель Тахер Мареай, Москва

61 12-3/1346

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К.А.ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

МУХАММЕД Мукбель Тахер Мареай

АДАПТАЦИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ РАПСА СBrassica napus L.) СО ВСТРОЕННЫМ ГЕНОМ ТРАНС-ФАКТОРА Osmyb4 РИСА К ТЯЖЕЛЫМ МЕТАЛЛАМ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Г. Н. Ралдугина

Научный консультант: доктор биологических наук профессор, чл.-корр. РАН Вл. В. Кузнецов

Москва-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ 2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6

ВВЕДЕНИЕ 7

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1.1. Накопление тяжелых металлов растениями 10

1.2. Пути поступления тяжелых металлов в растения 13

1.3. Влияние высоких концентраций тяжелых металлов на растения 14

1.4. Биологическая роль меди и цинка в растениях 15

1.5. Общие представления об адаптации растений к неблагоприятным факторам окружающей среды 18

1.6. Клеточные механизмы детоксикации тяжелых металлов 21

1.6.1. Детоксикация тяжелых металлов (ТМ) путем

внутриклеточной компартментации 22

1.6.2. Клеточная стенка и экссудаты корня 23

1.6.3. Роль плазматической мембраны в детоксикации ТМ 24

1.6.4. Белки теплового шока (БТШ) 25

1.6.5. Хелатирование 26 1.6.5.1 Фитохелатины 26 1.6.5.2. Металлотионеины 27 1.6.7. Органические кислоты и аминокислоты 29

1.7. Совместимые осмолиты 30

1.8. Стрессорные белки 32

1.9. Транскрипционные факторы 32 1.9.1. МУВ-факторы в растениях 33

1.10. Окислительный стресс и антиоксидантная система 35

1.10.1. Ферменты антиоксидантного комплекса 3 6

1.10.2. Неферментативные антиоксиданты 37

1.11. Повышение устойчивости растений к тяжелым металлам с помощью генной

инженерии 39 1.11.1. Создание растений с гетерологическими генами

металлотранспортеров 40

1.11.2.1. Встраивание в растения генов металлотионеинов 41

1.11.2.2. Встраивание в растения гетерологических генов

фитохелатинсинтазы 42

1.11.3. Перенос генов другие механизмы устойчивости к ТМ 43

1.11.4. Трансгенные растения с повышенным содержанием пролина 44

1.11.5. Встраивание генов, ответственных за преобразование тяжелых металлов в менее токсичные формы 45 ГЛАВА II. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 47

2.1. Характеристика Brassica napus L. в качестве модельного объекта исследования 47

2.2. Условия выращивания растений и проведения опытов 48

2.2.1. Выращивание растений рапса в водной культуре 48

2.2.2. Среды для культивирования растений 49

2.2.3. Выращивание растений рапса в условиях in vitro 49

2.2.4. Выращивание растений из семян 50

2.2.5. Условия проведения опытов 50

2.3. Физиологические методы исследований 50

2.3.1. Измерение оводненности листьев рапса 50

2.3.2. Измерение биомассы растений 51

2.3.3. Определение содержания пигментов 51

2.3.4. Определение содержания тяжелых металлов в тканях растений 52

2.3.5. Определение интенсивности перекисного окисления липидов 52

2.3.6. Определение активности СОД 53

2.3.7. Определение активности пероксидазы 54

2.3.8. Определение эндогенного содержания пролина. 55

2.3.9. Определение содержания растворимых фенольных соединений 56

2.3.10. Определение содержания флавоноидов 56

2.3.11. Определение содержания антоцианов 5 7

2.3.12. Определение содержания белка 57

2.4. Методы молекулярно-биологического анализа 58

2.4.1. Описание конструкции, использованной для трансформации растений рапса 58

2.4.2. Выращивание трансгенных растений 59

2.4.3. Выделение тотальной растительной ДНК 59

2.4.4. Подбор праймеров к генам исследования 60

2.4.5. Определение количества и качества нуклеиновых кислот 61

2.4.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 62

2.4.7. Электрофорез ДНК 62

2.4.8. Выделение тотальной РНК 63

2.4.9. Электрофорез РНК 65

2.4.10. Обратная транскрипция 65

2.5. Математическая обработка данных 66 ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ 67

3.1. Влияние тяжелых металлов на растений рапса двух сортов. 67

3.1.1. Рост и накопление биомассы 67

3.1.2. Измерение оводненности растений 68

3.1.3. Измерение содержания свободного пролина. 69

3.1.4. Аккумуляция ТМ в листьях растений рапса. 70

3.2. Влияние Си804 и 7п804 на трансгенные растения рапса с геном ОятуЬА

риса 73

3.2.1. Наследование трансгена ОзтуЬ4 и его экспрессия в условиях

действия ТМ 74

3.2.2. Накопление сырой биомассы и оводнённость растений 76

3.2.3. Влияние меди и цинка на содержание пигментов 80

3.2.4. Аккумуляция ТМ в листьях растений рапса 83

3.2.5. Влияние ТМ на перекисное окисление липидов 84

3.2.6. Изменение супероксиддисмутазы и активностей гваякольной пероксидазы при ТМ стрессе 86

3.2.6.1. Изменение активностей супероксиддисмутазы 86

3.2.6.2. Изменение активностей активностей гваякольной пероксидазы 87

3.2.7. Аккумуляция пролина в листьях растений рапса 88

3.2.8. Аккумуляция фенолов, флавоноидов и антоцианов под действием

меди и цинка 90

3.2.8.1. Аккумуляция фенолов 90

3.2.8.2. Аккумуляция флавоноидов 92

3.2.8.3. Аккумуляция антоцианов 92 3.3. Влияние ТМ на экспрессию генов системы их детоксикации в трансгенных растений 95 ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 97 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 107 ВЫВОДЫ 108 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

тм тяжелые металлы

кДНК комплементарная ДНК

мРНК матричная РНК

МДА малоновый диальдегид

НУК нафтилуксусная кислота

пдг пролиндегидрогеназа

Про пролин

пол реакция перекисного окисления липидов

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

N08 нопалинсинтаза

ЭПР эндоплазматический ретикулум

БТШ белки теплового шока

ФХ фитохелатины

мт металлотионеины

АФК активные формы кислорода

ТФ транскрипционные факторы

ЭТЦ электрон-транспортная цепь

СОД супероксиддисмутаза

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одним из негативных результатов бурного развития промышленности является загрязнение среды обитания тяжелыми металлами (ТМ), к которым относятся химические элементы, имеющие плотность

•з

больше 5 г/см и атомную массу более 40 Да (Кузнецов, Дмитриева, 2011). Многие ТМ, такие, например, как медь и цинк, являются эссенциальными элементами, т.е. элементами, которые в низких концентрациях жизненно необходимы для нормального роста и развития организма (Kholodova et al., 2011). Тем не менее, в высоких концентрациях они негативно влияют как на жизнь растений, так и на здоровье человека, накапливаясь в организме и вызывая различные нарушения. Так, высокие концентрации ТМ вызывают ингибирование роста растений и снижение урожая, торможение фотосинтеза и дыхания, нарушение синтеза белка и донорно-акцепторных отношений, инактивацию ключевых ферментов метаболизма, изменение водного и гормонального статуса и даже гибель организма (Титов и др., 2007; Kholodova et al., 2011).

Растения могут адаптироваться к токсическому действию высоких концентраций ТМ. В основе этой адаптации лежит формирование и функционирование как специализированных (хелатирование, секвестрация и компартментация ТМ), так и общих механизмов устойчивости (низкомолекулярные органические стресс-протекторные соединения, защитные макромолекулы и антиоксидантные системы) (Hall, 2002; Clemens, 2006; Кузнецов, 2009). Клетки растений воспринимают действие стрессорных факторов и передают внешний сигнал на особые регуляторные белки, называемые транскрипционными факторами (ТФ) или транс-факторами (Vannini et al., 2006), которые вызывают изменение экспрессии генов и формирование стресс-протекторных систем.

Знание механизмов устойчивости растений к ТМ позволяет получить методами генной инженерии трансгенные растения, обладающие большей

устойчивостью к токсическому действию ТМ. Для этой цели можно переносить в сельскозяйственные культуры (1) гены, участвующие в хелатировании ионов (Lefebvre et al., 198; Gasic et al., 2005), (2) гены, продукт которых превращает высокотоксичные формы в менее токсичные (Bizilli, 1999), (3) гены общих механизмов устойчивости или, наконец, (4) гены, кодирующие транс-факторы (Mattana et al., 2005; Latchman, 2007; Гомаа и др., 2012).

Одним из наиболее перспективных биотехнологических путей получения растений, обладающих повышенной устойчивостью к ТМ, является использование генов транс-факторных белков. Транс-факторные белки взаимодействуют с ДНК (либо с другими белками, а затем с ДНК), в результате чего образуется комплекс белок-ДНК, регулирующий экспрессию большого числа генов, в том числе и генов стрессорного ответа (Latchman, 2007). В растениях весьма распространены транскрипционные факторы MYB семейства (Vannini et al., 2006). К этому семейству относится и используемый в данной работе ген Osmyb4, который был изолирован из генома растений риса (Pandolfi et al., 1997).

Ранее было установлено, что сверхэкспрессия гена Osmyb4 риса в трансгенных растениях A. thaliana приводила к повышению засухо- и холодоустойчивости (Vannini et al., 2004, Mattana et al., 2005), а также сопровождалась повышением устойчивости растений ярового рапса (Brassica napus L.) к низким положительным и отрицательным температурам (Гомаа и др., 2012). При этом было показано, что повышение устойчивости этих трансгенных растений сопровождается интенсивной аккумуляцией совместимых осмолитов, обладающих стресс-протекторным эффектом (пролин, сахара и т.п.), а также низкомолекулярных органических соединений с антиоксидантной активностью (Mattana et al., 2005; Гомаа и др., 2012). На этом основании нами было высказано предположение, что трансгенные растения рапса с суперэкспрессией гена OsmybA риса могут быть устойчивы не только к засухе и низкотемпературному стрессу, но также и к повреждающему воздействию высоких концентраций ТМ, в частности, солей меди и цинка. Несмотря на то, что получение трансгенных растений рапса с

повышенной устойчивостью к ТМ весьма актуально, прежде всего, с теоретической точки зрения, до сих пор такие растения никем не были получены.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в том, чтобы выяснить, сопровождается ли суперэкспрессия гена ОятуЬ4 риса в растениях рапса повышением устойчивости к тяжелым металлам и, если сопровождается, то каковы физиологические механизмы этого явления.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

(1) Сравнить устойчивость двух сортов рапса к высоким концентрациям

ТМ.

(2) Изучить наследование трансгена ОзтуЬ4 риса в растениях рапса и его экспрессию.

(3) Исследовать влияние высоких концентраций ТМ на некоторые физиологические процессы у трансгенных растений.

(4) Исследовать влияние ТМ на функционирование отдельных компонентов антиоксидантных систем у трансгенных растений рапса.

(5) Исследовать экспрессию некоторых генов устойчивости растений к

ТМ.

Научная новизна работы. Показано, что в процессе генеративного размножения трансгенных растений рапса ген трансфакторного белка ОятуЬ4 наследуется и активно экспрессируется в процессе адаптации к тяжелым металлам. Установлено, что экспрессия трансгена ОзтуЬ4 в растениях рапса сопровождается повышением устойчивости к тяжелым металлам, в основе которой лежит снижение интенсивности окислительного стресса в результате аккумуляции низкомолекулярных органических антиоксидантов и увеличение активности антиоксидантных ферментов, с одной стороны, и накопление совместимых осмолитов, с другой. Впервые установлено, что интенсивная экспрессия гена ОятуЬ4 транс-фактора риса в растениях рапса в ответ на воздействие ТМ сопровождается активацией «работы» генов различных метаболических путей, обеспечивающих формирование защитных механизмов и повышение устойчивости к повреждающему действию тяжелых металлов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ПРОБЛЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Накопление тяжелых металлов растениями

Загрязнение почвы тяжелыми металлами в результате человеческой деятельности является серьезной экологической проблемой. После того как тяжелые металлы (ТМ) попадают в окружающую среду, они накапливаются в почве, что может приводить к их накоплению в растениях. Разные виды растений различаются по способности аккумулировать конкретные металлы. Различия заключаются не только в количестве накапливаемых металлов, но и в их органном распределении, что связано с морфофизиологическими особенностями разных видов. На этом основании растения подразделяют на три группы: аккумуляторы, индикаторы и исключатели (Baker, Walker, 1990). При этом растения-исключатели предотвращают чрезмерное поступление и транспорт металлов в надземные органы при высоком их содержании в среде, однако, они могут накапливать большое количество металлов в корнях (Baker, 1981). Содержание ТМ в тканях растений-индикаторов соответствует уровню металлов в среде. Растения-аккумуляторы способны накапливать большое количество ТМ в побегах независимо от концентрации металлов в почве (Baker, Walker, 1990).

Рис. 1. Основные стратегии ответов растений на повышенные концентрации ТМ в почвах (по Callahan et al., 2006).

Группу растений, способных не только произрастать на сильно обогащенных ТМ почвах, но и накапливать их в надземных органах в концентрациях, в десять и

Гипераккумуляторы

00 о

Концентрация металлов в почве

более раз превосходящих средние показатели содержания металлов для растений, не относящихся к этой группе, называют гипераккумуляторами. Уровень накопления металла растением, который позволяет отнести тот или иной вид к гипераккумуляторам, специфичен для каждого конкретного ТМ. Термин «гипераккумулятор» впервые предложил Brooks (1977) для растений, способных накапливать в побегах свыше 100 мкг кадмия на 1 г сухой массы. Для меди, кобальта, свинца, никеля и ряда других ТМ порог накопления составляет 1000 мкг/г, тогда как для цинка и марганца - 10000 мкг/г сухой массы. В настоящее время известно 400 видов растений-гипераккумуляторов ТМ, принадлежащих к 45 семействам. Больше сотни из них приходится на растения-гипераккумуляторы никеля и около двух дюжин на гипераккумуляторы цинка (Krämer et al., 1997; Guerinot, Salt, 2001).

Гипераккумуляторы представляют особый интерес для современной биологии по ряду параметров: во-первых, специфичность «сверхнакопления» определенных ТМ; во-вторых, специфика поступления, транспорта и накопления ТМ; в-третьих, физиологические, биохимические и молекулярные механизмы их накопления; в-четвертых, биологическое и эволюционное значение накопления ТМ. Кроме того, особый интерес к этой группе растений заключается в возможности их использования для фиторемедиации загрязненных почв (Baker et al., 2000; Pilson-Smits, 2005). Фиторемедиация ("phyto" - растение и "remedium" -восстанавливать) считается одним из наиболее перспективных методов борьбы с загрязнением почв ТМ. Составными элементами данной технологии является или создание устойчивого и продуктивного растительного сообщества, существующего в условиях токсичного загрязнения, либо снижение токсического содержания тяжелых металлов в почве.

Метод фиторемедиации основан на способности растений аккумулировать в своих тканях большие количества металлов без проявления симптомов токсичности. Растительную массу таких растений собирают и сжигают, а образовавшийся пепел захороняют или используют в целях извлечения из него высокоценных металлов (например, никеля) (Baker et al., 1994; McGrath, Zhao, 2003; Chaney et al., 2005). Фиторемедиация становится все более и более популярной, поскольку является наиболее эффективным и экономически

выгодным методом очистки окружающей среды. Кроме того, растительность придает очищаемой территории большую привлекательность, что делает этот метод наиболее эстетичным. Для целей фиторемедиации могут быть использованы различные виды растений (Табл. 1).

Таблица 1.

Некоторые виды растений-гипераккумуляторов ТМ, используемых в фиторемедиации

Вид растения Металл Ссылка

Thlaspi caerulescens Zn, Cd Reeves and Brooks (1983); Baker and Walker (1990)

Ipomoea alpina Cu Baker and Walker (1990)

Sebertia acuminata Ni Jaffre et al. (1976)

Haumaniastrum robertii Co Brooks(1977)

Astragalus racemosus Se Beath et al. (2002)

Arabidopsis thaliana Zn, Cu, Pb, Mn, P Lasat (2002b)

Thlaspi goesingens Ni Kramer et al. (2000)

Arabidopsis halleri Zn, Cd Reeves and Baker (2000); Cosio et al. (2004)

Sonchus asper Pb, Zn Yanqun et al. (2005)

Corydalis pterygopetala Zn, Cd Yanqun et al. (2005)

Alyssum bertolonii Ni Li et al. (2003); Chaney et al. (2000)

Astragalus bisulcatus Se Vallini et al. (2005)

Stackhousia tryonii Ni Bhatia et al. (2005)

Hemidesmus indicus Pb Chandra Sekhar et al. (2005)

Salsola kali Cd de la Rosa et al. (2004)

Sedum alfredii Pb, Zn Li et al. (2005)

Pteris vittata As Ma et al. (2001); Zhang et al. (2004); Tu and Ma (2005)

Helianthus anuus Cd, Cr, Ni Turgut et al. (2004)

(По Hooda, 2007)

Некоторые из этих растений известны как гипераккумуляторы и способны накапливать потенциально фитотоксичные элементы в концентрациях в 50-500 раз выше, чем в среднем по растениям (Raskin, 1996).

Однако многие из гипераккумуляторов медленно растут и накапливают небольшую биомассу, что делает их не очень эффективными при очистке загрязненных ТМ участков. Деревья, с другой стороны, являются привлекательной альтернативой травянистым растениям в связи с их развитой корневой системой, высокой скоростью поглощения воды, быстрым ростом и большим накоплением биомассы (Gullner et al., 2001; Pilon-Smits et al., 2002).

Достаточно большое количество растений гипераккумуляторов встречается в семействе капустных (Brassicaceae), к которым относится рапс (Brassica napus L), являющийся перспективным кандидатом для фитоэкстракции тяжелых металлов из загрязненной почвы (Grispen et al., 2006). Известно, что некоторые растения рода Brassica способны накапливать в надземных органах большое количество тяжелых металлов - Cd (Mishra, Singh, 2000; Singh, Tew